通過裂殖壺菌屬物種以兼養方式生產二十二碳六烯酸和蝦青素的制作方法
【專利摘要】本發明涉及新的屬于裂殖壺菌屬(Schizochytrium)的原生生物株系，其允許以兼養方式高產率地生產脂質和類胡蘿卜素，尤其是二十二碳六烯酸(DHA)和蝦青素；以及涉及選擇和培養此類株系的方法，通過采用可變地和/或不連續地提供光，尤其是以閃光形式。
【專利說明】通過裂殖壺菌屬物種以兼養方式生產二十二碳六烯酸和蝦青素
[0001]本發明涉及以兼養方式，尤其是在存在光的不連續和/或可變照射的情況下，培養網粘菌綱(Labyrinthulomycete)的,特別是裂殖壺菌屬(Schizochytrium)的原生生物的方法。該方法使得能夠獲得生物質的高產率，和經如此培養的原生生物對于脂質和類胡蘿卜素(更特別地，二十二碳六烯酸(DHA)和蝦青素)的富集。因此，該方法使得能夠選擇具有兼養特征且具有脂質和/或類胡蘿卜素(更特別地，多不飽和脂肪酸和蝦青素)的高產率的裂殖壺菌屬株系。本發明還涉及新的屬于裂殖壺菌屬的原生生物株系，其特別適合于脂質和類胡蘿卜素的生產。該新的裂殖壺菌屬株系可用于以兼養方式生產二十二碳六烯酸(DHA)和蝦青素。
[0002]序言
[0003]原生生物是具有簡單細胞構造的微生物，即它們通常是單細胞的和有時是多細胞的但不呈現特化的組織。它們可以是自養的或異養的。
[0004]原生生物目前是許多工業項目的目標，因為某些物種能夠積累或分泌大量的脂質，尤其是多不飽和脂肪酸。
[0005]裂殖壺菌屬物種是破囊壺菌科(Thraustochytriaceae)的原生生物,其是分布非常廣泛的一組海洋真菌。破囊壺菌已知產生寬范圍的脂質，特別是多不飽和脂肪酸，并且幾個物種已知產生類胡蘿卜素。
[0006]在多不飽和脂肪酸之中，某些ω-3系列的高度不飽和的脂肪酸(PUFA-C03)，特別是二十碳五烯酸(EPA或C20:5co3)和二十二碳六烯酸(DHA或C22:6 ω 3)，以及某些ω-6系列的高度不飽和的脂肪酸(PUFA-?6)，特別是花生四烯酸(ARA或AA或者二十碳四烯酸C20:4 ω 6)，具有公認的營養重要性并且在治療應用方面具有強大的潛力。
[0007]被認為是必需營養素的DHA對于細胞的正常的和功能性的發育來說是必需的，并且在各種生物化學過程和功能中發揮關鍵作用。其多不飽和性質，在植物中以及在動物中，賦予其以對于細胞膜的下列特性來說的至關重要性:流動性、柔性和選擇通透性，這些特性允許例如在低溫下的有效適應，甚至存活，特別是在魚類中。
[0008]DHA是人腦的主要結構組成部分，并且它是主要的脂肪酸。DHA占大腦皮層的15-20% (成人的腦包含至少20g DHA)和視網膜的30_60%。它通過摻入細胞膜中而對于中樞神經系統的發育和視網膜的功能來說是必不可少的，并且在視覺和記憶的機制的令人滿意的取得和維持中發揮首要作用。
[0009]目前，來自漁業的魚油是該類型的脂肪酸的主要商業來源。然而，盡管這些油找到了新的應用(水產養殖中的食物補充劑，整合到人造奶油中)，但是海洋漁業資源由于集約化的捕魚活動而變得稀少。
[0010]因此，應當尋找這些脂肪酸例如EF A、DHA和ARA的新來源以便在未來滿足市場對于該類型的多不飽和脂肪酸的日益增長的需求。
[0011]除了其從頭合成脂肪酸的能力外，原生生物還提供了相對于魚油而言的幾個優點:它們是在受控條件下在體外可培養的，這允許生產具有相對恒定的生物化學組成的生物質，和另一方面，與魚油相反，它們不具有令人不快的氣味并且其脂質不包含或包含很少的膽固醇。
[0012]最后，由原生生物產生的脂質具有比魚油的脂質更簡單的脂肪酸譜，這限制了目的脂肪酸的分離步驟。
[0013]此外，類胡蘿卜素也是目的分子。它們通常用作色素，但它們作為抗氧化劑對于人的健康也具有重要作用。最后，它們具有刺激免疫系統的能力。
[0014]為了以工業規模通過原生生物來生產脂肪酸和類胡蘿卜素，應當考慮幾個因素。例如，可以根據株系、溫度、光的條件和發酵罐的大小，在自養、兼養或異養條件下實施培養。例如，還可以在一升的容器中、在實驗室中、在光生物反應器中和在100000升的容器中或甚至在開放池(數公頃)中實施培養。然而，在開發理想的培養條件時，應當考慮能量消耗和其他資源例如勞力，和繼續培養的容易性。
[0015]無論如何，希望的是在對于增加待生產的脂肪酸和類胡蘿卜素的產率來說最佳的條件下培養原生生物。因此，優選的是具有可能的最高的產率(例如超過80g/l干物質的生物質，相對于干物質的總重量而言大于25重量％的脂肪酸，和例如相對于干物質的總重量而言大于0.2重量％的類胡蘿卜素)。
