生產具有ph依賴性結合特性的抗原結合蛋白的小鼠的制作方法【專利摘要】本申請提供了經基因修飾的非人動物，所述非人動物包含免疫球蛋白重鏈基因座，所述基因座含有未經重排的人源重鏈可變區核苷酸序列，所述核苷酸序列含有加入至少一個組氨酸密碼子或者使用組氨酸密碼子取代至少一個內源性非組氨酸密碼子。本申請提供了用于制備如本申請所述的經基因修飾的非人動物的組合物和方法。本申請還提供了能夠表達抗原結合蛋白的非人動物，所述抗原結合蛋白的特征為pH依賴性抗原結合、增強的再循環性和/或增強的血清半衰期。【專利說明】生產具有PH依賴性結合特性的抗原結合蛋白的小鼠[0001]相關申請的奪叉引用[0002]本申請要求2012年3月16日提交的美國臨時申請號61/611，950,2012年3月20提交的美國臨時申請號61/613,352,以及2012年12月13日提交的美國臨時申請號61/736,930的優先權，所述各申請的全部內容通過引用并入本申請。發明領域[0003]非人動物經基因修飾的免疫球蛋白基因座包含未經重排的人源重鏈可變區核苷酸序列，其中所述未經重排的人源重鏈可變區核苷酸序列包含加入至少一個組氨酸密碼子或使用組氨酸密碼子取代至少一個非組氨酸密碼子。非人動物，包含嚙齒動物例如小鼠和大鼠，在其種系中包含未經重排的人源免疫球蛋白重鏈可變區核苷酸序列，其中所述未經重排的人源免疫球蛋白重鏈可變區核苷酸序列包含加入至少一個組氨酸密碼子或使用組氨酸密碼子取代至少一個非組氨酸密碼子。基因工程改造的非人動物能夠表達抗原結合蛋白，所述抗原結合蛋白的特征為pH依賴性抗原結合、再循環性（recyclability)的提高和/或血清半衰期的增加。[0004]發明背景[0005]能夠通過多種消除機制影響給予身體的藥物（包括治療性單克隆抗體），所述消除機制包括腎小球濾過（例如進入尿液）、分泌（例如進入膽汁）和通過細胞的分解代謝。盡管小分子通過腎臟的過濾從身體中清除，但大多數的分泌抗體（例如IgG，其過大而無法濾過腎小球）主要通過細胞介導的分解代謝從身體中除去，例如流體相的內吞作用（吞噬作用）或受體介導的內吞作用。例如，具有若干重復表位的可溶性分子與多個循環抗體結合，并且所得到的較大的抗原_抗體復合物被迅速地吞噬進入細胞而降解。另一方面，與抗體結合的細胞表面靶受體（即受體-抗體復合物）以劑量依賴性的方式經歷靶向介導的內吞作用，這導致細胞內形成前往溶酶體降解的核內體（endosome)。在一些情況下，細胞內吞的受體-抗體復合物以pH依賴性的方式在核內體內結合新生兒Fc受體（FcRn)并且當暴露于中性細胞外pH(例如pH7.0-7.4)時，再返回細胞表面以釋放進入血漿或組織液。[0006]在本領域中需要系統，例如生成具有可滴定的殘基（titratableresidue)的抗原結合蛋白的非人動物、細胞和基因組的基因座，例如經基因修飾的基因座，所述基因座重排免疫球蛋白基因區段以生成響應pH的改變的重鏈可變結構域，例如提供或接受質子并且例如根據質子化狀態不同而具有不同的結合特性。[0007]在本領域中還需要某種方法和組合物，所述方法和組合物能夠在不影響所述抗原結合蛋白對目標抗原的特異性和親和性的情況下，通過促進抗原結合蛋白從受體抗原結合蛋白復合物中解離或通過在酸性核內體隔室中增加抗原結合蛋白對FcRn的親和性，來進一步增加細胞內吞的抗原結合蛋白的再循環效率。[0008]發明概沭[0009]本申請提供了在非人動物的種系基因組中的經基因修飾的免疫球蛋白重鏈基因座，其中所述免疫球蛋白重鏈基因座包含經基因修飾的未經重排的重鏈可變區核苷酸序列(例如一個或多個經基因修飾的人源VH、D和/或JH基因區段），其中所述未經重排的重鏈可變區核苷酸序列包含加入至少一個組氨酸密碼子或使用組氨酸密碼子取代至少一個內源性非組氨酸密碼子。在各種實施方式中，所述經基因修飾的未經重排的重鏈可變區核苷酸序列在編碼免疫球蛋白重鏈可變結構域的至少一個閱讀框架中包含至少一個組氨酸密碼子。在各種實施方式中，所述未經重排的重鏈可變區核苷酸序列包含與人源或非人源重鏈恒定區核苷酸序列（例如編碼選自IgM、IgD、IgA、IgE和IgG的免疫球蛋白同種型的重鏈恒定區核苷酸序列）可操作地連接的至少一個組氨酸密碼子。[0010]本申請提供了非人動物（哺乳動物，例如嚙齒動物，如小鼠、大鼠或倉鼠），所述非人動物經基因工程改造以便在其種系基因組中含有免疫球蛋白重鏈基因組基因座，其中所述基因組基因座包含未經重排的重鏈可變區核苷酸序列（例如一個或多個經基因修飾的人源VH、D和/或JH基因區段），其中所述未經重排的重鏈可變區核苷酸序列包含加入至少一個組氨酸密碼子或使用組氨酸密碼子取代至少一個內源性非組氨酸密碼子。在各種實施方式中，所述非人動物的基因組包含修飾（i)所述修飾使全部或基本上全部的內源性免疫球蛋白VH、D和/或JH基因區段缺失或使其不具有功能（例如通過在所述免疫球蛋白基因座插入核苷酸序列例如外源性核苷酸序列，或通過使內源性VH、D和/或JH基因區段產生不具有功能的重排或反轉）；以及（ii)所述修飾引入未經重排的人源重鏈可變區核苷酸序列（例如經基因修飾的人源VH、D或JH基因區段），其中所述未經重排的重鏈可變區核苷酸序列包含加入至少一個組氨酸密碼子或使用組氨酸密碼子取代至少一個內源性非組氨酸密碼子。