除草劑耐受性棉花事件pDAB4468.19.10.3的制作方法
【專利摘要】棉花事件pDAB4468.19.10.3包括編碼AAD-12和PAT的基因，為含有該事件的棉花作物提供了除草劑耐受性，并實現了用于作物保護的方法。PTA-1245720120123
【專利說明】除草劑耐受性棉花事件PDAB4468. 19. 10. 3
[0001] 優先權聲明
[0002] 本專利申請要求獲得于2012年1月23日提交的美國臨時專利申請系列 No. 61/589, 594 的權益。
[0003] 背景
[0004] 當在轉基因植物中表達時，編碼AAD_12(芳氧基鏈烷酸（aryloxyalkanoate)雙加 氧酶-12)的基因能夠賦予針對苯氧基乙酸類除草劑，2, 4-D和MCPA，和吡啶基氧基乙酸類 除草劑，綠草定和氟草煙，的產業水平的耐受性。當在轉基因植物中表達時，編碼PAT (膦絲 菌素乙酰轉移酶（phosphinothricin acetyltransferase))的基因能夠引入針對膦絲菌素 除草劑（草胺膦）的耐受性。PAT已經成功地在棉花中表達，同時用作生產轉基因作物的可 篩選標記并在轉基因植物中引入針對除草劑草胺膦的商業水平的耐受性。
[0005] 已知轉基因在植物中的表達受到其在植物基因中定位的影響，這可能是由于染色 質的結構（例如異染色質）或者轉錄調節元件（例如增強子）靠近整合位點（Weising et al. ,Ann. Rev. Genet. 22:421-477, 1988)。與此同時，轉基因在基因組中的不同位點的存在 會以不同的方式影響植物的整體表型。由于這個原因，經常需要篩選大量的轉基因事件，以 便鑒定以所導入的感興趣的基因的最佳表達為特征的特定轉基因事件。例如，已經在植物 和其它生物中觀察到，導入基因的表達水平在不同事件中可能有很大的變化。也可能存在 空間或時間表達模式的差異，例如，轉基因在各種植物組織中的相對表達的差異，這可能不 符合根據存在于所導入基因構建體中的轉錄調控元件所預期的模式。由于這個原因，通常 產生數百至數千個不同的事件并對這些事件進行篩選，以便獲得具有為產業目的所期望的 轉基因表達水平和模式的單一事件。具有期望的轉基因表達水平或模式的事件可用于使用 傳統的育種方法通過有性異交（outcrossing)將轉基因漸滲（introgressing)到其它遺傳 背景中。這種雜交的后代保持原有轉化子的轉基因表達特征。這一策略被用于在若干已經 良好適應局部生長條件的品種中確保可靠的基因表達。
[0006] 理想的是，能夠檢測特定事件的存在，以便確定有性雜交的后代中是否含有感興 趣的轉基因或感興趣的轉基因群。此外，用于檢測特定事件的方法將有助于遵從，例如，要 求上市前審批（pre-market approval)和對從重組作物衍生的食品或纖維進行標注的法 規，或者有助于進行環境監測，監測田間作物的性狀，或者監測從作物的收獲品衍生的產 品，以及用于確保相關方遵從有關法規或合同條款。
[0007] 有可能通過任何本領域已知的核酸檢測方法來檢測轉基因事件的存在，包括但不 僅限于，聚合酶鏈式反應（PCR)或使用核酸探針的DNA雜交。這些檢測方法一般聚焦于頻繁 使用的遺傳元件，例如啟動子、終止子、標志物基因等，因為對于許多DNA構建體，編碼區是 可以互換的。其結果是，這些方法并不能用于區分不同的事件，特別是那些使用相同的DNA 構建體或非常相似的構建體產生的事件，除非鄰近所插入異源DNA的側翼DNA的DNA序列 是已知的。例如，美國專利申請2006/0070139中描述了一種關于玉米事件DAS-59122-7的 事件特異性PCR測定法。建立一種用于鑒定棉花事件PDAB4468. 19. 10. 3的簡單而有判別 力的方法是令人期待的。
[0008] 公開
[0009] 本發明的實施方案涉及一種新的抗除草劑的轉基因棉花轉化事件，其被命名為棉 花事件PDAB4468. 19. 10. 3,其包括如本文中描述的aad-12和pat，它們被插入到棉花細胞 基因組內的一個特定位點。代表性的棉花種子已保藏于美國典型培養物保藏中心（ATCC)， 其登錄號在第[0032]段中示明。包含該事件的棉花植物的DNA包括本文中所述的、表征 插入DNA在棉花基因組內的位置的接點/側翼序列。SEQ ID NO: 1和SEQ ID NO: 2能鑒別 棉花事件 PDAB4468. 19. 10. 3。更具體地，SEQ ID NO: 1 的 bpl354/1355 處的接點和 SEQ ID N0:2的bpl68/169處的接點的周圍序列能鑒別棉花事件pDAB4468. 19. 10. 3。下面的段落
[0013]描述了包含這些接點的序列的實例，這些接點是含有棉花事件pDAB4468. 19. 10. 3 的棉花植物的DNA的特征。
[0010] 在一個實施方案中，本發明提供了一種抗苯氧基乙酸類除草劑如2, 4-D和MCPA的 棉花植物或其部分。在另一個實施方案中，本發明提供了一種抗吡啶基氧基乙酸類除草劑 如綠草定和氟草煙的棉花植物或其部分。在一個額外的實施方案中，本發明提供了一種具 有包含一個或多個選自下組的序列的基因組的棉花植物：SEQ ID N0:1的bpl329-1380;SEQ ID NO:1 的 bpl304-1405 ;SEQ ID NO:1 的 bpl254-1455 ;SEQ ID NO:1 的 bpll54-1555 ;SEQ ID N0:1 的 bpl054-1655;SEQ ID N0:2 的 bpl43-194;SEQ ID N0:2 的 bpll8-219;SEQ ID N0:2的bp68-269;和SEQ ID N0:2的bpl-369,和其互補物。在另一個實施方案中，本發明 提供了這類植物的種子。
[0011] 在另一個實施方案中，本發明提供了耐受如下化合物的棉花植物或其部分，該化 合物被轉化成苯氧乙酸類生長素除草劑如2, 4-D和MCPA (例如2, 4-DB、MCPB等）。在進一 步的實施方案中，本發明提供了耐受如下化合物的棉花植物或其部分，該化合物可以被轉 化成吡啶基氧基乙酸類除草劑如綠草定和氟草煙（例如綠草定B、氟草煙B等）。苯氧乙酸 生長素和吡啶基氧基乙酸除草劑中存在的丁酸部分可以通過￠-氧化被轉變成除草劑的 植物毒素形式。丁酸形式的除草劑本身是無除草活性的（nonherbicidal)。它們在易感植 物（例如棉花植物）內通過￠-氧化被轉變成其各自的酸形式，正是乙酸形式的除草劑有 植物毒性。不能夠進行快速3-氧化的植物不會受到丁酸除草劑的傷害。然而，能夠進行 快速￠-氧化并能夠將丁酸除草劑轉變成乙酸形式的植物可以隨后被AAD-12保護。因此， 本發明提供了具有包含一個或多個選自下組的序列的基因組的棉花植物：SEQ ID N0:1的 bpl329-1380;SEQ ID N0:1 的 bpl304-1405;SEQ ID N0:1 的 bpl254-1455;SEQ ID N0:1 的 bpll54-1555;SEQ ID N0:1 的 bpl054-1655;SEQ ID N0:2 的 bpl43-194;SEQ ID N0:2 的 bpll8-219;SEQ ID N0:2 的 bp68-269;和 SEQ ID N0:2 的 bpl-369,和其互補物，它們能鑒 別棉花事件PDAB4468. 19. 10. 3的存在。在另一個實施方案中，本發明提供了這類植物的種 子。
[0012] 在另一個實施方案中，本發明提供了用于控制棉花作物中雜草的方法，包括 向棉花作物施用苯氧乙酸除草劑例如2, 4-D和MCPA，其中該棉花作物包括具有包含一 個或多個選自下組的序列的基因組的棉花植物：SEQ ID N0:1的bpl329-1380;SEQ ID N0:1 的 bpl304-1405;SEQ ID N0:1 的 bpl254-1455;SEQ ID N0:1 的 bpll54-1555; SEQ ID N0:1 的 bpl054-1655;SEQ ID N0:2 的 bpl43-194;SEQ ID N0:2 的 bpll8-219; SEQ ID N0:2的bp68-269;和SEQ ID N0:2的bpl-369,和其互補物，它們能鑒別棉花事 件PDAB4468. 19. 10. 3的存在。在另一個實施方案中，本發明提供了用于控制棉花作物中 雜草的方法，包括向棉花作物施用吡啶基氧基乙酸除草劑如綠草定和氟草煙，其中該棉 花作物包括具有包含一個或多個選自下組的序列的基因組的棉花植物：SEQ ID NO:l的 bpl329-1380;SEQ ID NO:l 的 bpl304-1405;SEQ ID NO:l 的 bpl254-1455;SEQ ID NO:l 的 bpll54-1555;SEQ ID NO:l 的 bpl054-1655;SEQ ID NO:2 的 bpl43-194;SEQ ID NO:2 的 bpll8-219;SEQ ID NO:2 的 bp68-269;和 SEQ ID NO:2 的 bpl-369,和其互補物，它們能鑒 別棉花事件PDAB4468. 19. 10. 3的存在。棉花事件pDAB4468. 19. 10. 3中存在的aad-12基 因賦予對苯氧乙酸除草劑和吡啶基氧基乙酸除草劑的耐受性。
[0013] 在另一個實施方案中，本發明提供了用于控制棉花作物中雜草的方法，包括向 棉花作物施用草胺膦除草劑，所述棉花作物包括具有包含一個或多個選自下組的序列的 基因組的棉花植物：SEQ ID N0:1 的 bpl329-1380;SEQ ID N0:1 的 bpl304-1405;SEQ ID N0:1 的 bpl254-1455;SEQ ID N0:1 的 bpll54-1555;SEQ ID N0:1 的 bpl054-1655;SEQ ID N0:2 的 bpl43-194;SEQ ID N0:2 的 bpll8-219;SEQ ID N0:2 的 bp68-269;和 SEQ ID NO: 2的bp 1-369,和其互補物，它們能鑒別棉花事件pDAB4468. 19. 10. 3的存在。棉花事件 PDAB4468. 19. 10. 3中存在的pat基因引入對草胺膦除草劑的耐受性。
[0014] 在另一個實施方案中，本發明提供了在含有棉花DNA的樣品中檢測棉花事件 PDAB4468. 19. 10. 3的方法，所述方法包括：
[0015] (a)使所述樣品與第一引物和第二引物接觸，第一引物的長度為至少IObp并且選 擇性結合SEQ ID NO: 1的bpl-1354內的側翼序列或其互補物，第二引物的長度為至少IObp 并且選擇性結合SEQ ID N0:1的bpl355-1672內的插入序列或其互補物；和
[0016] (b)對所述引物之間產生的擴增子進行測定；或
[0017] (C)使所述樣品與第一引物和第二引物接觸，第一引物的長度為至少IObp并且選 擇性結合SEQ ID NO:2的bpl-168內的插入序列或其互補物，第二引物的長度為至少IObp 并且選擇性結合SEQ ID N0:2的bpl69-2898內的側翼序列或其互補物；和
[0018] (d)對所述引物之間產生的擴增子進行測定。