[0016]光對于生長的影響并不是僅僅留給光合生物(植物；藍細菌、微觀藻類和大型藻類)的。某些無葉綠素的生物具有允許其捕獲對于其發育來說必需的光信號的光受體。光受體例如植物光敏素為控制具有其的生物的發育的光感受器的典型例子。迄今已經描述了各種不同的光受體，即尤其是輔助色素、隱花色素和向光蛋白。
[0017]裂殖壺菌屬已知以異養方式產生DHA以及產生蝦青素，當將它在連續熒光存在下異養地進行培養時[R.Poontawe 等人，(2008)，Optimizat1n of DHA and astaxanthinproduct1n by Schizochytrium sp.1solated from mangrove forests in Thailand.JSPS-NRCT core university program on development of thermotolerant microbialresources and their applicat1ns,第 134-135 頁]。
[0018]然而，從工業開發利用的角度看，這樣的培養方式被證明是不合適的。這是因為，為了贏利，生物質的生產應當可以在大尺寸的封閉光生物反應器中實施。然而，這樣的培養方式難以實施，因為當培養基中細胞密度增加時，細胞越來越難以捕獲來自反應器外部的光。那么就需要活躍地攪拌培養基，這需要大的能量消耗。
[0019]可希望的是，能夠獲得比現有技術中所描述的更大的DHA和蝦青素的產率，以為了更有效和可贏利的工業開發利用。
[0020]為了改善DHA和蝦青素的產率，對于以上面所描述的培養方式進行培養而言的一個備選方法是以兼養方式(即采用較小強度的光提供，和在存在提供有機底物的情況下)實施培養。
[0021]應當理解，術語“兼養(的)”通常用于具有葉綠體的、能夠在光存在下通過利用兩種碳源(有機的和無機的)進行發育的株系。在裂殖壺菌屬株系的情況下，未鑒定到這樣的葉綠體。然而，由于該株系同時是異養的和對光反應性的，因而術語“兼養(的)”在本發明的范圍內將被放寬至該類別的株系。
[0022]因此，正是在許多的在不尋常的光條件下和通過添加各種不同底物進行的實驗結束之后， 申請人:終于分離到可以兼養方式進行培養的裂殖壺菌屬物種的原生生物株系，其使得能夠在本發明的條件下以高產率生產多不飽和脂肪酸和類胡蘿卜素，尤其是DHA和蝦青素。
[0023]已經將如此分離和選擇出的新的裂殖壺菌屬株系的代表性株系(FCC 1104)根據布達佩斯條約的規定以登錄號CCAP4087/1保藏于CCAP(藻類和原生動物培養物保藏中心，Scottish Associat1n for Marine Science, Dunstaffnage MarineLaboratory, Oban, Argyll PA371QA, Ecosse, Royaume-Uni)。
[0024]更具體而言，所述培養和選擇方法在于，在兼養條件下，在可變的和/或不連續的光照(尤其是以閃光形式)(具有特殊的光強度變化范圍和頻率)存在下培養原生生物。
[0025]光照期與黑暗期(或光強度減弱期)的接近的交替(這通常被視為對于原生生物來說是應激性的)令人驚奇地使得能夠獲得這樣的裂殖壺菌屬株系，其具有生物質、脂質和更特別地多不飽和脂肪酸和類胡蘿卜素的高產量。根據本發明的株系的這一使用打開了在從減小的光提供中受益的發酵罐中工業化生產多不飽和脂肪酸(特別是DHA)和類胡蘿卜素(特別是蝦青素)的前景，并因此應當使得能夠實現相對于先前所描述的培養方式而言的能量節約。
[0026]下面詳細說明本發明的各種不同的方面和優點。
[0027]發明詳述
[0028]因此，本發明的目標在于在隨時間不連續地和/或可變地進行光照的條件下以兼養方式培養網粘菌綱，尤其是破囊壺菌科，特別是裂殖壺菌屬的原生生物的方法。所述光照具有幅度通常在5 μ mol.m 2.s 1和1000 μ mol.m 2.s 1之間，優選地在30和400 μ mol.m 2.S1之間的強度變化。這些變化通常可以發生2至3600次/小時，優選地2至200次/小時。這些培養條件使得能夠提供確定量的光。該光提供可以包括不連續的和/或可變的光照期，其有著可以具有相同或不同幅度的強度變化。所述光照可以尤其以閃光形式。
