番茄種傳病原多重pcr檢測試劑盒的制作方法
【專利摘要】本實用新型屬于生物【技術領域】，涉及一種番茄病害的檢測試劑盒。一種番茄種傳病原多重PCR檢測試劑盒，番茄種傳病原為馬鈴薯紡錘塊莖類病毒、鳳果花葉病毒或煙草環斑病毒，其主要特點在于包括有在盒體內設有RT-PCRbuffer管，內裝2×RT-PCR?buffer；引物管，分別裝馬鈴薯紡錘塊莖類病毒PSTVd上游引物，濃度為10μmol/L；馬鈴薯紡錘塊莖類病毒PSTVd下游引物，濃度為10μmol/L；鳳果花葉病毒PepMV上游引物，濃度為10μmol/L；鳳果花葉病毒PepMV下游引物，濃度為10μmol/L；煙草環斑病毒TRSV上游引物，濃度為10μmol/L；煙草環斑病毒TRSV下游引物，濃度為10μmol/L；酶管，內裝反轉錄酶及DNA聚合酶Mix，去離子水管，內裝無RNA酶的去離子水；陽性對照管，內裝馬鈴薯紡錘塊莖類病毒PSTVd、鳳果花葉病毒PepMV和煙草環斑病毒TRSV無侵染活性的陽性對照。
【專利說明】番茄種傳病原多重PCR檢測試劑盒
【技術領域】
[0001]本實用新型屬于生物【技術領域】，涉及一種番茄病害的檢測試劑盒，主要針對番茄的3種重要種傳病原馬鈴薯紡錘塊莖類病毒、鳳果花葉病毒和煙草環斑病毒的同時檢測。
【背景技術】
[0002]番茄病毒病是由多種病毒引起的重要病害，是番茄上發生最普遍、最難防治的病害之一，分布于世界各番茄產地。馬鈴薯紡錘塊莖類病毒、煙草環斑病毒和鳳果花葉病毒均可引起番爺病毒病。馬鈴薯紡錘塊莖類病毒(Potato spindle tuber viroid,PSTVd)是我國進境植物檢疫性有害生物，在中國局部分布于黑龍江、江蘇、河北和青海，主要寄主為馬鈴薯、番茄和鱷梨，還能感染其它茄科植物，包括辣椒、甘薯、茄、茄屬觀賞植物、龍葵、曼陀羅屬、素馨茄、燈籠果、人參果、矮牽牛屬植物等。類病毒是無蛋白質外殼保護的游離的共價閉合環狀單鏈RNA分子，侵入宿主細胞后自我復制，具有高度的侵染活性，50?100分子的類病毒可以引起成功的侵染，并使宿主致病或死亡。煙草環斑病毒(Tobacco ringspotvirus,TRSV)為紅豆花葉病毒科(Comoviridae)線蟲傳病毒屬(Nepovirus)的成員，可侵染番茄等54科246種草本和木本植物，在植物上引起環斑等癥狀，是我國進境植物檢疫性有害生物。該病毒通過線蟲、機械接種和種子等途徑傳播，在多種多年生植物及種子上越冬，成為來年的初侵染來源，種子傳播是TRSV遠距離傳播的主要途徑。鳳果花葉病毒(Pepinomosaic virus, PepMV)為馬鈴薯X病毒(Potexvirus)屬病毒，最初發現于鳳果(又稱人參果、香瓜茄)上，自然寄主為番茄，并可侵染茄子、煙草和馬鈴薯等茄科作物及莧屬雜草、小花錦葵、粉藍煙草、龍葵、羅勒和苦苣菜。番茄受侵染后葉部出現黃斑，葉脈輕微枯萎，有時畸形，果實表面通常有斑點，植物矮小并扭曲。PepMV主要分布在秘魯、荷蘭和英國，對歐洲及美洲的番茄生產造成了毀滅性影響，被歐洲及地中海植物保護組織(EPPO)列于警戒目錄，我國尚無分布情況的報道。PSTVd、TRSV和PepMV均可侵染番茄，具有寄主范圍廣泛、可種傳、傳播途徑多樣的特點，一旦隨生產性引種傳入、擴散和蔓延，將對番爺生產構成嚴重障礙，對我國的生態安全、農業生產的正常發展造成嚴重影響。