[0019] 在另一個實施方案中，本發明提供了檢測棉花事件PDAB4468. 19. 10. 3的方法，包 括：
[0020] (a)使所述樣品與第一引物和第二引物接觸，第一引物與選自下組的側翼序列選 擇性結合：SEQ ID NO: 1的bpl-1354和SEQ ID NO: 2的bpl69-2898,及其互補物，第二引物 與SEQ ID NO:3或其互補物選擇性結合；
[0021] (b)使所述樣品進行聚合酶鏈式反應；和
[0022] (C)對所述引物之間產生的擴增子進行測定。
[0023] 在另一個實施方案中，本發明提供了一種棉花植物育種的方法，包括：將第一植物 與第二棉花植物雜交產生第三棉花植物，所述第一植物包含如下的DNA，該DNA含有一個 或多個選自下組的序列：SEQ ID N0:1 的 bpl329-1380;SEQ ID N0:1 的 bpl304-1405;SEQ ID NO:1 的 bpl254-1455 ;SEQ ID NO:1 的 bpll54-1555 ;SEQ ID NO:1 的 bpl054-1655 ;SEQ ID N0:2 的 bpl43-194;SEQ ID N0:2 的 bpll8-219;SEQ ID N0:2 的 bp68-269;和 SEQ ID NO: 2的bpl-369,和其互補物；對所述第三棉花植物測定包含一個或多個選自下組的序列 的 DNA 的存在：SEQ ID N0:1 的 bpl329-1380;SEQ ID N0:1 的 bpl304-1405;SEQ ID N0:1 的 bpl254-1455;SEQ ID N0:1 的 bpll54-1555;SEQ ID N0:1 的 bpl054-1655;SEQ ID N0:2 的 bpl43-194;SEQ ID N0:2 的 bpll8-219;SEQ ID N0:2 的 bp68-269;和 SEQ ID N0:2 的 bpl-369,和其互補物。
[0024] 在另一個實施方案中，本發明提供了一種分離的DNA分子，其能鑒別棉花事件 PDAB4468. 19. 10. 3。除了 SEQ ID N0S:1和2之外，這些分子還包括長度至少為50bp，并包 括跨越SEQ ID NO: 1的bpl354/1355接點的多核苷酸序列的分子，和長度至少為50bp，并 包括跨越SEQ ID NO: 2的bpl68/169接點的多核苷酸序列的分子。實例包括：SEQ ID NO: 1 的 bpl329-1380;SEQ ID N0:1 的 bpl304-1405;SEQ ID N0:1 的 bpl254-1455;SEQ ID N0:1 的bpll54-1555;SEQ ID N0:1 的bpl054-1655;SEQ ID N0:2 的bpl43-194;SEQ ID N0:2 的 bp 118-219 ; SEQ ID NO: 2 的 bp68-269 ;和 SEQ ID NO: 2 的 bp 1-369,和其互補物。
[0025] 在另一個實施方案中，本發明提供了棉花纖維、顆粒（grain)、種子、種子油或種子 柏，在所述棉花纖維、顆粒、種子、種子油或種子柏中含有棉花事件PDAB4468. 19. 10. 3,表現 為該棉花纖維、顆粒、種子、種子油或種子柏的DNA中含有一個或多個選自下組的序列：SEQ ID NO:1 的 bpl329-1380 ;SEQ ID NO:1 的 bpl304-1405 ;SEQ ID NO:1 的 bpl254-1455 ;SEQ ID N0:1 的bpll54-1555;SEQ ID N0:1 的bpl054-1655;SEQ ID N0:2 的bpl43-194;SEQ ID NO: 2 的 bp 118-219 ; SEQ ID NO: 2 的 bp68-269 ;和 SEQ ID NO: 2 的 bp 1-369,和其互補物。
[0026] 本發明的實施方案還包括含有棉花事件pDAB4468. 19. 10. 3的棉花植物細胞和植 物部分，包括但不僅限于，花粉、胚珠、花、芽（shoot)、根和葉，以及營養細胞的細胞核、花粉 細胞、種子、種子油和種子柏、及卵細胞（egg cell)。
[0027] 在一些實施方案中，棉花事件pDAB4468. 19. 10. 3可以和其它性狀組合，其他性 狀包括例如其它除草劑耐受基因和/或昆蟲抑制蛋白和轉錄調節序列（例如RNA干擾、 dsRNA、轉錄因子等）。額外的性狀可以通過植物育種、對含有棉花事件pDAB4468. 19. 10. 3 的轉基因植物的再次轉化、或同源重組介導的靶向整合添加新性狀，而疊加到植物基因組 內。
[0028] 其它實施方案包括切離包含棉花事件PDAB4468. 19. 10. 3的多核苷酸序列，包括 例如pat基因表達盒。一旦切離多核苷酸序列，經過修飾的事件可以被重新靶定到特定的 染色體位點，在該位點中額外的多核苷酸序列與棉花事件PDAB4468. 19. 10. 3疊加。
[0029] 在一個實施方案中，本發明涵蓋棉花染色體靶位點，其位于A亞基因組3號的染色 體上SEQ ID NOS: 1和2中表示的側翼序列之間。
[0030] 在一個實施方案中，本發明涵蓋制作轉基因棉花植物的方法，包括將異源核酸插 入到A亞基因組的3號染色體上SEQ ID NO: 1和2中表示的基因組序列之間的位置，即SEQ ID NO: 1 的 bpl-1354 和 SEQ ID N0:2 的 bpl69-2898 之間的位置。
[0031] 此外，本發明的實施方案還提供了用于檢測樣品（例如棉花纖維的樣品）中主題 事件之存在的測定法。該測定法可以基于插入到棉花基因組中的重組構建體的DNA序列， 并基于插入位點側翼的基因組序列。還提供了可用于實施該測定法的試劑盒和條件。
[0032] 本發明的實施方案還部分地涉及對轉基因棉花品系中由于插入來自PDAB4468的 T-DNA而產生的邊界區域的DNA序列的克隆和分析。這些序列是唯一的。基于插入序列和 接點序列，可以生成且實際生成了事件特異性引物。PCR分析表明，這些事件可以通過分析 用這些事件特異性引物組所產生的PCR擴增子來加以辨識。因此，這些和其他相關的程序 可以用于唯一地辨識包含本發明事件的棉花品系。
[0033] -個實施方案提供了一種控制棉花作物中雜草的方法，包括向棉花作物施用苯 氧乙酸除草劑，所述棉花作物包括含有如下所述的DNA的棉花植物，所述DNA包含選自下 組的序列：SEQ ID N0:1 的 bpl329-1380;SEQ ID N0:1 的 bpl304-1405;SEQ ID N0:1 的 bpl254-1455;SEQ ID N0:1 的 bpll54-1555;SEQ ID N0:1 的 bpl054-1655;SEQ ID N0:2 的 bp 143-194 ; SEQ ID NO: 2 的 bp 118-219 ; SEQ ID NO: 2 的 bp68-269 ;和 SEQ ID NO: 2 的 bpl-369。在本方法的進一步的方面中，苯氧乙酸除草劑是2, 4-D。在本方法進一步的方面 中，苯氧乙酸除草劑是MCPA。
[0034] 一個實施方案提供了一種控制棉花作物中雜草的方法，包括向棉花作物施用吡啶 氧基乙酸除草劑，所述棉花作物包括含有如下所述的DNA的棉花植物，所述DNA包含選自 下組的序列：SEQ ID N0:1 的 bpl329-1380 ;SEQ ID N0:1 的 bpl304-1405 ;SEQ ID N0:1 的 bpl254-1455;SEQ ID N0:1 的 bpll54-1555;SEQ ID N0:1 的 bpl054-1655;SEQ ID N0:2 的 bpl43-194;SEQ ID N0:2 的 bpll8-219;SEQ ID N0:2 的 bp68-269;和 SEQ ID N0:2 的 bp 1-369。在本方法進一步的方面中，吡啶氧基乙酸除草劑是綠草定。在本方法進一步的方 面中，苯氧乙酸除草劑是氟草煙。
[0035] -個實施方案提供了一種控制棉花作物中雜草的方法，包括向棉花作物施用草 胺膦除草劑，所述棉花作物包括含有如下所述的DNA的棉花植物，所述DNA包含選自下 組的序列：SEQ ID N0:1 的 bpl329-1380;SEQ ID N0:1 的 bpl304-1405;SEQ ID N0:1 的 bpl254-1455;SEQ ID N0:1 的 bpll54-1555;SEQ ID N0:1 的 bpl054-1655;SEQ ID N0:2 的 bpl43-194;SEQ ID N0:2 的 bpll8-219;SEQ ID N0:2 的 bp68-269;和 SEQ ID N0:2 的 bpl-369。
[0036] -個實施方案提供了一種分離的DNA序列，其包含一個或多個選自下組的序列： SEQ ID N0:1 的bpl329-1380;SEQ ID N0:1 的bpl304-1405;SEQ ID N0:1 的bpl254-1455; SEQ ID N0:1 的 bpll54-1555;SEQ ID N0:1 的 bpl054-1655;SEQ ID N0:2 的 bpl43-194; SEQ ID N0:2 的 bpll8-219 ;SEQ ID N0:2 的 bp68-269 ;和 SEQ ID N0:2 的 bpl-369。
[0037] -個實施方案提供了一種棉花植物育種的方法，包括：將第一植物與第二棉花植 物雜交產生第三棉花植物，所述第一植物包含含有一個或多個選自下組的序列的DNA :SEQ ID NO:1 的 bpl329-1380 ;SEQ ID NO:1 的 bpl304-1405 ;SEQ ID NO:1 的 bpl254-1455 ;SEQ ID N0:1 的bpll54-1555;SEQ ID N0:1 的bpl054-1655;SEQ ID N0:2 的bpl43-194;SEQ ID 勵:2的匕口118-219;5￡〇10勵:2的匕口68-269;和5￡〇10勵:2的匕口1-369，和其互補物 ；以 及對所述第三棉花植物測定包含一個或多個選自下組的序列的DNA的存在：SEQ ID NO: I 的 bpl329-1380;SEQ ID N0:1 的 bpl304-1405;SEQ ID N0:1 的 bpl254-1455;SEQ ID N0:1 的bpll54-1555;SEQ ID N0:1 的bpl054-1655;SEQ ID N0:2 的bpl43-194;SEQ ID N0:2 的 bp 118-219 ; SEQ ID NO: 2 的 bp68-269 ;和 SEQ ID NO: 2 的 bp 1-369,和其互補物。
[0038] -個實施方案提供了一種分離的DNA分子，其包含接點序列，所述接點序列包含 至少一個選自下組的序列：SEQ ID N0:1 的bpl329-1380;SEQ ID N0:1 的bpl304-1405;SEQ ID N0:1 的 bpl254-1455 ;SEQ ID N0:1 的 bpll54-1555 ;SEQ ID N0:1 的 bpl054-1655 ;SEQ ID N0:2 的bpl43-194;SEQ ID N0:2 的bpll8-219;SEQ ID N0:2 的bp68-269;SEQ ID N0:2 的bp 1-369,和其互補物。