在各種實施方式中，所述未經重排的重鏈可變區核苷酸序列存在于內源性基因座(即所述未經重排的重鏈可變區核苷酸序列位于野生型非人動物中）或存在于異位（即在與其基因組中的內源性免疫球蛋白重鏈基因座不同的基因座上），或在其內源性基因座中(例如在免疫球蛋白可變基因座內，其中所述內源性基因座位于或移至基因組中的不同位置）。在各種實施方式中，所述免疫球蛋白重鏈可變區核苷酸序列與人源或非人源重鏈恒定區核苷酸序列（例如編碼選自IgM、IgD、IgA、IgE和IgG的免疫球蛋白同種型的重鏈恒定區核苷酸序列）可操作地連接。[0011]本申請提供了經基因修飾的非人動物，所述非人動物能夠表達包含一個或多個組氨酸的經基因修飾的免疫球蛋白重鏈可變結構域，其中所述一個或多個組氨酸不是由與野生型非人動物對應的種系基因區段編碼。[0012]本申請提供了經基因修飾的非人動物，所述非人動物包含B細胞群，所述B細胞群的特征為經重排的免疫球蛋白重鏈可變基因編碼具有一個或多個組氨酸的免疫球蛋白重鏈可變結構域，所述一個或多個組氨酸不是由與野生型非人動物對應的種系基因區段編碼。[0013]本申請提供了用于制備非人動物的方法和組合物，所述非人動物包含經基因修飾的免疫球蛋白重鏈可變基因座，所述基因座包含未經重排的人源重鏈可變區核苷酸序列，所述核苷酸序列在編碼重鏈可變結構域的至少一個閱讀框架中含有一個或多個組氨酸密碼子。[0014]本申請提供了用于非人動物的方法和組合物，所述方法和組合物生成顯示出與抗原以pH依賴性方式結合的抗原結合蛋白。本申請提供了用于制備非人動物的方法和組合物，所述非人動物具有B細胞群或抗體群，其富含（與相應的野生型動物相比）pH依賴性的抗原結合蛋白，例如特別是重鏈可變結構域和/或其抗原結合片段。[0015]在一個方面，本申請提供了在非人動物的種系基因組中的經基因修飾的免疫球蛋白基因座，所述免疫球蛋白基因座包含未經重排的人源重鏈可變區核苷酸序列，其中所述未經重排的重鏈可變區核苷酸序列包含加入至少一個組氨酸密碼子或使用組氨酸密碼子取代至少一個內源性非組氨酸密碼子。[0016]在一個實施方式中，所述非人動物是哺乳動物，包含嚙齒動物，例如小鼠、大鼠或倉鼠。[0017]在一個實施方式中，所述組氨酸密碼子的加入或取代存在于選自下組的免疫球蛋白重鏈基因區段中：人源￥11基因區段、人源D基因區段、人源JH基因區段及其組合。在一個實施方式中，所述免疫球蛋白重鏈基因區段選自人源種系％基因區段、人源種系D基因區段、人源種系JH基因區段及其組合。[0018]在一個實施方式中，所述人源V基因區段（VH)選自下組：Vh1-2、Vh1-3、Vh1-8、Vh1-18、Vh1-24、Vh1-45、Vh1-46、Vh1-58、Vh1-69、Vh2-5、Vh2-26、Vh2-70、Vh3-7、Vh3-9、Vh3-11、Vh3-13、Vh3-15、Vh3-16、Vh3-20、Vh3-21、Vh3-23、Vh3-30、Vh3-30-3、Vh3-30-5、Vh3-33、Vh3-35、Vh3-38、Vh3-43、Vh3-48、Vh3-49、Vh3-53、Vh3-64、Vh3-66、Vh3-72、Vh3-73、Vh3-74、Vh4-4、Vh4-28、Vh4-30-1、Vh4-30-2、Vh4-30-4、Vh4-31、Vh4-34、Vh4-39、Vh4-59、Vh4-61、Vh5-51、Vh6-1、VH7-4-l、VH7-81及其組合。[0019]在一個實施方式中，所述人源D基因區段選自下組：Dl-1、Dl-7、Dl-14、Dl-20、Dl-26、D2-2、D2-8、D2-15、D2-21、D3-3、D3-9、D3-10、D3-16、D3-22、D4-4、D4-11、D4-17、D4-23、D5-12、D5-5、D5-18、D5-24、D6-6、D6-13、D6-19、D6-25、D7-27及其組合。[0020]在一個實施方式中，所述人源J基因區段選自下組：11、12、13、14、15、義6及其組合。[0021]在一個實施方式中，所述加入或取代的組氨酸密碼子存在于編碼N-末端區、環4區、⑶R1、⑶R2、⑶R3及其組合的未經重排的重鏈可變區核苷酸序列中。[0022]在一個實施方式中，所述未經重排的重鏈可變區核苷酸序列包含2個或更多個、3個或更多個、4個或更多個、5個或更多個、6個或更多個、7個或更多個、8個或更多個、9個或更多個、10個或更多個、11個或更多個、12個或更多個、13個或更多個、14個或更多個、15個或更多個、16個或更多個、17個或更多個、18個或更多個、19個或更多個、20個或更多個、21個或更多個、22個或更多個、23個或更多個、24個或更多個、25個或更多個、26個或更多個、27個或更多個、28個或更多個、29個或更多個、30個或更多個、31個或更多個、32個或更多個、33個或更多個、34個或更多個、35個或更多個、36個或更多個、37個或更多個、38個或更多個、39個或更多個、40個或更多個、41個或更多個、42個或更多個、43個或更多個、44個或更多個、45個或更多個、46個或更多個、47個或更多個、48個或更多個、49個或更多個、50個或更多個、51個或更多個、52個或更多個、53個或更多個、54個或更多個、55個或更多個、56個或更多個、57個或更多個、58個或更多個、59個或更多個、60個或更多個或者61個或更多個組氨酸密碼子。