[0029]該方法所具有的優點在于增加從培養獲得的生物質的產率。它所具有的優點還在于使經如此培養的原生生物富含多不飽和脂肪酸(更特別地，二十二碳六烯酸(DHA))和類胡蘿卜素(更特別地，蝦青素)。該方法還可以用于選擇網粘菌綱，尤其是破囊壺菌科和網粘菌科(Labyrinthulide)，特別是裂殖壺菌屬的株系，所述株系具有兼養特征并且具有多不飽和脂肪酸(尤其是DHA)和類胡蘿卜素(尤其是蝦青素)的高產率。
[0030]該原生生物的以兼養方式的培養優選地在10mM至1.5M，優選地300mM至1.2M，更優選地500mM至1M，和更加優選地600mM至900mM的有機含碳底物存在下施行。在培養期間連續地確保底物的提供，以便允許細胞積累重大濃度的脂質和類胡蘿卜素。在該培養方法期間向培養基添加額外的底物以維持恒定的濃度。該有機含碳底物優選地包括(以純的或混合物的形式):葡萄糖、纖維素衍生物、蔗糖和/或甘油。
[0031]包含在培養基中的有機含碳底物可以由復雜的分子或由底物混合物組成。來自淀粉的生物轉化(例如從玉米、小麥或馬鈴薯開始)的產物，尤其是由小尺寸的分子構成的淀粉水解物，例如構成了適合于根據本發明的原生生物的兼養培養的有機含碳底物。
[0032]更具體而言，該方法旨在利用網粘菌綱，特別是裂殖壺菌屬(門:粘菌門(Myxomycota),目:水霉目(Saprolegniales),科:破囊壺菌科)[ITIS Catalogue ofLife, 2010]的新株系，所述新株系因下列原因而被選擇:其兼養特征，和具有多不飽和脂肪酸(尤其是DHA)和類胡蘿卜素(尤其是蝦青素)的高產率，和尤其是其以高于10μ E的光提供，在富含有機成分的培養基，例如其中添加了有機含碳底物的經改良的Verduyn培養基(15g/L 海鹽，3g/L (NH4)2SO4,1g/L KH2PO4,0.5g/L MgSO4.7H20，24mg/L Na2EDTA, 3mg/LZnSO4.7H20，3mg/L MnCl2.2H20，0.04mg/L Na2MoO4.2H20, lOmg/L FeSO4.7H20，3.2mg/L 泛酸鹽，9.5mg/L鹽酸硫胺素，0.15mg/L維生素B12,0.lmL/L消泡劑)中進行培養的能力。優選地，所述有機含碳底物包括濃度等于或大于300mM的葡萄糖、甘油。
[0033]“株系”不僅是指裂殖壺菌屬的天然株系，而且還是指所述天然株系的突變體。
[0034]可以按照進一步描述的根據本發明的選擇和培養方法來分離和選擇出這些新的裂殖壺菌屬株系。
[0035]根據本發明的裂殖壺菌屬株系的代表性株系為由 申請人:分離并且以編號CCAP4087/1保藏于CCAP的株系FCC1104。當將它們根據本發明在可變地或不連續地提供光的情況下以兼養方式進行培養時，此類株系能夠產生顯著量的生物質以及脂質和類胡蘿卜素，和更特別地DHA和蝦青素。
[0036]根據現行的分類學分析，株系CCAP4087/1屬于裂殖壺菌屬。本發明涉及網粘菌綱，特別是裂殖壺菌屬的任何這樣的株系，其能夠在如在本申請中所描述的兼養培養條件下生長，并且能夠產生脂肪酸(例如DHA)和/或類胡蘿卜素(例如蝦青素)。本發明還涉及裂殖壺菌屬的任何這樣的原生生物物種，其能夠在如在本申請中所描述的兼養培養條件下生長，并且能夠產生脂肪酸(例如DHA)和類胡蘿卜素(例如蝦青素)。
[0037]根據本發明分離出的裂殖壺菌屬株系使得能夠在兼養條件下產生顯著量的生物質，以及脂質和類胡蘿卜素，所述脂質富含DHA，所述DHA可以占在所述原生生物中所包含的總脂質的大于40%，或大于50%，或大于60%;和所述類胡蘿卜素富含蝦青素，所述蝦青素可以相對于干物質的總重量而言占大于0.1重量％，或大于0.15重量％，或大于0.2重量％。所述株系可以達到大于0.015mg/L/小時，或大于0.020mg/L/小時，或大于0.025mg/L/小時的生產率水平(所產生的目的產物的量/升培養物/小時)。
[0038]在本發明中，在兼養條件下在可變的和/或不連續的光照(尤其是以閃光形式)存在下進行培養的裂殖壺菌屬株系(例如，由 申請人:分離出的株系FCC1104)使得能夠生產蝦青素。相反地，在異養條件下，檢測不到任何蝦青素。此外，根據本發明的某些實施方案以兼養方式獲得的生物質的量等于或甚至高于(例如，大約10-18%)在異養條件下所獲得的量。“異養條件”是指具有相同的培養基但不存在光的培養條件。
[0039]因此，本發明的目標在于在存在隨時間可變地或不連續地進行光照(例如以閃光形式)的情況下以兼養方式培養網粘菌綱，尤其是破囊壺菌科，特別是裂殖壺菌屬，尤其是所保藏的裂殖壺菌屬物種的原生生物株系的方法，尤其為了生產多不飽和脂肪酸和類胡蘿卜素，例如DHA和奸青素。
