抗原和抗原組合的制作方法
【專利摘要】NTHI蛋白抗原已得到鑒定并發現在數種流感嗜血桿菌病原性菌株中保守。已經從參考菌株中對其進行分離、克隆并對免疫原性進行了測試。還公開了免疫的方法和其來源的疫苗。
【專利說明】抗原和抗原組合
[0001] 本申請要求2012年4月26日提交的英國臨時申請號1207385. 4和2012年12月 21日提交的歐洲申請號EP12199079.0的權益，其完整內容通過引用納入本文以用于所有 目的。

【技術領域】
[0002] 本發明涉及流感嗜血桿菌免疫學和疫苗學的領域，尤其是不可分型流感嗜血桿菌 (NTHI)。本發明提供了用于引起抗體和免疫應答并對抗流感嗜血桿菌菌株的抗原多肽和抗 原多肽組合。本發明還提供了含有這類抗原的組合物，及其作為對抗流感嗜血桿菌的疫苗 或藥物的用途。本發明還提供了單獨或以組合形式使用或者與其他疫苗共同使用的包含這 類抗原的免疫原性組合物。本發明還提供了引起針對流感嗜血桿菌的免疫應答的方法，以 及治療和預防流感嗜血桿菌感染的方法。

【背景技術】
[0003] 流感嗜血桿菌（Haemophilus influenzae)是一種小型、非運動性、革蘭氏陰性球 桿菌。它是一種呼吸道病原體，誘發廣譜的人感染，包括：無癥狀的上呼吸道建群（即攜 帶）；延伸自建群的粘膜表面的感染以導致中耳炎（中耳發炎）、支氣管炎、結膜炎、鼻竇炎、 尿道感染和肺炎的感染；以及侵入性感染，如菌血癥、膿毒性關節炎、會厭炎、肺炎、積膿癥、 心包炎、蜂窩織炎、骨髓炎和腦膜炎。流感嗜血桿菌是第一個公開了全基因組序列的細菌 [1]。
[0004] 流感嗜血桿菌菌株是有莢膜的（可分型）或無莢膜的（不可分型），且存在六種主 要的莢膜菌株血清類型（a至f)。流感嗜血桿菌引起的侵入性疾病中95%是由流感嗜血桿 菌b型（'Hib'）菌株引起的。Hib疾病最嚴重的表現是腦膜炎，但1980年代基于偶聯的 Hib莢膜糖的疫苗的引入已大幅降低了該疾病的發病率。
[0005] 雖然Hib感染目前已被疫苗接種控制，但其他致病性流感嗜血桿菌感染仍然存在 風險。例如，不可分型流感嗜血桿菌（NTHI)導致中耳炎（OM)，尤其是慢性和急性0M。OM很 少與死亡率相關，但其與顯著的發病率相關。失聰是最常見的OM并發癥，而行為、教育和語 言發育延遲是有溢液的早發OM的其他結果。急性OM是美國兒童中最常見的細菌感染。不 可分型流感嗜血桿菌埃及生物群（H. influenzae biogroup aegyptius)引起流行性結膜炎 和巴西紫熱（BPF) [2]，其中BPF的死亡率高達70%。
[0006] 迄今為止，抗生素是對抗統稱為OM的臨床實體譜的主要手段，但由于多重抗生素 耐受性微生物的出現，針對OM的抗生素的廣泛使用遭遇爭議。向疫苗的發展緩慢，原因在 于對OM的發病機制及其免疫應答的理解不完整。
[0007] 血清型d菌株KW20的基因組序列[1，3]可用于理解基本的流感嗜血桿菌生物學， 但相對于致病性流感嗜血桿菌菌株的用處不大，原因在于血清型d菌株通常不是病原體。 已鑒定到來自致病性不可分型流感嗜血桿菌的多肽并將其作為疫苗候選物進行研究。參考 文獻4公開了來自致病性不可分型流感嗜血桿菌菌株的免疫原性多肽。
[0008] 但是，仍需要提供能夠保護抵御廣譜的流感嗜血桿菌菌株的疫苗。流感嗜血桿菌 是高適應性微生物，其具有較高的適應新的小生境（niche)并引起多種疾病的能力。適應 性、毒力和定居因子可變化以使微生物適應不同的組織和宿主。因此，潛在的抗原承受高度 選擇壓力，其結果是不同菌株間可能具有序列差異。
[0009] 因此，仍然存在鑒定用于不可分型流感嗜血桿菌疫苗的其他和改良型抗原的需 求，尤其是用于對抗多種NTHI引發的病變的疫苗。
[0010] 可獲自ncbi. nlm. nih. gov網站的基因組（genomes)欄目下的基因組數據庫中列 有致病性和非致病性流感嗜血桿菌基因組，其蛋白少則僅為2, 500種，多則可達4, 000種。 但是，這種羅列沒有指出哪些是在致病性NTHI的主要部分中保守的，如此保守的蛋白中的 保守區域是什么，或者數千種潛在蛋白中哪些蛋白可用于疫苗以產生充分的免疫應答來保 護抵御致病性NTHI，這需要篩選大量蛋白以鑒定最佳的候選物。
[0011] 本發明的目的是提供其他和更好的抗原和/或組合，能夠有效地針對流感嗜血桿 菌的不同菌株產生免疫應答，用于開發能夠預防和/或治療由流感嗜血桿菌病原體（尤其 是不可分型流感嗜血桿菌）引起的感染的疫苗。具體而言，目標在于提供多肽和多肽組合， 用于改良的免疫原性組合物和疫苗以預防和/或治療這類感染，尤其是急性中耳炎和慢性 阻塞性肺病（COPD)。該多肽也可用于診斷目的，并作為抗生素靶點。


【發明內容】

[0012] 本發明描述了免疫中有用的不可分型流感嗜血桿菌（NTHI)多肽，以進行單獨或 聯合使用。這些多肽可與其他NTHI多肽聯用?？乖捎糜贜THI疫苗，但也可用作疫苗組 分從而針對多種病原體進行免疫。
[0013] 通過使用兩種平行方法（即外膜囊泡（OMV)的反向疫苗學和蛋白組學分析），可鑒 定86種不同NTHI菌株中保守的抗原。反向疫苗學使用計算機分析以鑒定不同NTHI菌株 的基因組中保守且可能是表面暴露的蛋白。第二種方法則著重通過分析NTHI產生的外膜 囊泡中所含蛋白的質譜以鑒定抗原。
[0014] NTHI菌株的基因組包含約1800個基因。發明人從目前均為公開可得的15個 完整的基因組外加基于地理分布選擇的39種菌株以及來源于中耳炎芬蘭集合（Finnish collection)的32種菌株中鑒定到了 274個保守的抗原。從這274個中，發明人選擇了 53種特別感興趣的多肽。除了 CGSHiGG_00130選自PittG，CGSHiGG_02400選自PittG， gi-145633184選自3655菌株，以及gi-145628236選自22. 1-21菌株以外，這些抗原選自菌 株 NP86-028。
[0015] 在53種抗原的組中，考慮到免疫原性和保守性標準，產生了以下其他選擇。
[0016] ?一組26個抗原在本文中稱為"第一抗原組"
[0017] ?一組6個抗原在本文中稱為"第二抗原組"
[0018] ?一組21個抗原在本文中稱為"第三抗原組"
[0019] 多數優選的抗原組在本文中稱為"第一抗原組"。因此，本發明提供了一種 免疫原性組合物，所述組合物包含至少一種抗原，優選包含一種或多種（即1、2、3、 4、5、6 或更多種）選自以下組的抗原：（1)NTHI0915(NT018)、（2)NTHI1416(NT024)、 (3)NTHI2017(NT032)、（4)CGSHiGG_02400 (NT038)、（5)NTHI1292 (NT067)、（6) NTHI0877 (NTOOl)、（7)NTHI0266 (ΝΤΟ 16)、（8)CGSHiGG_00I 30(ΝΤ052)、(9) NTHI1627(ΝΤ002), (10)ΝΤΗΙ1109(ΝΤ026), (11)ΝΤΗΙ0821(ΝΤ009), (12)ΝΤΗΙ0409(ΝΤ025), (13)ΝΤΗΙ1954 (ΝΤ028)、（14)ΝΤΗΙ0371 (ΝΤ029)、（15)ΝΤΗΙ0509 (ΝΤ031)、（16) ΝΤΗΙ0449 (ΝΤ015) , (17) NTHI1473 (ΝΤ023) , (18) gi-145633184 (NT 100) , (19) ΝΤΗΙ1110(ΝΤ040) , (20)gi-46129075 (ΝΤ048) , (21)gi-145628236 (ΝΤ053) , (22) ΝΤΗΙ1230(ΝΤ066)、（23)ΝΤΗΙ0522(ΝΤ097)、（24)ΝΤ004、（25)ΝΤ014、（26)ΝΤ022。這些抗原顯 示積極的殺菌活性，如表III和表IV所示。
[0020] 在第一抗原組中，優選的抗原選自以下亞組：（1)NTHI0915(NT018)抗原、（2) NTHI1416(NT024)抗原、（3)NTHI2017(NT032)抗原、（4)CGSHiGG_02400(NT038)、（5) NTHI1292 抗原（NT067)、（6)NTHI0877(NT001)抗原、（8)NT052 抗原、（24)NT004 抗原、（25) NT014抗原、（26)NT022抗原、（7)NTHI0266NT016抗原。這些抗原均顯示良好的如表II所 示的純化水平和表III和IV所報道的免疫原性效力。
[0021] 特別優選的抗原是 NT067、NT014、NT016、NT022。
[0022] 因此，本發明提供了一種免疫原性組合物，所述組合物包含一種或多種（即1、2、 3、4、5、6或更多種）抗原，所述抗原選自由所述"第一抗原組"組成的組。
[0023] 發明人還鑒定到了以下6種多肽：（24)P48(NTHI0254,也定義為NT007)、（25) HtrA(NTHI1905，&SlSNT006)、（26)PE(NTHI0267，&SlSNT035)、（27)P26(NTHI0501， 也定義為 NT010)、（28)PHiD(NTHI0811，也定義為 NT080)、（29)P6(NTHI0501，也定義為 NT081)。這組6個抗原在本文中稱為"第二抗原組"。
[0024] 發明人還鑒定到了以下22種多肽：（30)NTHI0532(NT013)、（31) NTHI0363(NT106), (32)NTHI0370(NT107), (33)NTHI0205(NT108), (34)NTHI0374(NT109), (35)NTHI0579 (NTllO) , (36) NTHI0837 (NT111) , (37) NTHI0849 (NT 112) , (38) NTHI092KNT113), (39)NTHI0995 (NT114), (40) NTHI1091 (NT115), (41) NTHI1169 (NT116), (42)NTHI1208 (NT117) , (43) NTHI13 18 (NT 118) , (44) NTHI1796 (NT123) , (45) NTHI1930(NT124)、 （46)NTHI1565(NT119)、 （47)NTHI1569(NT120)、 （48)NTHI1571(NT121)、 (49) NTHI1667 (NT122)、（50) NTHI0588 (NT061)、（51) NTHI0915 (NT017)。這組 22 個抗原在本 文中稱為"第三抗原組"。
[0025] 在一個實施方式中，組合物包含至少一種（即1、2、3、4、5、6或更多種）選自第一 抗原組的抗原和/或至少一種（即1、2、3、4、5、6或更多種）選自第二抗原組的抗原和/或 至少一種（即1、2、3、4、5、6或更多種）選自第三抗原組的抗原。來自第一抗原組的抗原可 選自最優選的抗原亞組。
[0026] 優選地，本發明提供了一種免疫原性組合物，所述組合物包含選自第一抗原組或 第二抗原組或第三抗原組中任意一個的抗原。
[0027] 因此，本發明還提供了 一種免疫原性組合物，所述組合物包含抗原組合，所述組合 包含兩種或多種（即2、3、4、5、6或更多種）抗原，所述抗原選自由"第一抗原組"和/或"第 二抗原組"和/或"第三抗原組"組成的組。
[0028] 當組合物包含來自"第二抗原組"的抗原時，優選所述組合物還包含（i)至少一種 來自"第二抗原組"的其他抗原或者（i)至少一種來自"第一抗原組"或"第三抗原組"的抗 原。因此，本發明不包括僅包含其自身抗原組分的來自"第二抗原組"的單一抗原。當組合 物包含兩種或多種來自"第二抗原組"的抗原時，優選所述組合物應包含至少一種抗原，所 述抗原不是（a) P48抗原（b) HtrA抗原（c) PE抗原或（d)P26抗原。因此，在一些實施方式 中，本發明不包括僅含有P48、HtrA、PE和/或P26的組合。類似地，在一些實施方式中，本 發明不包括特定的雜交抗原，所述雜交抗原包含僅來自P48、HtrA、PE和/或P26的'X'部 分。
[0029] 在第一抗原組的11個優選抗原中，可能有55對不同抗原對。所有這類抗原對均 在本文中公開并且是本發明的一部分。因此本發明提供一種免疫組合物，所述組合物包含 一對抗原，該抗原對是所述55對之一。
[0030] 在一個實施方式中，組合物包含至少一種（即1、2、3、4、5、6或更多種）選自第一 抗原組的抗原和/或至少一種（即1、2、3、4、5、6或更多種）選自第二抗原組的抗原和/或 至少一種（即1、2、3、4、5、6或更多種）選自第三抗原組的抗原。
[0031] 在所有情況下，來自第一抗原組的抗原可優選地選自最優選的以下 亞組：（1)NTHI0915(NT018)、（2)NTHI1416(NT024)、（3)NTHI2017(NT032)、（4) CGSHiGG_02400(NT038), (5)NTHI1292(NT067), (6)NTHI0877(NTOOl), (8)NT052, (24) NT004、（25)NT014、（26)NT022、（7)NT016。
[0032] 本發明還提供了一種免疫組合物，所述組合物包含抗原組，所述抗原組包含兩種 或多種（即 2、3、4 或5 種）選自下組的抗原：（1)NTHI0915(NT018)、⑵NTHI1416(NT024)、 (3)NTHI2017(NT032) , (4)CGSHiGG_02400 (NT038) , (5)NTHI1292 (NT067) , (6) NTHI0877(NT001)、（8)NT052、（24)NT004、（25)NT014、（26)NT022、（7)NT016。所述組合物還 可包含佐劑，例如包含水包油乳液或鋁鹽的佐劑。
[0033] 參考文獻5討論了不可分型流感嗜血桿菌抗原，不限于可潛在用于疫苗的候選 物。參考文獻6至10分別涉及不可分型流感嗜血桿菌多肽P48、HtrA、PE和P26且不限于 其免疫原性潛能。參考文獻5還在較多數目的疫苗候選物中單獨提到了 HtrA、PE和P26， 且例如參考文獻10涉及多肽PE。然而，這些屬于"第二抗原組"的抗原沒有聯合使用的描 述。如今，出乎意料地發現一種或多種這些抗原（第二抗原組）與至少一種"第一抗原組" 所列抗原的組合特別適用于產生針對不可分型流感嗜血桿菌的保護性免疫應答，從而實現 上文提到的本發明的目標。
[0034] 本發明的優選組合是兩種或多種抗原協同作用的組合。因此，通過聯合給藥保護 免遭NTHI病原體侵擾的效果超過了僅由其單獨保護功效疊加的預期效果。
[0035] 第一抗原組
[0036] NTO18 抗原
[0037] "NT018"抗原標注為包含TPR重復的蛋白，且還標注為細胞色素 c成熟血紅素裂解 酶亞基CcmH2。其已標注為菌株86-028NP中的NTHI0915。所述序列在所有分析的菌株中 高度保守且預測為膜結合金屬肽酶。NT018是表面暴露的，如表III所示。已從另一種不可 分型菌株Fil76(-種分離自芬蘭中耳炎集合的菌株）中克隆并表達了 NT018。
[0038] 有用的NT018抗原可引發識別SEQ ID NO: 1的抗體（例如，在給予人時）和/或 可包含以下氨基酸序列：（a)與SEQ ID NO: 1具有50%或更高的相同性（例如60%、65%、 70%,75 %,80%,85 %,90%,91 %,92%,93 %,94%,95 %,96%,97 %,98%,99 %,99. 5% 或更高）；和/或（b)包含SEQ ID NO: 1的至少'η'個連續氨基酸的片段，其中'η'是7或 更多（例如，8、10、12、14、16、18、20、25、30、35、40、50、60、70、80、90、100、150、200、250 或更 多）。這些NT018蛋白包含SEQ ID NO: 1的變體，如已克隆并表達并測試免疫原性的SEQ ID NO: 49 (表III、IV)。（b)的優選片段包含來自SEQ ID NO: 1的表位。其他優選片段缺 少SEQ ID勵：1(：末端的一個或多個（如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25或更多個）氨 基酸和/或其N末端的一個或多個（如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、26、27、28或更 多個）氨基酸，而保留SEQ ID N0:1的至少一個表位。其它片段省去一個或多個蛋白結構 域。
[0039] 本發明的NT018抗原可與NT018天然的28個N末端氨基酸 (MNFTLIFILTTLVVALICFYPLLRQFKA;SEQ ID N0:69)或者替代的 N 末端序列（例如簡單的 N 末端甲硫氨酸、或者Met-Ala-、或者以所需方式靶向或運輸表達的蛋白的前導肽）共同表 達。
[0040] NT024 抗原
[0041] "NT024"抗原標注為"假擬蛋白"，且已標注為基因組86-028NP中的NTHI1416。已 從Fil76菌株中克隆并表達了該抗原。
[0042] 有用的NT024抗原可引發識別SEQ ID NO:2的抗體（例如，在給予人時）和/或 可包含以下氨基酸序列：(a)與SEQ ID N0:2具有50%或更高的相同性（如60%、65%、 70 %,75%,80 %,85%,90%,91 %,92%,93 %,94%,95 %,96%,97 %,98%,99 %,99. 5% 或更高）；和/或（b)包含SEQ ID N0:2的至少'η'個連續氨基酸的片段，其中'η'是7或更 高（如 8、10、12、14、16、18、20、25、30、35、40、50、60、70、80、90、100、150、200、250 或更高）。 這些ΝΤ024蛋白包含SEQ ID NO: 2的變體，如從菌株Fil76克隆的SEQ ID NO: 50。（b)的 優選片段包含來自SEQ ID NO: 2的表位。其他優選片段缺少SEQ ID NO: 2C末端的一個或 多個（如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25或更多個）氨基酸和/或N末端的一個或多個 (如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25或更多個）氨基酸，而保留SEQ ID N0:2的至少一個 表位。其它片段省去一個或多個蛋白結構域。
[0043] 本發明的NT024抗原可與NT024天然的20個N末端氨基酸 (MKLKLFFHIVLLCFSLPVWA;SEQ ID N0:70)或者替代的N末端序列（例如簡單的N末端甲硫 氨酸、或者Met-Ala-、或者以所需方式靶向或運輸表達的蛋白的前導肽）共同表達。
[0044] NT032 抗原
[0045] "NT032"抗原標注為"假擬蛋白"，且已標注為基因組86-028NP中的NTHI2017。測 試的菌株中最保守的結構域被描述為"細菌OB折疊（BOF)蛋白"。已從Fil76菌株中克隆 并表達了該抗原。
[0046] 有用的NT032抗原可引發識別SEQ ID NO:3的抗體（例如，在給予人時）和/或 可包含以下氨基酸序列：（a)與SEQ ID NO:3具有50%或更高的相同性（例如60%、65%、 70%,75 %,80%,85 %,90%,91 %,92%,93 %,94%,95 %,96%,97 %,98%,99 %,99. 5% 或更高）；和/或（b)包含SEQ ID NO: 3的至少'η'個連續氨基酸的片段，其中'η'是7或 更多（例如，8、10、12、14、16、18、20、25、30、35、40、50、60、70、80、90、100、150、200、250 或更 多）。這些ΝΤ032蛋白包含SEQ ID Ν0:3的變體，如從Fil76菌株克隆的SEQ ID Ν0:51。 (b)的優選片段包含來自SEQ ID NO:3的表位。其他優選片段缺少SEQ ID NO:3C末端的一 個或多個（如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25或更多個）氨基酸和/或N末端的一個或 多個（如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25或更多個）氨基酸，而保留SEQ ID N0:3的至 少一個表位。其它片段省去一個或多個蛋白結構域。
[0047] 本發明的NT032抗原可與NT032天然的19個N末端氨基酸 (MKKFALATIFALATTSAFA;SEQ ID N0:71)或者替代的N末端序列（例如簡單的N末端甲硫 氨酸、或者Met-Ala-、或者以所需方式靶向或運輸表達的蛋白的前導肽）共同表達。
[0048] NT067 抗原
[0049] "NT067"抗原標注為ABC轉運蛋白，且已提出其假擬功能類似周質寡肽結合蛋白 OppA。在菌株中86-028NP已標注為NTHI1292。已從Fil76菌株中克隆并表達了該抗原。
[0050] 有用的NT067抗原可引發識別SEQ ID NO:5的抗體（例如，在給予人時）和/或 可包含以下氨基酸序列：（a)與SEQ ID NO:5具有50%或更高的相同性（例如60%、65%、 70%,75 %,80%,85 %,90%,91 %,92%,93 %,94%,95 %,96%,97 %,98%,99 %,99. 5% 或更高）；和/或（b)包含SEQ ID NO: 5的至少'η'個連續氨基酸的片段，其中'η'是7或 更多（例如，8、10、12、14、16、18、20、25、30、35、40、50、60、70、80、90、100、150、200、250 或更 多）。這些ΝΤ067蛋白包含SEQ ID NO: 5的變體，如從Fil76菌株克隆的SEQ ID NO: 52。 (b)的優選片段包含來自SEQ ID NO:5的表位。其他優選片段缺少SEQ ID NO:5C末端的一 個或多個（如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25或更多個）氨基酸和/或N末端的一個或 多個（如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25或更多個）氨基酸，而保留SEQ ID N0:5的至 少一個表位。其它片段省去一個或多個蛋白結構域。
[0051] 本發明的NT067抗原可與NT067天然的20個N末端氨基酸 (MQHKLLFSAIALALSYSVQA;SEQ ID N0:72)或者替代的N末端序列（例如簡單的N末端甲硫 氨酸、或者Met-Ala-、或者以所需方式靶向或運輸表達的蛋白的前導肽）共同表達。
[0052] NT038 抗原
[0053] 該抗原稱為Hia(流感嗜血桿菌粘附素）蛋白[11]，且已在菌株CGSHiGG_02400中 鑒定為長度282個氨基酸，但它是最初描述于菌株86-028NP或其他NTHi菌株的Hia (616 個氨基酸）的截短形式。已從R2846菌株中克隆了該抗原。
