具有內(nèi)切葡聚糖酶活性的多肽和編碼該多肽的多核苷酸的制作方法【專利摘要】本發(fā)明涉及具有內(nèi)切葡聚糖酶活性的分離的多肽、催化域、纖維素結(jié)合域和編碼所述多肽、催化域、或纖維素結(jié)合域的多核苷酸。本發(fā)明還涉及包含所述多核苷酸的核酸構(gòu)建體、載體和宿主細(xì)胞，以及生成和使用所述多肽、催化域、或纖維素結(jié)合域的方法。【專利說(shuō)明】具有內(nèi)切葡聚糖酶活性的多肽和編碼該多肽的多核苷酸[0001]涉及序列表[0002]本申請(qǐng)包含計(jì)算機(jī)可讀形式的序列表，其通過(guò)提及并入本文。[0003]涉及生物材料的保藏物[0004]本申請(qǐng)含有生物材料保藏物的提及，該保藏物通過(guò)提及并入本文。[0005]發(fā)明背景【
技術(shù)領(lǐng)域：
】[0006]本發(fā)明涉及具有內(nèi)切葡聚糖酶活性的多肽，催化域，和內(nèi)切葡聚糖酶結(jié)合域，和編碼所述多肽，催化域，和內(nèi)切葡聚糖酶結(jié)合域的多核苷酸。本發(fā)明亦涉及包含所述多核苷酸的核酸構(gòu)建體、載體和宿主細(xì)胞，以及產(chǎn)生和使用所述多肽，催化域，和內(nèi)切葡聚糖酶結(jié)合域的方法。【
背景技術(shù)：
】[0007]纖維素是簡(jiǎn)單糖葡萄糖通過(guò)β-l，4-鍵共價(jià)連接的聚合物。許多微生物產(chǎn)生水解β_連接的葡聚糖的酶，諸如纖維素酶。纖維素酶包括內(nèi)切葡聚糖酶、纖維二糖水解酶和β-葡糖苷酶。內(nèi)切葡聚糖酶在隨機(jī)位置消化纖維素聚合物，使其暴露于纖維二糖水解酶攻擊（attack)。纖維二糖水解酶從纖維素聚合物的末端順序地釋放纖維二糖的分子。纖維二糖是水溶性的β-1，4-連接的葡萄糖二聚體。β-葡糖苷酶將纖維二糖水解成葡萄糖。[0008]纖維素酶有一大批工業(yè)應(yīng)用。在紡織品產(chǎn)業(yè)中，纖維素酶在勞動(dòng)布修整中用于在生物打磨（biostoning)工藝中在勞動(dòng)布衣服中產(chǎn)生流行的砂洗外觀。纖維素酶還用于例如清潔細(xì)毛，并且防止棉衣表面上形成小球。[0009]W09629397公開(kāi)了具有內(nèi)切葡聚糖酶活性的來(lái)自擬刺盤(pán)抱周刺座霉（Volutellacolletotrichoides)的多膚。[0010]本發(fā)明提供了具有內(nèi)切葡聚糖酶活性的多肽及編碼該多肽的多核苷酸。[0011]發(fā)明概述[0012]本發(fā)明涉及具有內(nèi)切葡聚糖酶活性的分離的多肽，其選自下組：[0013](a)多肽，其與SEQIDN0:2的成熟多肽具有至少80%序列同一性；[0014](b)多肽，其由多核苷酸編碼，該多核苷酸在中等，中等-高，高、或非常高嚴(yán)格條件下與以下雜交：（i)SEQIDN0:1的成熟多肽編碼序列，（ii)其cDNA序列，或（iii)(i)或(ii)的全長(zhǎng)互補(bǔ)物；[0015](C)多肽，其由多核苷酸編碼，所述多核苷酸與SEQIDNO:1或其cDNA序列的成熟多肽編碼序列具有至少80%序列同一性；[0016](d)SEQIDN0:2的成熟多肽的變體，其在一個(gè)或多個(gè)（例如幾個(gè)）位置包含取代、缺失和/或插入；和[0017](e)(a)，（b)，（c)，或（d)的多肽的片段，其具有內(nèi)切葡聚糖酶活性。[0018]本發(fā)明還涉及包含催化域的分離的多肽，所述催化域選自下組：[0019](a)催化域，其與SEQIDNO:2的氨基酸17至232具有至少80%序列同一性；[0020](b)催化域，其由多核苷酸編碼，該多核苷酸在中等，中等-高、高、或非常高嚴(yán)格條件下與以下雜交：（i)SEQIDN0:1的核苷酸49至953,（ii)其cDNA序列，或或（ii)的全長(zhǎng)互補(bǔ)物；[0021](C)催化域，其由多核苷酸編碼，所述多核苷酸與SEQIDNO:1或其cDNA序列的核苷酸49至953具有至少80%序列同一性；[0022](d)SEQIDN0:2的氨基酸17至232的變體，其在一個(gè)或多個(gè)（例如幾個(gè)）位置包含取代、缺失和/或插入；和[0023](e)(a)，（b)，（c)，或（d)的催化域的片段，其具有內(nèi)切葡聚糖酶活性。[0024]本發(fā)明還涉及包含纖維素結(jié)合域的分離的多肽，所述結(jié)合域選自下組：[0025](a)纖維素結(jié)合域，其與SEQIDN0:2的氨基酸267至305具有至少80%序列同一I"生；[0026](b)纖維素結(jié)合域，其由多核苷酸編碼，該多核苷酸在中等，中等-高、高、或非常高嚴(yán)格條件下與以下雜交：（i)SEQIDNO:1的核苷酸1056至1172,（ii)其cDNA序列，或(iii)(i)或（ii)的全長(zhǎng)互補(bǔ)物；[0027](c)纖維素結(jié)合域，其由多核苷酸編碼，所述多核苷酸與SEQIDN0:1或其cDNA序列的核苷酸1056至1172具有至少80%序列同一性；[0028](d)SEQIDN0:2的氨基酸267至305的變體，其在一個(gè)或多個(gè)（例如幾個(gè)）位置包含取代、缺失和/或插入；和[0029](e)(a)，（b)，（c)，或（d)的纖維素結(jié)合域的片段，其具有結(jié)合活性。[0030]本發(fā)明還涉及編碼本發(fā)明多肽的分離的多核苷酸；包含該多核苷酸的核酸構(gòu)建體；重組表達(dá)載體；重組宿主細(xì)胞；和生成多肽的方法。[0031]本發(fā)明還涉及用本發(fā)明的具有內(nèi)切葡聚糖酶活性的酶處理紡織品的方法。[0032]本發(fā)明還涉及編碼包含或組成為SEQIDN0:2的氨基酸1至16的信號(hào)肽的多核苷酸，其與編碼蛋白質(zhì)的基因可操作連接；包含該多核苷酸的核酸構(gòu)建體，表達(dá)載體，和重組宿主細(xì)胞；和生成蛋白質(zhì)的方法。[0033]定義[0034]內(nèi)切葡聚糖酶：術(shù)語(yǔ)"內(nèi)切葡聚糖酶"意指內(nèi)切-1，4-(1，3;l，4)-i3-D_葡聚糖葡聚糖水解酶（end〇-l，4-β-D-glucan4-glucanohydrolase)￠.C.3.2.1.4)，其催化纖維素、纖維素衍生物（例如羧甲基纖維素和羥乙基纖維素）、地衣淀粉（lichenin)中的l，4-i3-D-糖苷鍵、混合的β-1，3葡聚糖例如谷類β-D-葡聚糖或木葡聚糖和含有纖維素組分的其它植物材料中的β-1，4鍵的內(nèi)水解（endohydrolysis)。內(nèi)切葡聚糖酶活性可通過(guò)測(cè)量底物粘度的減少或由還原糖測(cè)定法（Zhang等，2006,BiotechnologyAdvances24:452-481)確定的還原端增加來(lái)確定。出于本發(fā)明的目的，根據(jù)Ghose，1987，PureandAppl.Chem.59:257-268的第264頁(yè)中部分VI的方法，使用羧甲基纖維素（CMC)作為底物來(lái)確定內(nèi)切葡聚糖酶活性。[0035]本發(fā)明的多肽具有SEQIDN0:2的成熟多肽的內(nèi)切葡聚糖酶活性的至少80%，至少85%，至少90%，至少95%，至少96%，至少97%，至少98%，至少99%，或至少100%。[0036]等位變體（allelicvariant):術(shù)語(yǔ)"等位變體"意指占據(jù)相同染色體基因座的基因的任何兩種或更多種可選形式。等位變異通過(guò)突變天然地發(fā)生，并且可導(dǎo)致種群內(nèi)的多態(tài)性。基因突變可以是沉默的（在編碼的多肽中無(wú)變化）或可以編碼具有改變的氨基酸序列的多肽。多肽的等位變體是由基因的等位變體編碼的多肽。[0037]結(jié)合域：術(shù)語(yǔ)"纖維素結(jié)合域"意指介導(dǎo)酶對(duì)纖維素底物的無(wú)定形區(qū)的結(jié)合的酶的區(qū)域。纖維素結(jié)合域（CBD)通常見(jiàn)于內(nèi)切葡聚糖酶的N末端或C末端。[0038]催化域：術(shù)語(yǔ)"催化域"意指含有酶的催化機(jī)構(gòu)（catalyticmachinery)的酶的區(qū)域。[0039]cDNA:術(shù)語(yǔ)"cDNA"意指能夠通過(guò)反轉(zhuǎn)錄從得自真核或原核細(xì)胞的成熟的、已剪接的mRNA分子制備得到的DNA分子。cDNA缺少通常存在于相應(yīng)基因組DNA中的內(nèi)含子序列。最初的（initial)初級(jí)RNA轉(zhuǎn)錄物是mRNA的前體，其通過(guò)一系列的步驟加工包括剪接，然后作為成熟的已剪接的mRNA出現(xiàn)。[0040]編碼序列：術(shù)語(yǔ)"編碼序列"意指直接指定多肽的氨基酸序列的多核苷酸。編碼序列的邊界通常由開(kāi)放閱讀框決定，所述開(kāi)放閱讀框以起始密碼子如ATG、GTG或TTG開(kāi)始，并且以終止密碼子如TAA、TAG或TGA結(jié)束。編碼序列可以是基因組DNA、cDNA、合成DNA或其組合。[0041]調(diào)控序列（controlsequence):術(shù)語(yǔ)"調(diào)控序列"意指對(duì)編碼本發(fā)明的成熟多肽的多核苷酸表達(dá)是必需的核酸序列。各個(gè)調(diào)控序列對(duì)于編碼所述成熟多肽的多核苷酸可以是天然的（即，來(lái)自同一基因）或外源的（即，來(lái)自不同基因），或各個(gè)調(diào)控序列對(duì)于彼此可以是天然的或外源的。這些調(diào)控序列包括但不限于前導(dǎo)序列、聚腺苷酸化序列、前肽序列、啟動(dòng)子、信號(hào)肽序列和轉(zhuǎn)錄終止子。至少，調(diào)控序列包括啟動(dòng)子和轉(zhuǎn)錄和翻譯的終止信號(hào)。調(diào)控序列可以配備用于引入特異性限制位點(diǎn)的接頭，所述特異性限制位點(diǎn)促進(jìn)調(diào)控序列與編碼多肽的多核苷酸編碼區(qū)的連接。[0042]表達(dá)：術(shù)語(yǔ)"表達(dá)"包括涉及多肽產(chǎn)生的任何步驟，其包括但不限于轉(zhuǎn)錄、轉(zhuǎn)錄后修飾、翻譯、翻譯后修飾和分泌。[0043]表達(dá)載體：術(shù)語(yǔ)"表達(dá)載體"意指線性的或環(huán)狀的DNA分子，其包含編碼多肽的多核苷酸，并且所述多核苷酸與提供用于其表達(dá)的調(diào)控序列可操作地連接。[0044]片段：術(shù)語(yǔ)"片段"意指從成熟多肽或域的氨基和/或羧基末端缺失一個(gè)或多個(gè)(例如幾個(gè)）氨基酸的多肽或催化域或纖維素結(jié)合域；其中所述片段具有內(nèi)切葡聚糖酶活性或纖維素結(jié)合活性。在一個(gè)方面，片段含有SEQIDN0:2的成熟多肽的氨基酸數(shù)目的至少85%，90%，和95%。[0045]高嚴(yán)格條件：術(shù)語(yǔ)"高嚴(yán)格條件"意指對(duì)于長(zhǎng)度至少100個(gè)核苷酸的探針，在42°C，在5XSSPE、0.3%SDS、200微克/ml已剪切并且變性的鮭精DNA和50%的甲酰胺中，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)的Southern印跡法進(jìn)行預(yù)雜交和雜交12至24小時(shí)。使用2XSSC、0.2%SDS在65°C將載體材料最終洗滌三次，每次15分鐘。[0046]宿主細(xì)胞：術(shù)語(yǔ)"宿主細(xì)胞"意指適合于使用包含本發(fā)明多核苷酸的核酸構(gòu)建體或表達(dá)載體進(jìn)行轉(zhuǎn)化、轉(zhuǎn)染、轉(zhuǎn)導(dǎo)等的細(xì)胞類型。術(shù)語(yǔ)"宿主細(xì)胞"涵蓋親本細(xì)胞的任何由于在復(fù)制中發(fā)生的突變而不同于親本細(xì)胞的后代。[0047]分離的：術(shù)語(yǔ)"分離的"意指以不在自然界出現(xiàn)的形式或環(huán)境存在的物質(zhì)。分離的物質(zhì)的非限定性實(shí)例包括（1)任何非天然存在的物質(zhì)，（2)任何至少部分地與一種或多種或全部與其天然伴隨的天然存在的成分脫離的物質(zhì)，包括但不限于任何酶、變體、核酸、蛋白質(zhì)、肽或輔因子；（3)任何相對(duì)于自然界中所見(jiàn)的該物質(zhì)而言經(jīng)過(guò)了人工修飾的物質(zhì)；或(4)任何通過(guò)相對(duì)于與其天然伴隨的其他組分增加該物質(zhì)的量（例如，編碼該物質(zhì)的基因的多拷貝；以及使用比與編碼該物質(zhì)的基因天然伴隨的啟動(dòng)子更強(qiáng)的啟動(dòng)子）而修飾的物質(zhì)。分離的物質(zhì)可以存在于發(fā)酵液樣品中。[0048]成熟多肽：術(shù)語(yǔ)"成熟多肽"意指以其在翻譯和任何翻譯后修飾之后的最終形式存在的多肽，所述修飾例如N-末端加工、C-末端截短、糖基化、磷酸化等。在一個(gè)方面，根據(jù)預(yù)測(cè)SEQIDN0:2的氨基酸1至16是信號(hào)肽的SignalP程序（Nielsen等，1997,ProteinEngineering10:1-6)，成熟多肽是SEQIDNO:2的氨基酸17至305。本領(lǐng)域中已知宿主細(xì)胞可產(chǎn)生由相同多核苷酸表達(dá)的兩種或更多種不同成熟多肽（即，具有不同的C-端和/或N-端氨基酸）的混合物。[0049]成熟多肽編碼序列：術(shù)語(yǔ)"成熟多肽編碼序列"意指編碼具有內(nèi)切葡聚糖酶活性的成熟多肽的多核苷酸。在一個(gè)方面，根據(jù)預(yù)測(cè)SEQIDNO:1的核苷酸1至48編碼信號(hào)肽的SignalP程序（Nielsen等，1997,見(jiàn)上），成熟多肽編碼序列是SEQIDNO:1或其cDNA序列的核苷酸49至1172。[0050]中等嚴(yán)格條件：術(shù)語(yǔ)"中等嚴(yán)格條件"意指對(duì)于長(zhǎng)度至少100個(gè)核苷酸的探針，在42°C，在5XSSPE、0.3%SDS、200微克/ml已剪切并且變性的鮭精DNA和35%的甲酰胺中，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)的Southern印跡法進(jìn)行預(yù)雜交和雜交12至24小時(shí)。使用2XSSC、0.2%SDS在55°C將載體材料最終洗滌三次，每次15分鐘。[0051]中等-高嚴(yán)格條件：術(shù)語(yǔ)"中等-高嚴(yán)格條件"意指對(duì)于長(zhǎng)度至少100個(gè)核苷酸的探針，在42°C，在5XSSPE、0.3%SDS、200微克/ml已剪切并且變性的鮭精DNA和35%的甲酰胺中，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)的Southern印跡法進(jìn)行預(yù)雜交和雜交12至24小時(shí)。使用2XSSC、0.2%SDS在60°C將載體材料最終洗滌三次，每次15分鐘。[0052]核酸構(gòu)建體：術(shù)語(yǔ)"核酸構(gòu)建體"意指單鏈或雙鏈的核酸分子，其分離自天然存在的基因，或其經(jīng)修飾以本來(lái)不存在于（nototherwiseexist)自然界中的方式含有核酸的區(qū)段，或其為合成的，其包含一個(gè)或多個(gè)調(diào)控序列。[0053]可操作地連接：術(shù)語(yǔ)"可操作地連接"意指這樣的構(gòu)型，其中將調(diào)控序列置于相對(duì)于多核苷酸的編碼序列的適當(dāng)位置，使得調(diào)控序列指導(dǎo)編碼序列的表達(dá)。[0054]序列同一性：參數(shù)"序列同一性"描述兩個(gè)氨基酸序列之間或兩個(gè)核苷酸序列之間的相關(guān)性。[0055]就本發(fā)明而言，兩個(gè)氨基酸序列之間的序列同一性程度使用如EMBOSS軟件包(EMBOSS:TheEuropeanMolecularBiologyOpenSoftwareSuite,Rice等，2000,TrendsGenet.16:276-277)，優(yōu)選5.0·0版或更高版本的Needle程序中所執(zhí)行的Needleman-Wunsch算法（Needleman和Wunsch,1970,J.Mol.Biol.48:443-453)來(lái)測(cè)定。使用的參數(shù)為缺口打開(kāi)罰分（gapopenpenalty)10,缺口延伸罰分（gapextensionpenalty)(λ5和EBL0SUM62(BL0SUM62的EMBOSS版）取代矩陣。使用Needle標(biāo)記為"最高同一'I"生（longestidentity)"的輸出結(jié)果（使用-nobrief選項(xiàng)獲得）作為同一'丨生百分比，并計(jì)算如下：[0056](同樣的殘基xlOOV(比對(duì)長(zhǎng)度一比對(duì)中缺口的總數(shù)）[0057]就本發(fā)明而言，兩個(gè)核苷酸序列之間的序列同一性程度使用如EMBOSS軟件包(EMBOSS:TheEuropeanMolecularBiologyOpenSoftwareSuite,Rice等，2000，見(jiàn)上文），優(yōu)選5.0.0版或更高版本的Needle程序中所執(zhí)行的Needleman-Wunsch算法(Needleman和Wunsch，1970,見(jiàn)上文）來(lái)測(cè)定。使用的參數(shù)為缺口打開(kāi)罰分10,缺口延伸罰分0.5和EDNAFULL(NCBINUC4.4的EMBOSS版）取代矩陣。使用Needle標(biāo)記為"最高同一性"的輸出結(jié)果（使用-nobrief選項(xiàng)獲得）作為同一性百分比，并計(jì)算如下：[0058](同樣的脫氧核糖核苷酸X100V(比對(duì)長(zhǎng)度一比對(duì)中缺口的總數(shù)）[0059]亞序列：術(shù)語(yǔ)"亞序列（subsequence)"意指從成熟多肽編碼序列的5'和/或3'端缺失一個(gè)或多個(gè)（例如幾個(gè)）核苷酸的多核苷酸；其中所述亞序列編碼具有內(nèi)切葡聚糖酶活性的片段。[0060]變體：術(shù)語(yǔ)"變體"意指在一個(gè)或多個(gè)（例如幾個(gè)）位置包含改變，即取代、插入和/或缺失的具有內(nèi)切葡聚糖酶活性的多肽。