[0039] -個實施方案提供了一種棉花種子，其在基因組中包含選自下組的DNA序列：SEQ ID N0:1 的 bpl329-1380;SEQ ID N0:1 的 bpl304-1405;SEQ ID N0:1 的 bpl254-1455; SEQ ID N0:1 的 bpll54-1555;SEQ ID N0:1 的 bpl054-1655;SEQ ID N0:2 的 bpl43-194; SEQ ID N0:2 的 bpll8-219;SEQ ID N0:2 的 bp68-269;SEQ ID N0:2 的 bpl-369,和其互 補物。進一步的實施方案提供了一種棉花種子，其在基因組中包含AAD-12/PAT棉花事 件PDAB4468. 19. 10. 3,并且其代表性棉花種子被保藏在美國典型培養物保藏中心，登錄號 為No. PTA-12457。進一步的實施方案提供了一種通過種植這兩個實施方案中任一個的棉 花種子產生的棉花植物。進一步的實施方案提供了通過該棉花植物生產的棉花種子，其 中所述種子在其基因組中含有AAD-12/PAT棉花事件pDAB4468. 19. 10. 3,其與以登錄號 No. PTA-12457保藏在美國典型培養物保藏中心的棉花種子中存在的AAD-12/PAT棉花事件 PDAB4468. 19. 10. 3相同。進一步的實施方案提供了該棉花植物的部分，其中所述部分選自 下組：花粉、胚珠、花、棉鈴、芽、根和葉，并且所述部分包含所述事件。進一步的實施方案提 供了從棉花植物或其部分衍生的組合物，其中所述組合物是選自下組的商業產品：棉柏、棉 纖維和棉籽油。
[0040] 在進一步的實施方案中，棉花植物包含與SEQ ID NO: 21的殘基1，355-7, 741具有 至少95%的序列同一性的DNA序列。一個實施方案提供了上述實施方案植物的后代棉花植 物，其中所述植物對苯氧基乙酸、吡啶基氧基乙酸和草胺膦除草劑顯示耐受性，并且所述耐 受性是由于所述事件或所述基因組中編碼的蛋白質的表達導致的。
[0041] 進一步的實施方案提供了一種棉花種子，包含含有如下所述的DNA序列的基因 組，所述DNA序列與SEQ ID N0:21具有至少95%的序列同一性。進一步的實施方案提供了 通過種植該棉花種子產生的植物。
[0042] 一個實施方案提供了一種含有棉花事件PDAB4468. 19. 10. 3的轉基因棉花植物或 其部分，其中包含棉花事件PDAB4468. 19. 10. 3的代表性棉花種子已經被保藏在美國典型 培養物保藏中心，登錄號為No. PTA-12457。
[0043] 種子保藏
[0044] 作為本公開的一部分，至少2500粒含有棉花事件pDAB4468. 19. 10. 3的 棉花品系的種子被保藏在美國典型培養物保藏中心（ATCC) (10801University Boulevard, Manassas, VA, 20110)，公眾可以無限制地獲得（但是受專利權保護）。該保藏 被指定為ATCC登錄號PTA-12457,是以陶氏益農公司（Dow AgroSciences LLC)的名義于 2012年1月23日保藏的。該保藏的實施和維持遵照布達佩斯條約關于專利程序目的的種 子保藏條款。
[0045] 序列簡述
[0046] SEQ ID NO: 1是用于棉花事件pDAB4468. 19. 10. 3的5' DNA側翼邊界序列。核苷 酸1-1354是基因組序列。核苷酸1355-1672是插入序列。
[0047] SEQ ID NO: 2是用于棉花事件pDAB4468. 19. 10. 3的3' DNA側翼邊界序列。核苷 酸1-168是插入序列。核苷酸169-2898是基因組序列。
[0048] SEQ ID NO: 3是pDAB4468的T-鏈DNA序列，其在下面的表1中有注釋。
[0049] SEQ ID NO:4是用于確認3'邊界基因組DNA的寡核苷酸引物3endGl。
[0050] SEQ ID NO: 5是用于確認3'邊界基因組DNA的寡核苷酸引物3endG2。
[0051] SEQ ID NO:6是用于確認3'邊界基因組DNA的寡核苷酸引物3endG3。
[0052] SEQ ID NO: 7是用于確認5'邊界基因組DNA的寡核苷酸引物5endGl。
[0053] SEQ ID NO:8是用于確認5'邊界基因組DNA的寡核苷酸引物5endG2。
[0054] SEQ ID NO:9是用于確認5'邊界基因組DNA的寡核苷酸引物5endG3。
[0055] SEQ ID NO: 10是用于確認5'邊界基因組DNA的寡核苷酸引物5endTl。
[0056] SEQ ID NO: 11是用于確認5'邊界基因組DNA的寡核苷酸引物5endT2。
[0057] SEQ ID NO: 12是用于確認5'邊界基因組DNA的寡核苷酸引物5endT3。
[0058] SEQ ID NO: 13是用于確認3'邊界基因組DNA的寡核苷酸引物3endTl。
[0059] SEQ ID NO: 14是用于確認3'邊界基因組DNA的寡核苷酸引物3endT2。
[0060] SEQ ID NO: 15是用于確認3'邊界基因組DNA的寡核苷酸引物3endT3。
[0061] SEQ ID NO: 16是用于確認5'邊界基因組DNA的寡核苷酸引物BACG6。
[0062] SEQ ID NO: 17是用于確認5'邊界基因組DNA的寡核苷酸引物UbiRev。
[0063] SEQ ID NO: 18是用于確認5'邊界基因組DNA的寡核苷酸引物GHBACA6。
[0064] SEQ ID NO: 19是用于確認5'邊界基因組DNA的寡核苷酸引物AAD3B1。
[0065] SEQ ID NO: 20是用于確認5'邊界基因組DNA的寡核苷酸引物5endPLs。
[0066] SEQ ID NO: 21是棉花事件pDAB4468. 19. 10. 3的序列，包括5'基因組側翼序列、 PDAB4468T-鏈插入、和3'基因組側翼序列。
[0067] 附圖簡述
[0068] 圖1是含有aad-12和pat基因表達盒的pDAB4468的質粒圖。
[0069] 圖2描繪了用于確認棉花事件pDAB4468. 19. 10. 3的5'和3'邊界序列的引物位 置。
[0070] 實施本發明的模式
[0071] 棉花事件pDAB4468. 19. 10. 3插入的兩端均已被測序和表征。事件特異性測定法 已經得以開發。該事件已被定位（mapped)到棉花基因組中（A亞基因組的3號染色體）。 可以令該事件滲入到更多的優良品系中。如在上文"背景"部分提到的，將轉基因引入并整 合到植物基因組中涉及到一些隨機事件（故而將得到表達的給定插入命名為"事件"）。也 就是說，由于轉化技術眾多，諸如土壤桿菌轉化、基因槍轉化（即基因槍）和碳化硅介導的 轉化（即WHISKERS)等，無法預測轉基因將會插入在基因組中的何處。因此，鑒定插入物兩 側的側翼植物基因組DNA對于辨識具有給定插入事件的植物而言是重要的。例如，可設計 PCR引物使其產生跨越插入物和宿主基因組的接點區的PCR擴增子。該PCR擴增子可用于 鑒定插入事件的獨特或不同的類型。
[0072] 本文提供了定義和實施例，用以幫助描述本發明的實施方案，并指導本領域的普 通技術人員實踐這些實施方案。除非另有說明，否則術語可以被相關領域的普通技術人員 根據常規的用法來理解。DNA堿基的命名根據37CFR § 1. 822所述。
[0073] 如這里所使用的，術語"后代"是指包含棉花事件PDAB4468. 19. 10. 3的任何一代 親本植物的后代。
[0074] 轉基因"事件"是通過用異源DNA，即包含感興趣的轉基因的核酸構建體轉化植物 細胞，再生由于轉基因插入到植物的基因組中而產生的植物群體，且選擇特定基因組位置 中的插入為特征的特定植物而產生的。術語"事件"是指包含異源DNA的原始轉化體以及 該轉化體的后代。術語"事件"也指通過轉化體與另一含有基因組/轉基因DNA的品種之 間的有性異交產生的后代。即使經過與輪回親本進行多次回交，插入的轉基因DNA和來自 被轉化親本的側翼基因組DNA (基因組/轉基因DNA)仍存在于雜交后代的同一染色體位置 處。術語"事件"還指來自原始轉化體和其后代的、包含插入的DNA和與插入的DNA緊鄰的 側翼基因組序列的DNA，該DNA預期會被轉移給由于一個包含插入DNA的親本品系（例如原 始轉化體和通過自交產生的后代）與一個不包含插入DNA的親本品系之間的有性雜交，而 接受包括感興趣的轉基因在內的插入DNA的后代。
[0075] "接點序列"或"邊界序列"跨越下述二者的連接點：插入到基因組內的DNA ;和來 自位于該插入點側翼的棉花天然基因組的DNA。鑒定或檢測植物遺傳材料中的任一接點序 列（one or the other junction sequences)足以用來鑒別該事件。跨越本文中描述的棉 花事件中的插入點、和相似長度的側翼DNA的DNA序列被包括在內。本文中提供了這樣的 鑒別性序列的具體實例；然而，其它與各插入物的接點、或各插入物與基因組序列的接點重 疊的序列，也能鑒別，并且可以根據本發明的實施方案加以使用。
[0076] 本發明的實施方案部分地涉及使用這些側翼、接點和插入序列進行事件鑒定。相 關的PCR引物和擴增子也包含在本發明的實施方案中。根據本發明的實施方案，可以利用 使用跨越所插入的DNA和其邊界的擴增子的PCR分析方法檢測或鑒定從本專有權轉基因棉 花品系衍生的商業化轉基因棉花品系或品種。
[0077] 側翼/接點序列能鑒別棉花事件PDAB4468. 19. 10. 3。基于這些序列，生成了事件 特異性的引物。PCR分析表明，通過分析用這些事件特異性引物組產生的PCR擴增子，可以 在不同棉花基因型中鑒定這些棉花品系。因此，這些和其他相關的程序可用于唯一地鑒定 這些棉花品系。本文中鑒定的序列是唯一的。
[0078] 本發明實施方案的檢測技術可特別用于和植物育種相結合，用來在為了向后代中 引入一個或多個額外的感興趣的性狀而將包含感興趣的事件的親本植物與另一種植物品 系雜交之后，確定哪個后代植物包含給定的事件。這些PCR分析方法有利于棉花育種計劃， 以及品質控制，尤其是對商業化的轉基因棉花種子。現在還可以制作和使用用于這些轉基 因棉花品系的PCR檢測試劑盒。這也有利于產品注冊和產品管理。
[0079] 進一步地，側翼棉花/基因組序列可用于具體鑒定每一個插入物的基因組位置。 這個信息可用于制作特異針對每個事件的分子標志系統。這些可用于快速育種策略和建立 連鎖數據。
[0080] 更進一步地，側翼序列信息可用于研究和表征轉基因整合過程、基因組整合位點 特征、事件分選（sorting)、轉基因及其側翼序列的穩定性、和基因表達（尤其是涉及基因 沉默、轉基因的甲基化模式、位置效應、以及潛在的表達相關元件如MARS [基質結合區]，等 等）。