[0003]目前番茄病毒病和類病毒病的主要檢測方法有生物學測定、血清學測定、電子顯微鏡技術和分子生物學技術。生物學方法的鑒別寄主法簡單易行，反應靈敏，但工作量比較大，常常受溫室條件和時間的限制，加之癥狀反應常受環境、土壤和氣候條件的影響，在一定程度上制約了鑒別寄主方法的應用。采用ELISA方法檢測植物病毒，操作過程簡便、快捷，但由于交叉反應等問題，可能出現假陽性。利用電子顯微鏡檢測病毒，可直接觀察病毒的大小、形態，但存在設備昂貴，技術要求高，準確性和靈敏度較低的弱點。對PSTVd而言，其侵染植物隱癥現象比較普遍，癥狀表現受環境溫度的影響較大，而且幾種鑒別植物對不同類病毒的反應癥狀相似，所以難于應用生物學方法進行診斷；類病毒不產生蛋白質，無法使用血清學方法檢測。與血清學方法相比較，RT-PCR技術不需要制備抗體，而且檢測所需的病毒量少，具有靈敏、快速、特異性強等優點，已成功地用于各種病毒的快速檢測。由于常規PCR技術一次只能擴增一個模板，如果反應體系中含有兩種以上的病原物，則需進行多次PCR，不但操作復雜，而且費用高，耽誤時間。多重PCR法使用多對引物，可在一個反應中擴增多種靶序列，其優點是可以在一種樣品中同時鑒別多種病毒，并將PCR的敏感性和快速性結合起來，避免了逐一擴增待測樣品中每種病原的麻煩，可提高診斷的敏感性，同時降低檢測費用。
[0004]目前PSTVd、TRSV和P印MV已建立單一 RT-PCR分子檢測技術，但尚未見這3種重要種傳病原的多重PCR體系的報道。建立穩定靈敏的多重RT-PCR技術,可實現在同一反應管中同時對PSTVd、TRSV和P印MV三種病原進行鑒別檢測，提高檢測準確性，縮短檢測周期，降低檢測成本，降低病原物種傳的危險性，為農業生產安全和制種業發展提供技術保障。

【發明內容】

[0005]本實用新型的目的提供一種番茄種傳病原多重PCR檢測試劑盒，番茄種傳病原為馬鈴薯紡錘塊莖類病毒、鳳果花葉病毒或煙草環斑病毒。
[0006]為實現上述目的，本實用新型的技術方案是一種番茄種傳病原多重PCR檢測試劑盒，番茄種傳病原為馬鈴薯紡錘塊莖類病毒、鳳果花葉病毒或煙草環斑病毒，其特征在于包括有在盒體內設有RT-PCR buffer管，內裝2 X RT-PCRbuffer, 100-250 μ L ；引物管，分別裝馬鈴薯紡錘塊莖類病毒PSTVd上游引物V -ATTCCCGCCGAAACAGG-3 ’，濃度為10μπιΟ1/1，10-30μ?;馬鈴薯紡錘塊莖類病毒PSTVd下游引物5' -CCCGAAGCAAAGAAGAT AGAGAAA-3 '，濃度為 10 μ mol/L, 10-30 μ L ;鳳果花葉病毒 P印MV上游引物 5' -ATGAGGTTGTCTGGTGAAGGTC-3'，濃度為 10 μ mol/L, 10-30 μ L ;鳳果花葉病毒P印MV下游引物 5' -AATTCCGTGCACAACTATGATTC-3'，濃度為 10 μ mol/L，10-30 μ L ;煙草環斑病毒 TRSV 上游引物 5' -CTTGCGGCCCAAATCTATAA-3 '，濃度為 10 μ mol/L, 10-30 μ L ;煙草環斑病毒TRSV下游引物5' -ACTTGTGCCCAGGAGAGCTA-3'，濃度為 10 μ mol/L, 10-30 μ L ；酶管，內裝反轉錄酶及DNA聚合酶MixJOyL;去離子水管，內裝無RNA酶的去離子水，100 μ L-1mL ;陽性對照管，內裝馬鈴薯紡錘塊莖類病毒PSTVd、鳳果花葉病毒PepMV和煙草環斑病毒TRSV無侵染活性的陽性對照各20-60 μ L0
[0007]本實用新型根據PSTVd和PepMV的保守序列區設計了檢測引物，建立并優化了多重RT-PCR反應體系和反應程序。