取代意指將占據(jù)某位置的氨基酸用不同的氨基酸替代；缺失意指去除占據(jù)某位置的氨基酸；而插入意指在在占據(jù)某位置的氨基酸附近添加一個(gè)或多個(gè)（例如幾個(gè)）氨基酸，例如1-5個(gè)氨基酸。[0061]非常高嚴(yán)格條件：術(shù)語(yǔ)"非常高嚴(yán)格條件"意指對(duì)于長(zhǎng)度至少100個(gè)核苷酸的探針，在42°C，在5XSSPE、0.3%SDS、200微克/ml已剪切并且變性的鮭精DNA和50%的甲酰胺中，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)的Southern印跡法進(jìn)行預(yù)雜交和雜交12至24小時(shí)。使用2XSSC、0.2%SDS在70°C將載體材料最終洗滌三次，每次15分鐘。[0062]發(fā)明詳述[0063]具有內(nèi)切葡聚糖酶活性的多肽[0064]在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及與SEQIDN0:2的成熟多肽具有SEQIDNO:2of至少80%，至少85%，至少90%，至少91%，至少92%，至少93%，至少94%，至少95%，至少96%，至少97%，至少98%，至少99%，或100%的序列同一性的分離的多肽，其具有內(nèi)切葡聚糖酶活性。在一個(gè)方面，多肽與SEQIDN0:2的成熟多肽相差不超過(guò)10個(gè)氨基酸，例如1、2、3、4、5、6、7、8、或9個(gè)。[0065]優(yōu)選地，本發(fā)明的多肽包含或組成為SEQIDN0:2的氨基酸序列或其等位變體；或是其具有內(nèi)切葡聚糖酶活性的片段。在另一個(gè)方面，多肽包含或組成為SEQIDN0:2的成熟多肽。在另一個(gè)方面，多肽包含或組成為SEQIDNO:2的氨基酸17至305。[0066]在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及由多核苷酸編碼的具有內(nèi)切葡聚糖酶活性的分離的多肽，所述多核苷酸在中等嚴(yán)格條件，中等-高嚴(yán)格條件，高嚴(yán)格條件，或非常高嚴(yán)格條件下與以下雜交：（i)SEQIDN0:1的成熟多肽編碼序列，（ii)其cDNA序列，或（iii)(i)或（ii)的全長(zhǎng)互補(bǔ)物（Sambrook等，1989,MolecularCloning,ALaboratoryManual,2dedition,ColdSpringHarbor,NewYork)〇[0067]可利用SEQIDNO:1的多核苷酸或其亞序列，以及SEQIDNO:2的多肽或其片段設(shè)計(jì)核酸探針，以根據(jù)本領(lǐng)域內(nèi)公知的方法從不同屬或種的菌株鑒定和克隆編碼具有內(nèi)切葡聚糖酶活性的多肽的DNA。具體而言，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)的Southern印跡方法，可將這些探針用于與感興趣的細(xì)胞的基因組DNA或cDNA雜交，以鑒定和從其中分離相應(yīng)的基因。這些探針可明顯短于完整序列，但長(zhǎng)度上應(yīng)為至少15,例如至少25,至少35,或至少70個(gè)核苷酸。優(yōu)選地，所述核酸探針是至少100個(gè)核苷酸的長(zhǎng)度，例如，至少200個(gè)核苷酸，至少300個(gè)核苷酸，至少400個(gè)核苷酸，至少500個(gè)核苷酸，至少600個(gè)核苷酸，至少700個(gè)核苷酸，至少800個(gè)核苷酸，或至少900個(gè)核苷酸的長(zhǎng)度。DNA和RNA探針二者均可使用。通常將探針標(biāo)記以探測(cè)相應(yīng)的基因（例如，用3午、311、353、生物素或抗生物素蛋白（&"虹11)標(biāo)記）。這些探針涵蓋于本發(fā)明中。[0068]可從由這樣的其它菌株制備的基因組DNA或cDNA文庫(kù)中篩選與上述探針雜交并且編碼具有內(nèi)切葡聚糖酶活性的多肽的DNA。可以通過(guò)瓊脂糖或聚丙烯酰胺凝膠電泳，或通過(guò)其它分離技術(shù)分離來(lái)自這些其它菌株的基因組或其它DNA。可以將來(lái)自文庫(kù)的DNA或分離的DNA轉(zhuǎn)移至硝化纖維素（nitrocellulose)或其它合適的載體材料并且固定于其上。為了鑒定與SEQIDN0:1或其亞序列雜交的克隆或DNA，將所述載體材料用在Sounthern印跡中。[0069]就本發(fā)明而言，雜交表示多核苷酸在非常低至非常高的嚴(yán)格條件下與標(biāo)記的核酸探針雜交，所述核酸探針對(duì)應(yīng)于：（i)SEQIDN0:1;(ii)SEQIDN0:1的成熟多肽編碼序列；(iii)其cDNA序列；（iv)它們的全長(zhǎng)互補(bǔ)物，或（v)它們的亞序列。可使用例如X射線膠片（X-rayfilm)或其他任何本領(lǐng)域中已知的檢測(cè)手段檢測(cè)在這些條件下與核酸探針雜交的分子。[0070]在另一個(gè)方面，核酸探針是編碼SEQIDN0:2的多肽；其成熟多肽；或其片段的多核苷酸。在另一個(gè)方面，核酸探針是SEQIDNO:1或其cDNA序列。[0071]在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及由多核苷酸編碼的具有內(nèi)切葡聚糖酶活性的分離的多肽，所述多核苷酸與SEQIDNO:1或其cDNA序列的成熟多肽編碼序列具有至少80%，至少85%，至少90%，至少91%，至少92%，至少93%，至少94%，至少95%，至少96%，至少97%，至少98%，至少99%，或100%的序列同一性。[0072]在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及SEQIDN0:2的成熟多肽的變體，其在一個(gè)或多個(gè)（例如幾個(gè)）位置包含取代、缺失和/或插入。在一個(gè)方面，導(dǎo)入SEQIDN0:2的成熟多肽的氨基酸取代、缺失和/或插入的數(shù)量是不超過(guò)10個(gè)，例如1、2、3、4、5、6、7、8、或9個(gè)。氨基酸改變可以是次要性的，即保守的氨基酸取代或插入，其不顯著影響蛋白質(zhì)的折疊和/或活性；通常為1至大約30個(gè)氨基酸的小缺失；小的氨基或羧基末端延伸，例如氨基末端甲硫氨酸殘基；至多大約20-25個(gè)殘基的小接頭肽；或通過(guò)改變凈電荷或其它功能來(lái)促進(jìn)純化的小延伸，如多組氨酸序列（polyhistidinetract)、抗原表位（antigenicepitope)或結(jié)合域（bindingdomain)〇[0073]保守取代的實(shí)例是在以下組之內(nèi)：堿性氨基酸組（精氨酸、賴氨酸和組氨酸）、酸性氨基酸組（谷氨酸和天冬氨酸）、極性氨基酸組（谷氨酰胺和天冬酰胺）、疏水氨基酸組（亮氨酸、異亮氨酸和纈氨酸）、芳族氨基酸組（苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸）和小氨基酸組（甘氨酸、丙氨酸、絲氨酸、蘇氨酸和甲硫氨酸）。通常不改變比活性（specificactivity)的氨基酸取代是本領(lǐng)域已知的，并且由例如H.Neurath和R.L.Hill,1979,于TheProteins,AcademicPress,NewYork中描述。最普遍發(fā)生的交換是Ala/Ser、Val/Ile、Asp/Glu、Thr/Ser、Ala/Gly、Ala/Thr、Ser/Asn、Ala/Val、Ser/Gly、Tyr/Phe、Ala/Pro、Lys/Arg、Asp/Asn、Leu/Ile、Leu/Val、Ala/Glu和Asp/Gly〇[0074]或者，氨基酸改變具有導(dǎo)致多肽的物理化學(xué)特性改變的性質(zhì)。例如，氨基酸改變可改善多肽的熱穩(wěn)定性，改變底物特異性，改變最適pH等。[0075]可以根據(jù)本領(lǐng)域已知的方法，例如定位誘變或丙氨酸分區(qū)誘變法（Cunningham和Wells,1989，Science244:1081-1085)來(lái)鑒定親本多肽中的必需氨基酸。在后一技術(shù)中，將單一丙氨酸突變引入到分子中的每個(gè)殘基，并且測(cè)試所得到的突變分子是否具有內(nèi)切葡聚糖酶活性，以鑒定對(duì)于所述分子的活性關(guān)鍵的氨基酸殘基。另參見(jiàn)Hilton等，1996,J.Biol.Chem.271:4699-4708。酶的活性部位或其它的生物相互作用也可以通過(guò)對(duì)結(jié)構(gòu)的物理分析，結(jié)合針對(duì)推定的接觸位點(diǎn)氨基酸的突變來(lái)確定，結(jié)構(gòu)通過(guò)以下這些技術(shù)來(lái)測(cè)定：如核磁共振、晶體學(xué)、電子衍射或光親和標(biāo)記。參見(jiàn)例如deVos等，1992,Science255:306-312;Smith等，1992,J.Mol.Biol.224:899-904;Wlodaver等，1992,FEBSLett.309:59-64。也可以從與相關(guān)多肽的同一性分析來(lái)推斷必需氨基酸的身份。[0076]可使用已知的誘變、重組和/或改組方法，然后進(jìn)行相關(guān)的篩選過(guò)程，如由Reidhaar-Olson和Sauer，1988，Science241:53_57;Bowie和Sauer，1989，Proc.Natl.Acad.Sci.USA86:2152-2156;W095/17413;或者W095/22625所公開(kāi)的那些，進(jìn)行一個(gè)或多個(gè)氨基酸取代、缺失和/或插入并加以測(cè)試。其他可使用的方法包括易錯(cuò)PCR、噬菌體展示（例如Lowman等，1991，Biochemistry30:10832-10837;美國(guó)專利號(hào)5,223,409;W092/06204)和區(qū)域定向誘變（region-directedmutagenesis)(Derbyshire等，1986,Gene46:145;等，1988,DNA7:127)。[0077]誘變/改組方法可與高通量、自動(dòng)篩選方法組合以檢測(cè)由宿主細(xì)胞表達(dá)的經(jīng)克隆、誘變的多肽的活性（Ness等，1999,NatureBiotechnology17:893-896)。編碼活性多肽的經(jīng)誘變的DNA分子可自宿主細(xì)胞回收并使用本領(lǐng)域標(biāo)準(zhǔn)方法迅速測(cè)序。這些方法允許快速確定多肽中單個(gè)氨基酸殘基的重要性。[0078]所述多肽可為雜合多肽，其中一個(gè)多肽的區(qū)域融合于另一個(gè)多肽的區(qū)域的N端或C端。[0079]所述多肽可為融合多肽或可切開(kāi)的融合多肽，其中另一個(gè)多肽融合于本發(fā)明的多肽的N端或C端。通過(guò)將編碼另一個(gè)多肽的多核苷酸融合于本發(fā)明的多核苷酸來(lái)產(chǎn)生融合多肽。產(chǎn)生融合多肽的技術(shù)是本領(lǐng)域已知的，并包括連接編碼多肽的編碼序列以使它們符合讀框（inframe)，并且使融合多肽的表達(dá)在相同啟動(dòng)子和終止子的控制下。融合蛋白亦可使用內(nèi)蛋白（intein)技術(shù)構(gòu)建，其中融合物在翻譯后產(chǎn)生（Cooper等，1993,ΕΜΒ0J.12:2575-2583;Dawson等，1994,Science266:776-779)。[0080]融合多肽還可以在兩個(gè)多肽之間包含切割位點(diǎn)。在分泌融合多肽時(shí)，所述位點(diǎn)就被切開(kāi)，釋放所述兩個(gè)多肽。切開(kāi)位點(diǎn)的實(shí)例包括，但不限于，公開(kāi)于Martin等，2003,J.Ind.Microbiol.Biotechnol.3:568-76;Svetina等，2000,J.Biotechnol.76:245-251;Rasmussen-Wilson等，1997,Appl.Environ.Microbiol.63:3488-3493;Ward等，1995,Biotechnology13:498-503;和Contreras等，1991，Biotechnology9:378-381;Eaton等，1986，Biochem.25:505-512);Collins_Racie等，1995，Biotechnology13:982-987;Carter等，1989,Proteins:Structure,Function,andGenetics6:240-248;以及Stevens,2003,DrugDiscoveryWorld4:35-48中的位點(diǎn)。[0081]具有內(nèi)切葡聚糖酶活性的多肽的來(lái)源[0082]本發(fā)明的具有內(nèi)切葡聚糖酶活性的多肽可以獲得自任何屬的微生物。就本發(fā)明而言，用于本文與給定的來(lái)源有關(guān)的術(shù)語(yǔ)"獲得自"，意思應(yīng)為由多核苷酸編碼的多肽由所述來(lái)源產(chǎn)生，或由其中插入了來(lái)自所述來(lái)源的多核苷酸的菌株產(chǎn)生。在一個(gè)方面，從給定來(lái)源獲得的多肽是胞外分泌的。[0083]所述多肽可為真菌多肽。例如，多肽可以是絲狀真菌多肽，諸如枝頂孢多肽。[0084]在另一個(gè)方面，多肽是直生枝頂孢（Acremoniumstrictum)、桃色枝頂抱（Acremoniumpersicinum),火紅色枝頂抱（Acremoniumrutilum)、薄狀枝頂抱（Acremoniumcharticola)、針狀枝頂抱（Acremoniumfusigerum)、環(huán)帶狀枝頂抱(Acremoniumzonatum)、地生枝頂抱（Acremoniumterricola)、或Acremoniumtubakii。[0085]在另一個(gè)方面，多肽是嗜堿枝頂孢（Acremoniumalcalophilum)多肽。[0086]可理解的是對(duì)于前述的種，本發(fā)明包含完全和不完全階段（perfectandimperfectstates),和其它分類學(xué)的等同物（equivalent),例如無(wú)性型（anamorph)，而無(wú)論它們已知的種名。本領(lǐng)域技術(shù)人員將容易地識(shí)別適合的等同物的身份。[0087]這些種的菌株在許多培養(yǎng)物保藏中心對(duì)于公眾能夠容易地取得，所述保藏中心諸如美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心（theAmericanTypeCultureCollection)(ATCC)、德意志微生物和細(xì)胞培養(yǎng)物保藏中心（DeutscheSammlungvonMikroorganismenundZellkulturenGmbH)(DSMZ)、真菌菌種保藏中心（CentraalbureauVoorSchimmelcultures)(CBS)和農(nóng)業(yè)研究機(jī)構(gòu)專利培養(yǎng)物保藏中心北區(qū)研究中心(AgriculturalResearchServicePatentCultureCollection,NorthernRegionalResearchCenter)(NRRL)〇[0088]可以利用上述的探針從其它來(lái)源，包括從自然界（例如，土壤、堆肥、水等）分離的微生物或直接獲得自自然材料（例如，土壤、堆肥、水等）的DNA樣品，鑒定并獲得所述多肽。用于直接從天然生境（habitat)分離微生物和DNA的技術(shù)是本領(lǐng)域內(nèi)公知的。隨后可通過(guò)類似地篩選另一種微生物的基因組DNA或cDNA文庫(kù)或混合的DNA樣品來(lái)得到編碼所述多肽的多核苷酸。一旦用探針檢測(cè)到編碼多肽的多核苷酸，就可以使用本領(lǐng)域普通技術(shù)人員已知的技術(shù)將所述多核苷酸分離或克隆（參見(jiàn)，例如，Sambrook等，1989，見(jiàn)上文）。[0089]催化域[0090]在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明還涉及催化域，其與SEQIDN0:2的氨基酸17至232具有至少80%，至少85%，至少90%，至少95%，至少96%，至少97%，至少98%，至少99%，或100%的序列同一性。在一個(gè)方面，催化域包含與SEQIDN0:2的氨基酸17至232相差不超過(guò)10個(gè)氨基酸，例如1、2、3、4、5、6、7、8、或9的氨基酸序列。[0091]優(yōu)選地，催化域包含或組成為SEQIDN0:2的氨基酸17至232或其等位變體；或其具有內(nèi)切葡聚糖酶活性的片段。[0092]在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明還涉及催化域，其由多核苷酸編碼，所述多核苷酸在中等嚴(yán)格條件，中等-高嚴(yán)格條件，高嚴(yán)格條件，或非常高嚴(yán)格條件（如上文定義）下與以下雜交：（i)SEQIDN0:1的核苷酸49至953,（ii)其cDNA序列，或（iii)⑴或（ii)的全長(zhǎng)互補(bǔ)物（Sambrook等，1989,見(jiàn)上文）。[0093]在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明還涉及由多核苷酸編碼的催化域，所述多核苷酸與SEQIDNO:1或其cDNA序列的核苷酸49至953具有至少80%，至少85%，至少90%，至少95%，至少96%，至少97%，至少98%，至少99%，或100%的序列同一性。[0094]優(yōu)選地，編碼催化域的多核苷酸包含或組成為SEQIDNO:1的核苷酸49至953。[0095]在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明還涉及SEQIDNO:2的氨基酸17至232的在一個(gè)或多個(gè)（例如幾個(gè)）位置處包含取代、缺失、和/或插入的催化域變體。在一個(gè)方面，引入SEQIDN0:2的氨基酸17至232的序列中的氨基酸取代、缺失和/或插入的數(shù)目是10,例如1、2、3、4、5、6、8、或9。