[0023]在一個實施方式中，所述未經重排的重鏈可變區核苷酸序列與編碼選自IgM、IgD、IgG、IgE和IgA的免疫球蛋白同種型的人源或非人源重鏈恒定區核苷酸序列可操作地連接。[0024]在一個實施方式中，所述人源未經重排的免疫球蛋白重鏈可變區核苷酸序列與選自CH1、鉸鏈、CH2、CH3及其組合的人源或非人源重鏈恒定區核苷酸序列可操作地連接。在一個實施方式中，所述重鏈恒定區核苷酸序列含有CH1、鉸鏈、CH2和CH3(即CH1_鉸鏈-CH2_CH3)。[0025]在一個實施方式中，重鏈恒定區核苷酸序列存在于內源性基因座（即所述核苷酸序列位于野生型非人動物中）或存在于異位（即在與其基因組的內源性免疫球蛋白鏈基因座不同的基因座上，或在其內源性基因座中，例如在免疫球蛋白可變基因座中，其中所述內源性基因座位于或移至基因組中的不同位置）。[0026]在一個實施方式中，所述重鏈恒定區核苷酸序列含有在CH2或CH3中的修飾，其中所述修飾在酸性環境中（例如在pH范圍是約5.5至約6.0的核內體中）增加所述重鏈恒定區氨基酸序列與FcRn的親和性。[0027]在一個實施方式中，所述重鏈恒定區核苷酸序列編碼人源重鏈恒定區氨基酸序列，所述人源重鏈恒定區氨基酸序列包含在位置250的修飾（例如E或Q);在位置250和428的修飾（例如L或F);在位置252的修飾（例如L/Y/F/W或T)、在254的修飾（例如S或T)和在256的修飾（例如S/R/Q/E/D或T);或在位置428和/或433的修飾（例如L/R/S/P/Q或K)和/或在434的修飾（例如H/F或Y);或在位置250和/或428的修飾；或在位置307或308的修飾（例如308F、V308F)和在434的修飾。在一個實施方式中，所述修飾包含428L(例如M428L)和434S(例如N434S)修飾；428L、259I(例如V259I)和308F(例如V308F)修飾；433K(例如H433K)和434(例如434Y)修飾；252、254和256(例如252Y、254T和256E)修飾；250Q和428L修飾（例如T250Q和M428L);以及307和/或308修飾(例如308F或308P)，其中所述修飾在酸性環境中（例如在pH范圍是約5.5至約6.0的核內體中）增加所述重鏈恒定區氨基酸序列對FcRn的親和性。[0028]在一個實施方式中，所述重鏈恒定區核苷酸序列編碼人源CH2氨基酸序列，所述人源CH2氨基酸序列包含在位置252和257的氨基酸殘基之間的至少一個修飾，其中所述修飾在酸性環境中（例如在pH范圍是約5.5至約6.0的核內體中）增加所述人源CH2氨基酸序列對FcRn的親和性。[0029]在一個實施方式中，所述重鏈恒定區核苷酸序列編碼人源CH2氨基酸序列，所述人源CH2氨基酸序列包含在位置307和311的氨基酸殘基之間的至少一個修飾，其中所述修飾在酸性環境中（例如在pH范圍是約5.5至約6.0的核內體中）增加所述CH2氨基酸序列對FcRn的親和性。[0030]在一個實施方式中，所述重鏈恒定區核苷酸序列編碼人源CH3氨基酸序列，所述人源CH3氨基酸序列包含在位置433和436的氨基酸殘基之間的至少一個修飾，其中所述修飾在酸性環境中（例如在pH范圍是約5.5至約6.0的核內體中）增加所述CH3氨基酸序列對FcRn的親和性。[0031]在一個實施方式中，所述重鏈恒定區核苷酸序列編碼人源重鏈恒定區氨基酸序列，所述人源重鏈恒定區氨基酸序列包含選自下組的突變：M428L、N434S及其組合。[0032]在一個實施方式中，所述重鏈恒定區核苷酸序列編碼人源重鏈恒定區氨基酸序列，所述人源重鏈恒定區氨基酸序列包含選自下組的突變：M428L、V259I、V308F及其組合。[0033]在一個實施方式中，所述重鏈恒定區核苷酸序列編碼人源重鏈恒定區氨基酸序列，所述人源重鏈恒定區氨基酸序列包含N434A突變。[0034]在一個實施方式中，所述重鏈恒定區核苷酸序列編碼人源重鏈恒定區氨基酸序列，所述人源重鏈恒定區氨基酸序列包含選自下組的突變：M252Y、S254T、T256E及其組合。[0035]在一個實施方式中，所述重鏈恒定區核苷酸序列編碼人源重鏈恒定區氨基酸序列，所述人源重鏈恒定區氨基酸序列包含選自下組的突變：T250Q、M248L或這兩者。[0036]在一個實施方式中，所述重鏈恒定區核苷酸序列編碼人源重鏈恒定區氨基酸序列，所述人源重鏈恒定區氨基酸序列包含選自下組的突變：H433K、N434Y或這兩者。