[0081] 根據本公開的所有內容，應該明確，本發明的實施方案包括基于在段落[0032]中 示明的ATCC登錄號可獲得的種子。本發明的實施方案還包括以在段落[0032]中示明的 ATCC登錄號保藏的種子所種植出的除草劑耐受性棉花植物。本發明的實施方案還包括所述 植物的部分，例如葉、組織樣品、由所述植物產生的種子、花粉等（其中植物的這些部分包 括 aad-12 和 pat，和 SEQ ID NO: 1 和 2)。
[0082] 更進一步，本發明的實施方案還包括從所保藏種子種植出的植物的子代和/或后 代植物，優選地是抗除草劑棉花植物，其中所述植物具有包含如本文中所述的可檢測接點/ 側翼序列的基因組。本文中所使用的術語"棉花"是指陸地棉（Gossypium hirsutum)，包括 其能夠用棉花植物育種而得的所有品種。
[0083] 本發明實施方案的除草劑耐受性棉花植物可以通過如下所述育種：首先使第一親 本棉花植物與第二親本棉花植物進行第一次有性雜交，其中第一親本棉花植物由本文中提 到的任何一種品系的種子長成的棉花植物構成，從而產生多個第一子代植物；然后選擇抗 草胺膦的第一子代植物；使該第一子代植物自交，從而產生多個第二子代植物；然后從這 些第二子代植物中選出抗草胺膦的植物。這些步驟可以進一步包括使所述第一子代植物或 所述第二子代植物與所述第二親本棉花植物或第三親本棉花植物回交。然后可以種植包含 本發明實施方案的棉花種子、或其后代的棉花作物。
[0084] 還應當理解，兩個不同的轉基因植物也可以交配而產生含有兩個獨立分離 (segregating)、加合的外源基因的后代。合適子代的自交可以產生對兩個加合的外源基因 均為純合的植物。還構想了與親本植物的回交和與非轉基因植物的異交，以及無性繁殖。其 他通常用于不同性狀和作物的育種方法是本領域已知的。回交育種已經被用于基因轉移， 以將簡單遺傳的、高度可遺傳的性狀引入到作為輪回親本的期望純合栽培品種中。待轉移 性狀的來源被稱為供體親本。得到的植物可望具有輪回親本（例如栽培種）的屬性和從供 體親本轉移而來的期望性狀。最初的雜交之后，選擇具有供體親本表型的個體，并與輪回親 本反復雜交（回交）。得到的植物可望具有輪回親本（例如栽培種）的屬性和從供體親本 轉移而來的期望性狀。
[0085] 類似地，本發明一個實施方案的除草劑耐受性棉花植物可以使用本領域已知的方 法用額外的轉基因進行轉化。轉化技術如土壤桿菌轉化、基因槍轉化（即基因槍）、和碳化 硅介導的轉化（即WHISKERS)，可用于將額外的轉基因導入到棉花事件pDAB4468. 19. 10. 3 的基因組中。可以進行對含有新插入的轉基因的轉基因植物的選擇和表征，以鑒定含有除 本發明實施方案aad-12和pat基因之外的其他新型轉基因的穩定整合體的植物。
[0086] 本發明實施方案的DNA分子可以用作分子標志輔助育種（MB)方法中的分子標 志。本發明實施方案的DNA分子可以在用于鑒定遺傳連鎖農藝有用性狀的方法（例如AFLP 標志、RFLP標志、RAH)標志、SNP和SSR)中使用，如本領域已知的。可以使用MAB方法在與 本發明實施方案的棉花植物（或其后代和任何其他棉花栽培品種或變種）的雜交后代中跟 蹤除草劑耐受性特性。這些DNA分子是此性狀的標志，可以使用本領域眾所周知的MB方 法在棉花植物--本發明實施方案的至少一種棉花品系或其后代在這些植物中是親本或 祖先--中跟蹤耐除草劑性狀。本發明實施方案的方法可以用于鑒定具有主題事件的任何 棉花品種。
[0087] 本發明實施方案的方法包括產生抗除草劑的棉花植物的方法，其中所述方法包括 用根據本發明一個實施方案的植物育種。更具體地，所述方法可以包括使兩個本發明實 施方案的植物雜交，或者使一個本發明實施方案的植物與任何其它植物雜交。優選的方 法進一步包括通過分析所該雜交的子代中可以根據本發明實施方案檢測到的事件和有利 的品種性能（例如產量），來篩選所述雜交的后代。例如，本發明的實施方案可用于通過 使用包含其它期望性狀（如農藝性狀、疾病耐受性或抵抗性、線蟲耐受或抵抗性和成熟日 期）的植物進行育種循環對主題事件進行跟蹤。包含主題事件和期望性狀的植物可以得 到檢測、鑒定、篩選和快速利用，例如在更多輪的育種中利用。主題事件/性狀也可以通過 育種與其他的抗昆蟲性狀和/或與其他的抗除草劑性狀結合，并根據本發明的實施方案 的方法進行跟蹤。后者的實施方案是包含與crylF和crylAc基因組合、或與具有編碼對 除草劑麥草畏耐受性的基因組合的主題事件的植物，crylF和cryIAc基因賦予對豆夜蛾 (Pseudoplusia includens)(大豆尺蠖）、Anticarsia gemmatalis (絨毛豆毛蟲）、Epinotia aporema、Omoides indicatus、Rachiplusia NU,草地夜蛾（Spodoptera frugiperda)、斜紋 夜蛾（Spodoptera cosmoides)、亞熱帶粘蟲（Spodoptera eridania)、煙芽夜蛾（Heliothis virescens)、美洲棉鈴蟲（Heliocoverpa zea)、黃色燈蛾蟲（Spilosoma virginica)和南美 玉米苗斑螟（Elasmopalpus Iignosellus)的耐受性。
[0088] 因此，本方面的實施方案可以與編碼下述抗性的性狀組合：草甘膦抗性（例如抗 性植物或細菌的EPSPS，GOX，GAT)、草胺膦抗性（例如dsm-2, bar)，乙酰乳酸合酶（ALS)抑 制性除草劑（例如咪唑啉酮[如咪草煙]、磺酰脲類、三唑嘧啶磺苯胺類、嘧啶硫代苯甲酸 類&71'1111(1；[11711：11；[(^61^03丨68)，和其它化學品[081'1，511^等])抗性、溴苯腈抗性（例如 Bxn)、HPH) (4-羥苯基-丙酮酸-雙加氧酶）酶抑制劑抗性、八氫番茄紅素去飽和酶（PDS) 抑制劑抗性、光系統II型除草劑抗性（例如psbA)、光系統I型除草劑抗性、原卟啉原氧化 酶IX(PPO)抑制型除草劑抗性（例如PP0-1)、苯脲除草劑抗性（例如CYP76B1)、麥草畏降 解酶（見例如US20030135879)，和其它可以被單獨疊加或多重組合的性狀，從而提供有效 控制或阻止雜草遷移和/或對任何前述類型的除草劑的抗性的能力。
[0089] 此外，棉花事件pDAB4468. 19. 10. 3可以和一種或多種額外的輸入（例如昆蟲抗 性、病原體抗性或脅迫耐受性等）或輸出（例如增加的產量、改善的油譜、提高的纖維品質 等）性狀組合。因此，本發明的實施方案可用于提供一套完整的改良作物品質農藝包，其能 夠靈活而成本高效地控制任意數量的農業害蟲。
[0090] 通過同源重組將多核苷酸序列整合在植物細胞中的特定染色體位點上的方法，在 本領域中已有描述。例如，如在美國專利申請公開No. 2009/0111188A1中描述的位點特異 性整合描述了利用重組酶或整合酶介導將供體多核苷酸序列引入到染色體靶中。此外，國 際專利申請NO.W02008/021207描述了鋅指介導的同源重組，用于將一個或多個供體多核 苷酸序列整合到基因組的特定位置。可以使用重組酶，例如在美國專利No. 6720475中描 述的FLP/FRT或在美國專利No. 5, 658, 772中描述的CRE/L0X，將多核苷酸序列整合到特定 的染色體位點上。最后，使用大范圍核酸酶將供體多核苷酸靶定到特定的染色體位置，在 Puchta et al.，PNAS USA93 (1996) pp. 5055-5060 中有描述。
[0091] 其它用于在植物細胞中進行位點特異性整合的方法通常是已知的并且是適用的 (Kumar et al.，Trends in Plant Sci. 6 (4) (2001) pp. 155-159)。進一步，已經在多種原 核和低等真核微生物中鑒定的位點特異性重組系統可以應用于植物中。這種系統的實例 包括，但不限于，來自魯氏酵母PSRl質粒的R/RS重組酶系統（Araki et al. (1985)J.Mol. Biol. 182:191-203)和噬菌體 Mu 的 Gin/gix 系統（Maeser and Kahlmann(1991)Mol. Gen. Genet. 230:170-176)。
[0092] 在本發明的一些實施方案中，理想的是，在現有轉基因事件的附近整合或疊加新 的轉基因。基于獨特的特征（例如單插入位點、正常的孟德爾分離和穩定的表達）和卓越 的功效組合（包括除草劑耐受性以及多種環境場所之內或跨越多種環境場所的農藝性能） 而選擇的轉基因事件，可以認為是優選的基因組位點。新整合的轉基因應當保持現有的轉 化體的轉基因表達特征。而且，由于基因組側翼序列和新整合事件的染色體位置已經被確 定，開發用于檢測和確認新整合事件的測定法將不是問題。最后，新的轉基因整合到與現有 轉基因連鎖的特定染色體位置中，將加快通過使用常規育種方法的有性異交將轉基因向其 它遺傳背景的基因滲入。
[0093] 在本發明的一些實施方案中，理想的是從轉基因事件切出多核苷酸序列。例如，如 在美國專利申請公開No. 2011/0191877中所述的轉基因切出，采用鋅指核酸酶從染色體整 合的轉基因事件中除去由基因表達盒構成的多核苷酸序列。被去除的多核苷酸序列可以是 可選擇標志。一旦切出并去除多核苷酸序列，可以通過插入多核苷酸序列來重新靶定該經 過修飾的轉基因事件。多核苷酸序列的切出和后續經修飾轉基因事件的重靶定可以提供許 多好處，例如重復使用可選擇標志物、或能夠克服由于特定基因的表達導致的對植物轉錄 組的意外改變。
[0094] 本文公開了棉花基因組中A亞基因組的3號染色體上的特定位點，其對于異源核 酸的插入是極為理想的。因此，本發明的實施方案提供了將感興趣的異源核酸導入到該預 先建立的目標位點或該目標位點附近的方法。本發明的實施方案還包括一種棉花種子和/ 或棉花植物，其包含插入在所公開的目標位點中或該位點附近的任何異源核苷酸序列。實 現這種靶向整合的一個選項是，切出本文中示例的pat表達盒和/或用不同的插入物代替 之。在此可以根據本發明的實施方案使用例如靶向同源重組，但不局限于此。
[0095] 如本文中所使用的，基因、事件或特征"疊加"是指將期望的性狀組合到一個轉基 因品系中。植物育種者通過將各自具有期望性狀的親本進行雜交，然后鑒定同時具有這些 期望性狀的后代，來疊加轉基因性狀。另一種疊加基因的方式是在轉化期間同時向植物的 細胞核內轉移兩個或多個基因。另一種疊加基因的方式是用另一個感興趣的基因再次轉化 轉基因植物。例如，基因疊加可用于組合兩種或更多種不同的特征，包括例如，兩種或更多 種不同的昆蟲性狀、昆蟲抗性性狀和疾病抗性性狀，兩種或更多種除草劑抗性性狀，和/或 昆蟲抗性性狀和除草劑抗性性狀。在感興趣的基因的基礎上使用可選擇標志物也可以視為 基因置加。