[0096]結(jié)合域[0097]在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明還涉及纖維素結(jié)合域，其與SEQIDN0:2的氨基酸267至305具有至少80%，至少85%，至少90%，至少91%，至少92%，至少93%，至少94%，至少95%，至少96%，至少97%，至少98%，至少99%，或100%序列同一性。在一個(gè)方面，所述纖維素結(jié)合域包含氨基酸序列，所述氨基酸序列與SEQIDN0:2的氨基酸267至305相差不超過(guò)10個(gè)，例如，1、2、3、4、5、6、7、8、或9個(gè)氨基酸。[0098]所述纖維素結(jié)合域優(yōu)選包含或組成為SEQIDN0:2的氨基酸267至305或其等位變體，或?yàn)槠渚哂欣w維素結(jié)合活性的片段。[0099]在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明還涉及纖維素結(jié)合域，其由多核苷酸編碼，所述多核苷酸在非常低嚴(yán)格條件、低嚴(yán)格條件、中等嚴(yán)格條件，中等-高嚴(yán)格條件，高嚴(yán)格條件，或非常高嚴(yán)格條件（如上文定義）下與以下雜交：（i)SEQIDNO:1的核苷酸1056至1172,（ii)其cDNA序列，或（iii)(i)或（ii)的全長(zhǎng)互補(bǔ)物（Sambrook等，1989,見(jiàn)上文）。[0100]在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明還涉及纖維素結(jié)合域，其由多核苷酸編碼，所述多核苷酸與SEQIDNO:1的核苷酸1056至1172具有至少80%，至少85%，至少90%，至少91%，至少92%，至少93%，至少94%，至少95%，至少96%，至少97%，至少98%，至少99%，或100%序列同一1f生。[0101]優(yōu)選地，編碼纖維素結(jié)合域的多核苷酸包含或組成為SEQIDNO:1的核苷酸1056至1172。[0102]在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明還涉及SEQIDN0:2的氨基酸267至305在一個(gè)或多個(gè)（例如幾個(gè)）位置包含取代、缺失和/或插入的纖維素結(jié)合域變體。在一個(gè)方面，引入SEQIDN0:2的氨基酸267至305的序列中的氨基酸取代、缺失和/或插入數(shù)是10,例如1、2、3、4、5、6、7、8、或9。[0103]與纖維素結(jié)合域可操作連接的催化域可來(lái)自水解酶、異構(gòu)酶、連接酶、裂合酶、氧還酶或轉(zhuǎn)移酶，例如氨肽酶、淀粉酶、糖酶、羧肽酶、過(guò)氧化氫酶、纖維二糖水解酶、纖維素酶、殼多糖酶、角質(zhì)酶、環(huán)糊精糖基轉(zhuǎn)移酶、脫氧核糖核酸酶、內(nèi)切葡聚糖酶、酯酶、α-半乳糖苷酶、β-半乳糖苷酶、葡糖淀粉酶、α-葡糖苷酶、β-葡糖苷酶、轉(zhuǎn)化酶、漆酶、脂肪酶、甘露糖苷酶、變聚糖酶、氧化酶、果膠分解酶、過(guò)氧化物酶、植酸酶、多酚氧化酶、蛋白水解酶、核糖核酸酶、轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶、木聚糖酶或木糖苷酶。編碼催化域的多肽可從任何原核、真核或其它來(lái)源獲得。[0104]多核苷酸[0105]本發(fā)明亦涉及編碼如本文中所述的本發(fā)明的多肽，催化域，或纖維素結(jié)合域的分離的多核苷酸。[0106]用于分離或克隆多核苷酸的技術(shù)在本領(lǐng)域中是已知的，并包括從基因組DNA或cDNA，或其組合分離。可通過(guò)例如使用熟知的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR)或表達(dá)文庫(kù)的抗體篩選來(lái)檢測(cè)具有共有結(jié)構(gòu)特性的克隆DNA片段，從而實(shí)現(xiàn)從這種基因組DNA克隆多核苷酸。參見(jiàn)，例如，Innis等，1990，PCR:AGuidetoMethodsandApplication,AcademicPress,NewYork。可以使用其它核酸擴(kuò)增方法，如連接酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（LCR)、連接活化轉(zhuǎn)錄（ligatedactivatedtranscription;LAT)和基于多核苷酸的擴(kuò)增（NASBA)。可以從枝頂孢菌株，或相關(guān)生物體克隆所述多核苷酸，因此，例如可為所述多核苷酸的多肽編碼區(qū)的等位基因變體或種間變體（speciesvariant)。[0107]修飾編碼本發(fā)明多肽的多核苷酸對(duì)于合成與所述多肽基本上相似的多肽而言可能是必需的。術(shù)語(yǔ)與所述多肽"基本上相似"指多肽的非天然存在的形式。這些多肽可能以一些工程改造的方式而不同于從其天然來(lái)源分離的多肽，例如，比活性、熱穩(wěn)定性、最適pH等方面不同的變體。可以在作為SEQIDNO:1的成熟多肽序列，或其cDNA序列，例如其亞序列呈現(xiàn)的多核苷酸的基礎(chǔ)上和/或通過(guò)引入如下核苷酸取代：所述取代不導(dǎo)致多肽氨基酸序列的改變，但是符合意欲產(chǎn)生酶的宿主生物體的密碼子用法；或者通過(guò)導(dǎo)入可產(chǎn)生不同的氨基酸序列的核苷酸取代來(lái)構(gòu)建變體。關(guān)于核苷酸取代的概述，參見(jiàn)，例如，F(xiàn)ord等，1991，ProteinExpressionandPurification2:95-107。[0108]核酸構(gòu)建體[0109]本發(fā)明還涉及包含本發(fā)明的多核苷酸的核酸構(gòu)建體，所述多核苷酸與一個(gè)或多個(gè)調(diào)控序列可操作地連接，所述調(diào)控序列在合適的宿主細(xì)胞中在與該調(diào)控序列相容的條件下指導(dǎo)編碼序列的表達(dá)。[0110]可以用許多方式操作所述多核苷酸以便于多肽的表達(dá)。取決于表達(dá)載體，在將多核苷酸插入載體之前對(duì)其進(jìn)行操作可能是理想的或必需的。使用重組DNA方法修飾多核苷酸的技術(shù)是本領(lǐng)域熟知的。[0111]調(diào)控序列可為啟動(dòng)子，其由用于表達(dá)編碼本發(fā)明的多肽的多核苷酸的宿主細(xì)胞所識(shí)別的多核苷酸。啟動(dòng)子含有介導(dǎo)多肽的表達(dá)的轉(zhuǎn)錄調(diào)控序列。啟動(dòng)子可以是在宿主細(xì)胞中顯示轉(zhuǎn)錄活性的任何多核苷酸，包括突變的、截短的和雜合的啟動(dòng)子，并且可以從編碼與宿主細(xì)胞同源或異源的胞外或胞內(nèi)多肽的基因獲得。[0112]用于在細(xì)菌宿主細(xì)胞中指導(dǎo)本發(fā)明的核酸構(gòu)建體轉(zhuǎn)錄的合適啟動(dòng)子的實(shí)例是從下述獲得的啟動(dòng)子：解淀粉芽孢桿菌α-淀粉酶基因（amyQ)、地衣芽孢桿菌α-淀粉酶基因（amyL)、地衣芽孢桿菌青霉素酶基因（penP)、嗜熱脂肪芽孢桿菌產(chǎn)麥芽淀粉酶基因（amyM)、枯草芽孢桿菌果聚糖蔗糖酶基因（sacB)、枯草芽孢桿菌xylA和xylB基因、蘇云金芽抱桿菌crylllA基因（Agaisse和Lereclus,1994,MolecularMicrobiology13:97-107)、大腸桿菌lac操縱子、大腸桿菌trc啟動(dòng)子（Egon等，1988,Gene69:301-315)、天藍(lán)鏈霉菌瓊脂糖酶基因（dagA)和原核β-內(nèi)酰胺酶基因（Villa-Kamaroff等，1978,ProceedingsoftheNationalAcademyofSciencesUSA75:3727-3731),以及tac啟動(dòng)子（DeBoer等，1983,Proc.Natl.Acad.Sci.USA80:21-25)。另外的啟動(dòng)子在〃Usefulproteinsfromrecombinantbacteria〃于Gilbert等，1980,ScientificAmerican,242:74-94中；和在Sambrook等，1989,見(jiàn)上文中描述。串聯(lián)啟動(dòng)子的實(shí)例公開(kāi)于TO99/43835。[0113]用于指導(dǎo)本發(fā)明的核酸構(gòu)建體在絲狀真菌宿主細(xì)胞中轉(zhuǎn)錄的合適啟動(dòng)子的實(shí)例是從下列酶的基因獲得的啟動(dòng)子：構(gòu)巢曲霉乙酰胺酶、黑曲霉中性α-淀粉酶、黑曲霉酸穩(wěn)定性α-淀粉酶、黑曲霉或泡盛曲霉葡糖淀粉酶（glaA)、米曲霉TAKA淀粉酶、米曲霉堿性蛋白酶、米曲霉丙糖磷酸異構(gòu)酶、尖鐮孢胰蛋白酶樣蛋白酶（WO96/00787)、鑲片鐮孢淀粉葡糖苷酶（W000/56900)、鑲片鐮孢Daria(W000/56900)、鑲片鐮孢Quinn(W000/56900)、曼赫根毛霉（Rhizomucormiehei)脂肪酶、曼赫根毛霉天冬氨酸蛋白酶、里氏木霉β-葡糖苷酶、里氏木霉纖維二糖水解酶I、里氏木霉纖維二糖水解酶II、里氏木霉內(nèi)切葡聚糖酶I、里氏木霉內(nèi)切葡聚糖酶II、里氏木霉內(nèi)切葡聚糖酶III、里氏木霉內(nèi)切葡聚糖酶IV、里氏木霉內(nèi)切葡聚糖酶V、里氏木霉木聚糖酶I、里氏木霉木聚糖酶II、里氏木霉β-木糖苷酶，以及NA2_tpi啟動(dòng)子（一種修飾的啟動(dòng)子，其來(lái)自在曲霉屬中性α-淀粉酶基因，其中未翻譯的前導(dǎo)序列由曲霉屬丙糖磷酸異構(gòu)酶的基因的未翻譯的前導(dǎo)序列所替代；非限制性實(shí)例包括修飾的啟動(dòng)子，其來(lái)自黑曲霉中性α-淀粉酶的基因，其中未翻譯的前導(dǎo)序列由構(gòu)巢曲霉或米曲霉丙糖磷酸異構(gòu)酶的基因的未翻譯的前導(dǎo)序列所替代）；和它們的突變的、截短的和雜合的啟動(dòng)子。[0114]在酵母宿主中，有用的啟動(dòng)子從如下的基因獲得：釀酒酵母烯醇化酶（ΕΝ0-1)、釀酒酵母半乳糖激酶（GAL1)、釀酒酵母醇脫氫酶/甘油醛-3-磷酸脫氫酶（ADH1，ADH2/GAP)、釀酒酵母丙糖磷酸異構(gòu)酶（ΤΡΙ)、釀酒酵母金屬硫蛋白（CUP1)和釀酒酵母3-磷酸甘油酸激酶。對(duì)于酵母宿主細(xì)胞其它有用的啟動(dòng)子由Romanos等，1992,Yeast8:423-488描述。[0115]調(diào)控序列也可以是轉(zhuǎn)錄終止子，其由宿主細(xì)胞識(shí)別以終止轉(zhuǎn)錄。所述終止子與編碼所述多肽的多核苷酸的3'末端可操作地連接。在本發(fā)明中，可使用在宿主細(xì)胞中有功能的任何終止子。[0116]對(duì)于細(xì)菌宿主細(xì)胞優(yōu)選的終止子從如下的基因獲得：克勞氏芽孢桿菌堿性蛋白酶(aprH)、地衣芽孢桿菌α-淀粉酶（amyL)和大腸桿菌核糖體RNA(rrnB)。[0117]對(duì)于絲狀真菌宿主細(xì)胞優(yōu)選的終止子從如下酶的基因獲得：構(gòu)巢曲霉鄰氨基苯甲酸合酶、黑曲霉葡糖淀粉酶、黑曲霉ct-葡糖苷酶、米曲霉TAKA淀粉酶、和尖鐮孢（Fusariumoxysporum)胰蛋白酶樣蛋白酶。[0118]對(duì)于酵母宿主細(xì)胞優(yōu)選的終止子從如下酶的基因獲得：釀酒酵母烯醇化酶、釀酒酵母細(xì)胞色素C(CYC1)和釀酒酵母甘油醛-3-磷酸脫氫酶。對(duì)于酵母宿主細(xì)胞其它有用的終止子由Romanos等，1992，見(jiàn)上文描述。[0119]調(diào)控序列還可以是啟動(dòng)子下游和基因的編碼序列上游的mRNA穩(wěn)定化區(qū)，其增加所述基因的表達(dá)。[0120]合適的mRNA穩(wěn)定化區(qū)的實(shí)例從如下的基因獲得：蘇云金芽孢桿菌crylllA基因（W094/25612)和枯草芽抱桿菌SP82基因（Hue等，1995,JournalofBacteriology177:3465-3471)。[0121]調(diào)控序列還可以是合適的前導(dǎo)序列，其為對(duì)于宿主細(xì)胞的翻譯重要的mRNA非翻譯區(qū)。前導(dǎo)序列可操作地連接于編碼多肽的多核苷酸的5'-末端。可使用在宿主細(xì)胞中有功能的任何前導(dǎo)序列。[0122]對(duì)于絲狀真菌宿主細(xì)胞優(yōu)選的前導(dǎo)序列從如下酶的基因獲得：米曲霉TAKA淀粉酶和構(gòu)巢曲霉丙糖磷酸異構(gòu)酶。[0123]對(duì)于酵母宿主細(xì)胞合適的前導(dǎo)序列從如下酶的基因獲得：釀酒酵母烯醇化酶(EN0-1)、釀酒酵母3-磷酸甘油酸激酶、釀酒酵母α因子和釀酒酵母醇脫氫酶/甘油醛-3-磷酸脫氫酶（ADH2/GAP)。[0124]調(diào)控序列也可以是聚腺苷酸化序列，其是與多核苷酸的3'末端可操作地連接的序列，并且在轉(zhuǎn)錄時(shí)，宿主細(xì)胞將其識(shí)別為將聚腺苷殘基添加至轉(zhuǎn)錄的mRNA的信號(hào)。可使用在宿主細(xì)胞中有功能的任何聚腺苷酸化序列。[0125]對(duì)于絲狀真菌宿主細(xì)胞優(yōu)選的聚腺苷酸化序列從如下酶的基因獲得：構(gòu)巢曲霉鄰氨基苯甲酸合酶、黑曲霉葡糖淀粉酶、黑曲霉α-葡糖苷酶、米曲霉TAKA淀粉酶和尖鐮孢胰蛋白酶樣蛋白酶。[0126]對(duì)于酵母宿主細(xì)胞有用的聚腺苷酸化序列由Guo和Sherman,1995,Mol.CellularBiol.15:5983-5990描述。[0127]調(diào)控序列還可以是信號(hào)肽編碼區(qū)，其編碼與多肽的N端相連的信號(hào)肽，并指導(dǎo)所述多肽進(jìn)入細(xì)胞分泌途徑。多核苷酸的編碼序列5'端可固有地包含信號(hào)肽編碼序列，其與編碼所述多肽的編碼序列的區(qū)段一起天然地連接在翻譯閱讀框中。或者，編碼序列5'端可含有對(duì)于所述編碼序列外源的信號(hào)肽編碼序列。當(dāng)編碼序列天然不含有信號(hào)肽編碼序列時(shí)，外源信號(hào)肽編碼序列可能是必需的。或者，可直接用外源信號(hào)肽編碼序列取代天然信號(hào)肽編碼序列以增強(qiáng)多肽的分泌。然而，可使用指導(dǎo)表達(dá)的多肽進(jìn)入宿主細(xì)胞的分泌途徑的任何信號(hào)膚編碼序列。[0128]對(duì)于細(xì)菌宿主細(xì)胞有效的信號(hào)肽編碼序列是從如下酶的基因獲得的信號(hào)肽編碼序列：芽孢桿菌屬NCIB11837產(chǎn)麥芽糖淀粉酶、地衣芽孢桿菌枯草桿菌蛋白酶(subtilisin)、地衣芽孢桿菌β-內(nèi)酰胺酶、嗜熱脂肪芽孢桿菌α-淀粉酶、嗜熱脂肪芽孢桿菌中性蛋白酶（nprT，nprS，nprM)和枯草芽孢桿菌prsA。另外的信號(hào)肽由Simonen和Palva,1993,MicrobiologicalReviews57:109-137描述。[0129]對(duì)于絲狀真菌宿主細(xì)胞有效的信號(hào)肽編碼序列是從如下酶的基因獲得的信號(hào)肽編碼序列：黑曲霉中性淀粉酶、黑曲霉葡糖淀粉酶、米曲霉TAKA淀粉酶、特異腐質(zhì)霉纖維素酶、特異腐質(zhì)霉內(nèi)切葡聚糖酶V、疏棉狀腐質(zhì)霉脂肪酶和曼赫根毛霉天冬氨酸蛋白酶。[0130]對(duì)于酵母宿主細(xì)胞有用的信號(hào)肽從釀酒酵母α因子和釀酒酵母轉(zhuǎn)化酶的基因獲得。其它有用的信號(hào)肽編碼序列由Romanos等，1992,見(jiàn)上文描述。[0131]調(diào)控序列還可以是前肽編碼序列，其編碼位于多肽N端的前肽。所得多肽稱為酶原（proenzyme)或前多肽（propolypeptide)(或在某些情況下稱為酶原（zymogen))。前多肽通常是無(wú)活性的，并且能夠通過(guò)前肽的催化或自催化切割從前多肽轉(zhuǎn)化為活性多肽。可以從枯草芽孢桿菌堿性蛋白酶（aprE)、枯草芽孢桿菌中性蛋白酶（nprT)、嗜熱毀絲霉漆酶（W095/33836)、曼赫根毛霉天冬氨酸蛋白酶和釀酒酵母α因子的基因獲得前肽編碼序列。[0132]當(dāng)信號(hào)肽和前肽序列二者均存在時(shí)，將前肽序列置于緊接著（nextto)多肽的Ν端，并且將信號(hào)肽序列置于緊接著前肽序列的N端。[0133]同樣理想的是添加調(diào)節(jié)序列，其相對(duì)于宿主細(xì)胞的生長(zhǎng)來(lái)調(diào)節(jié)多肽的表達(dá)。調(diào)節(jié)系統(tǒng)的實(shí)例是引起基因表達(dá)響應(yīng)化學(xué)或物理刺激物，包括調(diào)節(jié)化合物的存在而開(kāi)啟或關(guān)閉的那些系統(tǒng)。原核系統(tǒng)中的調(diào)節(jié)系統(tǒng)包括lac、tac和trp操縱基因系統(tǒng)。在酵母中，可使用ADH2系統(tǒng)或GAL1系統(tǒng)。在絲狀真菌中，可以使用黑曲霉葡糖淀粉酶啟動(dòng)子、米曲霉ΤΑΚΑα-淀粉酶啟動(dòng)子和米曲霉葡糖淀粉酶啟動(dòng)子。調(diào)節(jié)序列的其它實(shí)例是那些允許基因擴(kuò)增的序列。在真核系統(tǒng)中，這些調(diào)節(jié)序列包括在氨甲蝶呤（methotrexate)存在下擴(kuò)增的二氫葉酸還原酶基因，和以重金屬（withheavymetal)擴(kuò)增的金屬硫蛋白基因。在這些情況下，編碼多肽的多核苷酸將與調(diào)節(jié)序列可操作地連接。[0134]表達(dá)載體[0135]本發(fā)明還涉及重組表達(dá)載體，所述重組表達(dá)載體包含本發(fā)明的多核苷酸、啟動(dòng)子和轉(zhuǎn)錄和翻譯終止信號(hào)。多種核苷酸和調(diào)控序列可以結(jié)合在一起以產(chǎn)生重組表達(dá)載體，所述表達(dá)載體可以包括一個(gè)或多個(gè)方便的限制位點(diǎn)以允許在這些位點(diǎn)插入或取代編碼多肽的多核苷酸。或者，可以通過(guò)在適當(dāng)?shù)挠糜诒磉_(dá)的載體中插入包含所述多核苷酸的核酸構(gòu)建體或多核苷酸來(lái)表達(dá)所述多核苷酸。