[0037]在一個實施方式中，所述經基因修飾的免疫球蛋白基因座包含：（1)第一等位基因，其中如本申請所述的未經重排的人源免疫球蛋白重鏈可變區核苷酸序列與第一重鏈恒定區核苷酸序列可操作地連接，所述第一重鏈恒定區核苷酸序列編碼選自IgGl、IgG2、IgG4及其組合的人源IgG的第一CH3氨基酸序列；和（2)第二等位基因，其中如本申請所述的未經重排的人源免疫球蛋白重鏈可變區核苷酸序列與第二重鏈恒定區核苷酸序列可操作地連接，所述第二重鏈恒定區核苷酸序列編碼選自IgGl、IgG2、IgG4及其組合的人源IgG的第二CH3氨基酸序列，并且其中所述第二CH3氨基酸序列包含使所述第二CH3氨基酸序列與蛋白A的結合降低或消除的修飾（參見例如US2010/0331527A1，其通過引用整體并入本申請）。[0038]在一個實施方式中，所述第二CH3氨基酸序列包含H95R修飾（根據MGT外顯子編號；根據EU編號為H435R)。在一個實施方式中，所述第二CH3氨基酸序列還包含Y96F修飾(根據頂GT外顯子編號；根據EU編號為H436F)。在另一個實施方式中，所述第二CH3氨基酸序列包含！195R修飾（根據MGT外顯子編號；根據EU編號為H435R)和Y96F修飾（根據MGT外顯子編號；根據EU編號為H436F)這兩者。[0039]在一個實施方式中，所述第二CH3氨基酸序列來自經修飾的人源IgGl并且還包含選自下組的突變：D16E、L18M、N44S、K52N、V57M和V82I(根據MGT編號；根據EU編號為D356E、L38M、N384S、K392N、V397M和V422I)。[0040]在一個實施方式中，所述第二CH3氨基酸序列來自經修飾的人源IgG2并且還包含選自下組的突變：N44S、K52N和V82I(根據MGT編號；根據EU編號為N384S、K392N和V422I)。[0041]在一個實施方式中，所述第二CH3氨基酸序列來自經修飾的人源IgG4并且還包含選自下組的突變：0151?、財43、1(52隊￥57]\1、1?691(、￡790和￥821(根據頂61'編號；根據￡。編號為Q355R、N384S、K392N、V397M、R409K、E419Q和V422I)。[0042]在一個實施方式中，所述重鏈恒定區氨基酸序列是非人源恒定區氨基酸序列，并且所述重鏈恒定區氨基酸序列包含上文所述任意類型的修飾中的一種或多種。[0043]在一個實施方式中，全部或基本上全部的內源性VH、0和JH基因區段從免疫球蛋白重鏈基因座中缺失或者使其不具有功能（例如通過在免疫球蛋白基因座中插入核苷酸序列（例如外源性核苷酸序列）或者通過使內源性VH、D、JHg段產生不具有功能的重排或反轉）。在一個實施方式中，例如，約80%或更多的、約85%或更多的、約90%或更多的、約95%或更多的、約96%或更多的、約97%或更多的、約98%或更多的或者約99%或更多的全部的內源性VH、D或JH基因區段被缺失或使其不具有功能。在一個實施方式中，例如，至少95%、96%、97%、98%或99%的內源性具有功能的V、D或J基因區段被缺失或使其不具有功能。[0044]在一個實施方式中，所述經基因修飾的免疫球蛋白重鏈基因座包含使全部或基本上全部的內源性VH、D和JH基因區段缺失或使其不具有功能的修飾；并且所述經基因修飾的基因座包含未經重排的重鏈可變區核苷酸序列，所述核苷酸序列含有具有一個或多個組氨酸密碼子的一個或多個人源VH、D和/或JH基因區段，其中所述未經重排的重鏈可變區核苷酸序列存在于內源性位置中（即所述核苷酸序列位于野生型非人動物中）或存在于異位（即在與其基因組的內源性免疫球蛋白鏈基因座不同的基因座上），或在其內源性基因座中（例如在免疫球蛋白可變基因座中,其中所述內源性基因座位于或移至基因組中的不同位置）。[0045]在一個實施方式中，所述經基因修飾的免疫球蛋白基因座包含內源性Adam6a基因、Adam6b基因或者這兩者，并且所述基因修飾不會影響所述內源性Adam6a基因、Adam6b基因或者這兩者的表達和/或功能。[0046]在一個實施方式中，所述經基因修飾的免疫球蛋白基因座包含異位存在的Adam6a基因、Adam6b基因或者這兩者。在一個實施方式中，所述Adam6a基因是非人源Adam6a基因。在一個實施方式中，所述Adam6a基因是人源Adam6a基因。在一個實施方式中，所述Adam6b基因是非人源Adam6b基因。在一個實施方式中，所述Adam6b基因是人源Adam6b基因。[0047]在一個實施方式中，所述經基因修飾的免疫球蛋白基因座還包含人源化的、未經重排的A和/或K輕鏈可變基因序列。在一個實施方式中，所述人源化的、未經重排的X和/或K輕鏈可變基因序列與免疫球蛋白輕鏈恒定區核苷酸序列可操作地連接，所述輕鏈恒定區核苷酸序列選自A輕鏈恒定區核苷酸序列和K輕鏈恒定區核苷酸序列。在一個實施方式中，所述人源化的、未經重排的A輕鏈可變區核苷酸序列與A輕鏈恒定區核苷酸序列可操作地連接。在一個實施方式中，所述A輕鏈恒定區核苷酸序列是小鼠、大鼠或人源序列。在一個實施方式中，所述人源化的、未經重排的K輕鏈可變區核苷酸序列與K輕鏈恒定區核苷酸序列可操作地連接。在一個實施方式中，所述K輕鏈恒定區核苷酸序列是小鼠、大鼠或人源序列。