[0040]因此，本發明的目標在于在存在隨時間可變地和/或不連續地進行光照的情況下選擇網粘菌綱，尤其是破囊壺菌科和網粘菌科，特別是裂殖壺菌屬，尤其是所保藏的裂殖壺菌屬物種的原生生物株系的方法，所述原生生物株系具有兼養特征，并且具有多不飽和脂肪酸和類胡蘿卜素(例如DHA和蝦青素)的高產率。
[0041]看來培養物的可變的和/或不連續的光照(特別是在以兼養方式進行培養中)對于原生生物的發育具有有利的影響，并且使得能夠增加原生生物的生產率，尤其是關于其產生脂質和類胡蘿卜素方面。并不束縛于該理論，發明人估計，向原生生物不連續地和/或可變地提供光的效應在于引起對于生長和對于脂質的合成以及對于類胡蘿卜素的合成有利的“應激”。該現象可以部分地通過這樣的事實而得到解釋:在自然界中，原生生物具有積累脂質和類胡蘿卜素儲備物以抵抗其環境的限制的傾向。
[0042]“不連續的光照”應當理解為由黑暗期隔斷的光照。黑暗期可以占超過四分之一的在其期間對藻類進行培養的時間，優選地一半的時間或更多。
[0043]根據本發明的一個優選的方面，所述光照是不連續的，和更優選地以閃光形式。在本發明的范圍內，“閃光”是具有短的持續時間(即少于30分鐘)的光照射。持續時間可以少于15分鐘,優選地少于5分鐘,或更加優選地少于I分鐘。按照本發明的某些實施方案，閃光的持續時間可以少于I秒鐘。例如，閃光的持續時間可以為一秒鐘的1/10，或一秒鐘的2/10，或一秒鐘的3/10，或一秒鐘的4/10，或一秒鐘的5/10，或一秒鐘的6/10，或一秒鐘的7/10，或一秒鐘的8/10，或一秒鐘的9/10。光照射，或閃光，通常具有超過15秒鐘的持續時間。它通常為5秒鐘至10分鐘，優選地10秒鐘至2分鐘，更優選地20秒鐘至I分鐘。
[0044]通常，閃光次數為大約2至3600次/小時。它可以例如為100至3600次閃光/小時。它還可以為120至3000次閃光/小時，或400至2500次閃光/小時，或600至2000次閃光/小時，或800至1500次閃光/小時。它還可以為2至200次/小時，優選地10至150次/小時，更優選地15至100次/小時，和更加優選地20至50次/小時。閃光可以在時間上以規律的或不規律的間隔進行發射。在以規律的間隔進行發射的情況下，那么閃光次數/小時相應于具有時間段(T)的頻率(F)，認為F = 1/T。該時間段可以為I秒鐘至30分鐘，或I秒鐘至36秒鐘，或者1.2秒鐘至30秒鐘，或1.44秒鐘至9秒鐘，或1.8秒鐘至6秒鐘，或2.4秒鐘至4.5秒鐘。該頻率還可以為18秒鐘至30分鐘,優選地24秒鐘至6分鐘，更優選地36秒鐘至4分鐘，和更加優選地72秒鐘至3分鐘。根據閃光的強度和持續時間來選擇閃光次數/小時(參見下面)。通常，以閃光形式提供的光的強度為5至1000 μ mol.m 2.s S 優選地 5 至 500 μ mol.m 2.s S 或 50 至 400 μ mol.m 2.s S 和更優選地 150至300 μ mol.m_2.s—1。I μ mol.m_2.s—1相應于I μ E.m_2.s—1 (愛因斯坦),這是在文獻中經常使用的單位。
[0045]根據本發明的一個特別的實施方案，光的強度為50至200 μ mol.m_2.s—1，閃光頻率的時間段為10秒鐘至60分鐘，對于I秒鐘至I分鐘的閃光持續時間。
[0046]根據本發明的另一個實施方案，所述光照可以是可變的，這意味著光照不被黑暗期間斷，但光強度隨時間而變化。光強度的該變化是有規律的，并且可以是周期性的或循環的。根據本發明，也可以進行聯合了連續的和不連續的光照期的光提供。
[0047]根據本發明，無論光照條件是什么，以光子的微摩爾數/秒/平方米(μ mol.m_2.s—1)表示的向培養中的藻類提供的光強度在同一個小時內變化至少一次。該光強度變化的幅度通常在5和1000 μ mol.π-2.s_1之間，或在50和800 μ mol.π-2.s_1之間，或在100和600 μ mol.m_2.s—1之間。光的強度還可以在5和400 μ mol.m_2.s—1之間變化。優選地，光強度變化的幅度在70和300 μ mol.m_2.s—1之間，和更優選地在100和200 μ mol.m_2.s—1之間。