在制備表達(dá)載體的過(guò)程中，將編碼序列置于載體中，從而將該編碼序列與適當(dāng)?shù)恼{(diào)控序列可操作地連接以供表達(dá)。[0136]重組表達(dá)載體可以是任何能夠方便地進(jìn)行重組DNA步驟，并且能夠產(chǎn)生多核苷酸的表達(dá)的載體（例如，質(zhì)粒或病毒）。載體的選擇將通常依賴于載體與將引入該載體的宿主細(xì)胞的相容性。載體可以是線狀或閉合環(huán)狀質(zhì)粒。[0137]載體可以是自主復(fù)制載體，S卩，作為染色體外實(shí)體（entity)存在的載體，其復(fù)制獨(dú)立于染色體復(fù)制，例如，質(zhì)粒、染色體外元件、微型染色體（minichromosome)或人工染色體。載體可以含有任何用于確保自我復(fù)制的手段（means)。或者，載體可以是一種當(dāng)被引入宿主細(xì)胞中時(shí)，整合到基因組中并且與整合了該載體的染色體一起復(fù)制的載體。此外，可以使用單獨(dú)的載體或質(zhì)粒或兩個(gè)或更多個(gè)載體或質(zhì)粒，其共同含有待引入宿主細(xì)胞基因組的完整DNA(totalDNA)，或可以使用轉(zhuǎn)座子（transposon)。[0138]所述載體優(yōu)選地含有一個(gè)或多個(gè)選擇性標(biāo)記，以便于容易地選擇經(jīng)轉(zhuǎn)化、轉(zhuǎn)染、轉(zhuǎn)導(dǎo)等的細(xì)胞。選擇性標(biāo)記是這樣的基因，其產(chǎn)物提供殺生物劑或病毒抗性、對(duì)重金屬的抗性、對(duì)營(yíng)養(yǎng)缺陷型的原養(yǎng)性（prototrophytoauxotrophs)等。[0139]細(xì)菌選擇性標(biāo)記的實(shí)例是地衣芽孢桿菌或枯草芽孢桿菌dal基因，或賦予抗生素抗性的標(biāo)記，所述抗生素抗性例如氨芐青霉素、氯霉素、卡那霉素、新霉素、壯觀霉素或四環(huán)素抗性。對(duì)于酵母宿主細(xì)胞合適的標(biāo)記包括但不限于ADE2、HIS3、LEU2、LYS2、MET3、TRP1和URA3。用于絲狀真菌宿主細(xì)胞的選擇性標(biāo)記包括但不限于amdS(乙酰胺酶）、argB(鳥(niǎo)氨酸氨甲酰基轉(zhuǎn)移酶）、bar(草銨膦（phosphinothricin)乙酰轉(zhuǎn)移酶）、hph(潮霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶）、niaD(硝酸還原酶）（nitratereductase)、pyrG(乳清酸核苷-5'-磷酸脫羧酶）(orotidine-5'-phosphatedecarboxylase)、sC(硫酸腺昔醜轉(zhuǎn)移酶）和trpC(鄰氛基苯甲酸合酶（anthranilatesynthase))以及它們的等同物。優(yōu)選用在曲霉屬細(xì)胞中的是構(gòu)巢曲霉或米曲霉amdS和pyrG基因和吸水鏈霉菌（Streptomyceshygroscopicus)bar基因。[0140]所述載體優(yōu)選含有允許載體整合入宿主細(xì)胞基因組或載體在細(xì)胞中獨(dú)立于基因組的自主復(fù)制的元件。[0141]為了整合入宿主細(xì)胞基因組，載體可依賴編碼多肽的多核苷酸的序列或用于通過(guò)同源或非同源重組整合入基因組的任何其它載體元件。或者，載體可以含有用于指導(dǎo)通過(guò)同源重組整合入宿主細(xì)胞基因組染色體中的精確位置的額外的多核苷酸。為了增加在精確位置整合的可能性，整合元件應(yīng)含有足夠數(shù)量的與相應(yīng)的目標(biāo)序列具有高度序列同一性的核酸，如100至10,〇〇〇堿基對(duì)，400至10,000堿基對(duì)，和800至10,000堿基對(duì)，以提高同源重組的概率。整合元件可為任何與宿主細(xì)胞基因組中的目標(biāo)序列同源的序列。此外，整合元件可為非編碼或編碼的多核苷酸。另一方面，可以將載體通過(guò)非同源重組整合到宿主細(xì)胞的基因組中。[0142]為了自主復(fù)制，載體可以還包含復(fù)制起點(diǎn)，其使載體能夠在所述的宿主細(xì)胞中自主地復(fù)制。復(fù)制起點(diǎn)可以是在細(xì)胞中發(fā)揮功能的介導(dǎo)自主復(fù)制的任何質(zhì)粒復(fù)制子(replicator)。術(shù)語(yǔ)"復(fù)制起點(diǎn)"或"質(zhì)粒復(fù)制子"意指能夠使質(zhì)粒或載體體內(nèi)復(fù)制的多核苷酸。[0143]細(xì)菌復(fù)制起點(diǎn)的實(shí)例是允許在大腸桿菌中復(fù)制的質(zhì)粒pBR322、pUC19、pACYC177和PACYC184的復(fù)制起點(diǎn)，和允許在芽孢桿菌屬中復(fù)制的質(zhì)粒pUBllO、pE194、pTA1060和ρΑΜβ1的復(fù)制起點(diǎn)。[0144]用于酵母宿主細(xì)胞中的復(fù)制起點(diǎn)的實(shí)例是2微米復(fù)制起點(diǎn)，ARS1，ARS4,ARS1和CEN3的組合，和ARS4和CEN6的組合。[0145]在絲狀真菌細(xì)胞中有用的復(fù)制起點(diǎn)的實(shí)例是ΑΜΑ1和ANSI(Gems等，1991，Gene98:61-67;Cullen等，1987,NucleicAcidsRes.15:9163-9175;W000/24883)。分離AMA1基因和構(gòu)建包含該基因的質(zhì)粒或載體能夠根據(jù)公開(kāi)于WO00/24883中的方法完成。[0146]可以將多于一個(gè)拷貝的本發(fā)明的多核苷酸插入宿主細(xì)胞以增加多肽的產(chǎn)生。多核苷酸拷貝數(shù)的增加可通過(guò)如下方法獲得：將至少一個(gè)額外拷貝的序列整合入宿主細(xì)胞基因組，或?qū)⒖蓴U(kuò)增的選擇性標(biāo)記基因包括于多核苷酸，其中可通過(guò)在合適的選擇劑(selectableagent)存在下培養(yǎng)細(xì)胞來(lái)選擇含有選擇性標(biāo)記基因的擴(kuò)增拷貝，且由此含有多核苷酸的額外拷貝的細(xì)胞。[0147]用于連接上述元件以構(gòu)建本發(fā)明的重組表達(dá)載體的方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的（參見(jiàn)，例如，Sambrook等，1989，見(jiàn)上文）。[0148]宿主細(xì)胞[0149]本發(fā)明還涉及重組宿主細(xì)胞，其包含本發(fā)明的多核苷酸可操作地連接于一個(gè)或多個(gè)指導(dǎo)本發(fā)明多肽的產(chǎn)生的調(diào)控序列。將包含多核苷酸的構(gòu)建體或載體引入宿主細(xì)胞，使所述構(gòu)建體或載體如前所述作為染色體整合體或者作為自我復(fù)制的染色體外載體維持。術(shù)語(yǔ)"宿主細(xì)胞"包括親本細(xì)胞的任何由于復(fù)制過(guò)程中發(fā)生的突變而不同于親本細(xì)胞的后代。宿主細(xì)胞的選擇將在很大程度上依賴于編碼多肽的基因及其來(lái)源。[0150]宿主細(xì)胞可以是在本發(fā)明的多肽的重組產(chǎn)生中有用的任何細(xì)胞，例如，原核或真核細(xì)胞。[0151]原核宿主細(xì)胞可以是任何革蘭氏陽(yáng)性或革蘭氏陰性細(xì)菌。革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌包括但不限于，芽孢桿菌屬、梭菌屬、腸球菌屬、地芽孢桿菌屬、乳桿菌屬、乳球菌屬、海洋芽孢桿菌屬、葡萄球菌屬、鏈球菌屬和鏈霉菌屬。革蘭氏陰性細(xì)菌包括但不限于，彎曲桿菌屬、大腸桿菌、黃桿菌屬、梭桿菌屬、螺桿菌屬、泥桿菌屬、奈瑟氏菌屬、假單胞菌屬、沙門(mén)氏菌屬和脲原體屬。[0152]細(xì)菌宿主細(xì)胞可以是任何芽孢桿菌屬細(xì)胞，包括但不限于嗜堿芽孢桿菌、解淀粉芽孢桿菌、短芽孢桿菌、環(huán)狀芽孢桿菌、克勞氏芽孢桿菌、凝結(jié)芽孢桿菌、堅(jiān)強(qiáng)芽孢桿菌、燦爛芽孢桿菌、遲緩芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌、巨大芽孢桿菌、短小芽孢桿菌、嗜熱脂肪芽孢桿菌、枯草芽孢桿菌和蘇云金芽孢桿菌細(xì)胞。[0153]細(xì)菌宿主細(xì)胞還可以是任何鏈球菌屬細(xì)胞，包括但不限于，似馬鏈球菌、釀膿鏈球菌、乳房鏈球菌和馬鏈球菌獸瘟亞種細(xì)胞。[0154]細(xì)菌宿主細(xì)胞還可以是任何鏈霉菌屬細(xì)胞，包括但不限于，不產(chǎn)色鏈霉菌、除蟲(chóng)鏈霉菌、天藍(lán)鏈霉菌、灰色鏈霉菌和淺青紫鏈霉菌細(xì)胞。[0155]可通過(guò)如下方法實(shí)現(xiàn)將DNA引入到芽孢桿菌屬細(xì)胞：原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化（參見(jiàn)，例如，Chang和Cohen,1979,Mol.Gen.Genet.168:111-115)，感受態(tài)細(xì)胞轉(zhuǎn)化（參見(jiàn)，例如，Young和Spizizen，1961，J.Bacteriol.81:823-829或Dubnau和Davidoff-Abelson，1971，J·Mol.Biol.56:209-221),電穿孔（參見(jiàn)，例如，Shigekawa和Dower,1988,Biotechniques6:742-751)或接合（參見(jiàn)，例如，Koehler和Thorne,1987,J.Bacteriol.169:5771-5278)。可通過(guò)如下方法實(shí)現(xiàn)將DNA引入到大腸桿菌細(xì)胞：原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化（參見(jiàn)，例如，Hanahan,1983,J.Mol.Biol.166:557-580)或電穿孔（參見(jiàn)，例如，Dower等，1988,NucleicAcidsRes.16:6127-6145)。可通過(guò)如下方法實(shí)現(xiàn)將DNA引入到鏈霉菌屬細(xì)胞：原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化，電穿孔（參見(jiàn)，例如，Gong等，2004,FoliaMicrobiol.(Praha)49:399-405)，接合（參見(jiàn)，例如，Mazodier等，1989,J.Bacteriol.171:3583-3585)，或轉(zhuǎn)導(dǎo)（參見(jiàn)，例如，Burke等，2001，Proc.Natl.Acad.Sci.USA98:6289-6294)。可通過(guò)如下方法實(shí)現(xiàn)將DNA引入到假單胞菌屬細(xì)胞：電穿孔（參見(jiàn)，例如，Choi等，2006,J.Microbiol.Methods64:391-397)或接合（參見(jiàn)，例如，Pinedo和Smets,2005,Appl.Environ.Microbiol.71:51-57)。可通過(guò)如下方法實(shí)現(xiàn)將DNA引入到鏈球菌屬細(xì)胞：天然感受態(tài)（naturalcompetence)(參見(jiàn)，例如，Perry和Kuramitsu,1981,Infect.Tmmun.32:1295-1297)，原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化（參見(jiàn)，例如，Catt和Jollick,1991，Microbios·68:189-207),電穿孔（參見(jiàn)，例如，Buckley等，1999,Appl.Environ.Microbiol.65:3800-3804)或接合（參見(jiàn)，例如，Clewell,1981，Microbiol.Rev.45:409-436)。然而，可使用本領(lǐng)域已知的將DNA引入宿主細(xì)胞的任何方法。[0156]宿主細(xì)胞還可為真核生物，如哺乳動(dòng)物、昆蟲(chóng)、植物或真菌細(xì)胞。[0157]宿主細(xì)胞可為真菌細(xì)胞。"真菌"用在本文包括以下門(mén)：子囊菌門(mén)（Ascomycota)、擔(dān)子菌門(mén)（Basidiomycota)、壺菌門(mén)（Chytridiomycota)和接合菌門(mén)（Zygomycota)以及卵菌門(mén)（Oomycota)和所有有絲分裂抱子真菌（mitosporicfungi)(如由Hawksworth等，于AinsworthandBisby，sDictionaryofTheFungi,第8版，1995,CABInternational,UniversityPress,Cambridge,UK中所定義）。[0158]真菌宿主細(xì)胞可為酵母細(xì)胞。"酵母"用在本文包括產(chǎn)子囊酵母（ascosporogenousyeast)(內(nèi)抱霉目（Endomycetales))、產(chǎn)擔(dān)子酵母（basidiosporogenousyeast)和屬于半知菌類（FungiImperfecti)(芽孢綱（Blastomycetes))的酵母。由于酵母的分類在未來(lái)可能改變，就本發(fā)明而言，將酵母定義為如BiologyandActivitiesofYeast(Skinner,Passmore,和Davenport編,Soc.App.Bacteriol.SymposiumSeriesNo.9,1980)中所述。[0159]酵母宿主細(xì)胞可為假絲酵母屬、漢遜酵母屬（Hansenula)、克魯維酵母屬、畢赤酵母屬、酵母屬、裂殖酵母屬或西洋蓍霉屬細(xì)胞，如乳酸克魯維酵母（Kluyveromyceslactis)、卡爾酵母、釀酒酵母、糖化酵母、道格拉氏酵母、克魯弗酵母、諾地酵母、卵形酵母、或解脂西洋蓍霉（Yarrowialipolytica)細(xì)胞。[0160]真菌宿主細(xì)胞可為絲狀真菌細(xì)胞。"絲狀真菌"包括真菌門(mén)（Eumycota)和卵菌門(mén)的亞門(mén)（如由Hawksworth等，1995，見(jiàn)上文，所定義）的所有絲狀形式。絲狀真菌通常的特征在于由殼多糖（chitin)、纖維素、葡聚糖、殼聚糖（chitosan)、甘露聚糖和其它復(fù)雜多糖構(gòu)成的菌絲體壁。通過(guò)菌絲延伸進(jìn)行營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)，而碳分解代謝是專性需氧的。相反，酵母例如釀酒酵母的營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)通過(guò)單細(xì)胞菌體的出芽生殖（budding)進(jìn)行，而碳分解代謝可以是發(fā)酵性的。[0161]絲狀真菌宿主細(xì)胞可為枝頂孢霉屬、曲霉屬、短梗霉屬、煙管霉屬（Bjerkandera)、擬錯(cuò)菌屬、金孢子菌屬、鬼傘屬（Coprinus)、革蓋菌屬（Coriolus)、隱球菌屬、Filibasidium、鐮孢屬、腐質(zhì)霉屬、梨孢菌屬、毛霉屬、毀絲霉屬、新考瑪脂霉屬、脈孢菌屬、擬青霉屬、青霉屬、平革菌屬（Phanerochaete)、射脈菌屬（Phlebia)、瘤胃壺菌屬、側(cè)耳屬(Pleurotus)、裂裙菌屬、踝節(jié)菌屬、嗜熱子囊菌屬、梭孢霉屬、彎頸霉屬、栓菌屬（Trametes)或木霉屬細(xì)胞。[0162]例如，絲狀真菌宿主細(xì)胞可為泡盛曲霉、煙曲霉、臭曲霉、日本曲霉、構(gòu)巢曲霉、黑曲霉、米曲霉、黑刺煙管菌（Bjerkanderaadusta)、干擬錯(cuò)菌（Ceriporiopsisaneirina)、Ceriporiopsiscaregiea、Ceriporiopsisgilvescens、Ceriporiopsispannocinta、Ceriporiopsisrivulosa、Ceriporiopsissubrufa、蟲(chóng)擬錯(cuò)菌(Ceriporiopsissubvermispora)>Chrysosporiuminops、嗜角質(zhì)金抱子菌、Chrysosporiumlucknowense、Chrysosporiummerdariunu租金抱子菌>Chrysosporiumqueenslandicum>熱帶金抱子菌、Chrysosporiumzonatum、灰蓋鬼傘（Coprinuscinereus)、毛革蓋菌（Coriolushirsutus)、桿孢狀鐮孢、禾谷鐮孢、庫(kù)威鐮孢、大刀鐮孢、禾本科鐮孢、禾赤鐮孢、異孢鐮孢、合歡木鐮孢、尖鐮孢、多枝鐮孢、粉紅鐮孢、接骨木鐮孢、膚色鐮孢、擬分枝孢鐮孢、硫色鐮孢、圓鐮孢、擬絲孢鐮孢、鑲片鐮孢、特異腐質(zhì)霉、疏棉狀腐質(zhì)霉、米黑毛霉、嗜熱毀絲霉、粗糙脈孢菌、產(chǎn)紫青霉、黃孢平革菌（Phanerochaetechrysosporium)、福射射脈菌（Phlebiaradiata)、刺拜:側(cè)耳（Pleurotuseryngii)、土生梭孢霉、長(zhǎng)絨毛栓菌（Trametesvillosa)、變色栓菌（Trametesversicolor)、哈茨木霉、康寧木霉、長(zhǎng)枝木霉、里氏木霉或綠色木霉細(xì)胞。[0163]可以將真菌細(xì)胞通過(guò)涉及原生質(zhì)體形成、原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化和細(xì)胞壁再生的方法以本身公知的方式轉(zhuǎn)化。用于轉(zhuǎn)化曲霉屬和木霉屬宿主細(xì)胞的合適方法在EP238023和Yelton等，1984,Proc.Natl.Acad.Sci.USA81:1470-1474以及Christensen等，1988,Bio/Technology6:1419-1422中描述。用于轉(zhuǎn)化鐮孢屬菌種的合適方法由Malardier等，1989,Gene78:147-156和W096/00787描述。可以使用由如下文獻(xiàn)描述的方法轉(zhuǎn)化酵母：Becker和Guarente,于Abelson,J.Ν·和Simon，M.I.