[0048]在一個實施方式中，所述經基因修飾的免疫球蛋白基因座包含未經重排的輕鏈可變基因序列，所述未經重排的輕鏈可變基因序列含有在編碼輕鏈可變結構域的至少一個閱讀框架中引入至少一個組氨酸密碼子的至少一個修飾。在一個實施方式中，所述經基因修飾的免疫球蛋白基因座包含經重排的序列（例如重排的A或！CV/J序列），所述經重排的序列在輕鏈CDR中含有1個、2個、3個或4個組氨酸密碼子。在一個實施方式中，所述CDR選自⑶R1XDR2、⑶R3及其組合。在一個實施方式中，所述未經重排的或經重排的輕鏈可變區核苷酸序列是未經重排的或經重排的人源A或K輕鏈可變區核苷酸序列。在一個實施方式中，所述未經重排的或經重排的人源A或K輕鏈可變區核苷酸序列存在于內源性小鼠免疫球蛋白輕鏈基因座中。在一個實施方式中，所述小鼠免疫球蛋白輕鏈基因座是小鼠k基因座。在一個實施方式中，所述小鼠免疫球蛋白輕鏈基因座是小鼠A基因座。[0049]在一個實施方式中，如本申請所述的經基因修飾的免疫球蛋白基因座存在于小鼠的免疫球蛋白重鏈基因座中。在一個實施方式中，所述經基因修飾的免疫球蛋白基因座存在于VELOCIMMUNE?小鼠中的人源化的免疫球蛋白重鏈基因座中。[0050]在一個實施方式中，由如本申請所述的經基因修飾的免疫球蛋白重鏈基因座表達的、含有重鏈可變結構域的抗原結合蛋白與不具有基因修飾的相應野生型重鏈可變結構域相比,在酸性環境中（例如在約5.5至約6.0的pH下）顯示出更弱的抗原結合。[0051]在一個實施方式中，由如本申請所述的經基因修飾的免疫球蛋白重鏈基因座表達的、含有重鏈可變結構域的抗原結合蛋白在25°C在酸性pH下（例如pH約5.5至約6.0)具有的解離半衰期（t1/2)少于2min。在一個實施方式中，由如本申請所述的經基因修飾的免疫球蛋白重鏈基因座表達的、含有重鏈可變結構域的抗原結合蛋白在37°C在酸性pH下（例如pH約5.5至約6.0)具有的解離半衰期（t1/2)少于2min。在一個實施方式中，由如本申請所述的經基因修飾的免疫球蛋白重鏈基因座表達的、含有重鏈可變結構域的抗原結合蛋白在25°C在酸性pH下（例如pH約5.5至約6.0)具有的解離半衰期（t1/2)少于lmin。在一個實施方式中，由如本申請所述的經基因修飾的免疫球蛋白重鏈基因座表達的、含有重鏈可變結構域的抗原結合蛋白在37°C在酸性pH下（例如pH約5.5至約6.0)具有的解離半衰期（t1/2)少于lmin。在一個實施方式中，由如本申請所述的經基因修飾的免疫球蛋白基因座表達的、含有重鏈可變結構域的抗原結合蛋白，在酸性pH下（例如pH約5.5至約6.0)的解離半衰期（t1/2)比所述抗原結合蛋白在中性pH下（例如pH約7.0至約7.4)的解離半衰期（t1/2)降低至少約2倍、至少約3倍、至少約4倍、至少約5倍、至少約10倍、至少約15倍、至少約20倍、至少約25倍或至少約30倍。[0052]在一個實施方式中，本申請所述的經基因修飾的免疫球蛋白基因座包含B細胞群，所述B細胞群經目標抗原刺激后能夠產生抗原結合蛋白例如抗體，所述抗原結合蛋白含有具有一個或多個組氨酸殘基的重鏈可變結構域。如本申請所述的抗原結合蛋白當給予對象時，與相應的野生型抗原結合蛋白相比顯示出增加的血清半衰期，所述野生型抗原結合蛋白具有相似的或足夠相似的編碼重鏈可變結構域的氨基酸序列，但是在所述重鏈可變結構域中不包含組氨酸殘基。在一些實施方式中，本申請所述的抗原結合蛋白顯示出的增加的血清半衰期，與相應的野生型抗原結合蛋白相比高至少約2倍、至少約5倍、至少約10倍、至少約15倍、至少約20倍，所述野生型抗原結合蛋白具有相似的或足夠相似的編碼重鏈可變結構域的氨基酸序列，但是在所述重鏈可變結構域中不包含組氨酸殘基。[0053]在一個實施方式中，由如本申請所述的經基因修飾的免疫球蛋白基因座表達的、含有重鏈可變結構域的抗原結合蛋白與沒有本申請所述的基因修飾的野生型抗原結合蛋白相比，具有的特征為pH依賴的再循環性的提高、血清半衰期的增加或兩者兼而有之。[0054]在一個方面，本申請提供了在非人動物的種系基因組中的經基因修飾的免疫球蛋白基因座，所述經基因修飾的免疫球蛋白基因座含有未經重排的人源重鏈可變區核苷酸序列，其中所述人源未經重排的重鏈可變區核苷酸序列包含使用組氨酸密碼子取代至少一個內源性非組氨酸密碼子。[0055]在一個實施方式中，所述非人動物是哺乳動物，包含嚙齒動物，例如小鼠、大鼠或倉鼠。[0056]在一個實施方式中，2個或更多個、3個或更多個、4個或更多個、5個或更多個、6個或更多個、7個或更多個、8個或更多個、9個或更多個、10個或更多個、11個或更多個、12個或更多個、13個或更多個、14個或更多個、15個或更多個、16個或更多個、17個或更多個、18個或更多個、19個或更多個、20個或更多個、21個或更多個、22個或更多個、23個或更多個、24個或更多個、25個或更多個、26個或更多個、27個或更多個、28個或更多個、29個或更多個、30個或更多個、31個或更多個、32個或更多個、33個或更多個、34個或更多個、35個或更多個、36個或更多個、37個或更多個、38個或更多個、39個或更多個、40個或更多個、41個或更多個、42個或更多個、43個或更多個、44個或更多個、45個或更多個、46個或更多個、47個或更多個、48個或更多個、49個或更多個、50個或更多個、51個或更多個、52個或更多個、53個或更多個、54個或更多個、55個或更多個、56個或更多個、57個或更多個、58個或更多個、59個或更多個、60個或更多個或者61個或更多個內源性非組氨酸密碼子被組氨酸密碼子取代。