[0048]在可變的光照的條件下，所述光強度可以連續地達到例如50 μ mo 1.m_2.s—1和100 μ mol.m_2.s—1 這些值，或 5 和 400 μ mol.m_2.s—1 這些值，或 50 和 800 μ mol.m_2.s—1 這些值，每個小時數次。優選地，所述光強度可以連續地達到50和200 μ mol.m_2.s—1這些值。備選地，在不連續的光照的條件下，所述光強度可以連續地達到例如O和50 μ mol.m_2.s—1這些值，O和100 μ mol.m-2.S-1這些值，或更加優選地O和200 μ mol.m-2.s_1這些值，在一小時內數次。它還可以連續地達到例如O和300 μ mol.m-2.s_1這些值，O和600 μ mol.m02.s_1這些值，O和800 μ mol.m_2.s—1這些值，或者O和1000 μ mol.m_2.s—1這些值，在一小時內數次。
[0049]根據本發明的一個實施方案和無論光照條件是什么，向培養物提供的光的強度隨著細胞密度而變化。培養物變得越稠密，光可以越強。細胞密度是細胞數目/ml，并且按照本領域技術人員已知的技術進行測量。
[0050]在培養的初始階段，當細胞密度為大約15至5X 15個細胞/ml時，光強度可以為5至15 μ mol.m-2.s4,優選地5至10 μ mol.m-2.s'當培養物達到16至17個細胞/ml的密度時，可以增加光強度直至15至200 μ mol.m-2.s—1，例如，優選地，20至50 μ mol.m-2.s—1。當培養物在最后階段達到17至18個細胞/ml的密度時，可以增加光強度直至50至700 μ mol.m 2.s S 例如，優選地，50 至 150 μ mol.m 2.s 1O
[0051]根據某些實施方案,例如，當閃光的持續時間為例如少于一分鐘或少于一秒鐘時，光的強度可以比上面所提及的值更大。在培養的初始階段，當細胞密度為大約15至5X 15個細胞/ml時，光強度可以為5至200 μ mol.m-2.s'優選地5至100 μ mol.m-2.s'當培養物達到16至17個細胞/ml的密度時，可以增加光強度直至30至500 μ mol.m_2.s—1，例如，優選地，在50至400 μ mol.m_2.s'當培養物在最后階段達到17至18個細胞/ml的密度時，可以增加光強度直至100至1000 μ mol.m-2.s'例如,優選地,200至500 μ mol.m-2.s'
[0052]根據本發明的一個實施方案，在一小時內向培養物提供的光量保持在某些值之間。它為大約2000至600000 μ mol.m-2，優選地2000至300000 μ mol.m-2。它可以為大約4000 至 200000 μ mol.m-2/ 小時。
[0053]根據本發明的一個實施方案，用30次閃光/小時對培養物進行照明，其中每一次閃光具有30秒鐘的持續時間和10 μ mol.m_2.s—1的強度。該強度給出9000 μ mol.m_2的總的光提供/小時。根據本發明的另一個實施方案，用20次閃光/小時對培養物進行照明，其中每一次閃光具有30秒鐘的持續時間和20 μ mol.m_2.s—1的強度。該強度給出12000 μ mol.m_2的總的光提供/小時。根據本發明的另一個實施方案，用45次閃光/小時對培養物進行照明，其中每一次閃光具有15秒鐘的持續時間和5 μ mol.m_2.s—1的強度，這給出3375 μ mol.m-2的總的光提供/小時。
[0054]根據本發明的另一個實施方案，用120次閃光/小時對培養物進行照明，其中每一次閃光具有10秒鐘的持續時間和200 μ mol.m_2.s—1的強度，這給出240000 μ mol.m_2的總的光提供/小時。
[0055]如上面對于光強度所描述的，和根據本發明的一個實施方案，每小時向培養物提供的光量可以隨著細胞密度而變化。在培養的初始階段，當細胞密度為15至5X 15個細胞/ml時，在一小時內的總的光提供通常為大約1500至8000 μ mol.m_2，優選地1500至6000μπιο1.m-2，更優選地2000至5000 μ mol.m-2。當培養物達到16至17個細胞/ml的密度時，可以增加在一小時內的總的光提供直至例如6000至67000 μ mol.m-2，優選地6000至50000 μ mol.m-2，和更優選地12000至45000 μ mol.m-2。在培養的最后階段，在17至18個細胞/ml的細胞密度的情況下，可以增加在一小時內的總的光提供直至45000至300000 μ mol.m-2，例如優選地45000至200000 μ mol.m-2，和例如更優選地50000至150000 μ mol.m2。