[0096] "同源重組"是指任何在相應位置處含有相似核苷酸序列的一對核苷酸序列之間 的反應，通過該反應，這兩個核苷酸序列能夠相互作用（重組）形成一個新的重組DNA序 列。相似核苷酸序列的位點在本文中分別稱為"同源序列"。一般來說，同源重組的頻率隨 著同源序列長度的增加而增大。因此，盡管同源重組可以在兩個不完全相同的核苷酸序列 之間發生，但是重組的頻率（或效率）隨著兩個序列之間差異性的增加而降低。重組可以 用每個供體上的一個同源序列和靶分子實現，從而產生"單交換"重組產物。或者，可將兩 個同源序列放置在每個靶標和供體核苷酸序列上。供體上的兩個同源序列與靶標上的兩個 同源序列之間的重組會產生"雙交換"重組產物。如果供體分子上的同源序列位于待操作 序列（例如感興趣的序列）的兩側，則與靶分子的雙交換重組將產生這樣的重組產物，其中 感興趣的序列代替了原本位于靶分子上的同源序列之間的DNA序列。通過雙交換重組事件 實現的靶標與供體之間的DNA序列交換被稱為"序列替代。"
[0097] 本發明實施方案的優選植物或種子，在其基因組中含有如本文所鑒定的起作用的 aad-12和pat核苷酸序列，以及如本文所鑒定的位于該插入物兩側的至少20-500個或更多 個毗鄰的側翼核苷酸。除非另有說明，否則提到"側翼序列"是指相對于SEQ ID N0:1和2 鑒定的那些。這些側翼序列的全部或一部分可以預期被轉移給由于含有該事件的親本品系 的有性雜交而接收被插入的DNA的后代。
[0098] 本發明的實施方案包括本發明一個實施方案的植物的可再生細胞的組織培養物。 此外，還包含從這種組織培養物再生的植物，特別是當所述植物能夠表達一個示范品種的 所有形態學和生理學特征時。本發明實施方案的優選植物具有從所述保藏種子種植的植物 的所有生理學和形態學特征。本發明的實施方案進一步包括這種種子的后代和具有感興趣 的品質性狀的種子的后代。
[0099] 如這里所使用的，"品系"是指個體之間就至少一個性狀而言顯示很小或沒有遺傳 變異的一群植物。這些品系可以通過數代的自花授粉和選擇，或者通過使用組織或細胞培 養技術從單個親本無性繁殖而獲得。
[0100] 如這里所使用的，術語"栽培種"和"品種"是同義的，是指用于商業生產的品系。
[0101] "穩定性"或"穩定的"是指，相對于給定的組分，該組分在代與代之間得以保持，優 選為至少三代。
[0102] "商業效用"被定義為具有良好的植物活力和高生育力，使得作物能夠被農民用 傳統的種植設備生產，并且能夠使用常規的破碎和提取設備從種子中提取具有所述組分的 油。
[0103] "農藝學優良"是指某個品系除了由主題事件導致的除草劑耐受性之外，還具有理 想的農藝性狀，如產量、成熟度、抗病性等。這些農藝學特性和數據點中的任何一個或全部 均可用于辨識這樣的植物，無論是作為一個點還是位于用于限定此類植物的特征范圍的任 一端或兩端。
[0104] 本領域技術人員根據本公開內容會想到，檢測試劑盒的優選實施方案例如可以包 括針對和/或包含"接點序列"或"過渡序列"（棉花基因組側翼序列在此處與插入序列相 接）的探針和/或引物。例如，這包括被設計用于鑒定一個或全部兩個接點序列（插入物 在此處與側翼序列相接）的多核苷酸探針、引物、和/或擴增子。一種常見的設計是，一個 引物與側翼區雜交，一個引物與插入物雜交。這些引物的長度通常是每個約至少?15個殘 基。利用這種設置，可以利用引物生成/擴增可檢測的擴增子，該擴增子指示本發明實施方 案的事件的存在。這些引物可用于產生跨越（并包括）如上文所指出的接點序列的擴增子。
[0105] 在側翼序列中"觸地（touching down) "的引物通常不被設計為在超出接點多于大 約1200個堿基之處雜交。因此，典型的側翼引物將被設計為包括任一鏈上從插入物起點開 始向側翼序列中延伸1200個堿基以內的至少15個殘基。也就是說，包含來自（或者雜交 于）SEQ ID NO: 1的堿基對154-1672和/或SEQ ID NO: 2的堿基對1-1369的大小合適的 序列的引物，在本發明實施方案的范圍之內。插入物的引物可以類似地設計于插入物上的 任何地方，但SEQ ID NO:3的堿基對1-6287可以非排他性地用于例如此類引物的設計。 [0106] 本領域的技術人員還將會認識到，引物和探針可被設計成在一定范圍內的標準雜 交和/或PCR條件下進行雜交，其中引物或探針與示例序列不是完美互補。也就是說，某種 程度的錯配或簡并是可以容忍的。例如，對于約20個核苷酸的引物，通常一個或兩個左右 的核苷酸不需要與相反鏈結合，如果錯配的堿基在內部或者在引物的相對于擴增子的末端 的話。下面提供了各種合適的雜交條件。合成的核苷酸類似物，如肌苷，也可以用在探針中。 肽核酸（PNA)探針、以及DNA和RNA探針，也可以使用。重要的是，這些探針和引物能鑒別 (能夠唯一地鑒定和區分）本發明實施方案的事件的存在。
[0107] 應當注意的是，PCR擴增可能會出現錯誤，這可能導致例如輕微的測序錯誤。也就 是說，除非另有說明，本文中所列出的序列是通過從棉花基因組DNA生成長擴增子，然后對 擴增子進行克隆和測序而確定的。這種方式產生和確定的多個序列中發現細微的不同和 次要的差異并非罕事，考慮到需要多輪擴增才能從基因組DNA產生足夠的用于測序的擴增 子。本領域的技術人員應當會意識到并且注意到，由于這些類型的常見測序錯誤或差異而 需要進行的任何調整都在本發明實施方案的范圍之內。
[0108] 還應當注意，某些基因組序列被刪除并不罕見，例如當創建事件的過程中插入某 一序列時。因此，本主題側翼序列與例如GENBANK中列出的基因組序列之間也可能出現一 些差異。
[0109] 附圖中列舉了 DNA序列"插入物"的組分，并在下面的實施例中進行了更詳細的討 論。這些組分或其片段的DNA多核苷酸序列可以用作本發明實施方案的方法的DNA引物或 探針。
[0110] 在本發明的一些實施方案中，提供了用于檢測植物和種子等中來自棉花植物的轉 基因/基因組插入區的存在的組合物和方法。提供了這樣的DNA序列，它們包括本文中提供 的主題5'轉基因/基因組插入區域接點序列（SEQ ID NO: 1的堿基對1354/1355之間）、 其區段、和示例序列和其任意區段的互補物。提供了這樣的DNA序列，其包括本文中提供的 主題3'轉基因/基因組插入區域接點序列（SEQ ID NO:2的堿基對168/169之間）、其區 段、和示例序列和其任意區段的互補物。插入區接點序列跨越下述二者之間的接點：插入到 基因組中的異源DNA，和來自棉花細胞的位于插入位點側翼的DNA。這些序列可能能夠鑒別 給定的事件。
[0111] 根據這些插入物和邊界序列，可以生成事件特異性的引物。PCR分析表明，可以通 過分析用這些事件特異性的引物組所產生的PCR擴增子，可以在不同棉花基因型中鑒定出 本發明實施方案的棉花品系。這些和其他相關程序可用于唯一地鑒定這些棉花品系。因此， 從這樣的引物對衍生的PCR擴增子是唯一的，并可用于鑒定這些棉花品系。
[0112] 在一些實施方案中，包含新的轉基因/基因組插入區域的毗鄰片段的DNA序列是 本發明的一個方面。包括這樣的DNA序列，其包含一段足夠長度的轉基因插入序列的多核 苷酸和一段足夠長度的來自一個或多個前述棉花植物的棉花基因組序列的多核苷酸，和/ 或這樣的序列，它們可用作引物序列，用來產生能鑒別一種或多種這些棉花植物的擴增子 產物。
[0113] 相關實施方案涉及如下的DNA序列，其包含在本文中鑒定的DNA序列的轉基因部 分（例如 SEQ ID NO: 1 及其區段）的至少 10,11，12,13,14,15,16,17,18,19, 20, 21，22, 23， 24, 25或更多個毗鄰核苷酸，或其互補物，和類似長度的來自這些序列的側翼棉花DNA序 列，或其互補物。這些序列可以在DNA擴增方法中用作DNA引物。使用這些引物產生的擴 增子能鑒別本文中提到的任何棉花事件。因此，本發明的實施方案還包括由這樣的DNA引 物產生的擴增子。
[0114] 本發明的實施方案還包括用于檢測樣品中對應于本文中提到的棉花事件的DNA 的存在的方法。這些方法可以包括：(a)使包含DNA的樣品與引物組接觸，該引物組在被用 于使用來自所述棉花事件的DNA進行的核酸擴增反應中時，產生能鑒別該事件的擴增子； (b)進行核酸擴增反應，從而產生擴增子；和（c)檢測該擴增子。
[0115] 本發明實施方案進一步的檢測方法包括檢測樣品中對應于所述事件的DNA的存 在的方法，其中所述方法包括：(a)使包含DNA的樣品與探針接觸，該探針在嚴格雜交條件 下會與來自所述棉花事件的DNA雜交，并且在嚴格雜交條件下不會與對照棉花植物（非感 興趣的事件DNA)雜交；(b)將該樣品和該探針置于嚴格的雜交條件下；和（c)檢測該探針 與所述DNA的雜交。
[0116] 在更進一步的實施方案中，本發明包括產生包含本發明的一個實施方案的棉花事 件PDAB4468. 19. 10. 3的棉花植物的方法，其中所述方法包括如下的步驟：(a)將第一親本 棉花品系（包含本發明的一個實施方案的表達盒，該表達盒賦予所述品系的植物對2, 4-D 和草胺膦的耐受性）和第二親本棉花品系（其缺少上述除草劑耐受性性狀）有性雜交，從 而產生多個后代植物；和（b)通過使用分子標志物對所述后代植物進行選擇。這些方法可 以任選地包括使所述后代植物與第二親本棉花品系回交，從而產生包含抗除草劑性狀的純 育（true-breeding)棉花植物的額外步驟。
[0117] 根據本發明的另一個方面，提供了用于確定與所述事件的雜交的后代的合子型 (zygosity)的方法。所述方法可以包括使包含棉花DNA的樣品與本發明實施方案的引物組 接觸。所述的引物當被用于與來自所述棉花事件的基因組DNA進行核酸擴增反應時，可產 生能鑒別所述棉花事件的第一擴增子。這些方法進一步包括進行核酸擴增反應，從而產生 所述第一擴增子；檢測所述第一擴增子；和使包含棉花DNA的樣品與第二引物組接觸（所 述第二引物組當被用于與來自棉花植物的基因組DNA進行核酸擴增反應時，可產生第二 擴增子，該第二擴增子含有天然棉花基因組的內源序列，且不含有所述事件的多核苷酸序 列）；和進行核酸擴增反應，從而產生所述第二擴增子。該方法還包括檢測第二擴增子，并 比較樣品中的第一和第二擴增子，其中兩個擴增子的存在表明轉基因插入的合子型。
[0118] 可以使用本文公開的組合物和DNA檢測領域公知的方法開發DNA檢測試劑盒。該 試劑盒可用于鑒定樣品中的主題棉花事件，并可應用于含有該DNA的棉花植物的育種方 法。該試劑盒含有與例如本文所公開的擴增子互補的DNA序列，或者含有與和主題事件的 轉基因遺傳元件中所含有的DNA互補的DNA序列互補的DNA序列。這些DNA序列可以用于 DNA擴增反應或者作為DNA雜交方法中的探針。該試劑盒還可以含有實施該檢測方法必需 的試劑和材料。
[0119] "探針"是一種分離的核酸分子，其附接有常規的可檢測標記物或報告分子（例如 放射性同位素、配體、化學發光劑或酶）。這種探針能夠與靶核酸的鏈雜交，在本發明實施 方案的情況下，能夠與來自所述棉花事件之一（不管是來自棉花植物還是來自含有該事件 DNA的樣品）的基因組DNA的鏈雜交。根據本發明實施方案的探針不僅包括脫氧核糖核酸 或核糖核酸，還包括特異結合靶DNA序列并能夠用于檢測該靶DNA序列之存在的聚酰胺和 其它探針材料。
[0120] "引物"是分離的/合成的核酸，其通過核酸雜交與靶DNA鏈退火，從而形成引物和 靶DNA鏈之間的雜交體，然后在聚合酶，例如DNA聚合酶的作用下沿著靶DNA鏈延伸。本發 明實施方案的引物對，是指它們用于擴增靶核酸序列，例如通過聚合酶鏈式反應（PCR)或 其它常規的核酸擴增方法對擴增靶核酸序列的用途。