[0057]在一個實施方式中，所述內源性非組氨酸密碼子編碼選自下組的氨基酸：Y、N、D、Q、S、W和R。[0058]在一個實施方式中，所述取代的組氨酸密碼子存在于未經重排的重鏈可變區核苷酸序列中，所述未經重排的重鏈可變區核苷酸序列編碼選自下組的免疫球蛋白可變結構域：N-末端區、環4區、⑶R1、⑶R2、⑶R3及其組合。[0059]在一個實施方式中，所述取代的組氨酸密碼子存在于未經重排的重鏈可變區核苷酸序列中，所述未經重排的重鏈可變區核苷酸序列編碼選自下組的互補性決定區（CDR):CDR1、CDR2、CDR3及其組合。[0060]在一個實施方式中，所述取代的組氨酸密碼子存在于未經重排的重鏈可變區核苷酸序列中，所述未經重排的重鏈可變區核苷酸序列編碼選自下組的框架區（FR):FR1、FR2、FR3、FR4及其組合。[0061]在一個實施方式中，所述未經重排的重鏈可變區核苷酸序列包含經基因修飾的人源％基因區段，其中所述人源￥11基因區段的至少一個閱讀框架中的一個或多個內源性非組氨酸密碼子被組氨酸密碼子取代。[0062]在一個實施方式中，所述人源未經重排的重鏈可變區核苷酸序列包含修飾，所述修飾使用組氨酸密碼子取代人源％基因區段的至少一個內源性非組氨酸密碼子，其中所述人源VH基因區段選自下組：Vh1_2、Vh1_3、Vh1-8、Vh1-18、Vh1-24、Vh1-45、Vh1-46、Vh1-58、Vh1-69、Vh2-5、Vh2-26、Vh2-70、Vh3-7、Vh3-9、Vh3-11、Vh3-13、Vh3-15、Vh3-16、Vh3-20、Vh3-21、Vh3-23、Vh3-30、Vh3-30-3、Vh3-30-5、Vh3-33、Vh3-35、Vh3-38、Vh3-43、Vh3-48、Vh3-49、Vh3-53、VH3-64、VH3-66、VH3-72、VH3-73、VH3-74、VH4-4、VH4-28、VH4-30-1、VH4-30-2、VH4-30-4、VH4-31、VH4-34、VH4-39、VH4-59、VH4-61、VH5-51、VH6-1、VH7-4-l、VH7-81及其組合。[0063]在一個實施方式中，所述人源未經重排的重鏈可變區核苷酸序列包含經基因修飾的人源義基因區段，其中所述人源義基因區段的至少一個閱讀框架中的一個或多個內源性非組氨酸密碼子被組氨酸密碼子取代。[0064]在一個實施方式中，所述人源未經重排的重鏈可變區核苷酸序列包含修飾，所述修飾是使用組氨酸密碼子取代人源JH區段的至少一個內源性非組氨酸密碼子，其中所述人源JH基因區段選自下組：JH1、JH2、JH3、JH4、JH5、JH6及其組合。[0065]在一個實施方式中，所述取代的組氨酸密碼子存在于編碼⑶R3的一部分的重鏈可變區核苷酸序列中。在一個實施方式中，所述CDR3的一部分包含來源于經基因修飾的人源D基因區段的閱讀框架的氨基酸序列，所述經基因修飾的D基因區段含有使用組氨酸密碼子取代在閱讀框架中的至少一個內源性非組氨酸密碼子的修飾。[0066]在一個實施方式中，所述被組氨酸密碼子取代的內源性非組氨酸密碼子編碼選自下組的氨基酸：￥、隊0、〇、5、1和1?。[0067]在一個實施方式中，所述取代的組氨酸密碼子存在于在VELOCIMMUNE?.人源化免疫球蛋白小鼠中最常見的人源D基因區段的至少一個閱讀框架中。[0068]在一個實施方式中，編碼⑶R3的一部分的所述經基因修飾的人源D基因區段的閱讀框架選自疏水性框架、終止框架和親水性框架。[0069]在一個實施方式中，所述閱讀框架是人源D基因區段的疏水性框架。[0070]在一個實施方式中，所述人源D基因區段的疏水性框架包含編碼選自下組的氨基酸序列的核苷酸序列：D1_1(GTTGT;SEQIDN0:88)、D1-7(GITGT;SEQIDN0:89)、D1-20(GITGT;SEQIDN0:89)和D1-26(GIVGAT;SEQIDN0:90)，并且所述人源D基因區段還包含使用組氨酸密碼子取代在所述核苷酸序列中的至少一個內源性非組氨酸密碼子的修飾。[0071]在一個實施方式中，所述人源D基因區段的疏水性框架包含編碼選自下組的氨基酸序列的核苷酸序列：D2-2(DIVVVPAAI;SEQIDN0:92)、D2-8(DIVLMVYAI;SEQIDN0:94)、D2-15(DIVVVVAAT;SEQIDN0:95)和D2-21(HIVVVTAI;SEQIDN0:97)，并且所述人源D基因區段還包含使用組氨酸密碼子取代在所述核苷酸序列中的至少一個內源性非組氨酸密碼子的修飾。