[0054] 有用的NT038抗原可引發識別SEQ ID NO:4的抗體（例如，在給予人時）和/或 可包含以下氨基酸序列：（a)與SEQ ID N0:4具有50%或更高的相同性（例如60%、65%、 70%,75 %,80%,85 %,90%,91 %,92%,93 %,94%,95 %,96%,97 %,98%,99 %,99. 5% 或更高）；和/或（b)包含SEQ ID NO:4的至少'η'個連續氨基酸的片段，其中'η'是7或 更多（例如，8、10、12、14、16、18、20、25、30、35、40、50、60、70、80、90、100、150、200、250 或更 多）。這些ΝΤ038蛋白包含SEQ ID NO: 4的變體，如SEQ ID NO: 53,其缺少最初的23個天 然N末端氨基酸和位于C末端的102個氨基酸。（b)的優選片段包含來自SEQ ID NO:4的 表位。其它優選片段缺少SEQ ID N0:4C末端的一個或多個（如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、 15、20、25或更多個）氨基酸（甚至多至102個氨基酸），和/或N末端的一個或多個（如 1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、23、25 或更多個）氨基酸，而保留 SEQ ID N0:4 的至少一個 表位。其它片段省去一個或多個蛋白結構域。
[0055] 本發明的NT038抗原可與NT038天然的23個N末端氨基酸 (MPFQYVTEDGKTVVKVGNGYYEA;SEQ ID N0:73)或者替代的N末端序列（例如簡單的N末端 甲硫氨酸、或者Met-Ala-、或者以所需方式靶向或運輸表達的蛋白的前導肽）共同表達。
[0056] NTOOl 抗原
[0057] 該抗原標注為基因組86-028NP中NTHI0877,且稱為D-甲硫氨酸結合脂蛋白 MetQ。MetD是ABC轉運體，編碼DL甲硫氨酸攝取系統。該抗原最初公開為BASB202(28Kda) [12, 13]，并提出其作為針對NTHI的疫苗的用途。該抗原與參考文獻（4)中描述的同源抗 原共有99, 63%的匹配編碼，且已發現其在本發明涉及的所有菌株中具有良好的保守性。本 發明中，該抗原從Fil76菌株中克隆并表達。
[0058] 有用的NT001抗原可引發識別SEQ ID N0:6的抗體（例如，在給予人時）和/或 可包含以下氨基酸序列：（a)與SEQ ID N0:6具有50%或更高的相同性（例如60%、65%、 70%,75 %,80%,85 %,90%,91 %,92%,93 %,94%,95 %,96%,97 %,98%,99 %,99. 5% 或更高）；和/或（b)包含SEQ ID NO:6的至少'η'個連續氨基酸的片段，其中'η'是7或 更多（例如，8、10、12、14、16、18、20、25、30、35、40、50、60、70、80、90、100、150、200、250 或更 多）。這些ΝΤ001蛋白包含SEQ ID Ν0:4的變體，如SEQ ID N0:54。（b)的優選片段包含來 自SEQ ID N0:6的表位。其他優選片段缺少SEQ ID N0:6C末端的一個或多個（如1、2、3、 4、5、6、7、8、9、10、15、20、25或更多個）氨基酸和/或N末端的一個或多個（如1、2、3、4、5、 6、7、8、9、10、15、20、21、25或更多個）氨基酸，而保留SEQ ID N0:6的至少一個表位。其它 片段省去一個或多個蛋白結構域。
[0059] 本發明的NT001抗原可與NT001天然的21個N末端氨基酸 (MKLKQLFAITAIASALVLTGC;SEQ ID N0:74)或者替代的N末端序列（例如簡單的N末端甲 硫氨酸、或者Met-Ala-、或者以所需方式靶向或運輸表達的蛋白的前導肽）共同表達。
[0060] NTO16 抗原
[0061] 該抗原標注為菌株86-028即中的階!110266，并描述為假擬脂蛋白。已從？丨176菌 株中克隆并表達了該抗原。
[0062] 有用的NT016抗原可引發識別SEQ ID NO:7的抗體（例如，在給予人時）和/或 可包含以下氨基酸序列：（a)與SEQ ID NO:7具有50%或更高的相同性（例如60%、65%、 70%,75 %,80%,85 %,90%,91 %,92%,93 %,94%,95 %,96%,97 %,98%,99 %,99. 5% 或更高）；和/或（b)包含SEQ ID NO: 7的至少'η'個連續氨基酸的片段，其中'η'是7或 更多（例如，8、10、12、14、16、18、20、25、30、35、40、50、60、70、80、90、100、150、200、250 或更 多）。這些ΝΤ016蛋白包含SEQ ID NO: 7的變體，如SEQ ID NO: 55。（b)的優選片段包含來 自SEQ ID NO: 7的表位。其他優選片段缺少SEQ ID NO: 7C末端的一個或多個（如1、2、3、 4、5、6、7、8、9、10、15、20、25或更多個）氨基酸和/或N末端的一個或多個（如1、2、3、4、5、 6、7、8、9、10、15、19、20、25或更多個）氨基酸，而保留SEQ ID N0:7的至少一個表位。其它 片段省去一個或多個蛋白結構域。
[0063] 本發明的NT016抗原可與NT016天然的16個N末端氨基酸 (MRKIKSLALLAVAALVIGC;SEQ ID N0:75)或者替代的N末端序列（例如簡單的N末端甲硫 氨酸、或者Met-Ala-、或者以所需方式靶向或運輸表達的蛋白的前導肽）共同表達。
[0064] NT052 抗原
[0065] 該抗原標注為來自PittGG菌株的CGSHiGG_00130。它是含Sell結構域蛋白家族 的一部分。已從R2846菌株中克隆了該抗原并將克隆的序列報道為SEQ ID N0:8。雖然從 R2846克隆的序列與標注為CGSHiGG_00130的序列僅有64. 16%的相同性，但已顯示沿該序 列有保守的Sell結構域重復出現，用于提供有效的抗原性。該重復的共有序列是SEQ ID NO:EAVKWYRKAAEQ〇
[0066] 有用的NT052抗原可引發識別SEQ ID NO:8的抗體（例如，在給予人時）和/或 可包含以下氨基酸序列：（a)與SEQ ID N0:8具有50%或更高的相同性（例如60%、65%、 70%,75 %,80%,85 %,90%,91 %,92%,93 %,94%,95 %,96%,97 %,98%,99 %,99. 5% 或更高）；和/或（b)包含SEQ ID NO:8的至少'η'個連續氨基酸的片段，其中'η'是7或 更多（例如，8、10、12、14、16、18、20、25、30、35、40、50、60、70、80、90、100、150、200、250 或更 多）。這些ΝΤ052蛋白包含SEQ ID Ν0:8的變體，如SEQ ID N0:56。（b)的優選片段包含來 自SEQ ID N0:8的表位。其他優選片段缺少SEQ ID N0:8C末端的一個或多個（如1、2、3、 4、5、6、7、8、9、10、15、20、25或更多個）氨基酸和/或N末端的一個或多個（如1、2、3、4、5、 6、7、8、9、10、11、15、20、25或更多個）氨基酸，而保留SEQ ID N0:8的至少一個表位。其它 片段省去一個或多個蛋白結構域。
[0067] 本發明的NT052抗原可與NT052天然的11個N末端氨基酸（MLLFILSIAWA ;SEQ ID N0:76)或者替代的N末端序列（例如簡單的N末端甲硫氨酸、或者Met-Ala-、或者以所需 方式靶向或運輸表達的蛋白的前導肽）共同表達。
[0068] NT002 抗原
[0069] 該抗原標注為86-026NP菌株中的NTHI1627以及脂蛋白。已從Fil76菌株中克隆 并表達了該抗原。
[0070] 有用的NT002抗原可引發識別SEQ ID NO:9的抗體（例如，在給予人時）和/或 可包含以下氨基酸序列：（a)與SEQ ID N0:9具有50%或更高的相同性（例如60%、65%、 70%,75 %,80%,85 %,90%,91 %,92%,93 %,94%,95 %,96%,97 %,98%,99 %,99. 5% 或更高）；和/或（b)包含SEQ ID NO:9的至少'η'個連續氨基酸的片段，其中'η'是7或 更多（例如，8、10、12、14、16、18、20、25、30、35、40、50、60、70、80、90、100、150、200、250 或更 多）。這些ΝΤ002蛋白包含SEQ ID Ν0:9的變體，如SEQ ID N0:57。（b)的優選片段包含來 自SEQ ID N0:9的表位。其他優選片段缺少SEQ ID N0:9C末端的一個或多個（如1、2、3、 4、5、6、7、8、9、10、15、20、25或更多個）氨基酸和/或N末端的一個或多個（如1、2、3、4、5、 6、7、8、9、10、15、20、25或更多個）氨基酸，而保留SEQIDN0:9的至少一個表位。其它片段 省去一個或多個蛋白結構域。
[0071] 本發明的NT002抗原可與NT002天然的18個N末端氨基酸（MKVYKSFLIATASLFLFA ; SEQ ID NO: 77)或者替代的N末端序列（例如簡單的N末端甲硫氨酸、或者Met-Ala-、或者 以所需方式靶向或運輸表達的蛋白的前導肽）共同表達。
[0072] 本發明的NT002抗原可以是脂蛋白，例如在N末端半胱氨酸處脂化。
[0073] NT026 抗原
[0074] 該抗原標注為86-026NP菌株中的假擬蛋白NTHI1109。其預測為胞質膜蛋白。已 從Fil76菌株中克隆并表達了該抗原。
[0075] 有用的NT026抗原可引發識別SEQ ID NO: 10的抗體（例如，在給予人時）和/或 可包含以下氨基酸序列：（a)與SEQ ID NO: 10具有50%或更高的相同性（如60%、65%、 70%,75 %,80%,85 %,90%,91 %,92%,93 %,94%,95 %,96%,97 %,98%,99 %,99. 5% 或更高）；和/或（b)包含SEQ ID NO: 10的至少'η'個連續氨基酸的片段，其中'η'是7 或更高（如 8、10、12、14、16、18、20、25、30、35、40、50、60、70、80、90、100、150、200、250 或更 高）。這些NT026蛋白包含從Fil76菌株克隆的SEQ ID N0:10的變體，如SEQ ID N0:58。 (b)的優選片段包含來自SEQ ID NO: 10的表位。其他優選片段缺少SEQ ID NO: IOC末端的 一個或多個（如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25或更多個）氨基酸和/或N末端的一個 或多個（如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25或更多個）氨基酸，而保留SEQ ID N0:10的 至少一個表位。其它片段省去一個或多個蛋白結構域。
[0076] 本發明的NT026抗原可與NT026天然的24個N末端氨基酸 (MQKGMTLVELLIGLAIISIVLNFA;SEQ ID N0:78)或者替代的N末端序列（例如簡單的N末端 甲硫氨酸、或者Met-Ala-、或者以所需方式靶向或運輸表達的蛋白的前導肽）共同表達。
[0077] NT009 抗原
[0078] 該抗原標注為86-026NP菌株中的NTHI0821并且是0MP85家族蛋白的一部分。該 抗原位于細菌外膜中。已從Fil76菌株中克隆并表達了該抗原。
[0079] 有用的NT009抗原可引發識別SEQ ID NO: 11的抗體（例如，在給予人時）和/或 可包含以下氨基酸序列：（a)與SEQ ID N0:11具有50%或更高的相同性（例如60%、65%、 70 %,75 %,80 %,85 %,90 %,91 %,92 %,93 %,94 %,95 %,96 %,97 %,98 %,99 %,99. 5% 或更高）；和/或（b)包含SEQ ID NO: 11的至少'η'個連續氨基酸的片段，其中'η'是7或 更多（例如，8、10、12、14、16、18、20、25、30、35、40、50、60、70、80、90、100、150、200、250 或更 多）。這些NT009 蛋白包含SEQIDN0:ll的變體，如從Fil76克隆的SEQIDN0:59。（b) 的優選片段包含來自SEQ ID NO: 11的表位。其他優選片段缺少SEQ ID NO: IlC末端的一 個或多個（如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25或更多個）氨基酸和/或N末端的一個或 多個（如 1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、22、25 或更多個）氨基酸，而保留 SEQ ID N0:11 的至少一個表位。其它片段省去一個或多個蛋白結構域。
[0080] 本發明的NT009抗原可與NT009天然的22個N末端氨基酸 (MNKTLLKLTALFLALNCFPAFA;SEQ ID N0:79)或者替代的N末端序列（例如簡單的N末端甲 硫氨酸、或者Met-Ala-、或者以所需方式靶向或運輸表達的蛋白的前導肽）共同表達。
[0081] NT025 抗原
[0082] 該抗原標注為86-026NP菌株中的NTHI0409且屬于IV型菌毛素亞基蛋白家族。已 從Fil76菌株中克隆并表達了該抗原。
[0083] 有用的NT025抗原可引發識別SEQ ID NO: 12的抗體（例如，在給予人時）和/或 可包含以下氨基酸序列：(a)與SEQ ID NO: 12具有50%或更高的相同性（例如，60%、65%、 70%,75 %,80%,85 %,90%,91 %,92%,93 %,94%,95 %,96%,97 %,98%,99 %,99. 5% 或更高）；和/或（b)包含SEQ ID NO: 12的至少'η'個連續氨基酸的片段，其中'η'是7或 更多（例如，8、10、12、14、16、18、20、25、30、35、40、50、60、70、80、90、100、150、200、250 或更 多）。這些NT025 蛋白包含SEQIDN0:12的變體，如從Fil76克隆的SEQIDN0:60。（b) 的優選片段包含來自SEQ ID NO: 12的表位。其他優選片段缺少SEQ ID NO: 12C末端的一 個或多個（如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25或更多個）氨基酸和/或N末端的一個或 多個（如 1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、23、25 或更多個）氨基酸，而保留 SEQ ID N0:12 的至少一個表位。其它片段省去一個或多個蛋白結構域。
[0084] 本發明的NT025抗原可與NT025天然的23個N末端氨基酸 (MKLTTQQTLKKGFTLIELMIVIA;SEQ ID N0:80)或者替代的N末端序列（例如簡單的N末端 甲硫氨酸、或者Met-Ala-、或者以所需方式靶向或運輸表達的蛋白的前導肽）共同表達。
[0085] NT028 抗原
[0086] 該抗原標注為86-026即菌株中的階'!111954以及脂蛋白犯？(：。已從？丨176菌株中 克隆并表達了該抗原。
[0087] 有用的NT028抗原可引發識別SEQ ID NO: 13的抗體（例如，在給予人時）和/或 可包含以下氨基酸序列：（a)與SEQ ID N0:13具有50%或更高的相同性（例如60%、65%、 70 %,75 %,80 %,85 %,90 %,91 %,92 %,93 %,94 %,95 %,96 %,97 %,98 %,99 %,99. 5% 或更高）；和/或（b)包含SEQ ID NO: 13的至少'η'個連續氨基酸的片段，其中'η'是7或 更多（例如，8、10、12、14、16、18、20、25、30、35、40、50、60、70、80、90、100、150、200、250 或更 多）。這些NT028 蛋白包含SEQIDN0:13的變體，如從Fil76克隆的SEQIDN0:61。（b) 的優選片段包含來自SEQ ID NO: 13的表位。其他優選片段缺少SEQ ID NO: 13C末端的一 個或多個（如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25或更多個）氨基酸和/或N末端的一個或 多個（如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25或更多個）氨基酸，而保留SEQ ID N0:13的至 少一個表位。其它片段省去一個或多個蛋白結構域。
[0088] 本發明的NT028抗原可與NT028天然的21個N末端氨基酸 (MLKRILVIIGLAVLATACSNA;SEQ ID N0:81)或者替代的N末端序列（例如簡單的N末端甲 硫氨酸、或者Met-Ala-、或者以所需方式靶向或運輸表達的蛋白的前導肽）共同表達。
[0089] 本發明的NT028抗原可以是脂蛋白，例如在N末端半胱氨酸處脂化。
[0090] NT029 抗原
[0091] 該抗原標注為86-026NP菌株中的NTHI0371以及血紅素/血液結合素結合蛋白A， 屬于外膜蛋白家族。已從R2846菌株中克隆并表達了該抗原。
[0092] 有用的NT029抗原可引發識別SEQ ID NO: 14的抗體（例如，在給予人時）和/或 可包含以下氨基酸序列：（a)與SEQ ID N0:14具有50%或更高的相同性（例如60%、65%、 70 %,75 %,80 %,85 %,90 %,91 %,92 %,93 %,94 %,95 %,96 %,97 %,98 %,99 %,99. 5% 或更高）；和/或（b)包含SEQ ID NO: 14的至少'η'個連續氨基酸的片段，其中'η'是7或 更多（例如，8、10、12、14、16、18、20、25、30、35、40、50、60、70、80、90、100、150、200、250 或更 多）。這些ΝΤ029蛋白包含SEQ ID Ν0:14的變體，如從R2846菌株克隆的SEQ ID Ν0:62。 (b)的優選片段包含來自SEQ ID NO: 14的表位。其他優選片段缺少SEQ ID NO: 14C末端的 一個或多個（如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25或更多個）氨基酸和/或N末端的一個 或多個（如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25或更多個）氨基酸，而保留SEQ ID N0:14的 至少一個表位。其它片段省去一個或多個蛋白結構域。
[0093] 本發明的NT029抗原可與NT029天然的21個N末端氨基酸 (MYKLNVISLIILTTYTGATYA;SEQ ID N0:82)或者替代的N末端序列（例如簡單的N末端甲 硫氨酸、或者Met-Ala-、或者以所需方式靶向或運輸表達的蛋白的前導肽）共同表達。
[0094] NT031 抗原
[0095] 該抗原標注為86-026NP菌株中的饑餓誘導外膜脂蛋白NTHI0509。已從R2846菌 株中克隆并表達了該抗原。
[0096] 有用的NT031抗原可引發識別SEQ ID NO: 15的抗體（例如，在給予人時）和/或 可包含以下氨基酸序列：（a)與SEQ ID N0:15具有50%或更高的相同性（例如60%、65%、 70 %,75 %,80 %,85 %,90 %,91 %,92 %,93 %,94 %,95 %,96 %,97 %,98 %,99 %,99. 5% 或更高）；和/或（b)包含SEQ ID NO: 15的至少'η'個連續氨基酸的片段，其中'η'是7 或更多（例如，8、10、12、14、16、18、20、25、30、35、40、50、60、70、80、90、100、150、200、250 或 更多）。這些ΝΤ031蛋白包含SEQ ID NO: 15的變體，如從R2846菌株克隆并表達的SEQ ID N0:63。（b)的優選片段包含來自SEQ ID NO: 15的表位。其他優選片段缺少SEQ ID NO: 15C 末端的一個或多個（如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25或更多個）氨基酸和/或N末端 的一個或多個（如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、18、20、25或更多個）氨基酸，而保留SEQ ID NO: 15的至少一個表位。其它片段省去一個或多個蛋白結構域。
[0097] 本發明的NT031抗原可與NT031天然的18個N末端氨基酸（MKGKITLFFTALCFGLTG ; SEQ ID NO:83)或者替代的N末端序列（例如簡單的N末端甲硫氨酸、或者Met-Ala-、或者 以所需方式靶向或運輸表達的蛋白的前導肽）共同表達。
[0098] 本發明的NT031抗原可以是脂蛋白，例如在N末端半胱氨酸處脂化。
[0099] NT015 抗原
[0100] 該抗原標注為86-026NP菌株中的不透明相關蛋白OapB NTHI0449。已從Fil76菌 株中克隆并表達了該抗原。
[0101] 有用的NT015抗原可引發識別SEQ ID NO: 16的抗體（例如，在給予人時）和/或 可包含以下氨基酸序列：（a)與SEQ ID N0:16具有50%或更高的相同性（例如60%、65%、 70 %,75 %,80 %,85 %,90 %,91 %,92 %,93 %,94 %,95 %,96 %,97 %,98 %,99 %,99. 5% 或更高）；和/或（b)包含SEQ ID NO: 16的至少'η'個連續氨基酸的片段，其中'η'是7或 更多（例如，8、10、12、14、16、18、20、25、30、35、40、50、60、70、80、90、100、150、200、250 或更 多）。這些ΝΤ015蛋白包含SEQ ID Ν0:16的變體，如從Fil76克隆并表達的SEQ ID Ν0:64。 (b)的優選片段包含來自SEQ ID NO: 16的表位。其他優選片段缺少SEQ ID NO: 16C末端的 一個或多個（如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25或更多個）氨基酸和/或N末端的一個 或多個（如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25或更多個）氨基酸，而保留SEQ ID N0:16的 至少一個表位。其它片段省去一個或多個蛋白結構域。