編，GuidetoYeastGeneticsandMolecularBiology,MethodsinEnzymology,Volume194,pp182-187,AcademicPress,Inc.，NewYork;Ito等，1983,J.Bacteriol.153:163;和Hinnen等，1978,Proc.Natl.Acad.Sci.USA75:1920。[0164]產(chǎn)生方法[0165]本發(fā)明還涉及用于產(chǎn)生本發(fā)明多肽的方法，其包括：(a)在有助于產(chǎn)生多肽的條件下培養(yǎng)細(xì)胞，所述細(xì)胞以其野生型形式產(chǎn)生所述多肽；和（b)回收所述多肽。[0166]本發(fā)明還涉及用于產(chǎn)生本發(fā)明的多肽的方法，其包括：(a)在有助于產(chǎn)生多肽的條件下培養(yǎng)本發(fā)明的重組宿主細(xì)胞；和（b)回收所述多肽。在一個(gè)優(yōu)選的方面，細(xì)胞是枝頂孢細(xì)胞。在一個(gè)更優(yōu)選的實(shí)施方案中，細(xì)胞是嗜堿枝頂孢細(xì)胞。[0167]所述宿主細(xì)胞使用本領(lǐng)域已知的方法在適合于產(chǎn)生所述多肽的營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基中培養(yǎng)。例如，可以通過(guò)在合適培養(yǎng)基中和允許表達(dá)和/或分離所述多肽的條件下實(shí)施的搖瓶培養(yǎng)，或?qū)嶒?yàn)室或工業(yè)發(fā)酵罐中的小規(guī)模或大規(guī)模發(fā)酵（包括連續(xù)、分批、補(bǔ)料分批或固態(tài)發(fā)酵）來(lái)培養(yǎng)細(xì)胞。使用本領(lǐng)域已知的方法在合適的營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)，所述營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基包含碳源和氮源和無(wú)機(jī)鹽。合適的培養(yǎng)基能夠從商業(yè)供應(yīng)商獲得或可以根據(jù)公開(kāi)的組成制備（例如，在美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心的目錄中）。如果多肽分泌到營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基中，該多肽可以從所述培養(yǎng)基中直接回收。如果多肽不分泌，其可以從細(xì)胞裂解物（lysate)回收。[0168]可以使用本領(lǐng)域已知的對(duì)于所述多肽特異性的方法來(lái)檢測(cè)多肽。這些檢測(cè)方法包括但不限于特異性抗體的使用、酶產(chǎn)物的形成或酶底物的消失。例如，酶測(cè)定法（enzymeassay)可用于確定多肽的活性。[0169]多肽可以使用本領(lǐng)域已知的方法回收。例如，多肽可以通過(guò)常規(guī)方法從營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基中回收，所述常規(guī)方法包括但不限于收集、離心、過(guò)濾、提取、噴霧干燥、蒸發(fā)或沉淀。[0170]多肽可以通過(guò)多種本領(lǐng)域已知的方法純化以獲得基本上純的多肽，所述方法包括但不限于層析（例如，離子交換、親和、疏水、層析聚焦和大小排阻）、電泳方法（例如，制備型（preparative)等電聚焦）、差示溶解度（例如，硫酸銨沉淀）、SDS-PAGE或提取（參見(jiàn)，例如，ProteinPurification,Janson和Ryden編，VCHPublishers,NewYork,1989)。[0171]在另一個(gè)方面，不回收多肽，而是使用表達(dá)所述多肽的本發(fā)明的宿主細(xì)胞作為所述多肽的來(lái)源。[0172]植物[0173]本發(fā)明還涉及分離的植物，例如，轉(zhuǎn)基因植物、植物部分或植物細(xì)胞，其包含本發(fā)明的多核苷酸，從而以可回收的量表達(dá)和產(chǎn)生所述多肽或域。多肽或域可從植物或植物部分回收。或者，可以按原樣（assuch)將含有該多肽或域的植物或植物部分用于改進(jìn)食品或飼料的質(zhì)量，例如，改進(jìn)營(yíng)養(yǎng)價(jià)值、適口性（palatability)和流變性質(zhì)（rheologicalproperties)，或用于破壞抗?fàn)I養(yǎng)因子。[0174]轉(zhuǎn)基因植物可以是雙子葉的（雙子葉植物）或單子葉的（單子葉植物）。單子葉植物的實(shí)例是草（grasses),如草地早熟禾（meadowgrass)(藍(lán)草（bluegrass),早熟禾屬（Poa));飼用牧草（foragegrass)如羊茅屬（Festuca)、黑麥草屬（Lolium);寒地型牧草（temperategrass),如Agrostis(翦股穎屬）；和谷類，例如，小麥、燕麥、黑麥、大麥、稻(rice)、高粱和玉蜀黍（maize)(玉米）。[0175]雙子葉植物的實(shí)例是煙草（tobacco)，豆類（legumes)，如羽扇豆（lupins)，馬鈴薯，糖甜菜（sugarbeet),豌豆，豆（bean)和大豆（soybean)和十字花科的（cruciferous)植物（十字花科（familyBrassicaceae))，如花椰菜（cauliflower)，油菜桿（rapeseed)和緊密相關(guān)的模型生物體擬南芥（Arabidopsisthaliana)。[0176]植物部分的實(shí)例是莖（stem)、愈傷組織（callus)、葉（leaf)、根（root)、果實(shí)（fruit)、種子（seed)和塊莖（tuber)，以及包含這些部分的獨(dú)立組織，例如，表皮(epidermis)、葉肉（mesophyll)、薄壁組織（parenchyme)、維管組織（vasculartissue)、分生組織（meristem)。具體的植物細(xì)胞區(qū)室（compartments),如葉綠體（chloroplast)、質(zhì)外體（apoplast)、線粒體（mitochondria)、液泡（vacuole)、過(guò)氧化物酶體（peroxisome)和細(xì)胞質(zhì)（cytoplasm)也被認(rèn)為是植物部分。此外，任何植物細(xì)胞，無(wú)論什么組織來(lái)源，都被認(rèn)為是植物部分。同樣地，植物部分，如被分離用來(lái)促進(jìn)本發(fā)明的應(yīng)用的具體組織和細(xì)胞也被認(rèn)為是植物部分，例如胚（embryo)、胚乳（endosperm)、糊粉（aleurone)和種皮（seedcoat)。[0177]同樣包含于本發(fā)明范圍內(nèi)的還有這些植物、植物部分和植物細(xì)胞的后代。[0178]表達(dá)多肽或域的轉(zhuǎn)基因植物或植物細(xì)胞可以依照本領(lǐng)域已知方法構(gòu)建。簡(jiǎn)而言之，通過(guò)如下方法構(gòu)建所述植物或植物細(xì)胞：將編碼多肽或域的一個(gè)或多個(gè)表達(dá)構(gòu)建體導(dǎo)入植物宿主基因組或葉綠體基因組，并且將所得的經(jīng)修飾的植物或植物細(xì)胞繁殖為轉(zhuǎn)基因植物或植物細(xì)胞。[0179]表達(dá)構(gòu)建體便利地是包含編碼多肽或域的多核苷酸的核酸構(gòu)建體，所述多核苷酸與在選擇的植物或植物部分中表達(dá)該多核苷酸所需的適當(dāng)?shù)恼{(diào)節(jié)序列可操作地連接。此夕卜，表達(dá)構(gòu)建體可以包含對(duì)于鑒定植物細(xì)胞有用的選擇性標(biāo)記，在所述植物細(xì)胞中整合了表達(dá)構(gòu)建體和將該構(gòu)建體引入到所述植物中所必需的DNA序列（后者依賴于使用的DNA引入方法）。[0180]調(diào)節(jié)序列的選擇，例如啟動(dòng)子和終止子序列和任選地信號(hào)或轉(zhuǎn)運(yùn)序列的選擇，舉例來(lái)說(shuō)，基于期望何時(shí)、何處以及如何表達(dá)多肽或域而確定。例如，編碼多肽或域的基因的表達(dá)可以是組成型的或誘導(dǎo)型的，或可以是發(fā)育、階段或組織特異性的，并且基因產(chǎn)物可以祀向特定的組織或植物部分如種子或葉。調(diào)節(jié)序列由例如Tague等，1988,PlantPhysiology86:506所述。[0181]對(duì)于組成性表達(dá)，可以使用35S_CaMV、玉米泛素1或稻肌動(dòng)蛋白1啟動(dòng)子(Franck等，1980,Cell21:285-294,Christensen等，1992,PlantMo.Biol.18:675-689;Zhang等，1991，PlantCell3:1155-1165)。器官特異性啟動(dòng)子可以是例如來(lái)自貯藏庫(kù)組織（storagesinktissue)例如種子、馬鈴薯塊莖和果實(shí)的啟動(dòng)子（Edwards和Coruzzi,1990,Ann.Rev.Genet.24:275-303)，或來(lái)自代謝庫(kù)組織（metabolicsinktissue)例如分生組織的啟動(dòng)子（Ito等，1994,PlantMol.Biol.24:863-878)，種子特異性啟動(dòng)子諸如來(lái)自稻的谷蛋白（glutelin)、醇溶蛋白（prolamin)、球蛋白（globulin)或白蛋白（albumin)啟動(dòng)子（Wu等，1998,PlantCellPhysiol.39:885_889)，來(lái)自豆球蛋白（legumin)B4和蠶豆（Viciafaba)的未知的種子蛋白基因的蠶豆啟動(dòng)子（Conrad等，1998,J.PlantPhysiol.152:708-711)、來(lái)自種子油體蛋白（oilbodyprotein)的啟動(dòng)子（Chen等，1998,PlantCellPhysiol.39:935-941)，來(lái)自歐洲油菜（Brassicanapus)的藏蛋白napA啟動(dòng)子，或本【
技術(shù)領(lǐng)域：
】公知的任何其他種子特異性的啟動(dòng)子，例如，在W091/14772中所描述的。此外，啟動(dòng)子可為葉特異性的啟動(dòng)子，如來(lái)自稻或番爺?shù)膔bcs啟動(dòng)子（Kyozuka等，1993,PlantPhysiol.102:991-1000)，小球藻病毒（chlorellavirus)腺噪呤甲基轉(zhuǎn)移酶（adeninemethyltransferase)基因啟動(dòng)子(Mitra和Higgins,1994,PlantMol.Biol.26:85-93)，來(lái)自稻的aldP基因啟動(dòng)子（Kagaya等，1995,Mol.Gen.Genet.248:668-674)，或傷口誘導(dǎo)的啟動(dòng)子，如馬鈴薯pin2啟動(dòng)子（Xu等，1993,PlantMol.Biol.22:573-588)。同樣地，所述啟動(dòng)子可通過(guò)非生物的處理誘導(dǎo)，所述非生物的處理諸如溫度、干旱或鹽度變化，或通過(guò)外源施加的激活所述啟動(dòng)子的物質(zhì)誘導(dǎo)，例如乙醇、雌激素（oestrogens)、植物激素（planthormones)如乙烯、脫落酸(abscisicacid)和赤霉酸（gibberellicacid)，和重金屬。[0182]啟動(dòng)子增強(qiáng)子元件也可以用于實(shí)現(xiàn)多肽或域在植物中的較高表達(dá)。例如，啟動(dòng)子增強(qiáng)子元件可以是內(nèi)含子，其置于啟動(dòng)子和編碼多肽或域的多核苷酸之間。例如Xu等，1993,見(jiàn)上，公開(kāi)了使用稻肌動(dòng)蛋白1基因的第一內(nèi)含子以增強(qiáng)表達(dá)。[0183]選擇性標(biāo)記基因和表達(dá)構(gòu)建體的任何其它部分可以選自本領(lǐng)域內(nèi)可用的那些。[0184]將核酸構(gòu)建體根據(jù)本領(lǐng)域已知的常規(guī)技術(shù)導(dǎo)入植物基因組，所述常規(guī)技術(shù)包括土壤桿菌屬（Agrobacterium)介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化、病毒介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化、顯微注射（microinjection)、粒子轟擊、生物射彈轉(zhuǎn)化和電穿孔（Gasser等，1990,Science244:1293;Potrykus,1990,Bio/Technology8:535;Shimamoto等，I989,Nature338:2>74)。[0185]根癌土壤桿菌（Agrobacteriumtumefaciens)介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移（genetransfer)，是一種產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因雙子葉植物（其綜述，參見(jiàn)Hooykas和Schilperoort,1992,PlantMol.Biol.19:15-38)，和用于轉(zhuǎn)化單子葉植物的方法，雖然對(duì)于這些植物可使用其他的轉(zhuǎn)化方法。一種產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因單子葉植物的方法是用粒子（用轉(zhuǎn)化DNA涂覆的微觀的金或鶴粒子）轟擊胚愈傷組織（embryoniccalli)或發(fā)育中的胚（developingembryos)(Christou,1992,PlantJ.2:275-281；Shimamoto,1994,Curr.Opin.Biotechnol.5:158-162;Vasil等，1992,Bio/Technology10:667-674)。轉(zhuǎn)化單子葉植物的一種替代方法是基于原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化，如由Omirulleh等，1993,PlantMol.Biol.21:415-428所描述的。其它轉(zhuǎn)化方法包括描述于美國(guó)專利號(hào)6,395,966和7,151,204中的那些（兩者均通過(guò)提述以其整體并入本文）。[0186]轉(zhuǎn)化之后，根據(jù)本領(lǐng)域熟知的方法選擇具有導(dǎo)入的表達(dá)構(gòu)建體的轉(zhuǎn)化體并且再生成為完整植物。通常設(shè)計(jì)轉(zhuǎn)化方法用于通過(guò)如下方法在再生期間或在后續(xù)世代中選擇性消除選擇基因：例如，使用帶有兩個(gè)獨(dú)立的T-DNA構(gòu)建體的共轉(zhuǎn)化或通過(guò)特異性重組酶位點(diǎn)特異性地切除選擇基因。[0187]除了直接用本發(fā)明的構(gòu)建體直接轉(zhuǎn)化具體植物基因型之外，還可通過(guò)將具有構(gòu)建體的植物與缺乏該構(gòu)建體的第二植物雜交來(lái)制備轉(zhuǎn)基因植物。舉例而言，可將編碼多肽或域的構(gòu)建體通過(guò)雜交而引入特定植物品種，而根本無(wú)需直接轉(zhuǎn)化該給定品種的植物。因此，本發(fā)明不僅涵蓋從依照本發(fā)明經(jīng)轉(zhuǎn)化的細(xì)胞直接再生的植物，還包括此類植物的后代（progeny)。如用于本文的，后代可指依照本發(fā)明制備的親本植物任何世代的后裔(offspring)。此種后代可包含依據(jù)本發(fā)明制備的DNA構(gòu)建體。雜交導(dǎo)致轉(zhuǎn)基因通過(guò)將起始種系供體植物種系交叉授粉而引入植物種系。此類步驟的非限制性實(shí)例描述于美國(guó)專利號(hào)7,151，204。[0188]植物通過(guò)回交轉(zhuǎn)化方法生成。舉例而言，該植物包括稱作回交轉(zhuǎn)化的基因型、種系、近交體（inbred)或雜交體（hybrid)的植物。[0189]可使用遺傳標(biāo)記以協(xié)助本發(fā)明的一種或多種轉(zhuǎn)基因從一個(gè)遺傳背景基因滲入(introgression)至另一個(gè)。標(biāo)記協(xié)助的選擇提供了相對(duì)于常規(guī)育種的優(yōu)勢(shì)，在于其可用于避免由表型變異導(dǎo)致的錯(cuò)誤。進(jìn)一步，遺傳標(biāo)記可在特定雜交的個(gè)體后代中提供有關(guān)良種種質(zhì)相對(duì)程度的數(shù)據(jù)。舉例而言，當(dāng)本不（otherwise)具有非農(nóng)藝學(xué)所需的遺傳背景但具有所需性狀的植物與良種親本雜交時(shí)，可使用遺傳標(biāo)記來(lái)選擇不僅具有目標(biāo)性狀，還具有相對(duì)較大比例的所需種質(zhì)的后代。以此方式，使一種或多種性狀基因滲入特定遺傳背景所需的世代數(shù)得到最小化。[0190]本發(fā)明亦涉及產(chǎn)生本發(fā)明的多肽或域的方法，其包括：(a)在有助于產(chǎn)生所述多肽或域的條件下培養(yǎng)轉(zhuǎn)基因植物或植物細(xì)胞，所述植物或植物細(xì)胞包含編碼多肽或域的多核苷酸；和（b)回收所述多肽或域。[0191]去除或減少內(nèi)切葡聚糖酶活性[0192]本發(fā)明還涉及用于產(chǎn)生親本細(xì)胞突變體的方法，其包括破壞或缺失編碼本發(fā)明的多肽的多核苷酸或其部分，所述方法導(dǎo)致在相同條件下培養(yǎng)時(shí)，與親本細(xì)胞相比突變的細(xì)胞產(chǎn)生較少的所述多肽。[0193]可以使用本領(lǐng)域熟知的方法（例如，插入、破壞、替代或缺失）通過(guò)減少或消除多核苷酸的表達(dá)來(lái)構(gòu)建突變細(xì)胞。在一個(gè)優(yōu)選的方面，所述多核苷酸是失活的。待修飾或失活的多核苷酸可以是，例如，編碼區(qū)或其對(duì)活性關(guān)鍵的部分，或表達(dá)編碼區(qū)所需的調(diào)節(jié)元件。