[0056]根據本發明的一個實施方案，在培養的初始階段(在15至5X 15個細胞/ml的細胞密度的情況下)，用30次閃光/小時對培養物進行照明，其中每一次閃光具有30秒鐘的持續時間和5至10 μ mol.Hi2-S1的強度，這給出2250 μ mol.m 2至4500 μ mol.m 2的總的光提供/小時。然后，在中間階段(在16至17個細胞/ml的細胞密度的情況下)，用30次閃光/小時對培養物進行照明，其中每一次閃光具有30秒鐘的持續時間和15至50 μ mol.m_2.s—1的強度,這給出13500至45000 μ mol.m_2的總的光提供/小時。然后，在培養的最后階段(在17至18個細胞/ml的細胞密度的情況下)，用30次閃光/小時對培養物進行照明，其中每一次閃光具有30秒鐘的持續時間和50至150 μ mol.m_2.s—1的強度，這給出45000至135000 μ mol.m_2的總的光提供/小時。
[0057]根據本發明的一個實施方案，例如當閃光的持續時間為例如少于一分鐘或少于一秒鐘時，在培養的初始階段(在15至5 X 15個細胞/ml的細胞密度的情況下)，用30次閃光/小時對培養物進行照明，其中每一次閃光具有10秒鐘的持續時間和50至100 μ mol.m_2.s-1的強度，這給出15000 μ mol.m_2至30000 μ mol.m_2的總的光提供/小時。然后，在中間階段(在16至17個細胞/ml的細胞密度的情況下)，用50次閃光/小時對培養物進行照明，其中每一次閃光具有10秒鐘的持續時間和200至300 μ mol.m_2.s—1的強度，這給出100000至150000 μ mol.m_2的總的光提供/小時。然后，在培養的最后階段(在17至18個細胞/ml的細胞密度的情況下)，用120次閃光/小時對培養物進行照明，其中每一次閃光具有10秒鐘的持續時間和350至450 μ mol.π2.s_1的強度，這給出420000至540000 μ mol.π2的總的光提供/小時。
[0058]在培養物中的光提供可以通過分布在發酵罐外壁周圍的燈來獲得。一個時鐘以確定的光照時間開啟這些燈。發酵罐優選地位于可以控制其環境溫度的避開日光的圍殼中。
[0059]正如 申請人:已經能夠看到的，如此選擇出的株系具有良好的在不連續的和/或可變的光存在下以兼養方式生長的能力這一事實使得所述株系具有更多地產生多不飽和脂肪酸和類胡蘿卜素(尤其是DHA和蝦青素)的傾向。
[0060]因此，根據本發明的培養方法使得能夠選擇網粘菌綱，尤其是破囊壺菌科，特別是裂殖壺菌屬的株系，所述株系具有兼養特征，與由 申請人:分離并以編號CCAP4087/1保藏于CCAP的那種相似，并且具有多不飽和脂肪酸和類胡蘿卜素的高產率。該培養方法的特征在于，所述方法包括下列步驟:
[0061]a)在隨時間不連續地和/或可變地進行光照的條件下以兼養方式培養網粘菌綱，特別是裂殖壺菌屬的一種或多種株系，所述光照具有幅度在5 μ mol.π2.s_1和1000 μ mol.m_2.s—1之間，優選地在5和400 μ mol.m_2.s—1之間的強度變化，這些變化發生2至3600次/小時，優選地5至400次/小時；
[0062]b)在培養基中在有機含碳底物存在下維持所述培養物經過幾代的步驟；和任選地
[0063]c)回收經如此培養的原生生物的步驟。
[0064]更具體地，回收步驟是指分離其細胞數目在所述代期間增長最多的株系。
[0065]為了進行株系的選擇，可以在同一圍殼中的微量培養板上平行地培養網粘菌綱，尤其是破囊壺菌科，特別是裂殖壺菌屬的各種不同的株系，其中精確監測條件和不同培養物的發展。因此，容易知道不同株系對于不連續的和/或可變的光照的應答，和在需要時，對于在培養基中添加一種或多種有機含碳底物的應答。對于不連續的和/或可變的光照和對于有機含碳底物有利地作出應答的株系通常在質量(在脂質譜中更豐富的多不飽和脂肪酸，和在類胡蘿卜素之中更豐富的蝦青素)和數量(脂質包含更高比例的DHA，和干物質包含更高比例的蝦青素)方面為類胡蘿卜素和脂質的生產提供了更好的產率。
[0066]可以用兼養培養的條件，從異質的并且人們尋求從其中選擇出通過根據本發明的選擇方式(聯合了不連續的和/或可變的光，其具有特定的光強度范圍和頻率)而獲益的變體的群體開始，在發酵罐中選擇原生生物。在該情況下，通過維持原生生物處于培養狀態經過許多代來施行培養，然后在培養結束之后實施變成為在培養基中占多數的組分的分離。