[0102] 本發明的NT015抗原可與NT015天然的17個N末端氨基酸（MLKKTSLIFTALLLAGC ; SEQ ID NO: 84)或者替代的N末端序列（例如簡單的N末端甲硫氨酸、或者Met-Ala-、或者 以所需方式靶向或運輸表達的蛋白的前導肽）共同表達。
[0103] NT023 抗原
[0104] 該抗原標注為86-026NP菌株中的外膜脂蛋白PCP，NTHI1473。已從Fi 176菌株中 克隆并表達了該抗原。
[0105] 有用的NT023抗原可引發識別SEQ ID NO: 17的抗體（例如，在給予人時）和/或 可包含以下氨基酸序列：（a)與SEQ ID N0:17具有50%或更高的相同性（例如60%、65%、 70%,75 %,80%,85 %,90%,91 %,92%,93 %,94%,95 %,96%,97 %,98%,99 %,99. 5% 或更高）；和/或（b)包含SEQ ID NO: 17的至少'η'個連續氨基酸的片段，其中'η'是7 或更多（例如，8、10、12、14、16、18、20、25、30、35、40、50、60、70、80、90、100、150、200、250 或 更多）。這些ΝΤ023蛋白包含SEQ ID NO: 17的變體，如從菌株Fil76克隆并表達的SEQ ID NO:65。（b)的優選片段包含來自SEQ ID NO: 17的表位。其他優選片段缺少SEQ ID NO: 17C 末端的一個或多個（如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25或更多個）氨基酸和/或N末 端的一個或多個（如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25或更多個）氨基酸，而保留SEQ ID NO: 17的至少一個表位。其它片段省去一個或多個蛋白結構域。
[0106] 本發明的NT023抗原可與NT023天然的20個N末端氨基酸 (MKKTNMALALLVAFSVTGCA;SEQ ID N0:85)或者替代的N末端序列（例如簡單的N末端甲硫 氨酸、或者Met-Ala-、或者以所需方式靶向或運輸表達的蛋白的前導肽）共同表達。
[0107] 本發明的NT023抗原可以是脂蛋白，例如在N末端半胱氨酸處脂化。
[0108] NT100 抗原
[0109] 該抗原標注為"推定的氧肟酸鹽型含鐵細胞受體"且在NCBI中是來自菌株3655的 gi-145633184。已從R246菌株中克隆了該抗原。
[0110] 有用的NT100抗原可引發識別SEQ ID NO: 18的抗體（例如，在給予人時）和/或 可包含以下氨基酸序列：（a)與SEQ ID N0:18具有50%或更高的相同性（例如60%、65%、 70 %,75 %,80 %,85 %,90 %,91 %,92 %,93 %,94 %,95 %,96 %,97 %,98 %,99 %,99. 5% 或更高）；和/或（b)包含SEQ ID NO: 18的至少'η'個連續氨基酸的片段，其中'η'是7或 更多（例如，8、10、12、14、16、18、20、25、30、35、40、50、60、70、80、90、100、150、200、250 或更 多）。這些ΝΤ100蛋白包含SEQ ID NO: 18的變體，如SEQ ID N0:66。（b)的優選片段包含 來自SEQ ID NO: 18的表位。其它優選片段缺少SEQ ID NO: 18C末端的一個或多個（如1、 2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25或更多個）氨基酸和/或N末端的一個或多個（如1、2、3、 4、5、6、7、8、9、10、15、20、25或更多個）氨基酸，而保留SEQIDN0:18的至少一個表位。其 它片段省去一個或多個蛋白結構域。
[0111] 本發明的NT100抗原可與NT100天然的30個N末端氨基酸 (MDLGPIYNTRDINDGKVINIDNPNYTNPVA;SEQ ID N0:86)或者替代的 N末端序列（例如簡單的 N末端甲硫氨酸、或者Met-Ala-、或者以所需方式靶向或運輸表達的蛋白的前導肽）共同表 達。
[0112] NT040 抗原
[0113] 該抗原標注為86-026NP菌株中的假擬蛋白NTHI1110。已從R2846菌株中克隆并 表達了該抗原。
[0114] 有用的NT040抗原可引發識別SEQ ID NO: 19的抗體（例如，在給予人時）和/或 可包含以下氨基酸序列：（a)與SEQ ID N0:19具有50%或更高的相同性（例如60%、65%、 70 %,75 %,80 %,85 %,90 %,91 %,92 %,93 %,94 %,95 %,96 %,97 %,98 %,99 %,99. 5% 或更高）；和/或（b)包含SEQ ID NO: 19的至少'η'個連續氨基酸的片段，其中'η'是7或 更多（例如，8、10、12、14、16、18、20、25、30、35、40、50、60、70、80、90、100、150、200、250 或更 多）。這些ΝΤ040蛋白包含SEQ ID NO: 19的變體。（b)的優選片段包含來自SEQ ID NO: 19 的表位。其它優選片段缺少SEQ ID N0:19C末端的一個或多個（如1、2、3、4、5、6、7、8、9、 10、15、20、25或更多個）氨基酸和/或N末端的一個或多個（如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、 15、20、25或更多個）氨基酸，而保留SEQ ID NO: 19的至少一個表位。其它片段省去一個或 多個蛋白結構域。
[0115] 本發明的NT040抗原可與NT040天然的26個N末端氨基酸 (MMKTLLKGQTLLALMISLTLSSLLLL;SEQ ID N0:87)或者替代的N末端序列（例如簡單的N末 端甲硫氨酸、或者Met-Ala-、或者以所需方式靶向或運輸表達的蛋白的前導肽）共同表達。
[0116] NT048 抗原
[0117] 該抗原標注為菌株86-028NP中的NTHI1169。已從R2846菌株中克隆并表達了該 抗原。
[0118] 有用的NT048抗原可引發識別SEQ ID NO: 20的抗體（例如，在給予人時）和/或 可包含以下氨基酸序列：（a)與SEQ ID NO:20具有50%或更高的相同性（例如60%、65%、 70 %,75 %,80 %,85 %,90 %,91 %,92 %,93 %,94 %,95 %,96 %,97 %,98 %,99 %,99. 5% 或更高）；和/或（b)包含SEQ ID NO: 20的至少'η'個連續氨基酸的片段，其中'η'是7或 更多（例如，8、10、12、14、16、18、20、25、30、35、40、50、60、70、80、90、100、150、200、250 或更 多）。這些ΝΤ048蛋白包含SEQ ID NO: 20的變體。（b)的優選片段包含來自SEQ ID NO: 20 的表位。其它優選片段缺少SEQ ID N0:20C末端的一個或多個（如1、2、3、4、5、6、7、8、9、 10、15、20、25或更多個）氨基酸和/或N末端的一個或多個（如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、 15、20、25或更多個）氨基酸，而保留SEQ ID NO: 20的至少一個表位。其它片段省去一個或 多個蛋白結構域。
[0119] 本發明的NT048抗原可與NT048天然的18個N末端氨基酸（MKSVPLITGGLSFLLSAC ; SEQ ID NO:88)或者替代的N末端序列（例如簡單的N末端甲硫氨酸、或者Met-Ala-、或者 以所需方式靶向或運輸表達的蛋白的前導肽）共同表達。
[0120] NT053 抗原
[0121] 該抗原標注為R2846菌株中的gi-145628236并已從所述菌株中克隆。
[0122] 有用的NT053抗原可引發識別SEQ ID NO: 21的抗體（例如，在給予人時）和/或 可包含以下氨基酸序列：（a)與SEQ ID N0:21具有50%或更高的相同性（例如60%、65%、 70 %,75 %,80 %,85 %,90 %,91 %,92 %,93 %,94 %,95 %,96 %,97 %,98 %,99 %,99. 5% 或更高）；和/或（b)包含SEQ ID NO: 21的至少'η'個連續氨基酸的片段，其中'η'是7或 更多（例如，8、10、12、14、16、18、20、25、30、35、40、50、60、70、80、90、100、150、200、250 或更 多）。這些ΝΤ053蛋白包含SEQ ID NO: 21的變體。（b)的優選片段包含來自SEQ ID NO: 21 的表位。其它優選片段缺少SEQ ID N0:21C末端的一個或多個（如1、2、3、4、5、6、7、8、9、 10、15、20、25或更多個）氨基酸和/或N末端的一個或多個（如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、 15、20、25或更多個）氨基酸，而保留SEQ ID N0:21的至少一個表位。其它片段省去一個或 多個蛋白結構域。
[0123] 本發明的NT053抗原可與NT053天然的N末端Met或者替代的N末端序列（例如 Met-Ala-、或者以所需方式靶向或運輸表達的蛋白的前導肽）共同表達。
[0124] NT066 抗原
[0125] 該抗原標注為NP86-028菌株中的NTHI1230且定位于細菌的周質中。已從Fil76 菌株中克隆并表達了該抗原。
[0126] 有用的NT066抗原可引發識別SEQ ID NO: 22的抗體（例如，在給予人時）和/或 可包含以下氨基酸序列：（a)與SEQ ID NO:22具有50%或更高的相同性（例如60%、65%、 70%,75 %,80%,85 %,90%,91 %,92%,93 %,94%,95 %,96%,97 %,98%,99 %,99. 5% 或更高）；和/或（b)包含SEQ ID NO: 22的至少'η'個連續氨基酸的片段，其中'η'是7或 更多（例如，8、10、12、14、16、18、20、25、30、35、40、50、60、70、80、90、100、150、200、250 或更 多）。這些NT066蛋白包含SEQ ID N0:22的變體，如SEQ ID N0:67。（b)的優選片段包含 來自SEQ ID NO: 22的表位。其他優選片段缺少SEQ ID NO: 22C末端的一個或多個（如1、 2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25或更多個）氨基酸和/或N末端的一個或多個（如1、2、3、 4、 5、6、7、8、9、10、15、20、25、27、30、33或更多個）氨基酸，而保留SEQIDN0:22的至少一個 表位。其它片段省去一個或多個蛋白結構域。
[0127] 本發明的NT066抗原可與NT066天然的33個N末端氨基酸（MIQYLRFVWILIIILNF LLNLFITTNGVIIVNA;SEQ ID N0:90)或者替代的N末端序列（例如簡單的N末端甲硫氨酸、 或者Met-Ala-、或者以所需方式靶向或運輸表達的蛋白的前導肽）共同表達。
[0128] NT097 抗原
[0129] 該抗原標注為NP86-028菌株中的NTHI0522并描述為預測存在于外膜環境中的長 鏈脂肪酸FadL樣轉移蛋白。已從R2846菌株中克隆并表達了該抗原。
[0130] 有用的NT097抗原可引發識別SEQ ID NO: 23的抗體（例如，在給予人時）和/或 可包含以下氨基酸序列：（a)與SEQ ID NO:23具有50%或更高的相同性（例如60%、65%、 70 %,75 %,80 %,85 %,90 %,91 %,92 %,93 %,94 %,95 %,96 %,97 %,98 %,99 %,99. 5% 或更高）；和/或（b)包含SEQ ID NO: 23的至少'η'個連續氨基酸的片段，其中'η'是7或 更多（例如，8、10、12、14、16、18、20、25、30、35、40、50、60、70、80、90、100、150、200、250 或更 多）。這些ΝΤ097蛋白包含SEQ ID NO: 23的變體。（b)的優選片段包含來自SEQ ID NO: 23 的表位。其它優選片段缺少SEQ ID N0:23C末端的一個或多個（如1、2、3、4、5、6、7、8、9、 10、15、20、25或更多個）氨基酸和/或自N末端的一個或多個（如1、2、23、4、5、6、7、8、9、 10、15、20、22、25或更多個）氨基酸，而保留SEQ ID N0:23的至少一個表位。其它片段省去 一個或多個蛋白結構域。
[0131] 本發明的NT097抗原可與NT097天然的22個N末端氨基酸 (MKKFNQSILATAMLLAAGGANA;SEQ ID N0:91)或者替代的N末端序列（例如簡單的N末端甲 硫氨酸、或者Met-Ala-、或者以所需方式靶向或運輸表達的蛋白的前導肽）共同表達。
[0132] NT004 抗原
[0133] 該抗原標注為外膜環境中來自菌株PittGG的假擬蛋白CGSHiGG_08215。已從Fi 176菌株中克隆并表達了該抗原。
[0134] 有用的NT004抗原可引發識別SEQ ID NO: 122的抗體（例如，在給予人時）和/ 或可包含以下氨基酸序列：（a)與SEQ ID NO: 122具有50%或更高的相同性（例如60%、 65 %,70 %,75 %,80 %,85 %,90 %,91 %,92 %,93 %,94 %,95 %,96 %,97 %,98 %,99 %, 99. 5%或更高）；和/或（b)包含SEQ ID NO: 122的至少'η'個連續氨基酸的片段，其中'η' 是 7 或更多（例如，8、10、12、14、16、18、20、25、30、35、40、50、60、70、80、90、100、150、200、 250或更多）。這些ΝΤ004蛋白包含SEQ ID NO: 122的變體。（b)的優選片段包含來自SEQ ID NO: 122的表位。其它優選片段缺少SEQ ID NO: 122C末端的一個或多個（如1、2、3、4、 5、 6、7、8、9、10、15、20、25或更多個）氨基酸和/或自N末端的一個或多個（如1、2、3、4、5、 6、 7、8、9、10、15、20、22、25或更多個）氨基酸，而保留SEQIDN0:122的至少一個表位。其 它片段省去一個或多個蛋白結構域。
[0135] 本發明的NT004抗原可與NT004天然的20個N末端氨基酸 (MKKKNQILVSLSIVALLGGC;SEQ ID N0:125)或者替代的N末端序列（例如簡單的N末端甲 硫氨酸、或者Met-Ala-、或者以所需方式靶向或運輸表達的蛋白的前導肽）共同表達。
[0136] NT014 抗原
[0137] 該抗原標注為來自菌株Rd KW20的假擬蛋白HI1658。已從Fi 176菌株中克隆并表 達了該抗原。
[0138] 有用的NT014抗原可引發識別SEQ ID NO: 123的抗體（例如，在給予人時）和/ 或可包含以下氨基酸序列：（a)與SEQ ID NO: 123具有50%或更高的相同性（例如60%、 65 %,70 %,75 %,80 %,85 %,90 %,91 %,92 %,93 %,94 %,95 %,96 %,97 %,98 %,99 %, 99. 5%或更高）；和/或（b)包含SEQ ID NO: 123的至少'η'個連續氨基酸的片段，其中'η' 是 7 或更多（例如，8、10、12、14、16、18、20、25、30、35、40、50、60、70、80、90、100、150、200、 250或更多）。這些ΝΤ014蛋白包含SEQ ID NO: 123的變體。（b)的優選片段包含來自SEQ ID NO: 123的表位。其它優選片段缺少SEQ ID NO: 123C末端的一個或多個（如1、2、3、4、 5、 6、7、8、9、10、15、20、25或更多個）氨基酸和/或自N末端的一個或多個（如1、2、3、4、5、 6、 7、8、9、10、15、20、22、25或更多個）氨基酸，而保留SEQIDN0:123的至少一個表位。其 它片段省去一個或多個蛋白結構域。
[0139] 本發明的NT014抗原可與NT014天然的22個N末端氨基酸 (MTLSPLKKLAILLGATIFLQGC ;SEQ ID NO: 126)或者替代的N末端序列（例如簡單的N末端 甲硫氨酸、或者Met-Ala-、或者以所需方式靶向或運輸表達的蛋白的前導肽）共同表達。
[0140] NT022 抗原
[0141] 該抗原標注為來自菌株NP86-028的NTHI0830并鑒定為可能的外膜抗原脂蛋白B。 已從Fil76菌株中克隆并表達了該抗原。還發現該抗原含有LytM催化結構域并且是表面 暴露和分泌的。
[0142] 有用的NT022抗原可引發識別SEQ ID NO: 124的抗體（例如，在給予人時）和/ 或可包含以下氨基酸序列：（a)與SEQ ID NO: 124具有50%或更高的相同性（例如60%、 65 %,70 %,75 %,80 %,85 %,90 %,91 %,92 %,93 %,94 %,95 %,96 %,97 %,98 %,99 %, 99. 5%或更高）；和/或（b)包含SEQ ID NO: 124的至少'η'個連續氨基酸的片段，其中'η' 是 7 或更多（例如，8、10、12、14、16、18、20、25、30、35、40、50、60、70、80、90、100、150、200、 250或更多）。這些ΝΤ022蛋白包含SEQ ID NO: 124的變體。（b)的優選片段包含來自SEQ ID NO: 124的表位。其它優選片段缺少SEQ ID NO: 124C末端的一個或多個（如1、2、3、4、 5、 6、7、8、9、10、15、20、25或更多個）氨基酸和/或自N末端的一個或多個（如1、2、3、4、5、 6、 7、8、9、10、15、20、22、25或更多個）氨基酸，而保留SEQIDN0:124的至少一個表位。其 它片段省去一個或多個蛋白結構域。
[0143] 本發明的NT022抗原可與NT022天然的18個N末端氨基酸（MKKSFLLLPLSLVVLSAC ; SEQ ID NO: 127)或者替代的N末端序列（例如簡單的N末端甲硫氨酸、或者Met-Ala-、或 者以所需方式靶向或運輸表達的蛋白的前導肽）共同表達。
[0144] 第二抗原組
[0145] 抗原 P48
[0146] P48多肽在文獻中標注為Na(+)_易位NADH-醌還原酶亞基A。出于參比目的，P48 的全長氨基酸序列在本文中稱為SEQ ID NO: 24。
[0147] 本發明所用的優選P48多肽包含以下氨基酸序列：（a)與SEQ ID NO: 24具有50% 或更高的相同性（例如 60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、 95%、96%、97%、98%、99%、99. 5%或更高），例如90%或更高的相同性，或者95%或更高 的相同性，或者99%或更高的相同性；和/或（b)包含SEQ ID NO:24的至少'η'個連續氨 基酸的片段，其中 'η' 是 7 或更多（例如 8、10、12、14、16、18、20、25、30、35、40、50、60、70、 80、90、100、150、200、250或更多；例如20或更多；或者例如50或更多；或者例如80或更 多）。這些Ρ48多肽包含SEQ ID NO:24的變體。（b)的優選片段包含來自SEQ ID NO:24的 表位。其它優選片段缺少SEQ ID N0:24C末端的一個或多個（如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、 15、20、25或更多個）氨基酸和/或N末端的一個或多個（如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、 20、25或更多個）氨基酸，而保留SEQ ID NO:24的至少一個表位。其它片段省去一個或多 個蛋白結構域。
[0148] 理想情況下，本發明的P48抗原不具有P48天然的25個N末端氨基酸 (MITIKKGLDLPIAGKPAQVIHSGNA;SEQ ID N0:92)，因此其應與替代的N末端序列（例如簡單 的N末端甲硫氨酸、或者Met-Ala-、或者以所需方式靶向或運輸表達的蛋白的前導肽）共同 表達。
[0149] 根據本發明，P48抗原可優選與本文所述的抗原HtrA、PE、P26、PHiD和/或P6中 的一個或多個（例如1、2或3個）組合，具體而言例如與HtrA組合。
[0150] 抗原 HtrA
[0151] HtrA多肽在文獻中標注為周質絲氨酸蛋白酶do/HhoA樣前體，并描述為熱休克蛋 白或伴侶蛋白。出于參比目的，HtrA的全長氨基酸序列在本文中稱為SEQ ID NO: 25。
[0152] 本發明所用的優選HtrA多肽包含以下氨基酸序列：（a)與SEQ ID NO: 25具有50% 或更高的相同性（例如 60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、 95%、96%、97%、98%、99%、99. 5%或更高），例如90%或更高的相同性，或者95%或更高 的相同性，或者99%或更高的相同性；和/或（b)包含SEQ ID NO:25的至少'η'個連續氨 基酸的片段，其中 'η' 是 7 或更多（例如 8、10、12、14、16、18、20、25、30、35、40、50、60、70、 80、90、100、150、200、250或更多；例如20或更多；或者例如50或更多；或者例如80或更 多）。這些HtrA多肽包含SEQ ID Ν0:25的變體。（b)的優選片段包含來自SEQ ID Ν0:25 的表位。其它優選片段缺少SEQ ID N0:25C末端的一個或多個（如1、2、3、4、5、6、7、8、9、 10、15、20、25或更多個）氨基酸和/或N末端的一個或多個（如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、 15、20、25或更多個）氨基酸，而保留SEQ ID NO: 25的至少一個表位。其它片段省去一個或 多個多肽結構域。