[0072]在一個實施方式中，所述人源D基因區段的疏水性框架包含編碼選自下組的氨基酸序列的核苷酸序列：D3-3(ITIFGVVII;SEQIDN0:98)、D3-9(ITIF*LVII;SEQIDN0:99,SEQIDNO:100),D3-10(ITMVRGVII；SEQIDNO:101),D3-16(IMITFGGVIVI；SEQIDN0:102)和D3-22(ITMIVVVIT;SEQIDN0:103)，并且所述人源D基因區段還包含使用組氨酸密碼子取代在所述核苷酸序列中的至少一個內源性密碼子的修飾。[0073]在一個實施方式中，所述人源D基因區段的疏水性框架包含編碼選自下組的氨基酸序列的核苷酸序列：D4-4CTTVT;SEQIDN0:105)、D4-llCTTVT;SEQIDN0:105)、D4-17CTTVT;SEQIDN0:105)、D4-23CTTVVT;SEQID勵：106)，并且所述人源0基因區段還包含使用組氨酸密碼子取代在所述核苷酸序列中的至少一個內源性非組氨酸密碼子的修飾。[0074]在一個實施方式中，所述人源D基因區段的疏水性框架包含編碼選自下組的氨基酸序列的核苷酸序列：D5-5(VDTAMV;SEQIDN0:107)、D5-12(VDIVATI;SEQIDN0:108)、D5-18(VDTAMV;SEQIDN0:107)和D5-24(VEMATI;SEQIDN0:109)，并且所述人源D基因區段還包含使用組氨酸密碼子取代在所述核苷酸序列中的至少一個內源性非組氨酸密碼子的修飾。[0075]在一個實施方式中，所述人源D基因區段的疏水性框架包含編碼選自下組的氨基酸序列的核苷酸序列：D6-6(SIAAR;SEQIDN0:111)、D6-13(GIAAAG;SEQIDN0:113)和D6-19(GIAVAG;SEQID勵:115)，并且所述人源0基因區段還包含使用組氨酸密碼子取代在所述核苷酸序列中的至少一個內源性非組氨酸密碼子的修飾。[0076]在一個實施方式中，所述疏水性框架包含編碼人源D7-27(LTG)的核苷酸序列，并且所述人源D基因區段還包含使用組氨酸密碼子取代在所述核苷酸序列中的至少一個內源性非組氨酸密碼子的修飾。[0077]在一個實施方式中，所述閱讀框架是人源D基因區段的終止閱讀框架。[0078]在一個實施方式中，所述人源D基因區段的終止閱讀框架包含編碼選自下組的氨基酸序列的核苷酸序列：D1_1(VQLER;SEQIDN0:8)、D1-7(V*LEL)、D1-20(V*LER)、D1-26(V*WELL;SEQID勵:12)，并且所述人源0基因區段還包含使用組氨酸密碼子取代在所述核苷酸序列中的至少一個內源性非組氨酸密碼子的修飾。[0079]在一個實施方式中，所述人源D基因區段的終止閱讀框架包含編碼選自下組的氨基酸序列的核苷酸序列：D2-2(RIL#YQLLY;SEQIDN0:14)、D2-8(RILY*WCMLY;SEQID勵：16和5￡〇10勵：17)、02-15〇?11>醫札1^)和02-21(511醫札1^;5￡〇10勵：19)，并且所述人源D基因區段還包含使用組氨酸密碼子取代在所述核苷酸序列中的至少一個內源性非組氨酸密碼子的修飾。[0080]在一個實施方式中，所述人源D基因區段的終止閱讀框架包含編碼選自下組的氨基酸序列的核苷酸序列：D3-3(VLRFLEWLLY;SEQIDN0:21)、D3-9(VLRYFDWLL*;SEQIDN0:23)、D3-10(VLLWFGELL*;SEQIDN0:25)、D3-16(VL*LRLGELSLY;SEQIDN0:27)和D3-22(VLL*#WLLL;SEQID勵:29)，并且所述人源0基因區段包含使用組氨酸密碼子取代在所述核苷酸序列中的至少一個內源性非組氨酸密碼子的修飾。[0081]在一個實施方式中，所述人源D基因區段的終止閱讀框架包含編碼選自下組的氨基酸序列的核苷酸序列：D4-4(*LQ*L)、D4-11(*LQ*L)、D4-17(*LR*L)和D4-23(*LRW*L)，并且所述人源D基因區段包含使用組氨酸密碼子取代在所述核苷酸序列中的至少一個內源性非組氨酸密碼子的修飾。[0082]在一個實施方式中，所述人源D基因區段的終止閱讀框架包含編碼選自下組的氨基酸序列的核苷酸序列：D5-5(WIQLWL;SEQIDN0:35);D5-12(WI*WLRL;SEQIDN0:37)、D5-18(WIQLWL;SEQIDN0:35)和D5-24(*RWLQL;SEQIDN0:39)，并且所述人源D基因區段包含使用組氨酸密碼子取代在所述核苷酸序列中的至少一個內源性非組氨酸密碼子的修飾。[0083]在一個實施方式中，所述人源D基因區段的終止閱讀框架包含編碼選自下組的氨基酸序列的核苷酸序列：D6-6(V*QLV)、D6-13(V*QQLV;SEQIDN0:41)和D6-19(V*QWLV;SEQIDN0:43)，并且所述人源D基因區段還包含使用組氨酸密碼子取代在所述核苷酸序列中的至少一個內源性非組氨酸密碼子的修飾。