[0008]有益效果:本實用新型能同時檢測番茄3種重要種傳病原，快速準確，避免了常規PCR的重復檢測。利用該檢測方法能特異擴增出馬鈴薯紡錘塊莖類病毒、煙草環斑病毒和鳳果花葉病毒的基因片段且最低能檢測到I μ g的總核酸模板，檢測的穩定性好，特異性強，一致性高，可用于PSTVd、TRSV和PepMV的同時早期診斷和田間病原調查，實現了番茄多種病毒病和類病毒病的高效快速檢測，有利于摸清田間3種病害發生狀況，可為健康番茄種子的調運等提供有效的監控手段，確保番茄生產安全，還對番茄其它病原的檢測具有一定的參考價值。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0009]圖1為本實用新型的主視圖。
【具體實施方式】[0010]以下對本實用新型的原理和特征進行描述，所舉實例只用于解釋本實用新型，并非用于限定本實用新型的范圍。所述【技術領域】的普通技術人員依據以上本實用新型公開的內容和各參數所取范圍，均可實現本實用新型的目的。
[0011]實施例1:一種番茄種傳病原多重PCR檢測試劑盒，番茄種傳病原為馬鈴薯紡錘塊莖類病毒、鳳果花葉病毒或煙草環斑病毒，包括有在盒體I內設有RT-PCR buffer管2，內裝2XRT-PCR buffer，250yL;裝馬鈴薯紡錘塊莖類病毒引物管3，PSTVd上游引物
-ATTCCCGCCGAAACAGG-3 ;，濃度為10 μ mol/L，30 μ L ;馬鈴薯紡錘塊莖類病毒引物管4，PSTVd 下游引物 5 ' -CCCGAAGCAAAGAAGATAGAGAAA-3 '，濃度為 10 μ mol/L, 30 μ L ;鳳果花葉病毒引物管 5，PepMV 上游引物 5' -ATGAGGTTGTCTGGTGAAGGTC-3'，濃度為 10 μ mol/L，30y L ;鳳果花葉病毒引物管6，P印MV下游引物5' -AATTCCGTGCACAACTATGATTC-3 '，濃度為10ymol/L，30yL;煙草環斑病毒引物管7，TRSV上游引物5' -CTTGCGGCCCAAATCTATAA-3'，濃度為 10 μ mol/L, 30 μ L ;煙草環斑病毒 TRSV 下游引物引物管 8，5^ -ACTTGTGCCCAGGAGAGCTA-3'，濃度為 10 μ mol/L，30 μ L ;酶管 9，內裝反轉錄酶及DNA聚合酶Mix，20 μ L ;去離子水管10，內裝無RNA酶的去離子水，ImL ;陽性對照管，內裝馬鈴薯紡錘塊莖類病毒PSTVd對照管11、鳳果花葉病毒PepMV對照管12和煙草環斑病毒TRSV對照管13無侵染活性的陽性對照各60 μ L0
[0012]實施例2:—種番爺種傳病原多重PCR檢測試劑盒,番爺種傳病原為馬鈴薯紡錘塊莖類病毒、鳳果花葉病毒或煙草環斑病毒，包括有在盒體I內設有RT-PCR buffer管2，內裝2XRT-PCR buffer，150 μ L ;裝馬鈴薯紡錘塊莖類病毒引物管3，PSTVd上游引物
-ATTCCCGCCGAAACAGG-3 ;，濃度為10 μ mol/L，20 μ L ;馬鈴薯紡錘塊莖類病毒引物管4，PSTVd 下游引物 5 ' -CCCGAAGCAAAGAAGATAGAGAAA-3'，濃度為 10 μ mol/L, 20 μ L ;鳳果花葉病毒引物管 5，PepMV 上游引物 5' -ATGAGGTTGTCTGGTGAAGGTC-3'，濃度為 10 μ mol/L，20y L ;鳳果花葉病毒引物管6，P印MV下游引物5' -AATTCCGTGCACAACTATGATTC-3 '，濃度為10ymol/L，20yL;煙草環斑病毒引物管7，TRSV上游引物5' -CTTGCGGCCCAAATCTATAA-3`'，濃度為 10 μ mol/L, 20 μ L ;煙草環斑病毒 TRSV 下游引物引物管 8，5^ -ACTTGTGCCCAGGAGAGCTA-3'，濃度為 10 μ mol/L，20 μ L ;酶管 9，內裝反轉錄酶及DNA聚合酶Mix，20 μ L ;去離子水管10，內裝無RNA酶的去離子水，500 μ L ；陽性對照管，內裝馬鈴薯紡錘塊莖類病毒PSTVd對照管11、鳳果花葉病毒PepMV對照管12和煙草環斑病毒TRSV對照管13無侵染活性的陽性對照各40 μ L0
[0013]實施例3:—種番爺種傳病原多重PCR檢測試劑盒,番爺種傳病原為馬鈴薯紡錘塊莖類病毒、鳳果花葉病毒或煙草環斑病毒，包括有在盒體I內設有RT-PCR buffer管2，內裝2XRT-PCR buffer，IOOyL;裝馬鈴薯紡錘塊莖類病毒引物管3，PSTVd上游引物
-ATTCCCGCCGAAACAGG-3 ;，濃度為10 μ mol/L，10 μ L ;馬鈴薯紡錘塊莖類病毒引物管4，PSTVd 下游引物 5 ' -CCCGAAGCAAAGAAGATAGAGAAA-3 '，濃度為 10 μ mol/L, 10 μ L ;鳳果花葉病毒引物管 5，PepMV 上游引物 5' -ATGAGGTTGTCTGGTGAAGGTC-3'，濃度為 10 μ mol/L，10yL;鳳果花葉病毒引物管6，P印MV下游引物5 ' -AATTCCGTGCACAACTATGATTC-3 '，濃度為10ymol/L，10yL;煙草環斑病毒引物管7，TRSV上游引物5' -CTTGCGGCCCAAATCTATAA-3'，濃度為 10 μ mo 1/L，10 μ L ;煙草環斑病毒 TRSV 下游引物引物管 8，5^ -ACTTGTGCCCAGGAGAGCTA-3'，濃度為 10 μ mol/L，10 μ L ;酶管 9，內裝反轉錄酶及DNA聚合酶Mix，20 μ L ;去離子水管10，內裝無RNA酶的去離子水，100 μ L ；陽性對照管，內裝馬鈴薯紡錘塊莖類病毒PSTVd對照管11、鳳果花葉病毒PepMV對照管12和煙草環斑病毒TRSV對照管13無侵染活性的陽性對照各20 μ L0
[0014]使用時，番茄種傳病原多重PCR檢測方法，步驟為:
[0015]I)總核酸提取:
[0016](I)取感染馬鈴薯紡錘塊莖類病毒、鳳果花葉病毒或煙草環斑病毒的番茄葉片；稱取0.1g感染病毒樣品組織倒在潔凈的研缽內，加液氮研磨成粉末狀；
[0017](2)移入1.5mL離心管中，然后加入ImL的TRIzol，劇烈振蕩3min以上；
[0018](3)在4°C下，12000rpm離心IOmin以除去不溶成分,將上清液轉入另一新的1.5mL離心管中；
[0019](4)在室溫下靜置5min,加0.2mL氯仿/mL TRIzol,劇烈振蕩15s,然后在室溫下靜置15min,再于4°C、12000rpm的條件下離心15min ；
[0020](5)將上層水相轉移到新的1.5mL離心管中，加0.5mL異丙醇/mLTRIzol，上下顛倒混勻，室溫靜置15min ；
[0021](6) 4°C、12000rpm 離心 IOmin ;
[0022](7)棄上清，加入75%的乙醇洗滌沉淀，然后4°C、7500rpm離心2min，棄乙醇；
[0023](8)沉淀在室溫下干燥IOmin或在冷凍離心濃縮機上濃縮5min，加入30 μ L無RNase水溶解，_70°C保存備用。