這種調(diào)節(jié)或調(diào)控序列的實(shí)例可以是啟動(dòng)子序列或其功能部分，即，足以影響多核苷酸表達(dá)的部分。用于可能的修飾的其它調(diào)控序列包括但不限于前導(dǎo)序列、聚腺苷酸化序列、前肽序列、信號(hào)肽序列、轉(zhuǎn)錄終止子和轉(zhuǎn)錄激活子。[0194]可以通過(guò)向親本細(xì)胞施以誘變，并且選擇其中已將多核苷酸的表達(dá)減少或消除的突變細(xì)胞來(lái)進(jìn)行多核苷酸的修飾或失活。誘變可能是特異性的或隨機(jī)的，可以通過(guò)例如使用合適的物理或化學(xué)誘變劑進(jìn)行，通過(guò)使用合適的寡核苷酸進(jìn)行，或通過(guò)將所述DNA序列進(jìn)行PCR產(chǎn)生的誘變。此外，可以通過(guò)使用這些誘變劑的任何組合來(lái)進(jìn)行誘變。[0195]適合于本發(fā)明目的的物理或化學(xué)誘變劑的實(shí)例包括紫外線（UV)照射、羥胺、N-甲基-Ν'-硝基-N-亞硝基胍（MNNG)、0-甲基羥胺、亞硝酸、乙基甲烷磺酸酯（ethylmethanesulphonate)(EMS)、亞硫酸氫鈉、甲酸和核苷酸類似物。[0196]當(dāng)使用這些試劑時(shí)，通常通過(guò)如下方法來(lái)進(jìn)行所述誘變：在合適條件下存在選定的誘變劑時(shí)溫育待誘變的親本細(xì)胞，并篩選和/或選擇顯示基因表達(dá)減少的或無(wú)基因表達(dá)的突變體細(xì)胞。[0197]多核苷酸的修飾或失活可以通過(guò)插入、取代或缺失基因中的一個(gè)或多個(gè)核苷酸或其轉(zhuǎn)錄或翻譯所需的調(diào)控元件實(shí)現(xiàn)。例如，可以插入或去除核苷酸從而導(dǎo)致引入終止密碼子，去除起始密碼子，或改變開(kāi)讀框。按照本領(lǐng)域已知的方法通過(guò)定位誘變或PCR產(chǎn)生的誘變可以實(shí)現(xiàn)這種修飾或失活。盡管在理論上所述修飾可以在體內(nèi)進(jìn)行，即，直接在表達(dá)待修飾的多核苷酸的細(xì)胞上進(jìn)行，但優(yōu)選如下面所示例的那樣在體外進(jìn)行所述修飾。[0198]消除或減少多核苷酸表達(dá)的便利方式的例子有基于基因取代，基因缺失，或基因破壞的技術(shù)。例如，在基因破壞方法中，將相應(yīng)于內(nèi)源多核苷酸的核酸序列在體外進(jìn)行誘變以產(chǎn)生缺陷性的核酸序列，然后將其轉(zhuǎn)化入親本細(xì)胞中以產(chǎn)生缺陷基因。通過(guò)同源重組，所述缺陷性核酸序列替代了內(nèi)源性多核苷酸。可能理想的是所述缺陷性多核苷酸還編碼標(biāo)記，其可用于選擇其中多核苷酸被修飾或破壞的轉(zhuǎn)化子。在一個(gè)方面，用可選擇的標(biāo)記（如本文所述的那些）來(lái)破壞所述多核苷酸。[0199]本發(fā)明亦涉及在細(xì)胞中抑制具有內(nèi)切葡聚糖酶活性的多肽的表達(dá)的方法，其包括向細(xì)胞施用或在細(xì)胞中表達(dá)雙鏈RNA(dsRNA)分子，其中所述dsRNA包含本發(fā)明的多核苷酸的亞序列。在一個(gè)優(yōu)選的方面，所述dsRNA長(zhǎng)度為約15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25或更多個(gè)雙鏈體核苷酸。[0200]所述dsRNA優(yōu)選為小干擾RNA(siRNA)或微RNA(miRNA)。在一個(gè)優(yōu)選的方面，所述dsRNA是用于抑制轉(zhuǎn)錄的小干擾RNA。在另一個(gè)優(yōu)選的方面，所述dsRNA是用于抑制翻譯的微RNA。[0201]本發(fā)明亦涉及這樣的雙鏈RNA(dsRNA)分子，其包含SEQIDNO:1的成熟多肽編碼序列的一部分，以供在細(xì)胞中抑制所述多肽的表達(dá)。盡管本發(fā)明并不受任何具體作用機(jī)制的限制，但所述dsRNA可進(jìn)入細(xì)胞并導(dǎo)致類似或相同序列的單鏈RNA(ssRNA)，包括內(nèi)源mRNA的降解。當(dāng)細(xì)胞暴露于dsRNA時(shí)，來(lái)自同源基因的mRNA通過(guò)稱為RNA干擾（RNAi)的過(guò)程受選擇性降解。[0202]本發(fā)明的dsRNA可用于基因沉默。在一個(gè)方面，本發(fā)明提供了使用本發(fā)明的dsRNAi選擇性降解RNA的方法。該方法可在體外、離體或體內(nèi)實(shí)施。在一個(gè)方面，所述dsRNA分子可用于在細(xì)胞、器官或動(dòng)物中生成功能喪失的突變。用于制備和使用dsRNA分子選擇性降解RNA的方法是本領(lǐng)域中公知的，參見(jiàn)，例如美國(guó)專利號(hào)6,489,127;6,506,559;6,511，824;和6,515,109。[0203]本發(fā)明進(jìn)一步涉及親本細(xì)胞的突變體細(xì)胞，其包含編碼多肽的多核苷酸或其調(diào)控序列的破壞或缺失或編碼所述多肽的基因的沉默，這導(dǎo)致與親本細(xì)胞相比突變體細(xì)胞產(chǎn)生更少的多肽或不產(chǎn)生多肽。[0204]多肽缺陷型突變細(xì)胞作為表達(dá)天然和異源多肽的宿主細(xì)胞特別有用。所以，本發(fā)明進(jìn)一步涉及生產(chǎn)天然或異源多肽的方法，其包括：(a)在有助于生產(chǎn)多肽的條件下培養(yǎng)突變細(xì)胞；和（b)回收所述多肽。術(shù)語(yǔ)"異源多肽"意指對(duì)宿主細(xì)胞不是天然的多肽，例如，天然蛋白的變體。宿主細(xì)胞可包含超過(guò)一個(gè)拷貝的編碼所述天然或異源多肽的多核苷酸。[0205]用于培養(yǎng)和純化感興趣的產(chǎn)物的方法可以通過(guò)本領(lǐng)域已知的方法進(jìn)行。[0206]本發(fā)明用于產(chǎn)生基本上無(wú)內(nèi)切葡聚糖酶活性的產(chǎn)物的方法在真核多肽，特別是真菌蛋白質(zhì)例如酶的產(chǎn)生中是特別令人有興趣的。內(nèi)切葡聚糖酶活性缺陷細(xì)胞也可以用于表達(dá)在制藥上有意義的異源蛋白質(zhì)例如激素、生長(zhǎng)因子、受體等。術(shù)語(yǔ)"真核多肽"不僅包括天然多肽，也包括通過(guò)氨基酸取代、缺失或添加或其它這樣的修飾而被修飾以增強(qiáng)了活性、熱穩(wěn)定性、pH耐受性等的多肽，例如酶。[0207]在其他方面，本發(fā)明涉及基本上無(wú)內(nèi)切葡聚糖酶活性的蛋白質(zhì)產(chǎn)物，其通過(guò)本發(fā)明的方法產(chǎn)生。[0208]組合物[0209]本發(fā)明亦涉及包含本發(fā)明的多肽的組合物。[0210]所述組合物可包含本發(fā)明的多肽作為主要酶組分，例如單組分組合物。或者，所述組合物可包含多種酶活性，如選自下組的一種或多種（例如幾種）酶：纖維素酶、具有纖維素分解增強(qiáng)活性的GH61多肽、蛋白酶、脂肪酶、角質(zhì)酶、淀粉酶、果膠酶、半纖維素酶、氧化還原酶、過(guò)氧化物酶、漆酶、和轉(zhuǎn)移酶。[0211]所述組合物可依照本領(lǐng)域中已知的方法制備，并可為液體或干組合物的形式。所述組合物可依照本領(lǐng)域中已知的方法穩(wěn)定化。[0212]在一個(gè)實(shí)施方案中，組合物包含常規(guī)的成分，包括但不限于其他酶，及表面活性齊?、穩(wěn)定劑、濕潤(rùn)劑、分散劑、消泡劑、潤(rùn)滑劑、增潔劑系統(tǒng)，等等，或其混合物。[0213]用途[0214]本發(fā)明還涉及用具有內(nèi)切葡聚糖酶活性的多肽或其組合物處理紡織品的以下方法。[0215]牛.物拋光（Biopolishing)[0216]將織物，諸如纖維素材料的織物加工成準(zhǔn)備好制成衣服的材料牽涉幾個(gè)步驟：將纖維紡成紗線；從紗線構(gòu)成編織或編結(jié)織物；及隨后的準(zhǔn)備過(guò)程，染色/印花和修整(finishing)操作。準(zhǔn)備過(guò)程對(duì)于從纖維除去天然的和人為的雜質(zhì)及對(duì)于改善其在例如染色/印花和修整前的美學(xué)外觀和可處理性是必需的。常見(jiàn)的準(zhǔn)備過(guò)程包括脫漿（對(duì)于編織商品），沖刷（scouring)，和漂白，這產(chǎn)生適合于染色或修整的織物。[0217]生物拋光（Biopolishing)是一種在纖維素織物制造過(guò)程中通過(guò)在"降低的起球形成"方面改善織物質(zhì)量的酶，諸如纖維素酶對(duì)其處理的方法。生物拋光的最重要效果的特征可以在于較小的細(xì)毛和起球，增加的光澤表面/光澤，改善的織物手感，增加的持久柔軟性和/或改善的吸水性。生物拋光通常在制造編結(jié)和編織的織物或服裝的濕加工（wetprocessing)中發(fā)生。濕加工包括諸如以下的步驟，例如脫楽、沖刷、漂白、清洗、染色/印花和修整。生物拋光可以在任何濕潤(rùn)步驟后作為分開(kāi)的步驟或者可以作為分開(kāi)的步驟在任一濕潤(rùn)步驟后或與那些濕潤(rùn)步驟之任一組合實(shí)施。[0218]本發(fā)明涉及制造紡織品的方法，其通過(guò)在生物拋光過(guò)程中用具有內(nèi)切葡聚糖酶活性的分離的多肽處理紡織品進(jìn)行。[0219]在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了用于獲得具有降低的起球形成的纖維質(zhì)或含纖維素的紡織品的方法，該方法包括用水溶液中的具有內(nèi)切葡聚糖酶的多肽處理紡織品。在此實(shí)施方案中，可以對(duì)紗線、織品或衣服應(yīng)用生物拋光方法。[0220]牛.物磨光（Biostoning)[0221]一些染色的織品，如粗斜紋棉布織品需要在編織前對(duì)紗線染色。對(duì)于粗斜紋棉布織品，將經(jīng)紗例如用靛青染色，并且在編織前確定大小。優(yōu)選地，粗斜紋棉布織品的染色是環(huán)染（ring-dyeing)。本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案是用甕染料（vatdye)諸如靛青，或靛青相關(guān)染料諸如硫靛（thioindigo)，或硫化染料（sulfurdye)，或直接染料，或反應(yīng)性染料，或萘酚對(duì)紗線的環(huán)染。紗線也可以用超過(guò)一種染料染色，例如首先用硫化染料，然后用甕染料，或者反之亦然。[0222]優(yōu)選地，紗線在其被染色前經(jīng)歷沖刷（scouring)和/或漂白，以實(shí)現(xiàn)較高的粗斜紋棉布織品質(zhì)量。一般地，在編織成染色織品諸如粗斜紋棉布后，染色織品或衣服進(jìn)行到脫漿階段，優(yōu)選接著進(jìn)行生物磨光步驟和/或顏色修改步驟。[0223]本發(fā)明還涉及制造紡織品的方法，其通過(guò)在生物磨光過(guò)程中用具有內(nèi)切葡聚糖酶活性的分離的多肽處理紡織品進(jìn)行。[0224]在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了用于將顏色密度的局部變化引入染色織品或衣服表面的方法，其中該方法包括以下步驟：使織品或衣服與如本發(fā)明中定義的具有內(nèi)切葡聚糖酶的多肽接觸。優(yōu)選地，染色織品或衣服是纖維質(zhì)或含有纖維素的織品或衣服。更優(yōu)選地，染色織品是粗斜紋棉布織品，甚至更優(yōu)選地，靛青染色的粗斜紋棉布織品。[0225]在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了粗斜紋棉布制造方法，其包括：a)將粗斜紋棉布織品脫漿；b)用具有內(nèi)切葡聚糖酶活性的多肽對(duì)粗斜紋棉布生物磨光；c)漂洗。[0226]信號(hào)肽[0227]本發(fā)明還涉及編碼信號(hào)肽的分離的多核苷酸，所述信號(hào)肽包含或組成為SEQIDN0:2的氨基酸1至16。多核苷酸可以進(jìn)一步包含編碼蛋白質(zhì)的基因，其與信號(hào)肽可操作連接。優(yōu)選地，蛋白質(zhì)對(duì)于信號(hào)肽是外來(lái)的。在一個(gè)方面，編碼信號(hào)肽的多核苷酸是SEQIDNO:1的氨基酸1至48。在另一個(gè)方面，編碼信號(hào)肽的多核苷酸是SEQIDNO:1的氨基酸1至48。[0228]本發(fā)明還涉及包含此種多核苷酸的核酸構(gòu)建體、表達(dá)載體和重組宿主細(xì)胞。[0229]本發(fā)明還涉及產(chǎn)生蛋白質(zhì)的方法，包括：（a)培養(yǎng)包含此種多核苷酸的重組宿主細(xì)胞；和（b)回收所述蛋白質(zhì)。[0230]所述蛋白質(zhì)對(duì)于宿主細(xì)胞可以是天然的或異源的。術(shù)語(yǔ)"蛋白質(zhì)"在本文的意思不是指特定長(zhǎng)度的編碼產(chǎn)物，并且因此涵蓋肽、寡肽和多肽。術(shù)語(yǔ)"蛋白質(zhì)"還涵蓋經(jīng)組合以形成編碼產(chǎn)物的兩種以上多肽。所述蛋白質(zhì)還包括雜合多肽和融合多肽。[0231]優(yōu)選蛋白質(zhì)是激素、酶、受體或其部分、抗體或其部分，或報(bào)告蛋白（reporter)。例如，所述蛋白質(zhì)可為水解酶、異構(gòu)酶、連接酶、裂合酶（lyase)、氧化還原酶或轉(zhuǎn)移酶，例如氨肽酶、淀粉酶、糖酶、羧肽酶、過(guò)氧化氫酶、纖維二糖水解酶、纖維素酶、殼多糖酶、角質(zhì)酶、環(huán)糊精糖基轉(zhuǎn)移酶、脫氧核糖核酸酶、內(nèi)切葡聚糖酶、酯酶、alpha-半乳糖苷酶、beta-半乳糖苷酶、葡糖淀粉酶、alpha-葡糖苷酶、beta-葡糖苷酶、轉(zhuǎn)化酶、漆酶、脂肪酶、甘露糖苷酶、變聚糖酶（mutanase)、氧化酶、果膠分解酶、過(guò)氧化物酶、肌醇六磷酸酶、多酚氧化酶、蛋白水解酶、核糖核酸酶、轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶、或木聚糖酶。[0232]基因可以從任何原核、真核或其它來(lái)源獲得。[0233]通過(guò)以下實(shí)施例進(jìn)一步對(duì)本發(fā)明進(jìn)行描述，但不應(yīng)將其理解為對(duì)本發(fā)明范圍的限制。[0234]本方法和組合物在以下編號(hào)段落中進(jìn)一步描述。[0235]1.-種具有內(nèi)切葡聚糖酶活性的分離的多肽，其選自下組：[0236](a)多肽，其與SEQIDN0:2的成熟多肽具有至少80%，至少85%，至少90%，至少91%，至少92%，至少93%，至少94%，至少95%，至少96%，至少97%，至少98%，至少99%，或100%序列同一性；[0237](b)多肽，其由多核苷酸編碼，該多核苷酸在中等嚴(yán)格條件，中等-高嚴(yán)格條件、高嚴(yán)格條件、或非常高嚴(yán)格條件下與以下雜交：（i)SEQIDNO:1的成熟多肽編碼序列，（ii)其cDNA序列，或（iii)(i)或（ii)的全長(zhǎng)互補(bǔ)物；[0238](c)多肽，其由多核苷酸編碼，所述多核苷酸與SEQIDNO:1或其cDNA序列的成熟多肽編碼序列具有至少80%，至少85%，至少90%，至少91%，至少92%，至少93%，至少94%，至少95%，至少96%，至少97%，至少98%，至少99%，或100%序列同一性；[0239](d)SEQIDN0:2的成熟多肽的變體，其在一個(gè)或多個(gè)（例如幾個(gè)）位置包含取代、缺失和/或插入；和[0240](e)(a)，（b)，（c)，或（d)的多肽的片段，其具有內(nèi)切葡聚糖酶活性。[0241]2.在段落1的多肽的一些實(shí)施方案中，多肽與SEQIDN0:2的成熟多肽具有至少80%，至少85%，至少90%，至少91%，至少92%，至少93%，至少94%，至少95%，至少96%，至少97%，至少98%，至少99%或100%序列同一性。[0242]3.在段落1的多肽的一些實(shí)施方案中，多肽由多核苷酸編碼，所述多核苷酸在中等嚴(yán)格條件，中等-高嚴(yán)格條件，高嚴(yán)格條件，或非常高的嚴(yán)格條件下與以下雜交：（i)SEQIDN0:1的成熟多肽編碼序列，（ii)其cDNA序列，或（iii)(i)或（ii)的全長(zhǎng)互補(bǔ)物。[0243]4.在前述段落中任一項(xiàng)的多肽的一些實(shí)施方案中，多肽由多核苷酸編碼，所述多核苷酸與SEQIDNO:1的成熟多肽編碼序列或其cDNA序列具有至少80%，至少85%，至少90%，至少91%，至少92%，至少93%，至少94%，至少95%，至少96%，至少97%，至少98%，至少99%或100%序列同一性。[0244]5.在前述段落中任一項(xiàng)的多肽的一些實(shí)施方案中，多肽包含或組成為SEQIDNO:2或SEQIDNO:2的成熟多肽。[0245]6.在段落5的多肽的一些實(shí)施方案中，其中所述成熟多肽是SEQIDNO:2的氨基酸17至305。[0246]7.在段落1-4中任一項(xiàng)的多肽的一些實(shí)施方案中，其是SEQIDN0:2的成熟多肽的在一個(gè)或多個(gè)位置包含取代、缺失和/或插入的變體。[0247]8.在段落1的多肽的一些實(shí)施方案中，多肽是SEQIDN0:2的片段，其中所述片段具有內(nèi)切葡聚糖酶活性。[0248]9.-種包含催化域的分離的多肽，所述催化域選自下組：[0249](a)催化域，其與SEQIDN0:2的氨基酸17至232具有至少80%序列同一性；[0250](b)催化域，其由多核苷酸編碼，該多核苷酸在中等，中等-高、高、或非常高嚴(yán)格條件下與以下雜交：（i)SEQIDN0:1的核苷酸49至953,（ii)其cDNA序列，或或（ii)的全長(zhǎng)互補(bǔ)物；[0251](c)催化域，其由多核苷酸編碼，所述多核苷酸與SEQIDNO:1或其cDNA序列的催化域具有至少80%序列同一性；[0252](d)SEQIDN0:2的成熟多肽的變體，其在一個(gè)或多個(gè)（例如幾個(gè)）位置包含取代、缺失和/或插入；和[0253](d)SEQIDN0:2的氨基酸17至232的在一個(gè)或多個(gè)位置包含取代、缺失和/或插入的變體，和[0254](e)(a)，（b)，（c)，或（d)的催化域的片段，其具有內(nèi)切葡聚糖酶活性。