[0121] 探針和引物的長度通常為 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11，12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21，2 2, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31，32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41，42, 43, 44, 45, 46, 47， 48, 49, 50, 51，52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61，62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71，72, 73 ，74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81，82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91，92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 9 9, 100, 101，102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111，112, 113, 114, 115, 116, 117, 118 ，119, 120, 121，122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131，132, 133, 134, 135, 136, 137， 138, 139, 140, 141，142, 143, 144, 145, 146, 147, 148, 149, 150, 151，152, 153, 154, 155, 156, 1 57, 158, 159, 160, 161，162, 163, 164, 165, 166, 167, 168, 169, 170, 171，172, 173, 174, 175, 17 6, 177, 178, 179, 180, 181，182, 183, 184, 185, 186, 187, 188, 189, 190, 191，192, 193, 194, 195 ，196, 197, 198, 199, 200, 201，202, 203, 204, 205, 206, 207, 208, 209, 210, 211，212, 213, 214， 215, 216, 217, 218, 219, 220, 221，222, 223, 224, 225, 226, 227, 228, 229, 230, 231，232, 233, 2 34, 235, 236, 237, 238, 239, 240, 241，242, 243, 244, 245, 246, 247, 248, 249, 250, 251，252, 25 3, 254, 255, 256, 257, 258, 259, 260, 261，262, 263, 264, 265, 266, 267, 268, 269, 270, 271，272 ，273, 274, 275, 276, 277, 278, 279, 280, 281，282, 283, 284, 285, 286, 287, 288, 289, 290, 291， 292, 293, 294, 295, 296, 297, 298, 299, 300, 301，302, 303, 304, 305, 306, 307, 308, 309, 310, 3 11，312, 313, 314, 315, 316, 317, 318, 319, 320, 321，322, 323, 324, 325, 326, 327, 328, 329, 33 0, 331，332, 333, 334, 335, 336, 337, 338, 339, 340, 341，342, 343, 344, 345, 346, 347, 348, 349 ，350, 351，352, 353, 354, 355, 356, 357, 358, 359, 360, 361，362, 363, 364, 365, 366, 367, 368， 369, 370, 371，372, 373, 374, 375, 376, 377, 378, 379, 380, 381，382, 383, 384, 385, 386, 387, 3 88, 389, 390, 391，392, 393, 394, 395, 396, 397, 398, 399, 400, 401，402, 403, 404, 405, 406, 40 7, 408, 409, 410, 411，412, 413, 414, 415, 416, 417, 418, 419, 420, 421，422, 423, 424, 425, 426 ，427, 428, 429, 430, 431，432, 433, 434, 435, 436, 437, 438, 439, 440, 441，442, 443, 444, 445， 446, 447, 448, 449, 450, 451，452, 453, 454, 455, 456, 457, 458, 459, 460, 461，462, 463, 464, 4 65, 466, 467, 468, 469, 470, 471, 472, 473, 474, 475, 476, 477, 478, 479, 480, 481, 482, 483, 48 4,485,486,487,488,489,490,491,492,493,494,495,496,497,498,499,500,或 1000,或 2000,或5000個多核苷酸或者更長。這些探針和引物在嚴格雜交條件下特異性雜交于靶序 列。優選地，根據本發明實施方案的探針和引物與靶序列具有完全的序列相似性，盡管通過 常規方法也可以設計出與靶序列不同但保持與靶序列雜交的能力的探針。
[0122] 用于制備和使用探針和引物的方法在例如Molecular Cloning:A Laboratory Manual,第二版，第 1-3 卷，Sambrook 等編輯，Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N. Y.，1989中有描述。PCR引物對可以使用例如用于該目的的 計算機程序從已知的序列產生。
[0123] 基于本文中公開的側翼DNA和插入序列的引物和探針可用于通過常規方法確認 (并且，如果需要的話，修正）公開的序列，例如，通過對這些序列進行重克隆和測序。
[0124] 本發明實施方案的核酸探針和引物在嚴格條件下與靶DNA序列雜交。任何常規的 核酸雜交或擴增方法均可用于鑒定樣品中來自轉基因事件的DNA的存在。在特定情況下， 核酸分子或其片段能夠與其他的核酸分子特異性雜交。如本文所使用的，如果兩個分子能 夠形成反平行的雙鏈核酸結構，則可以說這兩個核酸分子能夠彼此特異性雜交。如果兩個 核酸分子顯示出完全的互補性，則稱一個核酸分子是另一個核酸分子的"互補物"。如本文 所使用的，當一個分子的每一個核苷酸都與另一個分子的核苷酸互補時，則可以說分子表 現出"完全互補性"。顯示完全互補性的分子通常會以足夠的穩定性彼此雜交，穩定性足以 允許它們在常規的"高嚴格性"條件下保持彼此退火。常規的高嚴格性條件如Sambrook et al.，1989 所述。
[0125] 如果兩個分子能夠彼此雜交并且在至少常規的"低嚴格性"條件具有足夠的穩定 性以允許它們保持彼此退火，則稱兩個分子顯示"最小互補性"。常規的低嚴格性條件如 Sambrook et al.，1989所述。核酸分子只需要表現出序列的最小互補性，以便能夠在所用 的特定溶劑和鹽濃度下形成穩定的雙鏈結構，就能夠用作引物或探針。
[0126] 術語"嚴格條件"或"嚴格性條件"是關于核酸探針與靶核酸雜交（即，與感興趣 的特定核酸序列雜交）的功能性定義，該雜交通過Sambrook et al.，1989在9. 52-9. 55中 討論的特定雜交程序實施。另外見Sambrook et al.，1989的9. 47-9. 52和9. 56-9. 58。
[0127] 取決于預期的應用，可以使用不同條件的嚴格條件或探針或引物的多核苷酸序列 簡并性，以實現對靶序列不同程度的雜交選擇性。對于要求高選擇性的應用，通常會采用相 對嚴格的條件來雜交一個多核苷酸序列與第二個多核苷酸序列，例如，會選擇相對低鹽和/ 或高溫條件，例如大約〇. 02M-大約0. 15M NaCl和大約50°C -大約70°C的溫度。嚴格條件， 例如，可能涉及用高嚴格性清洗緩沖液（0. 2 X SSC，0. 1% SDS，65°C )至少清洗雜交濾膜兩 次。促進DNA雜交的合適嚴格條件，例如，6. OX檸檬酸鈉/氯化銨（SSC)，大約45°C，隨后 用50°C的2. OXSSC清洗，是本領域技術人員已知的。例如，在清洗步驟中的鹽濃度可以從約 2. OX SSC，50°C的低嚴格性到大約0. 2X SSC，50°C的高嚴格性中進行選擇。另外，清洗步驟 中的溫度可以從低嚴格條件的室溫、大約約22°C增加到高嚴格條件的大約65°C。可以變化 溫度和鹽二者，或者可以保持溫度或鹽濃度恒定，而改變另一個變量。這種選擇條件可容忍 探針與模板或靶鏈之間的很小的（如果有的話）錯配。通過雜交檢測DNA序列是本領域技 術人員眾所周知的，美國專利Nos. 4, 965, 188和5, 176, 995的教導是雜交分析方法的實例。
[0128] 在一個特別優選的實施方案中，本發明一個實施方案的核酸會在高嚴格度條件下 與一個或多個本文舉例或建議的引物（或擴增子或其他序列），包括其互補物或片段，特異 性雜交。在本發明的一個方面中，本發明一個實施方案的標志物核酸分子具有本文在一個 或多個示例序列中表示的核酸序列，或其互補物和/或片段。
[0129] 在本發明的另一個方面中，本發明一個實施方案的標志物核酸分子與這樣的核酸 序列具有80% -100%或90%和100%的序列同一性。在本發明進一步的方面中，本發明一 個實施方案的標記核酸分子與這樣的序列具有95% -100%的序列同一'丨生。這樣的序列可 以在植物育種方法中用作標志物，以鑒定遺傳雜交的后代。探針與靶DNA分子的雜交可以 通過本領域技術人員已知的許多方法中的任一種進行檢測；包括但不限于，熒光標簽、放射 性標簽、基于抗體的標簽和化學發光標簽。
[0130] 關于使用特定擴增引物對的靶核酸序列的擴增（例如通過PCR)，"嚴格條件"是允 許引物對僅與這樣的靶核酸序列雜交的條件：具有相應野生型序列（或其互補物）的引物 會與該靶核酸序列結合，并優選地產生獨特的擴增產物--擴增子。