[0067]根據本發明的培養方法還使得能夠生產脂質和類胡蘿卜素。
[0068]在該情況下，根據本發明的方法此外還包括下列步驟:
[0069]d)回收原生生物的疏水物質的步驟；和任選地
[0070]e)從所回收的疏水物質中提取DHA(二十二碳六烯酸)和蝦青素。
[0071]這是因為，所述疏水物質包含脂質和類胡蘿卜素。
[0072]根據本發明的培養方法還可以應用于能夠在根據本發明的兼養條件下生長并且能夠產生DHA和蝦青素的裂殖壺菌屬的任何物種。
[0073]根據本發明的培養方法使得能夠優化從培養物獲得的生物質的生產。它還使得能夠使經如此培養的原生生物富含多不飽和脂肪酸和類胡蘿卜素，更特別地富含二十二碳六烯酸(DHA)和蝦青素。
[0074]因此，本發明的目標還在于生物質的生產，以及脂質和類胡蘿卜素，尤其是脂肪酸的生產，其通過培養具有兼養特征的裂殖壺菌屬的原生生物(所述原生生物優選地按照前面所針對的方法進行培養或選擇)，然后回收經如此培養的原生生物以從中提取疏水內容物，特別是脂質(包括DHA)和類胡蘿卜素(包括蝦青素)。
[0075]脂質(包括DHA)的選擇性提取方法是本領域技術人員已知的，并且例如由[Bligh, E.G.和 Dyer, W.J.(1959), A rapid method of total lipid extract1n andpurificat1n, Can.J.B1chem.Phys1l., 37:911-917]作了描述。
[0076]類胡蘿卜素(包括葉黃素)的提取和分析方法是本領域技術人員已知的，并且例如由 Wright 等人(1991) (S.ff.Wright, S.ff.Jeffrey, R.F.C.Mantoura, C.A.Llewellyn, T.Bjornland, D.Repeta, N.Welschmeyer:1mproved HPLC method for the analysis ofchlorophylls and carotenoids from marine phytoplankton.Marine ecology progressseries,第 77 卷，183-196，1991)作了描述。
[0077]本發明還涉及網粘菌綱，尤其是網粘菌科和破囊壺菌科，特別是裂殖壺菌屬的原生生物株系，其能夠按照前面所描述的本發明的方法來獲得。這些原生生物富含多不飽和脂肪酸和類胡蘿卜素。此類原生生物的總脂質通常包含大于40%，或大于50%，或大于60%的DHA，相對于脂質的總百分比而言。根據本發明的一個實施方案，此類原生生物所包含的蝦青素可以占大于0.1重量％，或大于0.15重量％，或大于0.2重量％，相對于干物質的總重量而言。因此，根據本發明的一個實施方案的原生生物可以具有大于0.015mg/L/小時，或大于0.020mg/L/小時，或大于0.025mg/L/小時的蝦青素生產率(所產生的目的產物的量/升培養物/小時)。
[0078]實施例1
[0079]在具有專用的自動裝置和經由信息處理站的監管的有用的1-2L的發酵罐(生物反應器)中進行裂殖壺菌屬物種的培養。通過添加堿(2N的氫氧化鈉溶液)和/或酸(IN的硫酸溶液)來調節該系統的pH。將培養溫度固定在26°C。借助于根據Rushton結構安置在樞軸上的3個攪拌活動體(下行式泵送的三槳葉螺旋槳)來進行攪拌。通過攪拌速度(250-600rpm)、空氣流量(0.25-lvvm)或甚至氧氣流量(0.1-0.5vvm)，在整個培養過程中在培養基中調節溶解氧的壓力。整合在監管自動裝置中的調節參數使得能夠維持15 %的恒定的p02。該生物反應器裝配有圍繞透明槽的外部照明系統。光的強度以及循環數由專用的自動裝置進行控制并且由信息處理站進行監管。
[0080]用在恒溫的(26°C )且以100至200 μ E進行光照的圍殼中在搖動臺(140rpm)上實現的預培養物接種反應器。預培養和在生物反應器中的培養在經改良的Verduyn培養基(15g/L 海鹽，3g/L (NH4)2SO4,1 g/L KH2PO4,0.5g/L MgSO4.7H20，24mg/L Na2EDTA, 3mg/LZnSO4.7H20，3mg/L MnCl2.2H20，0.04mg/L Na2MoO4.2H20, lOmg/L FeSO4.7H20，3.2mg/L 泛酸鹽，9.5mg/L鹽酸硫胺素，0.15mg/L維生素B12)中進行。用于在生物反應器中以常規的兼養形式、以異養形式和以閃光(可變的/不連續的光)+兼養形式進行培養的含碳底物是濃度為300mM至IM的葡萄糖。