[0153] 理想情況下，本發明的HtrA抗原不具有HtrA天然的26個N末端氨基酸 (MKKTRFVLNSIALGLSVLSTSFVAQA;SEQ ID N0:93)，因此其應與替代的N末端序列（例如簡單 的N末端甲硫氨酸、或者Met-Ala-、或者以所需方式靶向或運輸表達的蛋白的前導肽）共同 表達。
[0154] 根據本發明，HtrA抗原可優選與本文所述的抗原P48、PE、P26、P6和/或PHiD中 的一個或多個（例如1、2或3個）組合，具體而言例如與P48組合。
[0155] 抗原 PE
[0156] PE多肽標注為脂蛋白-玻璃體結合蛋白，或結合IgD并作為2型肺泡細胞的粘附 齊[J。出于參比目的，PE的全長氨基酸序列在本文中稱為SEQ ID NO: 26。
[0157] 本發明所用的優選PE多肽包含以下氨基酸序列：(a)與SEQ ID NO :26具有50% 或更高的相同性（例如 60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、 95%、96%、97%、98%、99%、99. 5%或更高），例如90%或更高的相同性，或者95%或更高 的相同性，或者99%或更高的相同性；和/或（b)包含SEQ ID NO:26的至少'η'個連續氨 基酸的片段，其中 'η' 是 7 或更多（例如 8、10、12、14、16、18、20、25、30、35、40、50、60、70、 80、90、100、150或更多；例如20或更多；或者例如50或更多；或者例如80或更多）。這些 PE多肽包括SEQ ID NO:26的變體。（b)的優選片段包含來自SEQ ID NO:26的表位。其它 優選片段缺少SEQ ID N0:26C末端的一個或多個（如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25或 更多個）氨基酸和/或N末端的一個或多個（如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25或更多 個）氨基酸，而保留SEQ ID N0:26的至少一個表位。其它片段省去一個或多個多肽結構域。
[0158] 理想情況下，本發明的PE抗原不具有PE天然的16個N末端氨基酸 (MKKIILTLSLGLLTAC;SEQ ID N0:94)，因此其應與替代的N末端序列（例如簡單的N末端甲 硫氨酸、或者Met-Ala-、或者以所需方式靶向或運輸表達的蛋白的前導肽）共同表達。
[0159] 根據本發明，PE抗原可優選與本文所述的抗原P48、HtrA、P26、P6和/或PHiD中 的一個或多個（例如1、2或3個）組合。
[0160] 抗原 P26
[0161] P26多肽也稱為外膜蛋白26。該抗原標注為Skp蛋白家族的成員，其推定的功能是 外膜蛋白的移位[5]。出于參比目的，P26的全長氨基酸序列在本文中稱為SEQ ID N0:27。
[0162] 本發明所用的優選P26多肽包含以下氨基酸序列：（a)與SEQ ID NO :27具有50 % 或更高的相同性（例如 60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、 95%、96%、97%、98%、99%、99. 5%或更高），例如90%或更高的相同性，或者95%或更高 的相同性，或者99%或更高的相同性；和/或（b)包含SEQ ID NO:27的至少'η'個連續氨 基酸的片段，其中 'η' 是 7 或更多（例如 8、10、12、14、16、18、20、25、30、35、40、50、60、70、 80、90、100、150或更多；例如20或更多；或者例如50或更多；或者例如80或更多）。這些 Ρ26多肽包含SEQ ID Ν0:27的變體。（b)的優選片段包含來自SEQ ID Ν0:27的表位。其 它優選片段缺少SEQ ID N0:27C末端的一個或多個（如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25 或更多個）氨基酸和/或N末端的一個或多個（如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25或更 多個）氨基酸，而保留SEQ ID N0:27的至少一個表位。其它片段省去一個或多個蛋白結構 域。
[0163] 根據本發明，P26抗原可優選與本文所述的抗原P48、HtrA、PE、PHiD和/或P6中 的一個或多個（例如1、2或3個）組合，具體而言可與本文所述的P48、HtrA和或PE中的 部分或全部組合。
[0164] PHiD 抗原
[0165] PHiD抗原也稱為"蛋白D"并主要用作糖偶聯物NTHi疫苗方法中的運載蛋白[95]。 已從Fil76菌株中克隆并表達了該抗原。
[0166] 本發明所用的優選PHiD多肽包含以下氨基酸序列：（a)與SEQ ID NO: 28具有50% 或更高的相同性（例如 60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、 95%、96%、97%、98%、99%、99. 5%或更高），例如90%或更高的相同性，或者95%或更高 的相同性，或者99%或更高的相同性；和/或（b)包含SEQ ID NO:28的至少'η'個連續氨 基酸的片段，其中 'η' 是 7 或更多（例如 8、10、12、14、16、18、20、25、30、35、40、50、60、70、 80、90、100、150或更多；例如20或更多；或者例如50或更多；或者例如80或更多）。這些 PHiD多肽包含SEQ ID ΝΟ:28的變體。（b)的優選片段包含來自SEQ ID ΝΟ:28的表位。其 它優選片段缺少SEQ ID NO:28C末端的一個或多個（如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25 或更多個）氨基酸和/或N末端的一個或多個（如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25或更 多個）氨基酸，而保留SEQ ID NO:28的至少一個表位。其它片段省去一個或多個蛋白結構 域。
[0167] 本發明的PhiD抗原可與PhiD天然的18個N末端氨基酸（MKLKTLALSLLAAGVLAG ; SEQ ID NO: 95)或者替代的N末端序列（例如簡單的N末端甲硫氨酸、或者Met-Ala-、或者 以所需方式靶向或運輸表達的蛋白的前導肽）共同表達。
[0168] 根據本發明，PHiD抗原可優選與本文所述的抗原P48、HtrA、PE、P26和/或P6中 的任意一個或多個（例如1、2或3個）組合。
[0169] 本發明的PhiD抗原可以是脂蛋白，例如在N末端半胱氨酸處脂化。
[0170] P6 抗原
[0171] P6抗原也稱為OMP 6(外膜蛋白6) [14]。已從Fil76菌株中克隆并表達了該抗原。
[0172] 本發明所用的優選P6多肽包含以下氨基酸序列：(a)與SEQ ID NO: 29具有50% 或更高的相同性（例如 60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、 95%、96%、97%、98%、99%、99. 5%或更高），例如90%或更高的相同性，或者95%或更高 的相同性，或者99%或更高的相同性；和/或（b)包含SEQ ID NO:29的至少'η'個連續氨 基酸的片段，其中 'η' 是 7 或更多（例如 8、10、12、14、16、18、20、25、30、35、40、50、60、70、 80、90、100、150或更多；例如20或更多；或者例如50或更多；或者例如80或更多）。這些 Ρ6多肽包含SEQ ID Ν0:29的變體。（b)的優選片段包含來自SEQ ID Ν0:29的表位。其它 優選片段缺少SEQ ID N0:29C末端的一個或多個（如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25或 更多個）氨基酸和/或N末端的一個或多個（如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25或更多 個）氨基酸，而保留SEQ ID N0:29的至少一個表位。其它片段省去一個或多個蛋白結構域。
[0173] 本發明的P6抗原可與P6天然的19個N末端氨基酸（MNKFVKSLLVAGSVAALAA ;SEQ ID N0:96)或者替代的N末端序列（例如簡單的N末端甲硫氨酸、或者Met-Ala-、或者以所 需方式靶向或運輸表達的蛋白的前導肽）共同表達。
[0174] 根據本發明，P6抗原可優選與本文所述的抗原P48、HtrA、PE、P26和/或PHiD中 的任意一個或多個（例如1、2或3個）組合。
[0175] 本發明的P6抗原可以是脂蛋白，例如在N末端半胱氨酸處脂化。
[0176] 第三抗原組
[0177] NT013 抗原
[0178] "NT013"抗原標注為包含TPR重復的蛋白，且還標注為細胞色素 c成熟血紅素裂解 酶亞基CcmH2。其已公開為菌株86-028NP中的NTHI0532。NT013已標注為屬于金屬蛋白酶 蛋白家族且其具有LytM催化結構域。
[0179] 有用的NT013抗原可引發抗體（例如，在給予人時），所述抗體識別SEQ ID NO: 30 和/或可包括以下氨基酸序列：（a)與SEQ ID N0:30具有50%或更高的相同性（例如60%、 65 %,70 %,75 %,80 %,85 %,90 %,91 %,92 %,93 %,94 %,95 %,96 %,97 %,98 %,99 %, 99. 5%或更高）；和/或（b)包含SEQ ID NO:20的至少'η'個連續氨基酸的片段，其中'η' 是 7 或更多（例如，8、10、12、14、16、18、20、25、30、35、40、50、60、70、80、90、100、150、200、 250或更多）。這些ΝΤ013蛋白包括SEQ ID NO: 30的變體。（b)的優選片段包含來自SEQ ID N0:30的表位。其他優選片段缺少SEQ ID N0:30C末端的一個或多個（如1、2、3、4、5、 6、7、8、9、10、15、20、25或更多個）氨基酸和/或N末端的一個或多個（如1、2、3、4、5、6、7、 8、9、30、15、20、25或更多個）氨基酸，而保留SEQ ID N0:30的至少一個表位。其它片段省 去一個或多個蛋白結構域。
[0180] 本發明的NT013抗原可與NT013天然的42個N末端氨基酸（MPVQHVKLARDRRKKRT HKVGVFFVAILLILTGILLTIKDK;SEQ ID N0:97)或者替代的N末端序列（例如簡單的N末端 甲硫氨酸、或者Met-Ala-、或者以所需方式靶向或運輸表達的蛋白的前導肽）共同表達。
[0181] NT106 抗原
[0182] "NT106"抗原標注為脂蛋白，且已公開為基因組86-028NP中的
[0183] NTHI0363。
[0184] 有用的NT106抗原可引發抗體（例如，在給予人時），所述抗體識別SEQ ID NO: 31 和/或可包含以下氨基酸序列：（a)與SEQ ID N0:31具有50%或更高的相同性（例如60%、 65 %,70 %,75 %,80 %,85 %,90 %,91 %,92 %,93 %,94 %,95 %,96 %,97 %,98 %,99 %, 99. 5%或更高）；和/或（b)包括SEQ ID NO:31的至少'η'個連續氨基酸的片段，其中'η' 是 7 或更多（例如，8、10、12、14、16、18、20、25、30、35、40、50、60、70、80、90、100、150、200、 250或更多）。這些ΝΤ106蛋白包括SEQ ID NO: 31的變體。（b)的優選片段包含來自SEQ ID N0:31的表位。其它優選片段缺少SEQ ID N0:31C末端的一個或多個（如1、2、3、4、5、 6、7、8、9、10、15、20、25或更多個）氨基酸和/或N末端的一個或多個（如1、2、3、4、5、6、7、 8、9、10、15、20、25或更多個）氨基酸，而保留SEQ ID N0:31的至少一個表位。其它片段省 去一個或多個蛋白結構域。
[0185] 本發明的NT106抗原可與NT106天然的17個N末端氨基酸（MKKIILNLVTAIILAGC ; SEQ ID NO: 98)或者替代的N末端序列（例如簡單的N末端甲硫氨酸、或者Met-Ala-、或者 以所需方式靶向或運輸表達的蛋白的前導肽）共同表達。
[0186] 本發明的NT106抗原可以是脂蛋白，例如在N末端半胱氨酸處脂化。
[0187] NT107 抗原
[0188] "NT107"抗原標注為"血紅素/血液結合素結合蛋白B"，且已公開為基因組 86-028NP 中的 NTHI0370。
[0189] 有用的NT107抗原可引發抗體（例如，在給予人時），所述抗體識別SEQ ID NO: 32 和/或可包含以下氨基酸序列：（a)與SEQ ID N0:32具有50%或更高的相同性（例如60%、 65 %,70 %,75 %,80 %,85 %,90 %,91 %,92 %,93 %,94 %,95 %,96 %,97 %,98 %,99 %, 99. 5%或更高）；和/或（b)包含SEQ ID NO:20的至少'η'個連續氨基酸的片段，其中'η' 是 7 或更多（例如，8、10、12、14、16、18、20、25、30、35、40、50、60、70、80、90、100、150、200、 250或更多）。這些ΝΤ107蛋白包括SEQ ID NO: 32的變體。（b)的優選片段包含來自SEQ ID N0:32的表位。其它優選片段缺少SEQ ID N0:32C末端的一個或多個（如1、2、3、4、5、 6、7、8、9、10、15、20、25或更多個）氨基酸和/或N末端的一個或多個（如1、2、3、4、5、6、7、 8、9、10、15、20、25或更多個）氨基酸，而保留SEQ ID NO:32的至少一個表位。其它片段省 去一個或多個蛋白結構域。
[0190] 本發明的NT107抗原可與NT107天然的28個N末端氨基酸 (MKMRPRYSVIASAVSLGFVLSKSVMALG;SEQ ID N0:99)或者替代的 N 末端序列（例如簡單的 N 末端甲硫氨酸、或者Met-Ala-、或者以所需方式靶向或運輸表達的蛋白的前導肽）共同表 達。
[0191] NT108 抗原
[0192] "NT108"抗原標注為胞壁質轉糖苷酶A脂蛋白。在菌株86-028NP中已標注為 NTHI0205。
[0193] 有用的NT108抗原可引發抗體（例如，在給予人時），所述抗體識別SEQ ID NO: 33 和/或可包含以下氨基酸序列：（a)與SEQ ID N0:33具有50%或更高的相同性（例如60%、 65 %,70 %,75 %,80 %,85 %,90 %,91 %,92 %,93 %,94 %,95 %,96 %,97 %,98 %,99 %, 99. 5%或更高）；和/或（b)包括SEQ ID NO:33的至少'η'個連續氨基酸的片段，其中'η' 是 7 或更多（例如，8、10、12、14、16、18、20、25、30、35、40、50、60、70、80、90、100、150、200、 250或更多）。這些ΝΤ108蛋白包括SEQ ID NO: 33的變體。（b)的優選片段包含來自SEQ ID N0:33的表位。其他優選片段缺少SEQ ID N0:33C末端的一個或多個（如1、2、3、4、5、 6、7、8、9、10、15、20、25或更多個）氨基酸和/或N末端的一個或多個（如1、2、3、4、5、6、7、 8、9、10、15、20、25或更多個）氨基酸，而保留SEQ ID NO:33的至少一個表位。其它片段省 去一個或多個蛋白結構域。
[0194] 本發明的NT108抗原可與NT108天然的24個N末端氨基酸 (MSVCKPFWFKTFSISIITALLVSC ;SEQ ID NO: 100)或者替代的N末端序列（例如簡單的N末 端甲硫氨酸、或者Met-Ala-、或者以所需方式靶向或運輸表達的蛋白的前導肽）共同表達。
[0195] 本發明的NT108抗原可以是脂蛋白，例如在N末端半胱氨酸處脂化。
[0196] NT109 抗原
[0197] 該抗原標注為硝酸鹽/亞硝酸鹽傳感蛋白NarQ并已鑒定為86-028NP菌株中的 NTHI0374并發現在所分析的菌株中保守。
[0198] 有用的NT109抗原可引發抗體（例如，在給予人時），所述抗體識別SEQ ID NO: 34 和/或可包含以下氨基酸序列：（a)與SEQ ID N0:34具有50%或更高的相同性（例如60%、 65 %,70 %,75 %,80 %,85 %,90 %,91 %,92 %,93 %,94 %,95 %,96 %,97 %,98 %,99 %, 99. 5%或更高）；和/或（b)包含SEQ ID NO:20的至少'η'個連續氨基酸的片段，其中'η' 是 7 或更多（例如，8、10、12、14、16、18、20、25、30、35、40、50、60、70、80、90、100、150、200、 250或更多）。這些ΝΤ109蛋白包括SEQ ID NO: 34的變體。（b)的優選片段包含來自SEQ ID N0:34的表位。其它優選片段缺少SEQ ID N0:34C末端的一個或多個（如1、2、3、4、5、 6、7、8、9、10、15、20、25或更多個）氨基酸和/或N末端的一個或多個（如1、2、3、4、5、6、7、 8、9、10、15、20、25或更多個）氨基酸，而保留SEQ ID NO:34的至少一個表位。其它片段省 去一個或多個蛋白結構域。
[0199] 本發明的NT109抗原可與NT109天然的33個N末端氨基酸（MYTKGSVSTRIAKYLFII LIVAGVISSLSLAM;SEQ ID N0:101)或者替代的N末端序列（例如簡單的N末端甲硫氨酸、 或者Met-Ala-、或者以所需方式靶向或運輸表達的蛋白的前導肽）共同表達。
[0200] NTllO 抗原
[0201] 該抗原已標注為基因組86-028NP中的NTHI0579并稱為推定的溶血TlyC。已發現 該抗原與外膜相關聯。
[0202] 有用的NTllO抗原可引發識別SEQ ID NO:35的抗體（例如，在給予人時）。
[0203] (b)的優選片段包含來自SEQ ID NO: 35的表位。其它優選片段缺少SEQ ID NO: 35C 末端的一個或多個（如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25或更多個）氨基酸和/或N末 端的一個或多個（如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25或更多個）氨基酸，而保留SEQ ID N0:35的至少一個表位。其它片段省去一個或多個蛋白結構域。
[0204] 本發明的NTllO抗原可與NTllO天然的30個N末端氨基酸 (^OMEL--TILAIVALILSSAVVSSAEISLA ;SEQIDN0:102)或者替代的N末端序列（例如簡單 的N末端甲硫氨酸、或者Met-Ala-、或者以所需方式靶向或運輸表達的蛋白的前導肽）共同 表達。
[0205] NTlll 抗原
[0206] 該抗原標注為菌株86-028NP中的NTHI0837,并描述為假擬脂蛋白。
[0207] 有用的NTlll抗原可引發抗體（例如，在給予人時），所述抗體識別SEQ ID NO: 36 和/或可包含以下氨基酸序列：（a)與SEQ ID N0:36具有50%或更高的相同性（例如60%、 65 %,70 %,75 %,80 %,85 %,90 %,91 %,92 %,93 %,94 %,95 %,96 %,97 %,98 %,99 %, 99. 5%或更高）；和/或（b)包括SEQ ID NO:36的至少'η'個連續氨基酸的片段，其中'η' 是 7 或更多（例如，8、10、12、14、16、18、20、25、30、35、40、50、60、70、80、90、100、150、200、 250或更多）。這些NTlll蛋白包括SEQ ID NO: 36的變體。（b)的優選片段包含來自SEQ ID N0:36的表位。其它優選片段缺少SEQ ID N0:36C末端的一個或多個（如1、2、3、4、5、 6、7、8、9、10、15、20、25或更多個）氨基酸和/或N末端的一個或多個（如1、2、3、4、5、6、7、 8、9、10、15、20、25或更多個）氨基酸，而保留SEQ ID NO:36的至少一個表位。其它片段省 去一個或多個蛋白結構域。
[0208] 本發明的NTlll抗原可與NTlll天然的19個N末端氨基酸 (MKKTLVAALISSVILLTGC;SEQ ID N0:103)或者替代的N末端序列（例如簡單的N末端甲硫 氨酸、或者Met-Ala-、或者以所需方式靶向或運輸表達的蛋白的前導肽）共同表達。
[0209] 本發明的NTllO抗原可以是脂蛋白，例如在N末端半胱氨酸處脂化。
[0210] NTl 12 抗原
[0211] 該抗原已標注為來自NP86-028菌株的NTHI0849。其標注為VacJ脂蛋白。
[0212] 有用的NT112抗原可引發抗體（例如，在給予人時），所述抗體識別SEQ ID NO: 37 和/或可包含以下氨基酸序列：（a)與SEQ ID N0:37具有50%或更高的相同性（例如60%、 65 %,70 %,75 %,80 %,85 %,90 %,91 %,92 %,93 %,94 %,95 %,96 %,97 %,98 %,99 %, 99. 5%或更高）；和/或（b)包括SEQ ID NO:37的至少'η'個連續氨基酸的片段，其中'η' 是 7 或更多（例如，8、10、12、14、16、18、20、25、30、35、40、50、60、70、80、90、100、150、200、 250或更多）。這些ΝΤ112蛋白包括SEQ ID NO: 37的變體。（b)的優選片段包含來自SEQ ID N0:37的表位。其它優選片段缺少SEQ ID N0:37C末端的一個或多個（如1、2、3、4、5、 6、7、8、9、10、15、20、25或更多個）氨基酸和/或N末端的一個或多個（如1、2、3、4、5、6、7、 8、9、10、15、20、25或更多個）氨基酸，而保留SEQ ID NO:37的至少一個表位。其它片段省 去一個或多個蛋白結構域。
[0213] 本發明的NT112抗原可與NT112天然的19個N末端氨基酸 (MKTKVILTALLSAIALTGC;SEQ ID N0:104)或者替代的N末端序列（例如簡單的N末端甲硫 氨酸、或者Met-Ala-、或者以所需方式靶向或運輸表達的蛋白的前導肽）共同表達。