[0131] 術語"對…（靶序列）特異性"是指，探針或引物在嚴格雜交條件下僅與包含靶序 列的樣品中的靶序列雜交。
[0132] 如本文中所使用的，"擴增的DNA"或"擴增子"是指，作為核酸模板一部分的靶核酸 序列的核酸擴增產物。例如，為了確定由于有性雜交而產生的棉花植物是否含有來自本發 明實施方案的棉花植物的轉基因事件基因組DNA，可以對從棉花植物組織樣品提取的DNA 進行核酸擴增方法，其使用的引物對包括來自植物基因組中與所插入異源DNA的插入位點 相鄰的側翼序列的引物，和來自所插入異源DNA的第二引物，從而產生能鑒別該事件DNA的 存在的擴增子。擴增子的長度及其具有的序列也能鑒別該事件。擴增子的長度可以改變， 從長度等于引物對的總長加一個核苷酸堿基對，到長度等于引物對的總長加上大約2, 3, 4， 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11，12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21，22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31，3 2, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41，42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51，52, 53, 54, 55, 56, 57， 58, 59, 60, 61，62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71，72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81，82, 83 ，84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91，92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101，102, 103, 104, 105, 106， 107, 108, 109, 110, 111，112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121，122, 123, 124, 125, 1 26, 127, 128, 129, 130, 131，132, 133, 134, 135, 136, 137, 138, 139, 140, 141，142, 143, 144, 14 5, 146, 147, 148, 149, 150, 151，152, 153, 154, 155, 156, 157, 158, 159, 160, 161，162, 163, 164 ，165, 166, 167, 168, 169, 170, 171，172, 173, 174, 175, 176, 177, 178, 179, 180, 181，182, 183， 184, 185, 186, 187, 188, 189, 190, 191，192, 193, 194, 195, 196, 197, 198, 199, 200, 201，202, 2 03, 204, 205, 206, 207, 208, 209, 210, 211，212, 213, 214, 215, 216, 217, 218, 219, 220, 221，22 2, 223, 224, 225, 226, 227, 228, 229, 230, 231，232, 233, 234, 235, 236, 237, 238, 239, 240, 241 ，242, 243, 244, 245, 246, 247, 248, 249, 250, 251，252, 253, 254, 255, 256, 257, 258, 259, 260， 261，262, 263, 264, 265, 266, 267, 268, 269, 270, 271，272, 273, 274, 275, 276, 277, 278, 279, 2 80, 281，282, 283, 284, 285, 286, 287, 288, 289, 290, 291，292, 293, 294, 295, 296, 297, 298, 29 9, 300, 301，302, 303, 304, 305, 306, 307, 308, 309, 310, 311，312, 313, 314, 315, 316, 317, 318 ，319, 320, 321，322, 323, 324, 325, 326, 327, 328, 329, 330, 331，332, 333, 334, 335, 336, 337， 338, 339, 340, 341，342, 343, 344, 345, 346, 347, 348, 349, 350, 351，352, 353, 354, 355, 356, 3 57, 358, 359, 360, 361，362, 363, 364, 365, 366, 367, 368, 369, 370, 371，372, 373, 374, 375, 37 6, 377, 378, 379, 380, 381，382, 383, 384, 385, 386, 387, 388, 389, 390, 391，392, 393, 394, 395 ，396, 397, 398, 399, 400, 401，402, 403, 404, 405, 406, 407, 408, 409, 410, 411，412, 413, 414， 415, 416, 417, 418, 419, 420, 421，422, 423, 424, 425, 426, 427, 428, 429, 430, 431，432, 433, 4 34, 435, 436, 437, 438, 439, 440, 441，442, 443, 444, 445, 446, 447, 448, 449, 450, 451，452, 45 3, 454, 455, 456, 457, 458, 459, 460, 461，462, 463, 464, 465, 466, 467, 468, 469, 470, 471，472 ，473, 474, 475, 476, 477, 478, 479, 480, 481，482, 483, 484, 485, 486, 487, 488, 489, 490, 491， 492, 493, 494, 495, 496, 497, 498, 499, or500, 750, 1000, 1250, 1500, 1750, 2000 或更多個核 苷酸堿基對（加上或減去任意上述列舉的增量）。或者，引物對可以來自于插入DNA兩側的 側翼序列，從而產生一個包含整個插入核苷酸序列的擴增子。從植物基因組序列衍生的引 物對的成員可能位于與插入的DNA序列有一定距離之處。這個距離的范圍可以從1個核苷 酸堿基對到大約兩萬個核苷酸堿基對。使用的"擴增子"一詞，明確排除可能在DNA熱擴增 反應中形成的引物二聚體。
[0133] 核酸擴增可以通過任何本領域已知的各種核酸擴增方法實現，包括聚合酶鏈反 應（PCR)。多種擴增方法是本領域已知的，并且特別在美國專利No. 4683195和美國專利 No. 4, 683, 202中有描述。PCR擴增方法已經被發展用來擴增高達22kb的基因組DNA。這些 方法以及DNA擴增領域中已知的其它方法可用于本發明實施方案的實施。來自主題棉花事 件的異源轉基因DNA插入物的序列或側翼基因組序列可以如下進行驗證（以及，如果有必 要，校正）：使用從本文提供的序列衍生的引物從該事件擴增此類序列，隨后對PCR擴增子 或克隆的DNA進彳丁標準DNA測序。
[0134] 通過這些方法產生的擴增子可以通過多種技術來檢測。瓊脂糖凝膠電泳和溴化 乙錠染色是檢測DNA擴增子的公知方法。另一種這樣的方法是遺傳位分析（Genetic Bit Analysis)，其中設計一個與相鄰的側翼基因組DNA序列和插入的DNA序列均重疊的DNA寡 核苷酸。將該寡核苷酸固定在微孔板的孔中。對感興趣的區域進行PCR(使用插入序列中 的一個引物和相鄰側翼基因組序列中的一個引物）之后，單鏈PCR產物可以和該固定的寡 核苷酸雜交，并作為模板，使用DNA聚合酶和特異針對所預期的下一個堿基的標記ddNTP進 行單堿基延伸反應。通過對熒光信號的量進行定量，可以完成對結合產物的分析。熒光信 號指示由于成功的擴增、雜交和單堿基延伸造成的插入/側翼序列的存在。
[0135] 另一種方法是焦磷酸測序技術，如 Winge(Innov. Pharma. Tech. 00:18-24, 2000) 所述。在該方法中，設計與相鄰的基因組DNA和插入DNA的接點重疊的寡核苷酸。該寡核 苷酸被設計成與來自感興趣的區域的單鏈PCR產物雜交（一個引物位于插入序列中，一個 引物位于側翼基因組序列中），并在DNA聚合酶、ATP、硫酸化酶、熒光素酶、三磷酸腺苷雙磷 酸酶（apyrase)、腺苷5'磷酰硫酸和熒光素的存在下進行溫育。分別添加dNTP，摻入導致 光信號，光信號被測量。光信號指示由于成功的擴增、雜交和單或多堿基延伸造成的轉基因 插入/側翼序列的存在。
[0136] 熒光偏振是另一種可用于檢測本發明的實施方案的擴增子的方法。根據這種方 法，設計成與基因組側翼和插入DNA接點重疊的寡核苷酸。該寡核苷酸與來自感興趣的區 域的單鏈PCR產物雜交（一個引物位于插入DNA中，一個引物位于側翼基因組序列中），并 在DNA聚合酶和熒光標記的ddNTP的存在下進行溫育。單堿基延伸導致ddNTP的摻入。熒 光標記的ddNTP的摻入可以作為偏振變化用熒光儀加以測量。偏振的變化指示由于成功的 擴增、雜交、和單堿基延伸造成的轉基因插入/側翼序列的存在。
[0137] 「aq"Man? (PE Applied Biosystems, Foster City, Calif.)是檢測和定量 DNA 序列的存在的方法。簡要地說，設計與基因組側翼和插入DNA接點重疊的FRET寡核苷酸探 針。將FRET探針和PCR引物（一個引物位于插入DNA序列中，一個位于側翼基因組序列 中）在熱穩定的聚合酶和dNTP的存在下循環。在特定的擴增期間，Taq DNA聚合酶的校對 機構從FRET探針的淬滅部分上釋放出熒光部分。熒光信號指示由于成功的擴增和雜交造 成的側翼/轉基因插入序列的存在。
[0138] 分子信標（Molecular Beacon)已經被描述用于多核苷酸序列的檢測。簡要地說， 設計與側翼基因組和插入DNA接點重疊的FRET寡核苷酸探針。FRET探針的獨特結構導致 其含有二級結構，該二級結構保持熒光部分和淬滅部分緊密接近。將FRET探針和PCR引物 (一個引物位于插入DNA序列中，一個位于側翼基因組序列中）在熱穩定的聚合酶和dNTP 的存在下進行循環。在成功的PCR擴增之后，FRET探針與靶序列的雜交導致探針二級結構 的除去和熒光部分和淬滅部分在空間上的分離。結果產生熒光信號。熒光信號指示由于成 功的擴增和雜交造成的側翼基因組/轉基因插入序列的存在。