[0255]10.在段落9的多肽的一些實(shí)施方案中，多肽進(jìn)一步包含纖維素結(jié)合域。[0256]11.-種分離的多肽，其包含與催化域可操作連接的纖維素結(jié)合域，其中所述結(jié)合域選自下組：[0257](a)纖維素結(jié)合域，其與SEQIDN0:2的氨基酸267至305具有至少80%序列同一I"生；[0258](b)纖維素結(jié)合域，其由多核苷酸編碼，該多核苷酸在中等，中等-高、高、或非常高嚴(yán)格條件下與以下雜交：（i)SEQIDNO:1的核苷酸1056至1172,（ii)其cDNA序列，或(iii)(i)或（ii)的全長(zhǎng)互補(bǔ)物；[0259](c)纖維素結(jié)合域，其由多核苷酸編碼，所述多核苷酸與SEQIDN0:1或其cDNA序列的核苷酸1056至1172具有至少80%序列同一性；[0260](d)SEQIDN0:2的氨基酸267至305的變體，其在一個(gè)或多個(gè)位置包含取代、缺失和/或插入；和[0261](e)(a)，（b)，（c)，或⑷的片段，其具有纖維素結(jié)合活性。[0262]12.在段落11的多肽的一些實(shí)施方案中，所述催化域獲自內(nèi)切葡聚糖酶。[0263]13.在段落1-12中任一項(xiàng)的多肽的一些實(shí)施方案中，所述多肽獲自枝頂孢屬，優(yōu)選嗜堿枝頂孢。[0264]14.一種組合物，其包含段落1-13中任一項(xiàng)的多肽。[0265]15.-種用于處理紡織品的方法，其通過(guò)用段落1-13中任一項(xiàng)的分離的多肽處理紡織品進(jìn)行。[0266]16.-種分離的多核苷酸，其編碼段落1-13中任一項(xiàng)的多肽。[0267]17.-種核酸構(gòu)建體或表達(dá)載體，其包含與一種或多種調(diào)控序列可操作連接的段落16的多核苷酸，所述調(diào)控序列指導(dǎo)所述多肽在表達(dá)宿主中生成。[0268]18.-種重組宿主細(xì)胞，其包含與一種或多種調(diào)控序列可操作連接的段落16的多核苷酸，所述調(diào)控序列指導(dǎo)所述多肽的生成。[0269]19.一種生成段落1-13中任一項(xiàng)的多肽的方法，其包括：[0270](a)在有助于所述多肽生成的條件下培養(yǎng)細(xì)胞，所述細(xì)胞以其野生型形式產(chǎn)生所述多肽；和[0271](b)回收所述多肽。[0272]20.-種生成具有內(nèi)切葡聚糖酶活性的多肽的方法，其包括：[0273](a)在有助于所述多肽生成的條件下培養(yǎng)段落18的宿主細(xì)胞；和[0274](b)回收所述多肽。[0275]21.-種轉(zhuǎn)基因植物、植物部分或植物細(xì)胞，其用編碼段落1-13中任一項(xiàng)的多肽的多核苷酸轉(zhuǎn)化。[0276]22.-種生成具有內(nèi)切葡聚糖酶活性的多肽的方法，其包括：[0277](a)在有助于所述多肽生成的條件下培養(yǎng)段落21的轉(zhuǎn)基因植物或植物細(xì)胞；和[0278](b)回收所述多肽。[0279]23.-種生成親本細(xì)胞的突變體的方法，其包括使編碼段落1-13中任一項(xiàng)的多肽的多核苷酸失活，這產(chǎn)生比親本細(xì)胞生成更少的多肽的突變體。[0280]24.通過(guò)段落23的方法生成的突變體細(xì)胞。[0281]25.段落24的突變體細(xì)胞，其進(jìn)一步包含編碼天然或異源蛋白的基因。[0282]26.-種生成蛋白質(zhì)的方法，其包括：[0283](a)在有助于所述蛋白質(zhì)生成的條件下培養(yǎng)段落24或段落25的突變體細(xì)胞；和[0284](b)回收所述蛋白質(zhì)。[0285]27.-種雙鏈抑制性RNA(dsRNA)分子，其包含段落16的多核苷酸的亞序列，其中任選地，所述dsRNA是siRNA或miRNA分子。[0286]28.段落27的雙鏈抑制性RNA(dsRNA)分子，其長(zhǎng)度是約15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25或更多個(gè)雙鏈體核苷酸。[0287]29.-種抑制細(xì)胞中具有內(nèi)切葡聚糖酶活性的多肽的表達(dá)的方法，其包括對(duì)細(xì)胞施用或在細(xì)胞中表達(dá)段落27或28的雙鏈抑制性RNA(dsRNA)分子。[0288]30.-種通過(guò)段落29的方法生成的細(xì)胞。[0289]31.段落30的細(xì)胞，其進(jìn)一步包含編碼天然或異源蛋白質(zhì)的基因。[0290]32.-種生成蛋白質(zhì)的方法，其包括：[0291](a)在有助于所述蛋白質(zhì)生成的條件下培養(yǎng)段落30或31的細(xì)胞；和[0292](b)回收所述蛋白質(zhì)。[0293]33.-種分離的多核苷酸，其編碼包含或組成為SEQIDNO:2的氨基酸1至17的信號(hào)肽。[0294]34.-種核酸構(gòu)建體或表達(dá)載體，其包含與段落33的多核苷酸可操作連接的編碼蛋白質(zhì)的基因，其中所述基因?qū)τ诰幋a信號(hào)肽的多核苷酸而言是外來(lái)的。[0295]35.-種重組宿主細(xì)胞，其包含與段落33的多核苷酸可操作連接的編碼蛋白質(zhì)的基因，其中所述基因?qū)τ诰幋a信號(hào)肽的多核苷酸而言是外來(lái)的。[0296]36.-種生成蛋白質(zhì)的方法，其包括：[0297](a)在有助于所述蛋白質(zhì)生成的條件下培養(yǎng)重組宿主細(xì)胞，其包含與段落33的多核苷酸可操作連接的編碼蛋白質(zhì)的基因，其中所述基因?qū)τ诰幋a信號(hào)肽的多核苷酸而言是外來(lái)的；和[0298](b)回收所述蛋白質(zhì)。實(shí)施例[0299]材料[0300]用作緩沖液和底物的化學(xué)品是至少試劑級(jí)的商業(yè)產(chǎn)品。[0301]菌株[0302]嗜堿枝頂孢菌株CBS114.92用作具有內(nèi)切葡聚糖酶活性的多肽的來(lái)源。米曲霉(Aspergillusoryzae)MT3568菌株用于表達(dá)編碼具有內(nèi)切葡聚糖酶活性的多肽的嗜堿枝頂孢基因。米曲霉MT3568是米曲霉JaL355(W02002/40694)的amdS(乙酰胺酶）破壞基因衍生物，其中pyrG營(yíng)養(yǎng)缺陷型通過(guò)破壞米曲霉乙酰胺酶（amdS)基因恢復(fù)。依照歐洲專利EP0238023(其并入本文）的方法制備MT3568原生質(zhì)體。[0303]培養(yǎng)基和溶液[0304]YP+2%葡萄糖培養(yǎng)基由1%酵母提取物，2%蛋白胨和2%葡萄糖構(gòu)成。這里的％指重量百分比。[0305]PDA瓊脂板由馬鈴薯浸液（通過(guò)在水中煮沸300g切片（清洗但削皮的）馬鈴薯達(dá)30分鐘，然后通過(guò)粗棉布棄去或過(guò)濾培養(yǎng)基生成馬鈴薯浸液）構(gòu)成。然后，添加蒸餾水，直到總體積懸浮液是1升，接著是20g右旋糖和20g瓊脂粉末。通過(guò)以15psi高壓滅菌15分鐘（BacteriologicalAnalyticalManual,8thEdition,RevisionA,1998)滅菌培養(yǎng)基。[0306]LB板由lOg細(xì)菌用胰蛋白胨，5g酵母提取物，lOg氯化鈉，15g細(xì)菌用瓊脂，和至1升的去離子水構(gòu)成。通過(guò)以15psi高溫滅菌15分鐘滅菌培養(yǎng)基（BacteriologicalAnalyticalManual,8thEdition,RevisionA,1998)〇[0307]COVE鹿糖板由342g鹿糖（SigmaS-9378)，20g瓊脂粉末，20mlCove鹽溶液（26gMgS04.7H20,26gKCL，26gKH2P04,50mlCove微量金屬溶液）和至1升的去離子水構(gòu)成。通過(guò)以15psi高溫滅菌15分鐘滅菌培養(yǎng)基（BacteriologicalAnalyticalManual,8thEdition,RevisionA,1998)。將培養(yǎng)基冷卻至60°C，并添加lOmM乙酰胺，15mMCsCl，TritonΧ-100(50μl/500ml)。[0308]Cove微量金屬溶液由0·04gNa2B407.10H20,0·4gCuS04.5H20,1.2gFeS04.7H20，0·7gMnS04.H20,0.8gNa2Mo04.2H20,lOgZnS04.7H20,和至1升的去離子水構(gòu)成。[0309]Dap-4C培養(yǎng)基由20g右旋糖，lOg麥芽糖，llgMgS04.7H20，lgKH2P04,2g檸檬酸，5.2gK3P04.H20,0.5g酵母提取物（Difco)，lmlDowfax63N10(DowChemicalCompany),0.5mlKU6痕量金屬溶液，2.5gCaC03，和至1升的去離子水構(gòu)成。通過(guò)以15psi高溫滅菌15分鐘滅菌培養(yǎng)基（BacteriologicalAnalyticalManual,8thEdition,RevisionA,1998)。在使用前，每150ml培養(yǎng)基對(duì)Dap-4C培養(yǎng)基添加3.5ml無(wú)菌50%(NH4)2HP04和5ml無(wú)菌20%乳酸。[0310]KU6痕量金屬溶液由0·13gNiCl2,2.5gCuS04.5H20,13.9gFeS04.7Η20,8·45gMnS04.H20,6.8gZnCl2,3g朽1檬酸，和至1升的去離子水構(gòu)成。[0311]具有50mM乙酸鹽的pH5.0緩沖液：將2.873g乙酸鈉和0.901g乙酸在去離子水中溶解。[0312]具有50mM磷酸鹽的pH6.5緩沖液：將5.642g磷酸氫二鈉十二水合物(Na2HP04·12H20)和5.344g磷酸二氫鈉脫水物（NaH2P04·2H20)在1L去離子水中溶解。[0313]具有50mM磷酸鹽的pH7.5緩沖液：將15.045g磷酸氫二鈉十二水合物(Na2HP04·12H20)和1.248g磷酸二氫鈉脫水物（NaH2P04·2H20)在1L去離子水中溶解。[0314]具有50mM磷酸鹽的pH8.5緩沖液：將17.607g磷酸氫二鈉十二水合物(Na2HP04·12H20)和0·116g磷酸二氫鉀（ΚΗ2Ρ04)在1L去離子水中溶解。[0315]酶[0316]VcGH45:來(lái)自Volutellacolletotrichoides的GH45(W09629397中的序列IdNo:17)。[0317]織品[0318]棉毛布（Cottoninterlock):40S，漂白的，HM-A0008，可獲自HMCotton,Guangzhou,Co.，Ltd,China。[0319]粗斜紋棉布：批次NoL001，7*7/76*42,120Z，可獲自HangzhouYimei,Co.，Ltd,China。[0320]方法[0321]重量減輕測(cè)定[0322]將樣本在設(shè)條件的房間（65%+/-5%適度，21+/_1°C)中放置24小時(shí)，之后對(duì)它們計(jì)數(shù)，通過(guò)分析天平（對(duì)于低于l〇〇g的樣品）或精密天平（對(duì)于超過(guò)l〇〇g的樣品）稱重，并記錄。在處理后，將所有樣品翻滾干燥1小時(shí)，并在如上文提及的設(shè)條件的房間中調(diào)節(jié)24小時(shí)。對(duì)于每份樣品，如下文限定重量減輕：重量減輕％=((處理前的重量-處理后的重量）xlOO)八處理前到達(dá)重量）[0323]起球記錄測(cè)試[0324]在正常氣候（65%+/-5%濕度，21+/_1°C)中預(yù)先調(diào)節(jié)后，用Nu-MartindaleTester(JamesΗ·HealCo.Ltd,England)磨損經(jīng)處理的和/或未處理的織品，相同類型的未處理織品在底部作為磨損的織品。在2000次旋轉(zhuǎn)后通過(guò)1-5的分級(jí)實(shí)施標(biāo)準(zhǔn)的起球測(cè)試(SwissNorm(SN)198525)，意義如下限定：[0325]記錄5:無(wú)起球[0326]記錄4:略微起球[0327]記錄3:中等起球[0328]記錄2:清楚起球[0329]記錄1:重度起球[0330]容許1/2和1/4記錄。對(duì)于每份樣品，使用來(lái)自>=2名技術(shù)人員的獨(dú)立評(píng)級(jí)的記錄的平均值作為起球記錄。[0331]通討A280得到的蛋白質(zhì)含量[0332]對(duì)于純化的蛋白質(zhì)樣品，使用280nm吸光度測(cè)量樣品的蛋白質(zhì)濃度。如下實(shí)施測(cè)量：將樣品用蒸餾水以合適的因數(shù)稀釋，然后用分光光度計(jì)UV1700在280nm測(cè)試吸光度，蒸餾水作為空白。計(jì)算基于：ε=650651^(31^1和分子量=30725g/mol(對(duì)于本發(fā)明的純化的GH45內(nèi)切葡聚糖酶P242X6)，和ε=735451^0^1和分子量=30687g/mol(對(duì)于基于成熟蛋白序列的純化的VcGH45)。依照LambertBeers定律Abs=εXcX1計(jì)算酶樣品的濃度。[0333]Abs代表280nm的吸光度。[0334]c代表酶濃度。[0335]1代表標(biāo)準(zhǔn)石英小杯的光路長(zhǎng)度。[0336]實(shí)施例1:嗜堿枝頂孢菌株CBS114.92的DNA序列信息的來(lái)源[0337]基因組序列信息由美國(guó)能源部聯(lián)合基因組研究所（JointGenomeInstitute,JGI)產(chǎn)生。從JGI下載基因組的初步裝配，并使用Pedant-Pro?序列分析包(BiomaxInformaticsAG，Martinsried,Germany)分析。使用由軟件構(gòu)建的基因模型作為起始點(diǎn)以檢測(cè)基因組中的GH45同源物。使用多個(gè)已知GH45蛋白序列作為指導(dǎo)手動(dòng)構(gòu)建更精確的基因模型。[0338]實(shí)施例2:嗜堿枝頂孢菌株CBS114.92基因組DNA提取[0339]為了生成基因組DNA以進(jìn)行PCR擴(kuò)增，通過(guò)于26°C生長(zhǎng)7天將嗜堿枝頂孢菌株CBS114.92在PDA瓊脂板上增殖。使用自PDA板收獲的孢子接種有擋板搖瓶中的25mlYP+2%葡萄糖培養(yǎng)基，并于26°C在以85rpm搖動(dòng)的情況中溫育72小時(shí)。[0340]依照修改的DNeasyPlantMaxi試劑盒方案（QiagenDanmark,Copenhagen,Denmark)分離基因組DNA。通過(guò)以14,OOOxg離心2分鐘收獲來(lái)自上述培養(yǎng)物的真菌材料。將上清液除去，并將〇.5g團(tuán)粒在具有石英砂的液氮中冷凍，并在預(yù)先冷卻的研缽中研磨成細(xì)粉末。將粉末轉(zhuǎn)移至15ml離心管，并添加5ml緩沖液API(預(yù)熱至65°C)和10μ1RNA酶A儲(chǔ)備溶液（100mg/ml)，接著進(jìn)行有力的渦旋振蕩。在于65°C在定期倒轉(zhuǎn)該管的情況中溫育10分鐘后，通過(guò)溫和混合，接著在冰上溫育10分鐘將1.8ml緩沖液AP2添加至溶胞物。然后，將溶胞物以3000xg于室溫離心5分鐘，并將上清液棄入置于50ml收集管中的QIAshreddermaxi旋轉(zhuǎn)柱中。這繼之以于室溫以3000xg離心5分鐘。將流過(guò)物轉(zhuǎn)移入新的50ml管中，并添加1.5個(gè)體積的緩沖液AP3/E，接著渦旋振蕩。將15ml樣品轉(zhuǎn)移入置于50ml收集管中的DNeasyMaxi旋轉(zhuǎn)柱中，并于室溫以3000xg離心5分鐘。棄去流過(guò)物，并將12ml緩沖液AW添加至置于50ml收集管中的DNeasyMaxi旋轉(zhuǎn)柱中，并于室溫以3000xg離心10分鐘。在棄去流過(guò)物后，重復(fù)離心以處置剩余的乙醇。將DNeasyMaxi旋轉(zhuǎn)柱轉(zhuǎn)移至新的50ml管，并添加0.5ml緩沖液AE(預(yù)熱至70°C)。在于室溫溫育5分鐘后，通過(guò)于室溫以3000xg離心5分鐘洗脫樣品。用額外的0.5ml緩沖液AE重復(fù)洗脫，并組合洗脫物。于260nm通過(guò)UV分光光度計(jì)測(cè)量收獲的DNA的濃度。[0341]實(shí)施例3:構(gòu)建含有編碼具有內(nèi)切葡聚糖酶活性的GH45多肽家族的嗜堿枝頂孢菌株CBS114.92基因組序列的米曲霉表達(dá)載體[0342]下文顯示的兩個(gè)合成的寡核苷酸引物設(shè)計(jì)用于從實(shí)施例2中制備的嗜堿枝頂孢菌株CBS114.92基因組DNA中PCR擴(kuò)增GH45內(nèi)切葡聚糖酶基因（本文給予名稱P242X6基因）。使用IN-FUSI0N?克隆試劑盒（BDBiosciences，PaloAlto，CA，USA)直接對(duì)表達(dá)載體pDaul09(W02005/042735)克隆片段。[0343]正向引物：F-P242X6[0344]5,-ACACAACTGGGGATCCACC丨ATGCGCiTCCGCCCffl_3,（SEQIDNO:3)反向引物：R-P242X6[0345]5,-CCCTCTAGATCTCGAGjCGTGCGTACATCGTAACCATCA|-3,(SEQIDNO:4)[0346]框中的字母代表基因序列。有下劃線的序列與pDaul09的插入位點(diǎn)是同源的使用MJResearchPTC-200DNAEngine實(shí)施PCR反應(yīng)。使用Phusion?高保真性PCR試劑盒(Finnzymes0y,Espoo,Finland)進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR反應(yīng)由5μ15XHF緩沖液（Finnzymes0y，Espoo，F(xiàn)inland)，0·5μldNTP(10mM)，0·5μlPllUSion?DNA聚合酶（0·2個(gè)單位/μl)(Finnzymes0y,Espoo,Finland)，1μ1引物F-P242X6(5μΜ)，1μ1引物R-P242X6(5μΜ)，0.5μ1嗜堿枝頂孢基因組DNA(100ng/y1)，和16.5μ1去離子水構(gòu)成，總體積為25μKPCR條件是于95°C持續(xù)2分鐘的1個(gè)循環(huán)，35個(gè)各于98°C持續(xù)10秒，60°C持續(xù)30秒，和72°C持續(xù)2.5分鐘的循環(huán)；和于72°C持續(xù)10分鐘的1個(gè)循環(huán)。