[0081]培養物的監測:
[0082]總生物質的濃度通過測量干質量(在濾器GF/F，Whatman上進行過濾，然后在稱重之前，在105°C下，在烘箱中干燥最少24小時)來進行監測。
[0083]關于總脂質的定量，提取18個細胞/mL。脂質的提取方法是本領域技術人員已知的。
[0084]為了定量類胡蘿卜素(尤其是蝦青素)，提取18個細胞/mL。類胡蘿卜素(包括蝦青素)的提取和分析方法是本領域技術人員已知的。
[0085]光照(對于以兼養形式的培養):
[0086]用30次閃光/小時對培養物進行照明，其中每一次閃光具有30秒鐘的持續時間和 80 μ mol.Hi2-S1 的強度。
[0087]在生物反應器中在培養物中的光提供通過分布在發酵罐外壁周圍的LED (發光電二極管)燈來獲得。一個時鐘以光照時間或者脈沖(對于以閃光(具有不連續的光)+兼養形式的培養)開啟這些LED。
[0088]結果(η= 3):
【權利要求】
1.一種方法，其包括下述步驟: a)在隨時間不連續地和/或可變地進行光照的條件下以兼養方式培養裂殖壺菌屬(Schizochytrium)的一種或多種株系，所述光照具有幅度在5 μ mol.π2.s_1和1000 μ mol.m_2.s—1之間的強度變化，這些變化發生2至3600次/小時。
2.根據權利要求1的方法，其特征在于，所述光照具有幅度在δμ mol.π--1和400 μ mol.m_2.s—1之間的強度變化，這些變化發生2至200次/小時。
3.根據權利要求1或2的方法，其特征在于，所述培養在濃度為10mM至1.5M，優選地300mM至1.2M，更優選地500mM至1M，和更加優選地600mM至900mM的有機含碳底物存在下進行，所述有機含碳底物選自蔗糖、甘油、葡萄糖和纖維素衍生物以及這些分子的混合物。
4.根據權利要求3的方法,其特征在于,存在于培養基中的所述有機含碳底物包括至少300mM的葡萄糖和/或甘油。
5.根據權利要求1至4中任一項的方法，其特征在于，所述強度變化的幅度在5和1000 μ mol.π2.s_1之間，優選地在70和300 μ mol.π2.s_1之間，和更優選地在100和200 μ mol.m 2.s 1 之間。
6.根據權利要求1至5中任一項的方法，其特征在于，以閃光形式來提供光。
7.根據權利要求6的方法，其特征在于，所述閃光具有1/10秒鐘至10分鐘，優選地5秒鐘至10分鐘，更優選地10秒鐘至2分鐘，更加優選地20秒鐘至I分鐘的持續時間。
8.根據權利要求6或權利要求7的方法，其特征在于，所述閃光次數為5至3600次/小時，優選地10至150次/小時，優選地15至100次/小時，和更優選地20至50次/小時。
9.根據權利要求1至6中任一項的方法,其特征在于，以光子的微摩爾數表不的每小時的總的光提供量為2000至600000 μ mol.π2，優選地2000至200000 μ mol.π2。
10.根據權利要求1至9中任一項的方法，其特征在于，所述方法還包含下列步驟: b)在培養基中在有機含碳底物存在下維持所述培養物經過幾代的步驟，和任選地 c)回收經如此培養的原生生物的步驟，和任選地 d)回收疏水物質的步驟，和任選地 e)從所回收的疏水物質中提取DHA(二十二碳六烯酸)和蝦青素。
11.根據權利要求1至10中任一項的方法，其特征在于，所述裂殖壺菌屬的原生生物相應于以編號CCAP4087/1保藏于CCAP (藻類和原生動物培養物保藏中心)的株系FCCl 104。
12.能夠通過根據權利要求1至11中任一項的方法而獲得的裂殖壺菌屬的原生生物。
13.根據權利要求12的裂殖壺菌屬的原生生物，其特征在于，所述裂殖壺菌屬的原生生物的總脂質包含相對于脂質的總％而言大于40%，或大于50%，或大于60%的DHA，并且所述裂殖壺菌屬的原生生物包含相對于干物質的總重量而言大于0.1重量％，或大于0.15重量％，或大于0.2重量％的蟲下青素。
14.根據權利要求12或13的裂殖壺菌屬的原生生物，其具有大于0.015mg/L/小時，或大于0.020mg/L/小時，或大于0.025mg/L/小時的生產率。
【文檔編號】C12P23/00GK104185678SQ201380014163
【公開日】2014年12月3日 申請日期:2013年3月15日 優先權日:2012年3月16日
【發明者】K·羅馬里, A·勒莫尼耶, C·羅爾斯, C·梅萊, J·帕格利亞迪尼, P·卡勒雅, C·居丹 申請人:費爾曼塔格公司