[0214] 本發明的NTl 12抗原可以是脂蛋白，例如在N末端半胱氨酸處脂化。
[0215] NTl 13 抗原
[0216] 該抗原標注為86-026NP菌株中的NTHI0921以及脂蛋白。
[0217] 有用的NT113抗原可引發抗體（例如，在給予人時），所述抗體識別SEQ ID NO: 38 和/或可包含以下氨基酸序列：（a)與SEQ ID N0:38具有50%或更高的相同性（例如60%、 65 %,70 %,75 %,80 %,85 %,90 %,91 %,92 %,93 %,94 %,95 %,96 %,97 %,98 %,99 %, 99. 5%或更高）；和/或（b)包括SEQ ID NO:38的至少'η'個連續氨基酸的片段，其中'η' 是 7 或更多（例如，8、10、12、14、16、18、20、25、30、35、40、50、60、70、80、90、100、150、200、 250或更多）。這些ΝΤ113蛋白包括SEQ ID NO: 38的變體。（b)的優選片段包含來自SEQ ID N0:38的表位。其它優選片段缺少SEQ ID N0:38C末端的一個或多個（如1、2、3、4、5、 6、7、8、9、10、15、20、25或更多個）氨基酸和/或N末端的一個或多個（如1、2、3、4、5、6、7、 8、9、10、15、20、25或更多個）氨基酸，而保留SEQ ID NO:38的至少一個表位。其它片段省 去一個或多個蛋白結構域。
[0218] 本發明的NT113抗原可與NT113天然的16個N末端氨基酸（MKKYLLLALLPFLYAC ; SEQ ID NO: 105)或者替代的N末端序列（例如簡單的N末端甲硫氨酸、或者Met-Ala-、或 者以所需方式靶向或運輸表達的蛋白的前導肽）共同表達。
[0219] 本發明的NTl 13抗原可以是脂蛋白，例如在N末端半胱氨酸處脂化。
[0220] NTl 14 抗原
[0221] 該抗原標注為可溶性裂解性胞壁質轉糖苷酶蛋白以及86-026NP菌株中的 NTHI0995。
[0222] 有用的NTl 14抗原可引發抗體（例如，在給予人時），所述抗體識別SEQ ID NO: 39 和/或可包含以下氨基酸序列：（a)與SEQ ID N0:39具有50%或更高的相同性（例如60%、 65 %,70 %,75 %,80 %,85 %,90 %,91 %,92 %,93 %,94 %,95 %,96 %,97 %,98 %,99 %, 99. 5%或更高）；和/或（b)包括SEQ ID NO:39的至少'η'個連續氨基酸的片段，其中'η' 是 7 或更多（例如，8、10、12、14、16、18、20、25、30、35、40、50、60、70、80、90、100、150、200、 250或更多）。這些ΝΤ114蛋白包括SEQ ID NO: 39的變體。（b)的優選片段包含來自SEQ ID N0:39的表位。其它優選片段缺少SEQ ID N0:39C末端的一個或多個（如1、2、3、4、5、 6、7、8、9、10、15、20、25或更多個）氨基酸和/或N末端的一個或多個（如1、2、3、4、5、6、7、 8、9、10、15、20、25或更多個）氨基酸，而保留SEQ ID NO:39的至少一個表位。其它片段省 去一個或多個蛋白結構域。
[0223] 本發明的NT114抗原可與NT114天然的19個N末端氨基酸 (MKKVALISLCIFTALSAFA;SEQ ID N0:106)或者替代的N末端序列（例如簡單的N末端甲硫 氨酸、或者Met-Ala-、或者以所需方式靶向或運輸表達的蛋白的前導肽）共同表達。
[0224] NTl 15 抗原
[0225] 該抗原標注為86-026NP菌株中的NTHI1091以及推定的LptE脂蛋白。其定位在 胞外環境中。
[0226] 有用的NT115抗原可引發抗體（例如，在給予人時），所述抗體識別SEQ ID N0:40 和/或可包括以下氨基酸序列：（a)與SEQ ID N0:40具有50%或更高的相同性（例如60%、 65 %,70 %,75 %,80 %,85 %,90 %,91 %,92 %,93 %,94 %,95 %,96 %,97 %,98 %,99 %, 99. 5%或更高）；和/或（b)包括SEQ ID N0:40的至少'η'個連續氨基酸的片段，其中'η' 是 7 或更多（例如，8、10、12、14、16、18、20、25、30、35、40、50、60、70、80、90、100、150、200、 250或更多）。這些ΝΤ115蛋白包括SEQ ID Ν0:40的變體。（b)的優選片段包含來自SEQ ID N0:40的表位。其它優選片段缺少SEQ ID N0:40C末端的一個或多個（如1、2、3、4、5、 6、7、8、9、10、15、20、25或更多個）氨基酸和/或N末端的一個或多個（如1、2、3、4、5、6、7、 8、9、10、15、20、25或更多個）氨基酸，而保留SEQ ID N0:40的至少一個表位。其它片段省 去一個或多個蛋白結構域。
[0227] 本發明的NT115抗原可與NT115天然的35個N末端氨基酸（MKYLHFTRPTIKVIFMI NSIKTLLLIATLAILSAC;SEQ ID N0:107)或者替代的N末端序列（例如簡單的N末端甲硫氨 酸、或者Met-Ala-、或者以所需方式靶向或運輸表達的蛋白的前導肽）共同表達。
[0228] 本發明的NTl 15抗原可以是脂蛋白，例如在N末端半胱氨酸處脂化。
[0229] NTl 16 抗原
[0230] 該抗原描述為86-026NP菌株中的NTHI1169且屬于轉鐵蛋白結合蛋白家族。
[0231] 有用的NT116抗原可引發抗體（例如，在給予人時），所述抗體識別SEQ ID N0:41 和/或可包含以下氨基酸序列：（a)與SEQ ID N0:41具有50%或更高的相同性（例如60%、 65 %,70 %,75 %,80 %,85 %,90 %,91 %,92 %,93 %,94 %,95 %,96 %,97 %,98 %,99 %, 99. 5%或更高）；和/或（b)包括SEQ ID N0:41的至少'η'個連續氨基酸的片段，其中'η' 是 7 或更多（例如，8、10、12、14、16、18、20、25、30、35、40、50、60、70、80、90、100、150、200、 250或更多）。這些ΝΤ116蛋白包括SEQ ID Ν0:41的變體。（b)的優選片段包含來自SEQ ID N0:41的表位。其它優選片段缺少SEQ ID N0:41C末端的一個或多個（如1、2、3、4、5、 6、7、8、9、10、15、20、25或更多個）氨基酸和/或N末端的一個或多個（如1、2、3、4、5、6、7、 8、9、10、15、20、25或更多個）氨基酸，而保留SEQ ID N0:41的至少一個表位。其它片段省 去一個或多個蛋白結構域。
[0232] 本發明的NT116抗原可與NT116天然的18個N末端氨基酸（MKSVPLITGGLSFLLSAC ; SEQ ID NO: 108)或者替代的N末端序列（例如簡單的N末端甲硫氨酸、或者Met-Ala-、或 者以所需方式靶向或運輸表達的蛋白的前導肽）共同表達。
[0233] NTl 17 抗原
[0234] 該抗原標注為86-026NP菌株中的NTHI1208以及推定的轉谷氨酰胺酶。其定位于 外膜中。
[0235] 有用的NT117抗原可引發抗體（例如，在給予人時），所述抗體識別SEQ ID N0:42 和/或可包含以下氨基酸序列：（a)與SEQ ID N0:42具有50%或更高的相同性（例如60%、 65 %,70 %,75 %,80 %,85 %,90 %,91 %,92 %,93 %,94 %,95 %,96 %,97 %,98 %,99 %, 99. 5%或更高）；和/或（b)包括SEQ ID N0:42的至少'η'個連續氨基酸的片段，其中'η' 是 7 或更多（例如，8、10、12、14、16、18、20、25、30、35、40、50、60、70、80、90、100、150、200、 250或更多）。這些ΝΤ117蛋白包括SEQ ID Ν0:42的變體。（b)的優選片段包含來自SEQ ID N0:42的表位。其它優選片段缺少SEQ ID N0:42C末端的一個或多個（如1、2、3、4、5、 6、7、8、9、10、15、20、25或更多個）氨基酸和/或N末端的一個或多個（如1、2、3、4、5、6、7、 8、9、10、15、20、25或更多個）氨基酸，而保留SEQ ID N0:42的至少一個表位。其它片段省 去一個或多個蛋白結構域。
[0236] 本發明的NT117抗原可與NT117天然的19個N末端氨基酸 (MKKLIAVAVFSACGSLAHA;SEQ ID N0:109)或者替代的N末端序列（例如簡單的N末端甲硫 氨酸、或者Met-Ala-、或者以所需方式靶向或運輸表達的蛋白的前導肽）共同表達。
[0237] NTl 18 抗原
[0238] 該抗原標注為86-026NP菌株中的NTHI1318以及假擬蛋白。
[0239] 有用的NT118抗原可引發抗體（例如，在給予人時），所述抗體識別SEQ ID N0:43 和/或可包含以下氨基酸序列：（a)與SEQ ID N0:43具有50%或更高的相同性（例如60%、 65 %,70 %,75 %,80 %,85 %,90 %,91 %,92 %,93 %,94 %,95 %,96 %,97 %,98 %,99 %, 99. 5%或更高）；和/或（b)包括SEQ ID N0:43的至少'η'個連續氨基酸的片段，其中'η' 是 7 或更多（例如，8、10、12、14、16、18、20、25、30、35、40、50、60、70、80、90、100、150、200、 250或更多）。這些ΝΤ118蛋白包括SEQ ID Ν0:43的變體。（b)的優選片段包含來自SEQ ID N0:43的表位。其它優選片段缺少SEQ ID N0:43C末端的一個或多個（如1、2、3、4、5、 6、7、8、9、10、15、20、25或更多個）氨基酸和/或N末端的一個或多個（如1、2、3、4、5、6、7、 8、9、10、15、20、25或更多個）氨基酸，而保留SEQ ID NO:43的至少一個表位。其它片段省 去一個或多個蛋白結構域。
[0240] 本發明的NT118抗原可與NT118天然的18個N末端氨基酸（MNIRWNVILGVIALCALA ; SEQ ID NO: 110)或者替代的N末端序列（例如簡單的N末端甲硫氨酸、或者Met-Ala-、或 者以所需方式靶向或運輸表達的蛋白的前導肽）共同表達。
[0241] NTl 19 抗原
[0242] 該抗原標注為86-028NP菌株中的NTHI1565假擬蛋白。
[0243] 有用的NT119抗原可引發抗體（例如，在給予人時），所述抗體識別SEQ ID NO: 114 和/或可包含以下氨基酸序列：（a)與SEQ ID NO: 114具有50%或更高的相同性（例如 60 %,65 %,70 %,75 %,80 %,85 %,90 %,91 %,92 %,93 %,94 %,95 %,96 %,97 %,98 %, 99%、99. 5%或更高）；和/或（b)包括SEQ ID NO: 114的至少'η'個連續氨基酸的片段，其 中 'η' 是 7 或更多（例如，8、10、12、14、16、18、20、25、30、35、40、50、60、70、80、90、100、150、 200、250或更多）。這些NT119蛋白包括SEQ ID NO: 114的變體。（b)的優選片段包含來自 SEQ ID NO: 114的表位。其它優選片段缺少SEQ ID NO: 114C末端的一個或多個（如1、2、 3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25或更多個）氨基酸和/或N末端的一個或多個（如1、2、3、4、 5、6、7、8、9、10、15、20、25或更多個）氨基酸，而保留SEQIDN0:114的至少一個表位。其它 片段省去一個或多個蛋白結構域。
[0244] 本發明的NT119抗原可與NT119天然的26個N末端氨基酸 (MRFTKTLFTTALLGASIFSFQSTAWA;SEQ ID N0:118)或者替代的N末端序列（例如簡單的N末 端甲硫氨酸、或者Met-Ala-、或者以所需方式靶向或運輸表達的蛋白的前導肽）共同表達。
[0245] NT120 抗原
[0246] 該抗原標注為86-028NP菌株中的NTHI1569假擬蛋白。
[0247] 有用的NT120抗原可引發抗體（例如，在給予人時），所述抗體識別SEQ ID NO: 115 和/或可包括以下氨基酸序列：（a)與SEQ ID NO: 115具有50%或更高的相同性（例如 60 %,65 %,70 %,75 %,80 %,85 %,90 %,91 %,92 %,93 %,94 %,95 %,96 %,97 %,98 %, 99%、99. 5%或更高）；和/或（b)包括SEQ ID NO: 115的至少'η'個連續氨基酸的片段，其 中 'η' 是 7 或更多（例如，8、10、12、14、16、18、20、25、30、35、40、50、60、70、80、90、100、150、 200、250 或更多）。這些NT120蛋白包括SEQIDN0:115的變體。（b)的優選片段包含來自 SEQ ID NO: 115的表位。其它優選片段缺少SEQ ID NO: 115C末端的一個或多個（如1、2、 3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25或更多個）氨基酸和/或N末端的一個或多個（如1、2、3、4、 5、6、7、8、9、10、15、20、25或更多個）氨基酸，而保留SEQIDN0:115的至少一個表位。其它 片段省去一個或多個蛋白結構域。
[0248] 本發明的NT120抗原可與NT120天然的26個N末端氨基酸 (MKLTKTLLTTALFGASVFSFQSTAWA;SEQ ID N0:119)或者替代的N末端序列（例如簡單的N末 端甲硫氨酸、或者Met-Ala-、或者以所需方式靶向或運輸表達的蛋白的前導肽）共同表達。
[0249] NT121 抗原
[0250] 該抗原標注為86-028NP菌株中的NTHI1571假擬蛋白。
[0251] 有用的NT121抗原可引發抗體（例如，在給予人時），所述抗體識別SEQ ID NO: 116 和/或可包括以下氨基酸序列：（a)與SEQ ID NO: 116具有50%或更高的相同性（例如 60 %,65 %,70 %,75 %,80 %,85 %,90 %,91 %,92 %,93 %,94 %,95 %,96 %,97 %,98 %, 99%、99. 5%或更高）；和/或（b)包括SEQ ID NO: 116的至少'η'個連續氨基酸的片段，其 中 'η' 是 7 或更多（例如，8、10、12、14、16、18、20、25、30、35、40、50、60、70、80、90、100、150、 200、250 或更多）。這些NT121蛋白包括SEQIDN0:116的變體。（b)的優選片段包含來自 SEQ ID NO: 116的表位。其它優選片段缺少SEQ ID NO: 116C末端的一個或多個（如1、2、 3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25或更多個）氨基酸和/或N末端的一個或多個（如1、2、3、4、 5、6、7、8、9、10、15、20、25或更多個）氨基酸，而保留SEQIDN0:116的至少一個表位。其它 片段省去一個或多個蛋白結構域。
[0252] 本發明的NT121抗原可與NT121天然的26個N末端氨基酸 (MKLTKTLLTTALLGASVFSFQSTAWA;SEQ ID N0:120)或者替代的N末端序列（例如簡單的N末 端甲硫氨酸、或者Met-Ala-、或者以所需方式靶向或運輸表達的蛋白的前導肽）共同表達。
[0253] NT122 抗原
[0254] 該抗原標注為86-028NP菌株中的NTHI1667假擬蛋白。
[0255] 有用的NT122抗原可引發抗體（例如，在給予人時），所述抗體識別SEQ ID NO: 117 和/或可包括以下氨基酸序列：（a)與SEQ ID NO: 117具有50%或更高的相同性（例如 60 %,65 %,70 %,75 %,80 %,85 %,90 %,91 %,92 %,93 %,94 %,95 %,96 %,97 %,98 %, 99%、99. 5%或更高）；和/或（b)包括SEQ ID NO: 117的至少'η'個連續氨基酸的片段，其 中 'η' 是 7 或更多（例如，8、10、12、14、16、18、20、25、30、35、40、50、60、70、80、90、100、150、 200、250 或更多）。這些NT122蛋白包括SEQIDN0:117的變體。（b)的優選片段包含來自 SEQ ID NO: 117的表位。其它優選片段缺少SEQ ID NO: 117C末端的一個或多個（如1、2、 3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25或更多個）氨基酸和/或N末端的一個或多個（如1、2、3、4、 5、6、7、8、9、10、15、20、25或更多個）氨基酸，而保留SEQIDN0:117的至少一個表位。其它 片段省去一個或多個蛋白結構域。
[0256] 本發明的NT122抗原可與NT122天然的23個N末端氨基酸 (MEKMKKLTLALVLGSALAVTGC;SEQ ID N0:121)或者替代的N末端序列（例如簡單的N末端 甲硫氨酸、或者Met-Ala-、或者以所需方式靶向或運輸表達的蛋白的前導肽）共同表達。
[0257] NT123 抗原
[0258] 該抗原標注為86-026NP菌株中的鋅蛋白酶NTHI1796。
[0259] 有用的NT123抗原可引發抗體（例如，在給予人時），所述抗體識別SEQ ID N0:44 和/或可包括以下氨基酸序列：（a)與SEQ ID N0:44具有50%或更高的相同性（例如60%、 65 %,70 %,75 %,80 %,85 %,90 %,91 %,92 %,93 %,94 %,95 %,96 %,97 %,98 %,99 %, 99. 5%或更高）；和/或（b)包括SEQ ID N0:44的至少'η'個連續氨基酸的片段，其中'η' 是 7 或更多（例如，8、10、12、14、16、18、20、25、30、35、40、50、60、70、80、90、100、150、200、 250或更多）。這些ΝΤ123蛋白包括SEQ ID Ν0:44的變體。（b)的優選片段包含來自SEQ ID N0:44的表位。其它優選片段缺少SEQ ID N0:44C末端的一個或多個（如1、2、3、4、5、 6、7、8、9、10、15、20、25或更多個）氨基酸和/或N末端的一個或多個（如1、2、3、4、5、6、7、 8、9、10、15、20、25或更多個）氨基酸，而保留SEQ ID NO:44的至少一個表位。其它片段省 去一個或多個蛋白結構域。
[0260] 本發明的NT123抗原可與NT123天然的17個N末端氨基酸（MKKTTALFLLIFSLIAC ; SEQ ID N0:111)或者替代的N末端序列（例如簡單的N末端甲硫氨酸、或者Met-Ala-、或 者以所需方式靶向或運輸表達的蛋白的前導肽）共同表達。
[0261] NT124 抗原
[0262] 該抗原標注為86-026NP菌株中的假擬蛋白NTHI1930。
[0263] 有用的NT124抗原可引發抗體（例如，在給予人時），所述抗體識別SEQ ID N0:45 和/或可包括以下氨基酸序列：（a)與SEQ ID N0:45具有50%或更高的相同性（例如60%、 65 %,70 %,75 %,80 %,85 %,90 %,91 %,92 %,93 %,94 %,95 %,96 %,97 %,98 %,99 %, 99. 5%或更高）；和/或（b)包括SEQ ID N0:45的至少'η'個連續氨基酸的片段，其中'η' 是 7 或更多（例如，8、10、12、14、16、18、20、25、30、35、40、50、60、70、80、90、100、150、200、 250或更多）。這些ΝΤ124蛋白包括SEQ ID Ν0:45的變體。（b)的優選片段包含來自SEQ ID N0:45的表位。其它優選片段缺少SEQ ID N0:45C末端的一個或多個（如1、2、3、4、5、 6、7、8、9、10、15、20、25或更多個）氨基酸和/或N末端的一個或多個（如1、2、3、4、5、6、7、 8、9、10、15、20、25或更多個）氨基酸，而保留SEQ ID NO:45的至少一個表位。其它片段省 去一個或多個蛋白結構域。
[0264] 本發明的NT124抗原可與NT124天然的22個N末端氨基酸 (MKKSKIAAGVVISLAAVWCAGA;SEQ ID N0:89)或者替代的N末端序列（例如簡單的N末端甲 硫氨酸、或者Met-Ala-、或者以所需方式靶向或運輸表達的蛋白的前導肽）共同表達。
[0265] NT061 抗原
[0266] 該抗原標注為86-026NP菌株中的存活蛋白SurA樣蛋白NTHI0588。
[0267] 有用的NT061抗原可引發抗體（例如，在給予人時），所述抗體識別SEQ ID NO: 128 和/或可包括以下氨基酸序列：（a)與SEQ ID NO: 128具有50%或更高的相同性（例如 60 %,65 %,70 %,75 %,80 %,85 %,90 %,91 %,92 %,93 %,94 %,95 %,96 %,97 %,98 %, 99%、99. 5%或更高）；和/或（b)包括SEQ ID NO: 128的至少'η'個連續氨基酸的片段，其 中 'η' 是 7 或更多（例如，8、10、12、14、16、18、20、25、30、35、40、50、60、70、80、90、100、150、 200、250 或更多）。這些NT061蛋白包括SEQIDN0:128的變體。（b)的優選片段包含來自 SEQ ID NO: 128的表位。其它優選片段缺少SEQ ID NO: 128C末端的一個或多個（如1、2、 3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25或更多個）氨基酸和/或N末端的一個或多個（如1、2、3、4、 5、6、7、8、9、10、15、20、25或更多個）氨基酸，而保留SEQIDN0 :128的至少一個表位。其它 片段省去一個或多個蛋白結構域。