然后，將樣品于12°C保持，直到從PCR儀取出。[0347]使用40mMTris堿，20mM乙酸鈉，ImM二鈉EDTA(TAE)緩沖液通過(guò)L0%瓊脂糖凝膠電泳分離反應(yīng)產(chǎn)物，其中從凝膠中切出1235bp產(chǎn)物條帶，并使用illustraGFX?PCRDNA和凝膠條帶純化試劑盒（GEHealthcareLifeSciences,Brondby,Denmark)依照制造商的用法說(shuō)明純化。使用IN-FUSION?克隆試劑盒將片段克隆入經(jīng)BamHI和XhoI消化的pDaul09中，產(chǎn)生質(zhì)粒pP242X6。將P242X6基因克隆入經(jīng)BamHI-XhoI消化的pDaul09中導(dǎo)致嗜堿枝頂孢P242X6基因在NA2-tpi雙重啟動(dòng)子的控制下轉(zhuǎn)錄。NA2-tpi是一種經(jīng)修飾的來(lái)自編碼黑曲霉中性alpha-淀粉酶的基因的啟動(dòng)子，其中非翻譯前導(dǎo)物已經(jīng)用來(lái)自編碼構(gòu)巢曲霉丙糖磷酸異構(gòu)酶的基因的非翻譯前導(dǎo)物替換。[0348]依照IN-FUSI0N?克隆試劑盒用法說(shuō)明實(shí)施克隆方案，生成P242X6GH45構(gòu)建體。依照制造商的方案將經(jīng)處理的質(zhì)粒和插入物轉(zhuǎn)化入OneShot?T0P10F化學(xué)感受態(tài)大腸桿菌細(xì)胞（Invitrogen,Carlsbad,CA,USA)中，并將其鋪板到每ml補(bǔ)充有0.lmg氨節(jié)青霉素的LB板上。在于37°C溫育過(guò)夜后，在LB氨芐青霉素板上的選擇下看到菌落生長(zhǎng)。將用P242X6GH45構(gòu)建體轉(zhuǎn)化的兩個(gè)菌落在每ml補(bǔ)充有0.lmg氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)，并用QIAprepSpinMiniprepKit(QIAGENInc.，Valencia,CA,USA)依照制造商的方案分離質(zhì)粒。[0349]用載體引物和P242X6基因特異性引物對(duì)分離的質(zhì)粒測(cè)序以測(cè)定沒(méi)有PCR錯(cuò)誤的代表性質(zhì)粒表達(dá)克隆。[0350]實(shí)施例4:表征編碼具有內(nèi)切葡聚糖酶活性的P242X6GH45多肽的嗜堿枝頂孢CBS114.92基因組序列[0351]使用3.1版BIG-DYE?終止劑化學(xué)（AppliedBiosystems,Inc.，F(xiàn)osterCity，CA，USA)和引物步行策略，用AppliedBiosystems3700型自動(dòng)化DNA測(cè)序儀實(shí)施嗜堿枝頂孢CBS114.92P242X6GH45基因組克隆的DNA測(cè)序。對(duì)核苷酸序列數(shù)據(jù)細(xì)察質(zhì)量，并且借助于PHRED/PHRAP軟件（UniversityofWashington,Seattle，WA,USA)將所有序列彼此比較。獲得的序列與來(lái)自北京基因組研究所（BeijingGenomeInstitute)(BGI,Shenzhen,China)的序列相同。[0352]嗜堿枝頂孢P242X6基因的核苷酸序列和推到的氨基酸序列分別顯示于SEQIDN0:1和SEQIDN0:2。SEQIDN0:1的編碼序列是包括終止密碼子的1175bp，并且被90bp(核苷酸81至170)，56bp(核苷酸420至475)，52bp(核苷酸538至589)，和59bp(核苷酸638至696)的內(nèi)含子中斷。SEQIDN0:2的編碼預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)是305個(gè)氨基酸。使用SignalP程序（Nielsen等，1997,ProteinEngineering10:1-6)，預(yù)測(cè)16個(gè)殘基的信號(hào)膚。預(yù)測(cè)的成熟蛋白含有289個(gè)氨基酸，預(yù)測(cè)的分子量為30.7kDa，且等電pH為4.92。通過(guò)使用BLAST與所有CAZY限定的亞族模塊比對(duì)氨基酸序列預(yù)測(cè)內(nèi)切葡聚糖酶催化域?yàn)榘被?7至232(Cantarel等，2009,NucleicAcidsRes.37:D233-238)，其中使用亞族內(nèi)單一的最顯著比對(duì)預(yù)測(cè)GH45域。[0353]使用具有缺口打開(kāi)罰分10,缺口延伸罰分0.5,和EBL0SUM62矩陣的Needleman和Wunsch算法（NeedlemanandWunsch,1970,J.Mol.Biol.48:443-453)測(cè)定氛基酸序列的全面成對(duì)全局比對(duì)。比對(duì)顯示了編碼具有內(nèi)切葡聚糖酶活性的P242X6GH45多肽的嗜堿枝頂孢基因的推導(dǎo)氨基酸序列（SEQIDN0:2)與具有內(nèi)切葡聚糖酶活性的來(lái)自Volutellacolletotrichoides的預(yù)測(cè)GH45家族蛋白（登錄號(hào)GENESEQP:AED55857)的推導(dǎo)的氨基酸序列共享70.4%同一性（排除缺口）。[0354]實(shí)施例5:嗜堿枝頂孢GH45內(nèi)切葡聚糖酶P242X6的表達(dá)[0355]將表達(dá)質(zhì)粒pP242X6轉(zhuǎn)化入米曲霉MT3568中。米曲霉MT3568是JaL355的AMDS(乙酰胺酶）受破壞的衍生物（W02002/40694)，其中pyrG營(yíng)養(yǎng)缺陷型在敲除米曲霉乙酰胺酶（AMDS)基因的過(guò)程中恢復(fù)。[0356]經(jīng)由單一無(wú)性孢子將轉(zhuǎn)化體在COVE蔗糖選擇板上純化，之后在PDA板上使它們形成孢子。從在YP+2%葡萄糖培養(yǎng)基中于30°C的lml96深孔靜止培養(yǎng)的培養(yǎng)上清液分析轉(zhuǎn)化體的嗜堿枝頂孢GH45多肽生成。通過(guò)考馬斯染色在E-Page8%SDS-PAGE48孔凝膠(Invitrogen,Carlsbad,CA,USA)上確認(rèn)表達(dá)。將1個(gè)轉(zhuǎn)化體選擇以進(jìn)行進(jìn)一步工作，并稱作轉(zhuǎn)化體-1。[0357]對(duì)于較大規(guī)模的生產(chǎn)，將轉(zhuǎn)化體-1孢子分散到PDA板上，并于37°C溫育5天。將匯合的孢子板用5ml0.01%TWEEN?20清洗兩次以使收集的孢子數(shù)目最大化。然后，使用孢子懸浮液接種25個(gè)含有100mlDap-4C培養(yǎng)基的500ml燒瓶中。將培養(yǎng)物于30°C在以lOOrprn不斷搖動(dòng)的情況中溫育。在接種后第4天，通過(guò)過(guò)濾流過(guò)瓶頂式MF75SuporMachV0·2μηιPES濾器（ThermoFisherScientific，Roskilde，Denmark)收集培養(yǎng)液。來(lái)自此轉(zhuǎn)化體的新鮮培養(yǎng)液產(chǎn)生約40kDa的GH45蛋白條帶。表觀的和預(yù)期的分子量之間的差異歸因于糖基化。通過(guò)肽測(cè)序確認(rèn)此條帶作為嗜堿枝頂孢GH45多肽的身份。[0358]實(shí)施例6:用于生成嗜堿枝頂孢GH45內(nèi)切葡聚糖酶P242X6的備選方法[0359]基于鑒定為SEQIDNO:1的核苷酸序列，可以從許多售主，諸如GeneArt(GENEARTAGBioPark，Josef-Engert-Str.il，93053,Regensburg,Germany)或DNA2.0(DNA2.0,14300'BrienDrive,SuiteE,MenloPark,CA94025,USA)獲得合成基因。合成基因可以設(shè)計(jì)為摻入別的DNA序列，諸如限制性位點(diǎn)或同源重組區(qū)以促進(jìn)對(duì)表達(dá)載體的克隆。[0360]使用上文描述的兩個(gè)合成寡核苷酸引物F-P242X6和F-P242X6,可以使用簡(jiǎn)單的PCR反應(yīng)從SEQIDN0:1的合成基因擴(kuò)增全長(zhǎng)可讀框。然后，可以將基因克隆入表達(dá)載體中，例如如上文描述的，并在宿主細(xì)胞中，例如在如上文描述的米曲霉中表達(dá)。[0361]實(shí)施例7:嗜堿枝頂孢GH45內(nèi)切葡聚糖酶P242X6的純化[0362]將來(lái)自實(shí)施例5的轉(zhuǎn)化體的培養(yǎng)液過(guò)濾流過(guò)0.2μm(微米）PES瓶頂式濾器以除去殘留的表達(dá)宿主。將經(jīng)過(guò)濾的培養(yǎng)液用等體積的2.4M磷酸銨，pH6.0稀釋，并將樣品再一次過(guò)濾流過(guò)0.2微米PES瓶頂式濾器以除去任何沉淀物。將粗制蛋白質(zhì)濾液在用結(jié)合緩沖液（具有1.2M硫酸銨的20mMTris-HCl，pH6,補(bǔ)充有0·5mMCaCl2)平衡的苯基S印harose高效柱（GEHealthcare)上加載。使用2個(gè)柱體積的結(jié)合緩沖液洗去未結(jié)合的蛋白質(zhì)。通過(guò)用洗脫緩沖液（補(bǔ)充有〇.5mMCaClJ^20mMTris-HCl，pH6.0)進(jìn)行的線性梯度，引起12個(gè)柱體積里從1.2M至0.0M的降低硫酸銨梯度實(shí)施洗脫。在梯度后，通過(guò)至少4個(gè)柱體積的洗脫緩沖液洗脫剩余的蛋白質(zhì)。[0363]通過(guò)活性測(cè)定法鑒定含有纖維素酶的級(jí)份。簡(jiǎn)言之，將0.2%(w/v)AZCL-HE-纖維素漿（Megazyme，I-AZCEL)在(λ1M磷酸鈉緩沖液，pH7.5中制備。將(λ575mLAZCL-HE-纖維素漿與25微升樣品混合，接著是熱混合儀（于40°C1400rpm攪動(dòng)）的20分鐘溫育。將0.lmL1MNaOH添加至管以停止反應(yīng)，并將樣品于+5°C以14000rpm離心5分鐘。將200微升反應(yīng)混合物從每份樣品轉(zhuǎn)移至96孔微量滴定板，并讀出590nm的吸光度。在SDS-PAGE(NuPAGE，invitrogen)上分析顯示超過(guò)0.1AU的0D590的級(jí)份，并合并純的級(jí)份。[0364]實(shí)施例8:在Launder-〇-meter中的生物拋光[0365]在本實(shí)施例中使用自實(shí)施例7純化的嗜堿枝頂孢GH45內(nèi)切葡聚糖酶P242X6(SEQIDN0:2的成熟肽，在此實(shí)施例中縮寫(xiě)為AaGH45)進(jìn)行生物拋光，并且將其性能與純化的切葡聚糖酶VcGH45比較。[0366]將棉織品樣本切成約16cmX16cm(各約5克）。將各樣本置于設(shè)條件的房間（65%濕度，21°C)中24小時(shí)，之后將它們計(jì)數(shù)，通過(guò)分析天平稱重，并記錄。用Launder-0-meter進(jìn)行生物拋光。將2個(gè)條件化的樣本和20個(gè)大鋼球（總共220克左右）置于每個(gè)燒杯中。將燒杯充滿如表1中規(guī)定的酶和緩沖液至總體積l〇〇ml，其可以得到液體與織品比率為約10:l(v/w)〇[0367]在選擇需要的程序后開(kāi)始Launder-O-Meter(LOM)儀，并且在溫度達(dá)到35°C或55°C時(shí)它可以保持。給每個(gè)燒杯安裝以2個(gè)Neoprin墊圈為襯里且與金屬箝位裝置緊密接近的蓋。將燒杯加載到預(yù)熱的L0M中。使用金屬架在垂直位置在4個(gè)鼓狀位置中每個(gè)容納并保護(hù)5個(gè)燒杯。于35或55°C在預(yù)置的溫度處理1小時(shí)后，將樣本從燒杯取出，并轉(zhuǎn)移到具有2g/L碳酸鈉的滅活溶液中，并于85°C保持10分鐘。然后，將樣本從滅活浴中取出，并在熱水中漂洗2次及在冷水中漂洗2次。將它們翻滾干燥1小時(shí)，條件化24小時(shí)，之后在重量減輕和起球記錄方面評(píng)估。[0368]表1中匯總的結(jié)果提示了在本文測(cè)試的所有pH/溫度，本發(fā)明中生成的AaGH45在加載相同量的蛋白質(zhì)時(shí)與VcGH45顯示更好的性能。于55°C，0.032mg蛋白質(zhì)/克織品的AaGH45在pH6.5,7.5和8.5分別提供3.3,3.6,3.5的起球記錄；比較而言，0.032mg蛋白質(zhì)/克織品的VcGH45在pH6.5,7.5和8.5提供分別1.8,2.9,1.8的起球記錄。于35°C，0.032mg蛋白質(zhì)/克織品的AaGH45在pH6.5,7·5和8.5分別提供3·0,3·1，3·3的起球記錄；比較而言，0.〇32mg蛋白質(zhì)/克織品的VcGH45在7.5和8.5兩者都提供2.5的起球記錄。AaGH45于35和55°C(其中于55°C，性能更高）在6.5至8.5的較寬pH范圍中（其中于PH7.5至8.5,性能更高）良好起作用。[0369]表1:AaGH45和VcGH45在L0M中于35或55°C，pH5-8.5生物拋光1小時(shí)[0370]【權(quán)利要求】1.一種具有內(nèi)切葡聚糖酶活性的分離的多肽，其選自下組：(a)多肽，其與SEQIDN0:2的成熟多肽具有至少80%，至少85%，至少90%，至少91%，至少92%，至少93%，至少94%，至少95%，至少96%，至少97%，至少98%，至少99%，或100%序列同一性；(b)多肽，其由多核苷酸編碼，該多核苷酸在中等嚴(yán)格條件，中等-高嚴(yán)格條件、高嚴(yán)格條件、或非常高嚴(yán)格條件下與以下雜交：（i)SEQIDΝΟ:1的成熟多肽編碼序列，（ii)其cDNA序列，或（iii)(i)或（ii)的全長(zhǎng)互補(bǔ)物；(c)多肽，其由多核苷酸編碼，所述多核苷酸與SEQIDΝΟ:1或其cDNA序列的成熟多肽編碼序列具有至少80%，至少85%，至少90%，至少91%，至少92%，至少93%，至少94%，至少95%，至少96%，至少97%，至少98%，至少99%，或100%序列同一性；(d)SEQIDNO:2的成熟多肽的變體，其在一個(gè)或多個(gè)位置包含取代、缺失和/或插入；和(e)(a)，（b)，（c)，或（d)的多肽的片段，其具有內(nèi)切葡聚糖酶活性。2.權(quán)利要求1的多肽，其包含或組成為SEQIDN0:2或SEQIDN0:2的成熟多肽。3.權(quán)利要求2的多肽，其中所述成熟多肽是SEQIDNO:2的氨基酸17至305。4.權(quán)利要求1-3中任一項(xiàng)的多肽，其是SEQIDNO:2的成熟多肽的在一個(gè)或多個(gè)位置包含取代、缺失和/或插入的變體。5.-種包含催化域的分離的多肽，所述催化域選自下組：(a)催化域，其與SEQIDN0:2的氨基酸17至232具有至少80%序列同一性；(b)催化域，其由多核苷酸編碼，該多核苷酸在中等，中等-高、高、或非常高嚴(yán)格條件下與以下雜交：（i)SEQIDN0:1的核苷酸49至953,（ii)其cDNA序列，或（iii)⑴或（ii)的全長(zhǎng)互補(bǔ)物；(c)催化域，其由多核苷酸編碼，所述多核苷酸與SEQIDNO:1或其cDNA序列的催化域具有至少80%序列同一性；(d)SEQIDNO:2的氨基酸17至232的在一個(gè)或多個(gè)位置包含取代、缺失和/或插入的變體，和(e)(a)，（b)，（c)，或（d)的催化域的片段，其具有內(nèi)切葡聚糖酶活性。6.權(quán)利要求5的多肽，其進(jìn)一步包含纖維素結(jié)合域。7.-種分離的多肽，其包含與催化域可操作連接的纖維素結(jié)合域，其中所述結(jié)合域選自下組：(a)纖維素結(jié)合域，其與SEQIDN0:2的氨基酸267至305具有至少80%序列同一性；(b)纖維素結(jié)合域，其由多核苷酸編碼，該多核苷酸在中等，中等-高、高、或非常高嚴(yán)格條件下與以下雜交：（i)SEQIDNO:1的核苷酸1056至1172,（ii)其cDNA序列，或（iii)(i)或（ii)的全長(zhǎng)互補(bǔ)物；(c)纖維素結(jié)合域，其由多核苷酸編碼，所述多核苷酸與SEQIDN0:1或其cDNA序列的核苷酸1056至1172具有至少80%序列同一性；(d)SEQIDNO:2的氨基酸267至305的變體，其在一個(gè)或多個(gè)位置包含取代、缺失和/或插入；和(e)(a)，（b)，（c)，或⑷的片段，其具有纖維素結(jié)合活性。8.權(quán)利要求5的多肽，其中所述催化域從內(nèi)切葡聚糖酶獲得。9.權(quán)利要求1-8中任一項(xiàng)的多肽，其獲自枝頂孢屬（Acremonium)，優(yōu)選嗜堿枝頂孢(Acremoniumalcalophilum)〇10.-種組合物，其包含權(quán)利要求1-9中任一項(xiàng)的多肽。11.一種用于處理紡織品的方法，其通過(guò)用權(quán)利要求1-9中任一項(xiàng)的分離的多肽處理紡織品進(jìn)行。12.-種分離的多核苷酸，其編碼權(quán)利要求1-9中任一項(xiàng)的多肽。13.-種核酸構(gòu)建體或表達(dá)載體，其包含與一種或多種調(diào)控序列可操作連接的權(quán)利要求12的多核苷酸，所述調(diào)控序列指導(dǎo)所述多肽在表達(dá)宿主中生成。14.一種重組宿主細(xì)胞，其包含與一種或多種調(diào)控序列可操作連接的權(quán)利要求12的多核苷酸，所述調(diào)控序列指導(dǎo)所述多肽的生成。15.-種生成權(quán)利要求1-9中任一項(xiàng)的多肽的方法，其包括：(a)在有助于所述多肽生成的條件下培養(yǎng)細(xì)胞，所述細(xì)胞以其野生型形式產(chǎn)生所述多肽；和(b)回收所述多肽。【文檔編號(hào)】C12N9/46GK104204199SQ201380015793【公開(kāi)日】2014年12月10日申請(qǐng)日期:2013年2月19日優(yōu)先權(quán)日:2012年2月20日【發(fā)明者】賴偉堅(jiān),N.斯博德斯伯格,L.安德森申請(qǐng)人:諾維信公司