[0024]2) RT-PCR 反應體系為 50 μ L，其中 2X RT-PCR buffer25 μ L, RT/Taq Mix2 μ L,10 μ mol/L PSTVd 上下游引物各 1.5 μ L, 10 μ mol/L PepMV 上下游引物各 0.5 μ L, 10 μ mol/L TRSV上下游引物各0.25 μ L，總RNA模板3 μ L，滅菌去離子水補足反應總體積；
[0025]3).RT-PCR 反應條件為:
[0026]cDNA 合成:50°C 30min, I 個循環；
[0027]PCR 擴增:94°C預變性 3min ;94°C變性 30s，50°C退火 45s，72°C延伸 lmin，35 個循環；最后72°C延伸IOmin ；
[0028]4 ).RT-PCR擴增產物電泳檢測:
[0029]用TAE電泳緩沖液制備1.5%瓊脂糖凝膠，在室溫下進行水平電泳。加10 μ LPCR擴增產物，以健康番茄總核酸的反轉錄物PCR產物為陰性對照，以DLlOOOMarker為標準分子量；100V/80mA下電泳30分鐘，用SYBR Safe代替EB染色，用凝膠成像系統觀察并拍照，馬鈴薯紡錘塊莖類病毒擴增產物為一條163bp的條帶，鳳果花葉病毒擴增產物為一條625bp的條帶，煙草環斑病毒擴增產物為一條348bp的條帶。
[0030]以上所述僅為本實用新型的較佳實施例，并不用以限制本實用新型，凡在本實用新型的精神和原則之內所作的任何修改、等同替換、改進等，均應包含在本實用新型的保護范圍之內。
【權利要求】
1.一種番茄種傳病原多重PCR檢測試劑盒，番茄種傳病原為馬鈴薯紡錘塊莖類病毒、鳳果花葉病毒或煙草環斑病毒，其特征在于包括有在盒體內設有RT-PCR buffer管，內裝2XRT-PCR buffer, 100-250 μ L ;引物管，分別裝馬鈴薯紡錘塊莖類病毒PSTVd上游引物V -ATTCCCGCCGAAACAGG-3 '，濃度為10 μ mol/L, 10-30 μ L ;馬鈴薯紡錘塊莖類病毒 PSTVd 下游引物 5 ' -CCCGAAGCAAAGAAGATAGAGAAA-3 '，濃度為 10 μ mol/L，10-30 μ L ；鳳果花葉病毒P印MV上游引物5 ' -ATGAGGTTGTCTGGTGAAGGTC-3 '，濃度為10 μ mol/L，。10-30 yL;鳳果花葉病毒P印MV下游引物5 ' -AATTCCGTGCACAACTATGATTC-3 '，濃度為。10 μ mol/L, 10-30 μ L ;煙草環斑病毒 TRSV 上游引物 5' -CTTGCGGCCCAAATCTATAA-3'，濃度為 10 μ mol/L, 10-30 μ L ;煙草環斑病毒 TRSV 下游引物 5 ' -ACTTGTGCCCAGGAGAGCTA-3'，濃度為10 μ mol/L, 10-30 μ L ;酶管，內裝反轉錄酶及DNA聚合酶Mix，20 μ L ;去離子水管，內裝無RNA酶的去離子水，100 μ L-1mL ;陽性對照管，內裝馬鈴薯紡錘塊莖類病毒PSTVcUM果花葉病毒P印MV和煙草環斑病毒TRSV無侵染活性的陽性對照各20-60 μ L。
【文檔編號】C12Q1/70GK203582881SQ201320605630
【公開日】2014年5月7日 申請日期:2013年9月28日 優先權日:2013年9月28日
【發明者】文朝慧, 王軍平, 王肅軍, 劉雯 申請人:甘肅出入境檢驗檢疫局檢驗檢疫綜合技術中心