[0139] 在公開了棉花基因組中的一個非常適于插入的位置的基礎上，本發明的實施方案 還包括在該基因組位置附近的區域內含有至少一個非棉花事件PDAB4468. 19. 10. 3插入物 的棉花種子和/或棉花植物。一個選擇是用其他不同的插入物代替來自本文例舉的棉花 事件PDAB4468. 19. 10. 3的插入物。一般情況下，在特定的實施方案中采用，例如，靶向同 源重組。此類技術是，例如，W003/080809A2及相應公布的美國申請（US20030232410)的主 題。因此，本發明的實施方案包括如下的植物和植物細胞，其含有異源插入物（代替或連同 aad-12或pat基因的多個拷貝），異源插入物的兩側是本文所鑒定的全部側翼序列的或可 識別的部分（SEQ ID NO:l 的 bpl-1354 和 SEQ ID NO:2 的 bpl69-2898)。aad-12 或 pat 基 因的一個額外拷貝（或多個額外拷貝）也可以通過這種/這些方式作為插入用的靶標。
[0140] 下面的實施例被包括用于舉例說明用于實施本發明實施方案的程序，和證明本發 明的某些優選實施方案。這些實施例不應被理解為具有限制意義。本領域的技術人員應當 意識到，下面實施例中公開的技術只是代表用于例證其實踐的優選模式的特定方法。然而， 本領域的技術人員應當，根據本公開，認識到，在不背離本發明精神和范圍的前提下，可以 對這些具體實施方案進行許多變化，而仍然能夠獲得相同或類似的結果。除非另有說明，否 則所有的百分比都是按重量計，所有溶劑混合物的比例均為體積比。
[0141] 除非另有說明，使用如下的縮寫。
[0142] bp 堿基對
[0143] V 攝氏度
[0144] DNA 脫氧核糖核酸
[0145] EDTA乙二胺四乙酸
[0146] kb 千堿基
[0147] Ug 微克
[0148] UL 微升
[0149] mL 毫升
[0150] M 摩爾量（molar mass)
[0151] PCR 聚合酶鏈式反應
[0152] PTU 植物轉錄單元或表達盒
[0153] SDS 十_燒基硫酸納
[0154] SSC 含有氯化鈉和檸檬酸鈉混合物的緩沖溶液，pH7. 0
[0155] TBE 含有Tirs堿、硼酸和EDTA混合物的緩沖溶液，pH8. 3 實施例
[0156] 實施例I :aad_12和Dat棉花事件DDAB4468. 19. 10. 3的轉化和詵擇
[0157] 通過土壤桿菌介導的轉化、并使用含有草胺膦的培養基進行選擇，產生含有棉 花事件pDAB4468. 19. 10. 3的轉基因棉花（陸地棉Gossypium hirsutum)。使用去甲 (disarmed) 土壤桿菌菌株EHAlOl (Hood et al.，1993)啟動棉花植物品種Coker310的轉 化，上述菌株攜帶雙元載體PDAB4468 (圖1)，該載體在T-鏈DNA區中含有可選擇標志物pat 和感興趣的基因aad-12。pDAB4468的DNA T-鏈序列在SEQ ID N0:3中示出，且在下面表 1中有注釋。
[0158] 表1 :位于pDAB4468上的基因元件
[0159]
【權利要求】
1. 一種棉花種子，該種子在其基因組中包含選自下組的DNA序列：SEQ ID N0:1的殘基 1329-1380 ;SEQ ID NO: 1 的殘基 1304-1405 ;SEQ ID NO: 1 的殘基 1254-1455 ;SEQ ID NO: 1 的殘基 1154-1555 ;SEQ ID NO: 1 的殘基 1054-1655 ;SEQ ID NO:2 的殘基 143-194 ;SEQ ID NO :2 的殘基 118-219 ; SEQ ID NO :2 的殘基 68-269 ;和 SEQ ID NO :2 的殘基 1-369 ;及其互 補物。
2. -種棉花種子，該種子在其基因組中包含AAD-12/PAT棉花事件pDAB4468. 19. 10. 3， 并且其代表性的棉花種子被保藏于美國典型培養物保藏中心，登錄號為No. PTA-12457。
3. -種棉花植物，其是通過種植權利要求1或權利要求2的種子產生的。
4. 一種由權利要求3的植物產生的棉花種子，其中所述種子在其基因組中包含 AAD-12/PAT棉花事件pDAB4468. 19. 10. 3,該事件也存在于以登錄號No. PTA-12457保藏在 美國典型培養物保藏中心的棉花種子中。
5. 權利要求3的棉花植物的一部分，其中所述部分選自花粉、胚珠、花、棉鈴、芽、根和 葉，并且所述部分包含所述事件。
6. -種從權利要求3的棉花植物或權利要求5的部分衍生的組合物，其中所述組合物 是選自下組的商業產品：棉柏、棉纖維和棉籽油。
7. 權利要求3的植物的后代棉花植物，其中所述植物對苯氧基乙酸、吡啶氧基乙酸和 草胺膦除草劑顯示耐受性，并且所述耐受性是由于在所述事件或所述基因組中編碼的蛋白 質的表達導致的。
8. 權利要求3的棉花植物，其中所述棉花植物包含與SEQ ID NO: 21的殘基 1，355-7, 741具有至少95%的序列同一性的DNA序列。
9. 一種棉花種子，其包含含有與SEQ ID N0:21具有至少95%的序列同一性的DNA序 列的基因組。
10. 通過種植權利要求9的種子產生的植物。
11. 一種包含棉花事件PDAB4468. 19. 10. 3的轉基因棉花植物或其部分，其中包含棉花 事件PDAB4468. 19. 10. 3的代表性棉花種子已被保藏在美國典型培養物保藏中心，登錄號 為 No. PTA-12457。
12. -種分離的DNA序列，其包含一個或多個選自下組的序列：SEQ ID N0:1的 bpl329-1380;SEQ ID N0:1 的 bpl304-1405;SEQ ID N0:1 的 bpl254-1455;SEQ ID N0:1 的 bpll54-1555;SEQ ID N0:1 的 bpl054-1655;SEQ ID N0:2 的 bpl43-194;SEQ ID N0:2 的 bpll8-219 ;SEQ ID N0:2 的 bp68-269 ;和 SEQ ID N0:2 的 bpl-369。
13. -種棉花植物育種方法，包括： 將第一植物與第二棉花植物雜交產生第三棉花植物，所述第一植物包含含有一個或多 個選自下組的序列的 DNA:SEQ ID N0:1 的 bpl329-1380;SEQ ID N0:1 的 bpl304-1405;SEQ ID NO: 1 的 bpl254-1455 ;SEQ ID NO: 1 的 bpll54-1555 ;SEQ ID NO: 1 的 bpl054-1655 ;SEQ ID N0:2 的 bpl43-194;SEQ ID N0:2 的 bpll8-219;SEQ ID N0:2 的 bp68-269;和 SEQ ID N0:2的bpl-369,和其互補物；和 對所述第三棉花植物測定包含一個或多個選自下組的序列的DNA的存在：SEQ ID NO: 1 的 bpl329-1380;SEQ ID N0:1 的 bpl304-1405;SEQ ID N0:1 的 bpl254-1455;SEQ ID N0:1 的bpll54-1555;SEQ ID N0:1的bpl054-1655;SEQ ID N0:2 的bpl43-194;SEQ ID N0:2的 bpll8-219 ;SEQ ID N0:2 的 bp68-269 ;和 SEQ ID N0:2 的 bpl-369,和其互補物。
14. 一種分離的DNA分子，其包含接點序列，該接點序列含有至少一個選自下組 的序列：SEQ ID N0:1 的 bpl329-1380 ;SEQ ID N0:1 的 bpl304-1405 ;SEQ ID N0:1 的 bpl254-1455;SEQ ID N0:1 的 bpll54-1555;SEQ ID N0:1 的 bpl054-1655;SEQ ID N0:2 的 bp 143-194 ;SEQ ID NO:2 的 bp 118-219 ;SEQ ID NO:2 的 bp68-269 ;和 SEQ ID NO:2 的 bpl-369,和其互補物。
15. -種控制棉花作物中的雜草的方法，包括向棉花作物施用苯氧乙酸除草劑，所述棉 花作物包括含有如下所述的DNA的棉花植物，該DNA包含選自下組的序列：SEQ ID N0:1的 bpl329-1380;SEQ ID N0:1 的bpl304-1405;SEQ ID N0:1 的bpl254-1455;SEQ ID N0:1 的 bpll54-1555;SEQ ID N0:1 的 bpl054-1655;SEQ ID N0:2 的 bpl43-194;SEQ ID N0:2 的 bpll8-219 ;SEQ ID N0:2 的 bp68-269 ;和 SEQ ID N0:2 的 bpl-369。
16. 權利要求15的方法，其中所述苯氧乙酸除草劑是2, 4-D。
17. 權利要求15的方法，其中所述苯氧乙酸除草劑是MCPA。
18. -種控制棉花作物中的雜草的方法，包括向棉花作物施用吡啶氧基乙酸除草劑， 所述棉花作物包括含有如下所述的DNA的棉花植物，該DNA包含選自下組的序列：SEQ ID N0:1 的 bpl329-1380 ;SEQ ID N0:1 的 bpl304-1405 ;SEQ ID N0:1 的 bpl254-1455 ;SEQ ID N0:1 的 bpll54-1555;SEQ ID N0:1 的 bpl054-1655;SEQ ID N0:2 的 bpl43-194;SEQ ID N0:2 的 bpll8-219 ;SEQ ID N0:2 的 bp68-269 ;和 SEQ ID N0:2 的 bpl-369。
19. 權利要求18的方法，其中所述吡啶氧基乙酸除草劑是綠草定。
20. 權利要求18的方法，其中所述吡啶氧基乙酸除草劑是氟草煙。
21. -種控制棉花作物中的雜草的方法，包括向棉花作物施用草胺膦除草劑，所述棉花 作物包括含有如下所述的DNA的棉花植物，該DNA包含選自下組的序列：SEQ ID NO: 1的 bpl329-1380;SEQ ID N0:1 的 bpl304-1405;SEQ ID N0:1 的 bpl254-1455;SEQ ID N0:1 的 bpll54-1555;SEQ ID N0:1 的 bpl054-1655;SEQ ID N0:2 的 bpl43-194;SEQ ID N0:2 的 bpll8-219 ;SEQ ID N0:2 的 bp68-269 ;和 SEQ ID N0:2 的 bpl-369。
【文檔編號】C12N15/29GK104427863SQ201380016110
【公開日】2015年3月18日 申請日期:2013年1月23日 優先權日:2012年1月23日
【發明者】Y·C·崔, R·金, T·M·凱澤, A·E·魯賓遜, D·佩爾迪, S·G·托萊多, L·B·布拉克斯頓, D·M·安德森 申請人:陶氏益農公司