[0268] 本發明的NT061抗原可與NT061天然的27個N末端氨基酸 (MKMKKFILKSFLLATLGCVAFTSMAQA;SEQ ID N0:129)或者替代的 N 末端序列（例如簡單的 N 末端甲硫氨酸、或者Met-Ala-、或者以所需方式靶向或運輸表達的蛋白的前導肽）共同表 達。
[0269] NT017 抗原
[0270] 該抗原標注為86-026NP菌株中的存活蛋白SurA樣蛋白NTHI0915。
[0271] 有用的NT017抗原可引發抗體（例如，在給予人時），所述抗體識別SEQ ID NO: 130 和/或可包括以下氨基酸序列：（a)與SEQ ID NO: 130具有50%或更高的相同性（例如 60 %,65 %,70 %,75 %,80 %,85 %,90 %,91 %,92 %,93 %,94 %,95 %,96 %,97 %,98 %, 99%、99. 5%或更高）；和/或（b)包括SEQ ID NO: 130的至少'η'個連續氨基酸的片段，其 中 'η' 是 7 或更多（例如，8、10、12、14、16、18、20、25、30、35、40、50、60、70、80、90、100、150、 200、250 或更多）。這些NT017蛋白包括SEQIDN0:130的變體。（b)的優選片段包含來自 SEQ ID NO: 130的表位。其它優選片段缺少SEQ ID NO: 130C末端的一個或多個（如1、2、 3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25或更多個）氨基酸和/或N末端的一個或多個（如1、2、3、4、 5、6、7、8、9、10、15、20、25或更多個）氨基酸，而保留SEQIDN0 :130的至少一個表位。其它 片段省去一個或多個蛋白結構域。
[0272] 本發明的NT017抗原可與NT017天然的20個N末端氨基酸 (MLRFGVNQKTSLLLTALLSC;SEQ ID N0:131)或者替代的N末端序列（例如簡單的N末端甲 硫氨酸、或者Met-Ala-、或者以所需方式靶向或運輸表達的蛋白的前導肽）共同表達。
[0273] 雜交多肽
[0274] 本發明使用的多肽可單獨表達或在單獨的多肽鏈上獨立表達。或者，本發 明使用的兩種或多種多肽也可作為單個多肽鏈（"雜交"多肽）進行表達。雜交多 肽可以通式NH 2-A- {-X-L-} n-B-C00H表示，其中：A是任選的N末端氨基酸序列；B是 任選的C末端氨基酸序列；η是2或更大的整數（如2、3、4、5、6等）；至少一個1是 本發明的抗原的氨基酸序列（如上文所述）；且L是任選的接頭氨基酸序列。根據 本發明，例如，各X n可包含選自下組的抗原的氨基酸序列：（I) ΝΤΗΙ0915 (ΝΤ018)、（2) NTHI1416(NT024)、（3)NTHI2017(NT032)、（4)CGSHiGG_02400(NT038，但該抗原不 在優選之列）、（5)NTHI1292(NT067)、（6)NTHI0877(NT001)、（7)NTHI0266(NT016)、 (8)CGSHiGG_00130 (NT052) , (9)NTHI1627 (NT002) , (10)NTHI1109(NT026) , (11) NTHI082KNT009), (12) NTHI0409 (NT025), (13) NTHI1954 (NT028), (14) NTHI0371 (NT029), (15) NTHI0509 (NT031) , (16) NTHI0449 (ΝΤΟ 15) , (17) NTHI1473 (NT023) , (18) gi-145633184 (NTlOO), (19)NTHI1110(NT040) , (20)gi-46129075 (NT048), (21) gi-145628236(NT053), (22) NTHI1230(NT066), (23)NTHI0522(NT097), (24)P48(NTHI0254, &SlSNT007)、（25)HtrA(NTHI1905，&SlSNT006)、（26)PE(NTHI0267，&SlS NT035)、（27)P26(NTHI0501，也定義為 NT010)、（28)PHiD(NTHI0811，也定義為 NT080)、 (29)P6(NTHI0501，也定義為 NT081)、（30)NT013、（31)NT106、（32)NT107、（33)NT108、（34) NT109、（35)NT110、（36)NT111、（37)NT112、（38)NT113、（39)NT114、（40)NT115、（41)NT116、 (42)NT117、（43)NT118、（44)NT119、（45)NT120、（46)NT121、（47)、NT122、（48)NT123、（49) NT124 ; (50) NT004 ; (51) NT014 ; (52) NT022 (也標注為 NTHI0830) ; (53) NT016 (也標注為 NTHI0266)〇
[0275] 根據本發明，Xn可包括兩種或多種抗原的氨基酸序列，所述抗原選自"第一抗原 組"所列任意抗原和"第二抗原組"所列任意抗原組成的組。各乂"可以是本發明的抗原組 合中的抗原的氨基酸序列（如上文所述）。在某些實施方式中，η是2。當η是2時，按照 本發明還可使用任何兩種上述抗原的組合。例如，當η是3時，本發明中可使用任何三種上 述抗原的組合。通常，兩個或多個乂"可以是同一抗原，或者當η是2、3或4時，各X n可以是 不同的抗原。當兩個或多個Xn是同一抗原的序列時，所述兩個或多個Xn可具有相同多肽序 列或不同多肽序列，例如可以是給定抗原的不同變體或片段，如上文所述。
[0276] 當這些抗原定義為（a)與給定的序列有50%或更高相同性（例如，60%、65%、 70%,75 %,80%,85 %,90%,91 %,92%,93 %,94%,95 %,96%,97 %,98%,99 %,99. 5% 或更高）；和/或（b)包含給定的序列的至少'η'個連續氨基酸的片段，其中'η'是7或 更多（例如，8、10、12、14、16、18、20、25、30、35、40、50、60、70、80、90、100、150、200、250 或更 多）時，對于各X而言，（a)中的相同性水平和（b)中'η'的值可以是相同的。
[0277] 在雜交蛋白中可以包括或缺少各-X-部分的野生型中的前導肽序列。在一些實施 方式中，前導肽可缺失，除非-X-部分位于雜交蛋白的N-末端，即保留X 1的前導肽，但略去 Xf-Xn的前導肽。這相當于刪除所有前導肽并使用X1的前導肽作為-A-部分。
[0278] 在{-X-L-}的各個η值的情況下，接頭氨基酸序列-L-可存在或不存在。例 如，當 η = 2 時，雜交體可以是 NH2-X1-L1-X2-L2-COOl NH2-X1-X2-COOl NH2-X1-L1-X2-COOl NH 2-X1-X2-L2-COOH等。接頭氨基酸序列-L- 一般較短（如20個或更少個氨基酸，即20、19、 18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2、1 個）。示例包括有利于克隆的短肽序 列，聚-甘氨酸接頭（即包含Glyn，其中η = 2、3、4、5、6、7、8、9、10或更大），和組氨酸標簽 (即Hisn，其中11 = 3、4、5、6、7、8、9、10或更大）。本領域技術人員顯然了解其它合適的接頭 氨基酸序列。有用的接頭是 GSGGGG(SEQ ID Ν0:46)或 GSGSGGGG(SEQ ID N0:47)，Gly-Ser 二肽由BamHI限制位點形成，因而有助于克隆和操作，（Gly)4四肽是常用的多聚甘氨酸接 頭。其他合適接頭，尤其是用作最后L n的接頭，是Leu-Glu二肽。
[0279] -A-是任選的N末端氨基酸序列。其一般較短（如40個或更少個氨基酸，即40、 39、38、37、36、35、34、33、32、31、30、29、28、27、26、25、24、23、22、21、20、19、18、17、16、15、 14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2、1個）。例子包括指導蛋白運輸的前導序列，或有利于 克隆或純化的短肽序列（例如組氨酸標簽，即His n，其中η = 3、4、5、6、7、8、9、10或更多）， 如SEQ ID Ν0:48。其它合適的N-末端氨基酸序列對于本領域技術人員來說是顯而易見的。 如果X1缺少其自身的N末端甲硫氨酸，-A-優選是提供N末端甲硫氨酸的寡肽（例如，具有 1、2、3、4、5、6、7或8個氨基酸），如Met-Ala-Ser或單個Met殘基。
[0280] -B-是任選的C末端氨基酸序列。其一般較短（如40個或更少個氨基酸，即39、 38、37、36、35、34、33、32、31、30、29、28、27、26、25、24、23、22、21、20、19、18、17、16、15、14、 13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2、1個）。示例包括指導蛋白運輸的前導序列、有利于克隆或 純化的短肽序列（例如包含組氨酸標簽，即His n，其中n = 3、4、5、6、7、8、9、10或更大，例如 SEQ ID N0:68)，或增強蛋白穩定性的序列。其它合適的C末端氨基酸序列對于本領域技術 人員來說是顯而易見的。
[0281] 菌株和變體
[0282] 抗原在上文中依據文獻中的命名規范定義，例如"NTHI"編號（來自菌株86-028NP 的基因組）或CGSHiGG編號（來自菌株PittGG的基因組）。參考文獻15中較詳細地解釋 了這類規范（具體是表1)。本文中表V將現有的命名與本文使用的"NT"命名關聯。因此， 可在指定菌株的公共序列數據庫中容易地找到本發明的任何抗原的示例性氨基酸和核苷 酸序列（以及其他信息，如功能標注），但本發明不限于來自86-028NP、3655或PittGG菌株 的序列?？梢允褂脦追N其他NTHI菌株的基因組序列（再次參見參考文獻15的表1)。可 使用標準的搜索和比對技術在這些（或其他）基因組序列中鑒定本文中提供的任意特定序 列的同源物。而且，可使用的序列可用于設計引物擴增來自其他菌株的同源序列。因此，本 發明不限于這些特定序列，而是可以包括來自其他NTHI菌株的這類變體和同源物，以及非 天然變體。通常，特定SEQ ID NO的合適變體包括其等位基因變體、其多態性形式、其同源 物、其直系同源物、其旁系同源物、其突變體等。例如，SEQ ID No:49、52、54、55、57-59、64、 65和67包括下文所述的突變。
[0283] 因此，例如，與本文中的SEQ ID NO相比，本發明所用多肽可包括一個或多個（如 1、2、3、4、5、6、7、8、9等）氨基酸取代，如保守取代（即用具有相關側鏈的另一氨基酸取代 某氨基酸）。遺傳編碼的氨基酸通常分為四類：（1)酸性，即天冬氨酸、谷氨酸；（2)堿性， 即賴氨酸、精氨酸、組氨酸；（3)非極性，即丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、脯氨酸、苯丙 氨酸、甲硫氨酸、色氨酸；和（4)不帶電的極性氨基酸，即甘氨酸、天冬酰胺、谷胺酰胺、胱氨 酸、絲氨酸、蘇氨酸、酪氨酸。有時將苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸一起歸類為芳族氨基酸。通 常，這些家族中的單個氨基酸的取代不會對生物活性產生重要影響。相對于SEQ ID NO序 列，多肽還可包含一個或多個（如1、2、3、4、5、6、7、8、9等）單個氨基酸的缺失。相對于SEQ ID NO序列，多肽也可包含一個或多個（如1、2、3、4、5、6、7、8、9等）插入（如各1、2、3、4或 5個氨基酸）。
[0284] 類似地，本發明所用多肽可包含具有以下特征的氨基酸序列：
[0285] (a)與序列表公開的某一序列相同（即100%相同）；
[0286] (b)與序列表公開的某一序列具有序列相同性（如80%、85%、90%、91%、92%、 93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、99· 5%或更高）；
[0287] (c)與（a)或（b)的序列相比，含有1、2、3、4、5、6、7、8、9或10個（或更多個）單 一氨基酸改變（缺失、插入、取代），這些改變可以位于分開的位置或連續出現；和/或
[0288] (d)用逐對比對算法與序列表中的特定序列比對時，每個從N-末端向C-末端移 動的X個氨基酸的窗口（使得在P (p>x)個氨基酸上比對時，存在P-X+1個這種窗口）具有 至少X · y個相同的比對氨基酸，其中：x選自20、25、30、35、40、45、50、60、70、80、90、100、 150、200 ;y 選自 0· 50、0· 60、0· 70、0· 75、0· 80、0· 85、0· 90、0· 91、0· 92、0· 93、0· 94、0· 95、 0. 96、0. 97、0. 98、0. 99 ;如果X · y不是整數，則四舍五入至整數。優選的成對比對算法是 Needleman-Wunsch全局比對算法[16]，使用默認參數（如缺口開放罰分=10.0,缺口延伸 罰分=〇. 5,使用EBLOSUM62積分矩陣）。用EMBOSS軟件包中的needle工具能方便地實施 這種算法[17]。
[0289] 使用雜交多肽時，雜交體內的單個抗原（即單個-X-部分）可來自一種或多種菌 株。例如，η = 2時，乂2可來自與X1相同的菌株，或來自不同菌株。當η = 3時，該菌株可以 是⑴ X1 = X2 = X3 (ii) X1 = X2 尹 X3 (iii) X1 尹 X2 = X3 (iV) X1 尹 X2 尹 X3 或（V) X1 = X3 尹 X2 等。
[0290] 在（c)組內，缺失或取代可在N末端和/或C末端，或者可以在兩個末端之間。因 此，截短是缺失的一個例子。截短可包括在N末端和/或C末端缺失多達40個（或更多 個）氨基酸。N末端截短可移除前導肽，從而例如有利于在異源宿主中重組表達。C末端截 短可移除錨定序列，從而例如有利于在異源宿主中重組表達。
[0291] 通常，當抗原包括與來自序列表的NTHI序列不同的序列時（例如，當它包含序列 相同性〈100%的序列，或包含其片段時），在各種單獨情況下，優選地，該抗原可引發抗體， 所述抗體識別相應的來自序列表的NTHI序列。
[0292] 突變細菌
[0293] 本發明還提供了 NTHi細菌，其中敲除了一種或多種本發明的抗原[18]。產生敲 除細菌的技術是公知的，且已報道了來自NTHi菌株的基因的敲除，即在參考文獻19中。敲 除突變可位于基因的編碼區，或者可位于轉錄控制區內（如啟動子內）。敲除突變會將編 碼抗原的mRNA水平降低至野生型細菌產量水平的〈1 %，優選降低至〈0. 5%，更優選降低至 〈0. 1%，最優選降低至0%。
[0294] 本發明還提供一種NTHI細菌，其中一種或多種本發明的抗原具有抑制其活性的 突變。編碼該抗原的基因將具有改變所編碼氨基酸序列或破壞其表達的突變。突變可包括 缺失、取代和/或插入，其中任何一種均可涉及一個或多個氨基酸。
[0295] -個實施方式提供了編碼本發明的抗原的一個或多個基因的缺失。
[0296] 已知在大腸桿菌中，具有LytM結構域的兩個分裂機制組分（EnvC和NlpD)是負責 細胞分離的細胞壁水解酶（酰胺酶）（AmiA、AmiB和AmiC)的直接調節因子[20]。還已知 大腸桿菌中的LytM金屬蛋白酶是子細胞分離所必需的。
[0297] 在一個實施方式中，本發明提供了編碼具有LytM催化結構域的多肽的NTHI基因。 通常金屬蛋白酶經鑒定在其催化結構域中含有HxH和HxxxD氨基酸結構域。優選地，這些 一個或多個基因編碼NT013、NT022或NT017中任意一個。
[0298] 本發明中描述了編碼具有共同的LytM催化結構域的多肽的一種或多種基因的突 變或缺失會導致細菌細胞分裂和細菌表型的巨大變化。
[0299] 發明人還顯示所述突變或缺失導致稱為OMV或外膜囊泡的囊泡釋放，而相同的野 生型NTHi菌株通常不會釋放OMV。
[0300] 在一個特別優選實施方式中，通過除去NT013和/或NT022,不僅細菌細胞分裂受 到影響，而且在通常不會釋放OMV的NTHI菌株中出乎意料地產生并釋放了外膜囊泡（OMV)。
[0301] 優選的實施方式提供了 NTHI菌株，其中缺失了編碼NTO13或NT022或NTO17中任 一項的一種或多種基因。例如，可使用抗生素抗性盒（如紅霉素抗性盒）取代缺失的基因。 已發現所有上述多肽都具有共同的LytM催化結構域且都是金屬蛋白酶。
[0302] 還發現NT013和NT022中的LytM結構域是保守的。NT013催化活性位點由位于 C-末端部分的以下氨基酸基序-HKGD-和-HLH-表示。NT022催化活性位點由位于C-末 端部分的以下氨基酸基序-NKGID-和-KLH-表示。
[0303] 本發明還提供了過表達本發明的抗原的細菌（如NTHi菌）。
[0304] 本發明還提供了組成性表達本發明的抗原的細菌（如NTHi菌）。本發明還提供了 一種大腸桿菌，所述大腸桿菌包含至少一種編碼本發明的抗原的基因，所述基因處于誘導 型啟動子的控制下。
[0305] 基于OMV的疫苗
[0306] 革蘭氏陰性菌通過連續的雙層膜結構與外部培養基分離。這些稱作質膜和外膜 (OM)的結構在結構和功能上都有差異。外膜在病原菌與其相應宿主之間的相互作用中起重 要作用。因此，表面暴露的細菌分子是宿主免疫應答的重要靶標，使得外膜組分成為提供疫 苗、診斷性和治療性試劑中有吸引力的候選物質。
[0307] 本發明的突變細菌在制備包括NTHi抗原（例如本發明的抗原）且可用作免疫原 的細菌外膜囊泡過程中特別有用。
[0308] 本發明還提供了過表達至少一種本發明抗原的細菌（如NTHi細菌），優選通過過 量產生OMV。
[0309] 可以使用上調來增加在OMV中有用的NTHi蛋白的水平。
[0310] 還提供了一種產生NTHi菌的方法，所述NTHi均過量產生0MV，所述方法包括使用 一種或多種以下方法對革蘭氏陰性菌株基序進行遺傳修飾：(a)對菌株進行基因工程改造 以下調一種或多種Tol基因的表達；以及（b)突變一種或多種編碼包含肽聚糖相關位點的 蛋白的基因，以減弱所述蛋白的肽聚糖結合活性；（c)通過突變或去除一種或多種編碼具 有共同的LytM催化結構域的多肽的基因。在一個特別優選實施方式中，NTHi可不表達活 性NT013、NT022基因和/或任何Tol基因[19]，[18]。
[0311] 本發明還提供了制備NTHi囊泡的方法，所述方法包括處理本發明的NTHi菌的步 驟，使其外膜形成囊泡。
[0312] 本發明還提供了制備NTHi囊泡的方法，所述方法包括在本發明的NTHi菌外膜自 發脫落囊泡的條件下培養本發明的NTHi菌的步驟。
[0313] 本發明還提供了過量產生OMV并過表達本發明的抗原的NTHi菌。
[0314] 本發明所用多肽
[0315] 本發明所用多肽可采取各種形式（如天然多肽、融合多肽、糖基化多肽、非糖基化 多肽、脂化多肽、非脂化多肽、磷酸化多肽、非磷酸化多肽、肉豆蘧酰化多肽、非肉豆蘧?；?多肽、單體、多聚體、顆粒、變性多肽等）。
[0316] 本發明所用多肽可通過各種方式（如重組表達、由細胞培養物純化、化學合成等） 制備。優選重組表達的蛋白，特別是雜交多肽。
[0317] 本發明所用多肽優選以純化或基本純化（即基本不含其它多肽（如不含天然產生 的多肽）、特別是不含其它流感嗜血桿菌或宿主細胞多肽）的形式提供，本發明多肽的純度 通常為至少約50重量％，通常至少約90%，即組成中少于約50%，更優選少于約10% (如 5%)是其它表達的多肽。因此，組合物中的抗原與表達該分子的完整生物體分離。
[0318] 術語"多肽"指任何長度的氨基酸聚合物。該聚合物可以是線性或支鏈聚合物，可 包含修飾的氨基酸，可被非氨基酸打斷。該術語也包括天然修飾或通過介入修飾的氨基酸 聚合物；例如，二硫鍵形成、糖基化、脂化、乙?；⒘姿峄蛉魏纹渌僮骰蛐揎?，如與標記 組分偶聯。例如，還包括含有一個或多個氨基酸類似物（包括例如非天然氨基酸等）以及 本領域已知其它修飾的多肽。多肽可以單鏈或結合鏈的形式產生。
[0319] 本發明所用多肽可包含序列-P-Q-或-Q-P-，其中：-P-是上文定義的氨基酸序 列，-Q-不是上文定義的序列（即以融合蛋白的形式提供）。-P-的N-末端密碼子不是ATG 且此密碼子未出現在多肽的N末端時，它將被翻譯成該密碼子的標準氨基酸，而不是Met。 然而，當該密碼子位于多肽N末端時，它將被翻譯成Met。-Q-部分的例子包括但不限于組 氨酸標簽（即His n，其中η = 3、4、5、6、7、8、9、10或更高，例如SEQ ID N0:68)、麥芽糖結合 蛋白或谷胱甘肽-S-轉移酶（GST)。
[0320] 最初作為初生蛋白表達時，本發明所用多肽可包含序列-P-Q-或-Q-P-，但在一些 實施方式中，在蛋白的使用點處可能缺失-Q-部分，例如前導肽可能被翻譯后切割。
[0321] 有用的用于表達的N末端序列是SEQ ID N0:48。
[0322] 雖然本發明所用多肽可在流感嗜血桿菌中表達，但本發明通常使用異源宿主進 行表達（重組表達）。異源宿主可以是原核（例如細菌）或真核生物?？梢允谴竽c桿 菌（E.coli)，其他合適的宿主包括枯草桿菌（Bacillus subtilis)、霍亂弧菌（Vibrio cholerae)、傷寒沙門菌（Salmonella typhi)、鼠傷寒沙門菌（Salmonella typhimurium)、 乳醜胺奈瑟菌（Neisseria lactamica)、灰色奈瑟菌（Neisseria cinerea)、分枝桿菌 (Mycobacteria)(例如結核分支桿菌（M. tuberculosis))、酵母等。與編碼本發明多肽的野 生型流感嗜血桿菌基因相比，改變密碼子以優化這類宿主中的表達效率而不影響編碼氨基 酸是有幫助的。
[0323] 本發明所用多肽可通過特定方法合成，所述方法包括通過化學手段合成至少部分 所述多肽的步驟。
[0324] 核酸
[0325] 本發明還提供了核酸（例如核酸組合、載體或載體組合），所述核酸編碼本發明所 用多肽、本發明的多肽或雜交多肽組合。還提供核酸，所述核酸包含編碼一種或多種（例 如2、3或4種）本發明的抗原組合的多肽或雜交多肽的核苷酸序列。核酸可以是例如載體 (例如克隆或表達載體）。
[0326] 編碼一種或多種（至少一種）本發明抗原和抗原組合的多肽的核苷酸序列是已 知的（參見例如參考文獻6-9)或者是根據遺傳密碼設計的。因此，在本發明的內容中，這 類核苷酸序列可編碼以下一種或多種抗原：（1)NTHI0915(NT018)、（2)NTHI1416(NT024)、 (3) NTHI2017 (NT032) , (4) CGSHiGG_02400 (NT038) , (5) NTHI1292 (NT067) , (6) NTHI0877 (NTOOl)、（7)NTHI0266 (ΝΤΟ 16)、（8)CGSHiGG_00I 30(ΝΤ052)、(9) NTHI1627(ΝΤ002), (10)ΝΤΗΙ1109(ΝΤ026), (11)ΝΤΗΙ0821(ΝΤ009), (12)ΝΤΗΙ0409(ΝΤ025), (13)ΝΤΗΙ1954 (ΝΤ028) , (14) ΝΤΗΙ037I (ΝΤ029) , (15) NTHI0509 (ΝΤ03 1) , (16) ΝΤΗΙ0449 (ΝΤ015) , (17) NTHI1473 (ΝΤ023) , (18) gi-145633184 (NT 100), (19) ΝΤΗΙ1110(ΝΤ040) , (20)gi-46129075 (ΝΤ048) , (21)gi-145628236 (ΝΤ053) , (22) ΝΤΗΙ1230(ΝΤ066)、（23)ΝΤΗΙ0522(ΝΤ097)或Ρ48抗原（如SEQ ID Ν0:24) ;HtrA抗原（如SEQ ID NO:25) ;PE 抗原（如 SEQ ID NO:26) ;P26 抗原（如 SEQ ID NO:27) ;PHiD 抗原（如 SEQ ID N0:28) ;P6抗原（如SEQ ID N0:29)、（24)NT004、（25)NT014、（26)NT022或者一種或多種 來自"第三抗原組"的抗原或者可編碼以下氨基酸序列：（a)與上述任意多肽具有50%或更 高的相同性（例如 60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、 96%、97%、98%、99%、99. 5%或更高；例如90%或更高的相同性，或者95%或更高的相同 性）；和/或（b)包含任意所述多肽：1的至少'η'個連續氨基酸的片段，其中'η'是7或 更多（例如，8、10、12、14、16、18、20、25、30、35、40、50、60、70、80、90、100、150、200、250 或更 多；例如20或更多；或者例如50或更多；或者例如80或更多）。
[0327] 本發明也提供可與這些核酸雜交的核酸?？梢栽诓煌?嚴謹性"的條件下進行雜交 反應。提高雜交反應嚴謹性的條件是本領域眾所周知的，且已公開過（如參考文獻121的第 752頁）。相關條件的例子包括（按嚴謹性提高的順序）：培育溫度25°C、37°C、50°C、55°C 和 68°C ;緩沖液濃度 IOx SSC、6x SSC、lx SSC、0. Ix SSC (其中 SSC 是 0· 15M NaCl 和 15mM 檸檬酸鹽緩沖液）和使用其它緩沖液體系的等同條件；甲酰胺濃度〇 %、25 %、50 %和75 %; 培育時間5分鐘至24小時；1個、2個或多個洗滌步驟；洗滌培育時間1、2或15分鐘；洗滌 溶液6x SSCUx SSC、0. Ix SSC或去離子水。雜交技術和其優化方法為本領域熟知（例如， 參見參考文獻21、22和123)。
[0328] 核酸可與靶標在低嚴謹條件下雜交；在其它實施方式中，其在中等嚴謹條件下雜 交；在優選實施方式中，其在高嚴謹條件下雜交。一組示范性的低嚴謹雜交條件是50°C和 IOx SSC。一組示范性的中等嚴謹雜交條件是55°C和lx SSC。一組示范性的高嚴謹雜交條 件是 68°C和 0· lx SSC。
[0329] 本發明包括含有這些序列的互補序列的核酸（例如，用于反義或檢測，或用作引 物）。
[0330] 本發明核酸可采取各種形式（如單鏈、雙鏈、載體、引物、探針、標記形式等）。本 發明核酸可以是環狀或分枝狀核酸，但通常是線性核酸。除非另有說明或要求，利用核酸的 本發明任何實施方式可利用雙鏈形式和構成該雙鏈形式的兩條互補單鏈形式的每條鏈。引 物、探針以及反義核酸通常是單鏈。
[0331] 編碼本文所述抗原的核酸優選以純化或基本純化的形式提供，即基本不含其它核 酸（如不含天然產生的核酸），特別是不含其它流感嗜血桿菌或宿主細胞核酸，通常其至少 為約50%純（重量），通常至少為約90%純。本發明核酸優選為流感嗜血桿菌核酸。
[0332] 可以多種方式制備編碼本文所述抗原的核酸，例如，完全或部分化學合成（例如 DNA的亞磷酰胺合成）、利用核酸酶（例如限制性酶）消化較長核酸、連接較短核酸或核苷 酸（例如使用連接酶或聚合酶）、由基因組或cDNA文庫制備等。
[0333] 核酸可連接于固體支持物（如珠、平板、濾器、膜、玻片、微陣列支持物、樹脂等）。 可用例如放射性或熒光標記、或生物素標記來標記核酸。在準備將核酸用于檢測技術時，例 如核酸是引物或探針時，這特別有用。
[0334] 術語"核酸"通常包括任何長度的核苷酸聚合形式，其包含脫氧核糖核苷酸、核糖 核苷酸和/或其類似物。它包括DNA、RNA、DNA/RNA雜交體。它也包括DNA或RNA類似物， 如含有修飾主鏈（如肽核酸（PM)或硫代磷酸酯）或修飾堿基的類似物。因此，本發明包 括mRNA、tRNA、rRNA、核酶、DNA、cDNA、重組核酸、分枝核酸、質粒、載體、探針、引物等。本發 明的核酸是RNA形式時，它可能具有或不具有5'帽。
[0335] 編碼本文所述抗原的核酸可以是載體的一部分，即設計用于轉導/轉染一種或多 種細胞類型的核酸構建的一部分。載體可以是，例如，設計用于分離、增殖和復制所插入核 苷酸的"克隆載體"，設計用于在宿主細胞中表達核苷酸序列的"表達載體"，設計用于產生 重組病毒或病毒樣顆粒的"病毒載體"，或具有一種以上載體類型的屬性的"穿梭載體"。優 選的載體是質粒。"宿主細胞"包括單個細胞或細胞培養物，其可能是或已經是外源核酸的 受體。宿主細胞包括單個宿主細胞的后代，由于天然、偶然或有意的突變和/或改變，這些 后代與原始親本細胞不必需完全相同（形態或總DNA互補方面）。宿主細胞包括用本發明 的核酸體內或體外轉染或感染的細胞。
[0336] 涉及核酸使用的術語"互補"或"互補的"指沃森克里克堿基配對。因此，C的互補 物是G，G的互補物是C，A的互補物是T (或U)，T (或U)的互補物是A。也能使用如I (嘌 呤肌苷）等堿基，例如與嘧啶（C或T)互補。
[0337] 可使用編碼本文所述抗原的核酸，例如：產生多肽；作為檢測生物樣品中的核酸 的雜交探針；產生額外的核酸拷貝；產生核酶或反義寡核苷酸；作為單鏈DNA引物或探針； 或作為形成三鏈體的寡核苷酸。
[0338] 本發明提供了產生編碼本文所述抗原的核酸的方法，其中所述核酸部分或完全用 化學方式合成。
[0339] 本發明提供了包含編碼本文所述抗原的核苷酸序列的載體（如克隆或表達載體） 和用這種載體轉化的宿主細胞。
[0340] 在本發明的某些實施方式中，核酸的長度優選為至少7個核苷酸（如8、9、10、11、 12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、 37、38、39、40、45、50、55、60、65、70、75、80、90、100、110、120、130、140、150、160、170、180、 190、200、225、250、275、300 個核苷酸或更長）。
[0341] 在本發明的某些實施方式中，核酸長度優選至多為500個核苷酸（如450、400、 350、300、250、200、150、140、130、120、110、100、90、80、75、70、65、60、55、50、45、40、39、38、 37、36、35、34、33、32、31、30、29、28、27、26、25、24、23、22、21、20、19、18、17、16、15 個核苷酸 或更短）。
[0342] 免疫原性組合物和藥物
[0343] 本發明的免疫原性組合物可用作疫苗。本發明的疫苗可以是預防性（即預防感 染）或治療性（即治療感染）疫苗，但通常是預防性疫苗。
[0344] 因此，組合物可以是藥學上可接受的。除抗原外，它們通常還包含其它組分，例如 它們一般包含一種或多種藥物載體和/或賦形劑。對這類組分的充分討論參見參考文獻 118。
[0345] 組合物通常以水性形式給予哺乳動物。然而在給藥前，該組合物可以是非水性形 式。例如，雖然一些疫苗制備成水性形式然后以水性形式填裝、分銷和給藥，但其他疫苗在 制備過程中凍干，并在使用時重建成水性形式。因此，本發明的組合物可被干燥，例如凍干 制劑。
[0346] 該組合物可含有防腐劑，如硫柳汞或2-苯氧乙醇。然而，疫苗優選應基本不含（即 少于5 μ g/ml)含汞物質，如不含硫柳汞。更優選無汞的疫苗。特別優選不含防腐劑的疫苗。
[0347] 為了提高熱穩定性，組合物可包含溫度保護劑。這類試劑的更多詳情如下所述。
[0348] 為了控制張度，優選包含生理鹽如鈉鹽。優選氯化鈉（NaCl)，它的濃度可以是1至 20mg/ml，例如約10±2mg/ml NaCl。可存在的其它鹽包括氯化鉀、磷酸二氫鉀、無水磷酸氫 二鈉、氯化鎂、氯化鈣等。
[0349] 組合物的滲透壓通常為200m0sm/kg-400m0sm/kg，優選為240-360m0sm/kg，更優 選落入290_310m0sm/kg的范圍內。
[0350] 組合物可含有一種或多種緩沖劑。典型的緩沖劑包括：磷酸鹽緩沖劑；Tris緩沖 齊?;硼酸鹽緩沖劑；琥珀酸鹽緩沖劑；組氨酸緩沖劑（具體是有氫氧化鋁佐劑時）；或檸檬 酸鹽緩沖劑。包含的緩沖劑的濃度一般為5-20mM。
[0351] 組合物的pH通常為5. 0至8. 1，更常為6. 0至8. 0,例如6. 5至7. 5,或者7. 0至 7. 8。
[0352] 該組合物優選無菌。該組合物優選無熱原，如每劑量含有小于1EU(內毒素單位， 標準量度），優選每劑量小于〇. 1EU。該組合物優選不含谷蛋白。
[0353] 所述組合物可含有一次免疫的物質，或者可含有多次免疫的物質（即"多劑量"藥 盒）。多劑量配置優選含有防腐劑。作為多劑量組合物中包含防腐劑的替代方案（或補充 方案），所述組合物可包含在裝有無菌接頭以取出物質的容器中。
[0354] 人疫苗的給藥劑量體積一般為約0. 5ml，但可將一半劑量（即約0. 25ml)給予兒 里。
[0355] 本發明免疫原性組合物也可包含一種或多種免疫調節劑。優選地，一種或多種免 疫調節劑包括一種或多種佐劑。佐劑可包括THl佐劑和/或TH2佐劑，詳述見下。
[0356] 可用于本發明組合物的佐劑包括但不限于：
[0357] ?礦物鹽，例如鋁鹽和鈣鹽，包括氫氧化物（例如，氫氧化合物）、磷酸鹽（例如羥 基磷酸鹽、正磷酸鹽）和硫酸鹽等[例如，參見參考文獻23的第8和第9章];
[0358] ?水包油乳劑，例如鯊烯-水乳劑，包括MF59 (5 %鯊烯、0. 5 %吐溫80和0. 5 %司盤 85,采用微射流機制成亞微米顆粒）[參考文獻23的第10章，還參見參考文獻24-26,和參 考文獻27的第12章]，完全弗氏佐劑（CFA)和不完全弗氏佐劑（IFA);
[0359] ?皂苷制劑[參考文獻23的第22章]，例如QS21 [28]和ISCOM[參考文獻23的 第23章];
[0360] ?病毒體和病毒樣顆粒（VLP) [29-35];
[0361] ?細菌或微生物衍生物，例如腸細菌脂多糖（LPS)的無毒衍生物、脂質A衍生物 [36, 37]、免疫刺激性寡核苷酸[38-43]，例如IC-31?[44](包含26-基體序列5' - (IC) 13-3' 的脫氧核苷酸（SEQ ID N0:112)和包含11-聚體氨基酸序列KLKLLLLLKLK的多聚陽離子聚 合肽（SEQ ID NO: 113))，和ADP-核糖基化毒素及其脫毒化的衍生物[45-54];
[0362] ?人免疫調節劑，包括細胞因子，如白介素（如IL-l、IL-2、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、 IL-12 [55, 56])，干擾素（如干擾素 -γ )、巨噬細胞集落刺激因子和腫瘤壞死因子；
[0363] ?生物粘著劑和粘膜粘著劑，例如殼聚糖及其衍生物、酯化透明質酸微球[57]或 粘膜粘著劑，如聚（丙烯酸）、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮、多糖和羧甲基纖維素的交聯衍生 物[58]。
[0364] ?微顆粒（即，直徑為約IOOnm至約150 μ m的顆粒，更優選直徑為約200nm至約 30 μ m的顆粒，且最優選直徑為約500nm至約10 μ m的顆粒），所述微顆粒由生物可降解且 無毒的材料形成（例如，聚（Ct-輕酸）、聚輕基丁酸、聚原酸酯（polyorthoester)、聚酸酐、 聚己酸內酯等）；
[0365] ?脂質體[參考文獻23的第13和14章、參考文獻59-61]。
[0366] ?聚氧乙烯醚和聚氧乙烯酯[62];
[0367] · PCPP 制劑[63 和 64];
[0368] ?胞壁酰肽，包括N-乙?；?胞壁酰-L-蘇氨酰-D-異谷酰胺（thr-MDP)、N-乙酰 基-正胞壁酰-L-丙氨酰-D-異谷酰胺（nor-MDP)和N-乙酰胞壁酰-L-丙氨酰-D-異谷 氨酰胺酰-L-丙氨酸-2-(Γ-2'_二棕櫚酰-sn-甘油-3-羥基磷酰氧基）-乙胺MTP-PE); 和
[0369] ?咪唑并喹諾酮化合物，包括咪喹莫特及其同系物（例如，"瑞喹莫德3M"）[65和 66]。
[0370] 本發明的免疫原性組合物和疫苗還可包含上述鑒定的一種或多種佐劑各方面的 組合。例如，可將以下佐劑組合物用于本發明：（1)皂苷和水包油乳液[67] ; (2)皂苷（例如 QS21) +無毒LPS衍生物（例如3dMPL) [68] ; (3)皂苷（例如QS21) +無毒LPS衍生物（如 3dMPL) + 膽固醇；（4)皂苷（例如 QS21) +3dMPL+IL-12 (任選 + 固醇）[69] ; (5) 3dMPL 與（例 如）QS21和/或水包油乳液的組合[70] ;(6)SAF，含有10%鯊烯、0. 4%吐溫80?、5%普流 羅尼-嵌段聚合物L121和thr-MDP，微流體化形成亞微米乳液或渦旋產生粒度較大的乳液。 (7)Ribi?佐劑系統（RAS)(瑞比免疫化學公司（Ribi Immunochem))，含有2%鯊烯、0.2% 吐溫80和一種或多種細菌細胞壁組分，所述組分選自單磷酰脂質A (MPL)、海藻糖二霉菌 酸酯（TDM)和細胞壁骨架（CWS)，優選MPL+CWS (Detox?);和（8) -種或多種礦物鹽（如鋁 鹽）+LPS的無毒衍生物（如3dMPL)。
[0371] 用作免疫刺激劑的其它物質參見參考文獻23的第7章。
[0372] 特別優選使用氫氧化鋁和/或磷酸鋁佐劑，抗原通常吸附于這些鹽。磷酸鈣是另 一種優選佐劑。其它優選的佐劑組合包括Thl和Th2佐劑的組合，如CpG和鋁或雷西莫特 和鋁?？墒褂昧姿徜X和3dMPL的組合（已報道這種組合在肺炎球菌免疫中有效[71])。優 選使用MF59佐劑，尤其在IM(肌肉內）或IP(腹膜內）免疫的情況下。
[0373] 本發明的組合物可引起細胞介導的免疫應答以及體液免疫應答。此種免疫應答優 選誘導能在接觸NTHI時迅速作出反應的持續性（如中和性）抗體和細胞介導的免疫。
[0374] 通常認為兩種T細胞類型CD4和CD8細胞是啟動和/或增強細胞介導免疫和體液 免疫所必需的。⑶8T細胞可表達⑶8共受體，通常稱為細胞毒性T淋巴細胞（CTL)。⑶8T 細胞能夠識別MHC I型分子上展示的抗原或與之相互作用。
[0375] ⑶4T細胞可表達⑶4共受體，并通常稱為T輔助細胞。⑶4T細胞能夠識別結合 MHC II型分子的抗原性肽。與MHC II型分子相互作用后，CD4細胞可分泌諸如細胞因子等 因子。這些分泌的細胞因子可激活B細胞、細胞毒性T細胞、巨噬細胞和參與免疫應答的其 它細胞。輔助T細胞或CD4+細胞可進一步分為兩個功能不同的亞組：即細胞因子和效應功 能不同的THl表型和TH2表型。
[0376] 活化的THl細胞能增強細胞免疫（包括抗原特異性CTL生產增加），因而對響應 胞內感染具有特定價值?；罨腡Hl細胞可分泌IL-2、IFN-y和TNF-β中的一種或多種。 THl免疫應答可通過激活巨噬細胞、NK (自然殺傷）細胞和CD8細胞毒性T細胞（CTL)導致 局部炎癥反應。通過用IL-12刺激B和T細胞的生長，THl免疫應答也可用于放大免疫應 答。THl刺激的B細胞可分泌IgG2a。
[0377] 活化的TH2細胞提高抗體生成，因此對響應胞外感染具有價值。活化的TH2細胞 可分泌IL-4、IL-5、IL-6和IL-10中的一種或多種。TH2免疫應答可引起生成IgGl、IgE、 IgA和記憶B細胞來用于未來的保護。
[0378] 增強的免疫應答可包括增強的THl免疫應答和TH2免疫應答中的一種或多種。
[0379] THl免疫應答可包括CTL增加，與THl免疫應答相關的一種或多種細胞因子（如 IL-2、IFN γ和TNF-β )增加，活化巨噬細胞增加，NK活性增加，或者IgG2a產量增加中的一 種或多種現象。增強的THl免疫應答優選包括IgG2a生成增加。
[0380] 可使用THl佐劑引發THl免疫應答。相對于不用佐劑的抗原免疫，THl佐劑通常 引起IgG2a生成水平增力卩。適用于本發明的THl佐劑可包括例如，皂苷制劑、病毒體和病毒 樣顆粒、腸細菌脂多糖（LPS)的無毒衍生物、免疫刺激性寡核苷酸。免疫刺激性寡核苷酸， 如含有CpG基序的寡核苷酸是本發明所用的優選THl佐劑。
[0381] TH2免疫應答可包括以下一種或多種：與TH2免疫應答相關的一種或多種細胞因 子（如IL-4, IL-5, IL-6和IL-10)增加，或者IgGl、IgE、IgA和記憶B細胞生成增加。增 強的TH2免疫應答優選包括IgGl生成增加。
[0382] 可使用TH2佐劑引發TH2免疫應答。相對于不用佐劑的抗原免疫，TH2佐劑通常 引起IgGl生成水平增加。適用于本發明的TH2佐劑包括例如，含礦物質組合物、油乳劑和 ADP-核糖基化毒素及其脫毒衍生物。含礦物質組合物如鋁鹽是本發明使用的優選TH2佐 劑。
[0383] 本發明優選包括含THl佐劑和TH2佐劑組合的組合物。這種組合物優選引起增強 的THl和增強的TH2反應，即IgGl和IgG2a的生成相對于不用佐劑的免疫均有增加。更優 選地，相對于用單一佐劑的免疫（即，相對于只用THl佐劑的免疫或只用TH2佐劑的免疫）， 包含THl和TH2佐劑組合的組合物引起THl和/或TH2免疫應答增強。
[0384] 所述免疫應答可以是THl免疫應答和TH2免疫應答之一或兩種。免疫應答優選提 供增強的THl反應和增強的TH2反應之一或兩種。
[0385] 增強的免疫應答可以是全身免疫應答和粘膜免疫應答之一或兩種。該免疫應答優 選提供增強的全身免疫應答和增強的粘膜免疫應答之一或兩種。優選粘膜免疫應答為TH2 免疫應答。粘膜免疫應答優選包括IgA生成增加。
[0386] 流感嗜血桿菌感染可影響軀體的各個部分，因此可將本發明組合物制備成各種形 式。例如，可將所述組合物制備為液體溶液或懸浮液形式的注射劑。也可制備適合在注射 前溶解或懸浮于液體載劑的固體形式（如凍干組合物或噴霧凍干組合物）。所述組合物可 以制備成局部制劑，例如油膏、乳膏或粉末。所述組合物可制備成口服給藥制劑，如片劑或 膠囊，噴霧劑，或糖漿劑（任選調味）。所述組合物可以制備成使用細粉或噴霧的肺部給藥 制劑，例如吸入劑。所述組合物可制備為栓劑或子宮托。所述組合物可以制成鼻部、耳部或 眼部給藥制劑，例如滴劑。可將所述組合物設計為藥盒的形式，從而在臨對患者給予之前重 建合并的組合物。此類藥盒可包含一種或多種液體形式的抗原以及一種或多種凍干抗原。
[0387] 臨用前制備組合物（例如，以凍干形式提供組分時）和以藥盒形式提供組合物時， 該藥盒可包括兩個藥瓶，或者可包括一個填充好的注射器和一個藥瓶，注射器內容物用于 在注射前重激活藥瓶內容物。
[0388] 用作疫苗的免疫原性組合物包含免疫有效量的抗原，以及需要的任何其它組分。 "免疫有效量"是指以單一劑量或一系列劑量的部分給予個體的對治療或預防有效的量。此 量取決于待治療個體的健康和身體狀況、年齡、待治療個體的分類組（如非人靈長動物、靈 長動物等）、個體的免疫系統合成抗體的能力、所需的保護程度、疫苗制劑、治療醫生對醫學 情況的評估和其它相關因素。預計所述量將落入可通過常規試驗可確定的較寬范圍內。組 合物中包含一種以上抗原時，存在的兩種抗原的劑量可以相同或不同。
[0389] 如上所述，一種組合物可包含溫度保護劑，此種組分可能在佐劑化組合物（特別 是含有礦物質佐劑，如鋁鹽的組合物）中特別有用。如參考文獻72所述，可將液體溫度保 護劑加入水性疫苗組合物中，以降低其凝固點，例如將凝固點降低至〇°C以下。因此該組合 物可以儲存于〇°C以下但在其凝固點以上，以抑制熱裂解。溫度保護劑也允許冷凍該組合 物，同時保護礦物鹽佐劑在凍融后不發生團聚或沉降，還可在較高溫度，例如40°C以上保護 該組合物。可混合初始的水性疫苗與液體溫度保護劑使液體溫度保護劑占最終混合物體積 的1-80 %。合適的溫度保護劑應該是對人給藥安全的、易于混溶/可溶于水的、并且不應破 壞組合物的其他成分（如抗原和佐劑）。示例包括甘油、丙二醇和/或聚乙二醇（PEG)。合 適PEG的平均分子量可為200-20, OOODa。在優選實施方式中，聚乙二醇的平均分子量可以 約為 300Da( 'PEG-300'）。
[0390] 可通過混合⑴包含本發明的抗原組合中兩種或多種（例如1、2、3、4種）抗原的 水性組合物與（ii)溫度保護劑來形成本發明的組合物。然后，該混合物可儲存于例如〇°C 以下、0-20°C、20-35°C、35-55°C或更高溫度。它可以液體或凍結形式儲存。該混合物可以 是凍干的混合物?；蛘?，可通過混合（i)包含本發明的抗原組合中兩種或多種（例如1、2、 3、4種）抗原的干燥組合物與（ii)包含溫度保護劑的液體組合物來形成組合物。因此，可 利用組分（ii)重建組分（i)。
[0391] 治療方法和疫苗的給予
[0392] 本發明還提供了一種在哺乳動物中產生免疫應答的方法，所述方法包括給予有效 量的本發明的組合物的步驟，或給予至少一種或多種（如1、2、3、4、5、6、7、8、9或10種）本 發明的抗原的一個或多個步驟。所述免疫應答優選為保護性免疫應答，并優選涉及抗體和 /或細胞介導的免疫。所述方法可以產生加強的應答。
[0393] 本發明還提供聯合用作（例如）使哺乳動物產生免疫應答的藥物的至少一種或多 種本發明抗原。
[0394] 本發明也提供至少一種或多種本發明抗原在制備使哺乳動物產生免疫應答的藥 物中的應用。
[0395] 在本發明的方法和用途中，可同時、分別或依次給予至少一種或多種（例如1、2、 3、4種）本發明的抗原。
[0396] 借助這些應用和方法在哺乳動物中產生免疫應答后，則能保護該哺乳動物免遭流 感嗜血桿菌感染。本發明有效針對各種不同血清型的流感嗜血桿菌,但在針對不可分型流 感嗜血桿菌（NTHI)感染導致疾病的保護中特別有用。根據本發明，感染可與選自下組的疾 病或病癥相關：例如，中耳炎（包括急性中耳炎）、支氣管炎、結膜炎、鼻竇炎、尿道感染、肺 炎、菌血癥、膿毒性關節炎、會厭炎、肺炎、積膿癥、心包炎、蜂窩織炎、骨髓炎、下呼吸道感染 或腦膜炎。通過引起防止細胞從喉部通過咽鼓管移動至中耳（中耳隨即會受到感染）的免 疫應答，本發明對于治療或預防中耳炎癥或者對于治療或預防COPD疾病特別有用。
[0397] 本發明還提供了包含第一種組分和第二種組分的藥盒，其中第一種組分和第二種 組分均非如上所述本發明的組合物，但其中可將第一種組分和第二種組分組合以提供如上 所述本發明的組合物。所述藥盒還可以包括含有下列一種或多種的第三種組分：說明書、注 射器或其它遞送裝置、佐劑或藥學上可接受的制劑溶液。
[0398] 本發明還提供了一種預填充本發明的免疫原性組合物的遞送裝置。
[0399] 優選地，所述哺乳動物是人，例如，人患者。當所述疫苗用于預防性用途時，人優選 是兒童（如幼童或嬰兒）或青少年；當疫苗用于治療用途時，人優選是青少年或成人。意圖 用于兒童的疫苗也可給予成年人，例如，以評估安全性、劑量、免疫原性等。哺乳動物（例如 人，例如患者）可以自身處于發生該疾病的風險中，或者可以是妊娠女性，例如，女性（"母 體免疫"）。
[0400] 檢測治療性治療功效的一種方式包括在給予本發明組合物后監測流感嗜血桿菌 感染。一種檢查預防性治療療效的途徑包括給予組合物后監測對抗本發明的組合物中的抗 原的全身免疫應答（如監測IgGl和IgG2a產生水平）和/或粘膜免疫應答（如監測IgA 產生水平）。本發明組合物的免疫原性可通過以下方法測定：給予受試對象（如12-16個 月大的兒童，或動物模型，如南美栗鼠（chinchilla)模型[73])，然后測定標準參數，包括 IgG的ELISA效價（GMT)。通常在給予該組合物后約4周測定這些免疫應答，并與給予該組 合物之前測定的值作比較。給予一個以上劑量的組合物時，可以進行超過一次的給藥后測 定。通常，在免疫后但在刺激前測定抗原特異性血清抗體應答，而在免疫后且刺激后測定抗 原特異性粘膜抗體應答。
[0401] 另一評價本發明組合物免疫原性的途徑是重組表達蛋白，通過免疫印跡和/或微 陣列篩查患者血清或粘膜分泌物。蛋白質和患者樣品間的陽性反應表明患者已經產生對受 試蛋白的免疫應答。該方法也可用于鑒定免疫顯性抗原和/或抗原中的表位。
[0402] 通過在流感嗜血桿菌感染的動物模型（如豚鼠、南美栗鼠或小鼠）中進行免疫研 究，可在體內測定疫苗組合物的效果。參考文獻74中描述了一種此類模型。
[0403] 用于體內測定本發明疫苗組合物效果的其他有用的動物模型描述于參考文獻75 中。
[0404] 本發明的組合物通常直接給予患者?？赏ㄟ^胃腸道外注射（如皮下、腹膜內、靜脈 內、肌肉內或組織間隙），或通過粘膜，如通過直腸、口腔（如片劑、噴霧）、陰道、局部、透皮 或經皮、鼻內、眼、耳、肺或其它粘膜途徑完成直接遞送。
[0405] 本發明可用于引發全身和/或粘膜免疫，優選引發增強的全身和/或粘膜免疫。
[0406] 增強的全身和/或粘膜免疫優選表現為提高的THl和/或TH2免疫應答。增強的 免疫應答優選包括IgGl和/或IgG2a和/或IgA生成增加。
[0407] 可通過單劑量方案或多劑量方案來進行給藥。多劑量可用于初次免疫方案和/或 加強的免疫方案。在多劑量方案中，可通過相同或不同的途徑（如腸胃外初次和粘膜加強， 粘膜初次和腸胃外加強等）給予多個劑量。一般以至少1周（例如約2周、約3周、約4周、 約6周、約8周、約10周、約12周、約16周等）的間隔給予多個劑量。
[0408] 根據本發明制備的疫苗可用于治療兒童和成人。因此，人患者可以小于1歲、1-5 歲、5-15歲、15-55歲或至少55歲。接受疫苗的患者優選老年人（如大于或等于50歲、大 于或等于60歲并優選大于或等于65歲）、幼兒（如小于或等于5歲）、住院病人、保健護理 人員、武裝人員和軍人、孕婦、慢性病人或免疫缺陷病人。然而所述疫苗不僅適用于這些人 群，還可用于更廣泛的群體。
[0409] 可將本發明產生的疫苗與其它疫苗基本上同時（在健康護理專業人員或疫苗接 種中心的同一用藥咨詢或訪問期間）給予患者，例如與麻疹疫苗、腮腺炎疫苗、風疹疫苗、 MMR疫苗、水痘疫苗、MMRV疫苗、白喉疫苗、破傷風疫苗、百日咳疫苗、DTP疫苗、偶聯的B型流 感嗜血桿菌疫苗、脊髓灰質炎病毒滅活疫苗、乙型肝炎病毒疫苗、腦膜炎球菌偶聯疫苗（如 四價A-C-W135-Y疫苗）、呼吸道合胞病毒疫苗等基本同時給藥。
[0410] 粘膜免疫
[0411] 本發明提供了用于粘膜免疫的抗原、抗原組合和本發明的組合物。例如，本發明提 供一種免疫原性組合物，其包含（i)本發明的多肽抗原組合，和（ii)細菌ADP-核糖基化毒 素和或其脫毒衍生物。本發明還提供一種使哺乳動物產生免疫應答的方法，包括給予哺乳 動物有效量的這種免疫原性組合物的步驟。優選將該組合物通過粘膜給予（給予到粘膜表 面），如可進行鼻內給藥。
[0412] 毒素組分（i)可以，例如，源于大腸桿菌（E. coli)不耐熱腸毒素（"LT"）。衍生 物可在其A亞基中具有脫毒突變，例如可為LT-K63或LT-R72。具體地，其可以是LT-K63。 在其他實施方式中，其不是LT-K63。
[0413] 優選經鼻內給予本發明的抗原或組合物和LT-K63佐劑。這會降低鼻咽、肺和血液 中流感嗜血桿菌的加載量，并增加受感染哺乳動物的存活率。
[0414] 本發明組合物的其它抗原性組分
[0415] 本發明還提供了包含至少一種其它不可分型流感嗜血桿菌抗原的組合物。
[0416] 本發明還提供了包含至少一種除不可分型流感嗜血桿菌抗原以外抗原的組合物。
[0417] 具體而言，本發明還提供了包含一種或多種本發明的多肽和一種或多種以下其它 其他抗原的組合物：
[0418] -來自腦膜炎奈瑟球菌血清組A、B、C、W135和/或Y的抗原。
[0419] -來自肺炎鏈球菌的糖或多肽抗原[例如76、77、78]。
[0420] -來自甲型肝炎病毒如滅活病毒的抗原[例如79、80]。
[0421] -來自乙型肝炎病毒的抗原，如表面和/或核心抗原[例如80、81]。
[0422] -白喉抗原，如白喉類毒素[例如參考文獻82的第3章]或CRM197突變體[例如 83]。
[0423] -破傷風抗原，如破傷風類毒素[如參考文獻82的第4章]。
[0424] -來自百日咳博德特菌（Bordetella pertussis)的抗原，如百日咳博德特菌的 百日咳全毒素（PT)和絲狀血凝素（FHA)，也可任選與百日咳桿菌黏附素（pertactin)和/ 或凝集原2和3的組合[例如參考文獻84和85]。
[0425] -全細胞百日咳抗原
[0426] -來自流感嗜血桿菌B的糖抗原[例如86]。
[0427] -脊髓灰質炎病毒抗原[例如87、88]，如IPV。
[0428] -麻疹、腮腺炎和/或風疹抗原[如參考文獻82的第9、10和11章]。
[0429] -流感抗原[如參考文獻82的第19章]，如血細胞凝集素和/或神經氨酸酶表 面蛋白。
[0430] -來自粘膜炎莫拉菌（Moraxella catarrhalis)的抗原[例如89]。
[0431] -來自無乳鏈球菌（Streptococcus agalactiae) (B型鏈球菌）的蛋白抗原[例 如 90、91]。
[0432] -來自無乳鏈球菌（B型鏈球菌）的糖抗原。
[0433] -來自釀膿鏈球菌（Streptococcus pyogenes) (A型鏈球菌）的抗原[例如9I、 92,93]〇
[0434] -來自金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus)的抗原[例如94]。
[0435] -來自呼吸道合胞病毒的抗原，例如重組蛋白F[例如142]
[0436] -包含白喉（D)、破傷風（T)、百日咳（無細胞、組分）（Pa)、乙肝（rDNA) (HBV)、脊 髓灰質炎（已滅活）（IPV)和流感嗜血桿菌b型（Hib)偶聯疫苗（吸附）的疫苗組合物，例 如 Infanrix-hexa
[0437] 所述組合物可以包含一種或多種這些其它抗原。特別感興趣的是與RSV疫苗和/ 或與含DTPa疫苗的組合。
[0438] 必要時，可以使有毒的蛋白質抗原脫毒（例如，通過化學和/或遺傳方式使百日咳 毒素脫毒[85])。
[0439] 所述組合物中包含白喉抗原時，也優選包含破傷風抗原和百日咳抗原。相似地，包 含破傷風抗原時，也優選包含白喉和百日咳抗原。相似地，包含百日咳抗原時，也優選包含 白喉和破傷風抗原。因此，優選DTP組合。
[0440] 糖抗原優選偶聯物形式。偶聯物的載體蛋白包括白喉毒素、破傷風毒素、腦膜炎奈 瑟球菌外膜蛋白[95]、合成肽[96、97]、熱激蛋白[98、99]、百日咳蛋白[100、101]、來自流 感嗜血桿菌的蛋白D[102]、細胞因子[103]、淋巴因子[103]、鏈球菌蛋白、激素[103]、生長 因子[103]、艱難梭菌（C. difficile)的毒素 A或B[104]、攝鐵蛋白[105]等。優選的載體 蛋白是白喉類毒素的CRM197突變體[106]。
[0441] 所述組合物中抗原存在的濃度一般是至少各1 μ g/ml。通常，任何給定抗原的濃度 將足以引發針對該抗原的免疫應答。
[0442] 作為在本發明免疫原性組合物中使用蛋白質抗原的替代方式，可以使用編碼該抗 原的核酸（優選DNA，例如質粒形式的DNA)。
[0443] 抗原優選吸附于鋁鹽。
[0444] 抗體
[0445] 針對本發明抗原的抗體可用于被動免疫[i]。因此，本發明提供了特異性針對本發 明抗原的抗體以用于治療。這些抗體可單獨或聯合使用。本發明還提供了包含這類抗體的 免疫原性和藥物組合物。
[0446] 所述抗體可用于藥物和治療，例如用于對抗NTHI的被動免疫，或用于清除NTHI感 染。本發明還提供了此類抗體在藥物制造中的應用。本發明還提供了一種治療哺乳動物的 方法，所述方法包括給予有效量的本發明抗體的步驟。如上述免疫原性組合物，這些方法和 應用能夠保護哺乳動物對抗NTHI感染。具體地，本發明的抗體可用于治療或預防NTHI引 起的感染，包括向哺乳動物給予有效量的上述抗體或包含這類抗體的組合物的步驟。
[0447] 術語"抗體"包括完整的免疫球蛋白分子（像帕麗珠單抗）及其能結合NTHI抗原 的片段。這些包括雜交（嵌合）抗體分子[108, 109] ;F (ab') 2和F (ab)片段和Fv分子； 非共價異源二聚體[110, 111];單鏈Fv分子（sFv) [112];二聚和三聚抗體片段構建；微型 抗體[113, 114];人源化抗體分子）[115-117];任何獲自此類分子的功能性片段，以及通過 非常規工藝（如噬菌體展示）獲得的抗體。優選所述抗體為單克隆抗體。獲取單克隆抗體 的方法為本領域熟知。優選人源化或完全人抗體。可純化或分離本發明的抗體和抗體組合。
[0448] 概述
[0449] 除非另有說明，本發明的實施將采用化學、生物化學、分子生物學、免疫學和藥理 學的常規方法，這些方法在本領域技術范圍內。這些技術在文獻中已有充分描述。參見例 如，參考文獻118-125等。
[0450] 當本發明涉及"表位"時，該表位可以是B細胞表位和/或T細胞表位。這類表位 可憑經驗確定（例如，使用PEPSCAN[126, 127]或相似方法），或它們可被預測（如利用詹姆 森-沃爾夫抗原性指數（Jameson-Wolf antigenic index) [128]、基于矩陣的方法[129]、 MAPIT0PE[130]、TEPIT0PE[131, 132]、神經網絡[133]、OptiMer 和 EpiMer[134, 135]、 ADEPT[136]、T位點（Tsites) [137]、親水性[138]、抗原性指數[139]或參考文獻140-144 公開的方法等）。表位是由抗體或T細胞受體的抗原結合位點識別并與之結合的抗原某部 分，它們也稱作"抗原決定簇"。
[0451] 當抗原"結構域"被省略時，可以包括省略信號肽、胞質結構域、跨膜結構域、胞外 結構域等。
[0452] 術語"包括"涵蓋"包含"以及"由……組成"，例如，"包含"X的組合物可以僅由X 組成或可包含其它物質，例如X+Y。
[0453] 與數值X相關的術語"約"是可任選的，并且表示，例如x± 10%。
[0454] 兩個氨基酸序列間的序列相同性百分數表示進行比對時所比較的兩條序列中相 同氨基酸的百分數。這種比對和同源性百分數或序列相同性百分數可利用本領域所知軟 件程序來確定，例如用參考文獻22的7. 7. 18部分所描述的那些。優選的比對通過史密 斯-沃特曼（Smith-Waterman)同源性搜索算法使用仿射缺口搜索確定，其中缺口開放罰 12分，缺口延伸罰2分，BLOSUM矩陣計62分。參考文獻145中公開了史密斯-沃特曼 (Smith-Waterman)同源性搜索算法。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0455] 圖1顯示了確認BL21 ΦΕ3)ΤΓ細胞中抗原強表達的小型誘導。（a) : (LMWM :分子 量標準標記物）
[0456] 圖 2 顯示了 NT001、NT007、NT018、NT024、NT032 和 NT067 的多個結果。可使用其 他優選的抗原（如階052、階'004、階'014、階'016或階'022)獲得類似的表達結果。各圖顯示 了 western印記和FACS數據。western印記使用小鼠血清進行，且泳道顯示了與總細菌提 取物（"TE"）、與從NTHI外膜中制備的囊泡（"0MV"）、或者與純化的重組蛋白（"PP"）的 反應活性。將滅活的細菌與來自經多種抗原組合物免疫的小鼠的血清孵育后進行FACS分 析，僅使用鋁作為陰性對照；免疫前血清陰性對照以實心區域的形式顯示，而樣品血清所獲 得的表面表達信號以單線的形式顯示。
[0457] 圖3顯示了血清殺菌試驗的96孔板布局，該試驗用于證明針對本發明抗原的抗血 清具有殺死NTHI的能力。

【具體實施方式】
[0458] 概述
[0459] 在發明人使用至少86種不同NTHI菌株進行的比較分析中被鑒定為保守的所有抗 原都進行了克隆和表達。純化蛋白并用于免疫小鼠。來自經免疫小鼠的抗血清用于證明免 疫所用蛋白的表面定位和保護能力（表III和/或表IV)。結果顯示，免疫NT052、NT024、 NT032、NT001、NT067、NT004、NT014、NT022、NT016 對 NTHI 具有高度保護性，并且甚至與"第 二抗原組"相比，其也顯示了較高或至少相當的殺菌活性SBA(血清殺菌試驗）效價。
[0460] 菌株和變體
[0461] 發明人發現編碼 NT022、NT016、NT014、NT018、NT024、NT032、NT067 和 NT001 的基 因存在于經分析的所有86種基因組序列中并保守。
[0462] 編碼的NT018序列在由來自芬蘭中耳炎集合（Finnish otitis collection)的15 種完整基因組和32種菌株組成的組中具有95-100%相同性。編碼的NT024序列在由來自 芬蘭中耳炎集合的15種完整基因組和32種菌株組成的組中具有90-100%相同性。
[0463] 編碼的NT032序列在由來自芬蘭中耳炎集合的15種完整基因組和32種菌株組成 的組中具有95-100%相同性；編碼的NT067序列在由來自芬蘭中耳炎集合的15種完整基 因組和32種菌株組成的組中具有95-100%相同性。編碼的NT001序列在由來自芬蘭中耳 炎集合的15種完整基因組和32種菌株組成的組中具有95-100%相同性。
[0464] 編碼的氨基酸序列的保守性如表I所示。
[0465] 表I :嗜血桿菌基因組和菌株中的抗原保守性（相同性百分比）
[0466]

【權利要求】
1. 一種免疫原性組合物，所述組合物包含一種或多種不可分型流感嗜血桿菌分離 或重組的多肽抗原，所述抗原選自：（5)NTHI1292(NT067)、（8)CGSHiGG_00130(NT052)、 (I) NTHI0915 (NT018)、（2) NTH 11 4 I 6 (ΝΤΟ 24)、（3) NTHI20 I 7 (ΝΤ032)、(4) CGSHiGG_02400 (ΝΤ038)、（6)ΝΤΗΙ0877 (ΝΤ00 I)、（7)ΝΤΗΙ0266 (ΝΤΟ 16)、(9) NTHI1627(ΝΤ002), (10)NTHIl109(ΝΤ026), (11)ΝΤΗΙ0821(ΝΤ009), (12)ΝΤΗΙ0409(ΝΤ025), (13)ΝΤΗΙ1954 (ΝΤ028) , (14) ΝΤΗΙ037I(ΝΤ029) , (15) NTHI0509 (ΝΤ03 1) , (16) ΝΤΗΙ0449 (ΝΤ015) , (17) NTHI1473 (ΝΤ023) , (18) gi-145633184 (NT 100) , (19) ΝΤΗΙ1110 (ΝΤ040) , (20) gi-46129075 (ΝΤ048) , (21) gi-145628236 (ΝΤ053) , (22) ΝΤΗΙ1230(ΝΤ066)、（23)ΝΤΗΙ0522(ΝΤ097)、（24)ΝΤ004、（25)ΝΤ014、（26)ΝΤ022。
2. 如權利要求1所述的組合物，其中 所述ΝΤ067抗原是包含氨基酸序列的多肽，所述序列：（a)與SEQ ID Ν0:5或與SEQ ID NO:52存在80%或更高的相同性；和/或（b)是SEQ ID NO:5或SEQ ID NO:52的至少10 個連續氨基酸的片段，且包含SEQ ID NO:5或SEQ ID NO:52的表位； 所述NT016抗原是包含氨基酸序列的多肽，所述序列：（a)與SEQ ID N0:7或與SEQ ID NO:55存在80%或更高的相同性；和/或（b)是SEQ ID NO:7或SEQ ID NO:55的至少10 個連續氨基酸的片段，且包含SEQ ID NO:7或SEQ ID NO:55的表位； 所述NT014抗原是包含氨基酸序列的多肽，所述序列：（a)與SEQ ID NO: 123存在80% 或更高的相同性；和/或（b)是SEQ ID NO: 123的至少10個連續氨基酸的片段，且包含SEQ ID NO: 123的表位； 所述NT022抗原是包含氨基酸序列的多肽，所述序列：（a)與SEQ ID N0:124存在80% 或更高的相同性；和/或（b)是SEQ ID NO: 124的至少10個連續氨基酸的片段，且包含SEQ ID NO: 124的表位。
3. 如權利要求1所述的免疫原性組合物，所述組合物還包含至少一種選自下組 的多肽：（24)P48(NTHI0254,也定義為 NT007)、（25)HtrA(NTHI1905,也定義為 NT006)、 (26)PE(NTHI0267，也定義為 NT035)、（27)P26(NTHI0501，也定義為 NT010)、（28) PHiD(NTHI0811，也定義為 NT080)、（29)P6(NTHI0501，也定義為 NT081)。
4. 如前述權利要求中任一項所述的免疫原性組合物，所述組合物還包含至少一種選自 下組的多肽：（30)NT013、（31)NT106、（32)NT107、（33)NT108、（34)NT109、（35)NT110、（36) NT111、（37)NT112、（38)NT113、（39)NT114、（40)NT115、（41)NT116、（42)NT117、（43)NT118、 (44)NT123、（45)NT124、（46)NT119、（47)NT120、（48)NT121、（49)NT122 和 / 或（50)NT061。
5. 如權利要求1-4所述的免疫原性組合物，所述組合物包含兩種或多種抗原的組合。
6. 如權利要求1所述的組合物，所述至少一種不可分型流感嗜血桿菌分離或重組的多 肽抗原在不同的病原性不可分型流感嗜血桿菌菌株之間具有保守性。
7. 如前述權利要求中任一項所述的組合物，所述組合物還包含至少一種不可分型流感 嗜血桿菌抗原以外的疫苗抗原，所述疫苗抗原選自： -來自腦膜炎奈瑟球菌血清組A、B、C、W135和/或Y的抗原 -來自肺炎鏈球菌的糖或多肽抗原 -來自甲型肝炎病毒的抗原 -來自乙型肝炎病毒的抗原 -白喉抗原，如白喉類毒素 -破傷風抗原 -來自百日咳博德特菌的抗原 -全細胞百日咳抗原 -來自乙型流感嗜血桿菌的糖抗原 -脊髓灰質炎抗原 -麻疹、腮腺炎和/或風疹抗原 -流感病毒抗原 -來自粘膜炎莫拉菌的抗原 -來自呼吸道合胞病毒的抗原 -包含白喉（D)、破傷風（T)、百日咳（無細胞、組分）（Pa)、乙肝（rDNA) (HBV)、脊髓灰 質炎（已滅活）（IPV)和流感嗜血桿菌b型（Hib)偶聯疫苗（吸附）的疫苗組合物，例如 Infanrix-hexa〇
8. 如前述權利要求中任一項所述的組合物，所述組合物還包含一種或多種藥學上可接 受的載劑、稀釋劑和/或佐劑。
9. 用于藥物的前述權利要求中任一項所述的組合物。
10. 如權利要求1-8中任一項所述的組合物，所述組合物是疫苗。
11. 用作對抗流感嗜血桿菌屬的免疫劑的權利要求1-8中任一項所述組合物。
12. 用作對抗不可分型流感嗜血桿菌所引起感染的免疫劑的權利要求1-8中任一項所 述組合物，所述感染例如中耳炎。
13. 用作對抗流感嗜血桿菌所引起疾病的疫苗的權利要求1-8中任一項所述組合物。
14. 一種預防或治療不可分型流感嗜血桿菌感染的方法，所述方法包括向哺乳動物給 予有效量的權利要求1-8中任一項所述組合物的步驟，或者包括給予至少一種權利要求 1-4中所定義抗原的一個或多個步驟。
15. 如權利要求13所述的方法，所述方法包括同時給予至少一種權利要求1-4中所定 義抗原的步驟。
16. 如權利要求13-14中任一項所述的方法，其中至少一種權利要求1-8中任一項所定 義的抗原分多個步驟給予。
17. 至少一種權利要求1-8中任一項所定義的抗原，用于聯合使用以在哺乳動物中引 起免疫應答。
18. -種制備權利要求1-8中任一項所定義的組合物的方法，所述方法包括將一種或 多種抗原與佐劑混合的步驟。
19. 如權利要求18所述的方法，所述方法還包括將混合物配制為藥物或疫苗的步驟， 且可選地還包括隨后對制劑進行包裝以作為藥物或疫苗進行配送的步驟。
【文檔編號】C12N15/63GK104321078SQ201380021921
【公開日】2015年1月28日 申請日期:2013年4月24日 優先權日:2012年4月26日
【發明者】M·瑟里阿尼, M·斯卡塞利, N·諾拉斯, D·戈麥斯莫里爾, S·羅西　帕卡尼 申請人:諾華股份有限公司