[0084]在一個實施方式中，所述人源D基因區段的終止閱讀框架包含編碼D7-27(*LG)的核苷酸序列，并且所述人源D基因區段還包含使用組氨酸密碼子取代在所述核苷酸序列中人源D基因區段的至少一個內源性密碼子的修飾。[0085]在一個實施方式中，所述閱讀框架是人源D基因區段的親水性框架。[0086]在一個實施方式中，所述人源D基因區段的親水性框架包含編碼選自下組的氨基酸序列的核苷酸序列：D1_1(YNWND;SEQIDN0:45)、D1-7(YNWNY;SEQIDN0:47)、D1-20(YNWND;SEQIDN0:45)和D1-26(YSGSYY;SEQIDN0:49)，并且所述人源D基因區段還包含使用組氨酸密碼子取代在所述核苷酸序列中的至少一個內源性密碼子的修飾。在一個實施方式中，所述親水性框架包含編碼選自下組的氨基酸序列的核苷酸序列：SEQIDNO:46、SEQIDNO:48、SEQIDNO:50及其組合。[0087]在一個實施方式中，所述人源D基因區段的親水性框架包含編碼選自下組的氨基酸序列的核苷酸序列：D2-2(GYCSSTSCYT;SEQIDN0:51)、D2-8(GYCTNGVCYT;SEQIDN0:53)、D2-15(GYCSGGSCYS;SEQIDN0:55)和D2-21(AYCGGDCYS;SEQIDN0:57)，并且所述人源D基因區段還包含使用組氨酸密碼子取代在所述核苷酸序列中的至少一個內源性密碼子的修飾。在一個實施方式中，所述親水性框架包含編碼選自下組的氨基酸序列的核苷酸序列：3￡〇10勵：52、5￡〇10勵：54、5￡〇10勵：56、5￡〇10勵：58及其組合。[0088]在一個實施方式中，所述人源D基因區段的親水性框架包含編碼選自下組的氨基酸序列的核苷酸序列：D3-3(YYDFWSGYYT;SEQIDN0:59)、D3-9(YYDILTGYYN;SEQIDN0:61)、D3-10(YYYGSGSYYN;SEQIDN0:63)、D3-16(YYDYVWGSYRYT;SEQIDN0:65)和D3-22(YYYDSSGYYY;SEQIDN0:67)，并且所述人源D基因區段還包含使用組氨酸密碼子取代在所述核苷酸序列中的至少一個內源性密碼子的修飾。在一個實施方式中，所述親水性框架包含編碼選自下組的氨基酸序列的核苷酸序列：SEQIDN0:60、SEQIDN0:62、SEQID勵：64、5￡〇10勵：66、5￡〇10勵：68及其組合。[0089]在一個實施方式中，所述人源D基因區段的親水性框架包含編碼選自下組的氨基酸序列的核苷酸序列：D4-4(DYSNY;SEQIDN0:69)、D4-11(DYSNY;SEQIDN0:69)、D4-17(DYGDY;SEQIDN0:71)和D4-23(DYGGNS;SEQIDN0:73)，并且所述人源D基因區段包含使用組氨酸密碼子取代在所述核苷酸序列中的至少一個內源性密碼子的修飾。在一個實施方式中，所述親水性框架包含編碼選自下組的氨基酸序列的核苷酸序列：SEQIDNO:70、SEQIDNO:72、SEQIDNO:74及其組合。[0090]在一個實施方式中，所述人源D基因區段的親水性框架包含編碼選自下組的氨基酸序列的核苷酸序列：D5-5(GYSYGY;SEQIDN0:75)、D5-12(GYSGYDY;SEQIDN0:77)、D5-18(GYSYGY;SEQIDN0:75)和D5-24(RDGYNY;SEQIDN0:79)，并且所述人源D基因區段還包含使用組氨酸密碼子取代在所述核苷酸序列中的至少一個內源性密碼子的修飾。在一個實施方式中，所述親水性框架包含編碼選自下組的氨基酸序列的核苷酸序列：SEQIDNO:76、SEQIDNO:78、SEQIDNO:80及其組合。[0091]在一個實施方式中，所述人源D基因區段的親水性框架包含編碼選自下組的氨基酸序列的核苷酸序列：D6-6(EYSSSS;SEQIDN0:81)、D6-13(GYSSSWY;SEQIDN0:83)和D6-19(GYSSGWY;SEQIDN0:85)，并且所述人源D基因區段還包含使用組氨酸密碼子取代在所述核苷酸序列中的至少一個內源性密碼子的修飾。在一個實施方式中，所述親水性框架包含編碼選自下組的氨基酸序列的核苷酸序列：SEQIDN0:82、SEQIDN0:84、SEQIDNO:86、SEQIDNO:76及其組合。[0092]在一個實施方式中，所述人源D基因區段的親水性框架包含編碼D7-27(NWG)的核苷酸序列，并且所述人源D基因區段還包含使用組氨酸密碼子取代在所述核苷酸序列中的至少一個內源性密碼子的修飾。[0093]在一個實施方式中，所述人源D基因區段的親水性框架包含編碼選自下組的氨基酸序列的核苷酸序列：SEQIDN0:46、SEQIDN0:48、SEQIDN0:50、SEQIDN0:52、SEQIDNO:54、SEQIDNO:56、SEQIDNO:58、SEQIDNO:60、SEQIDNO:62、SEQIDNO:64、SEQIDNO:66、SEQIDNO:68、SEQIDNO:70、SEQIDNO:72、SEQIDNO:74、SEQIDNO:76、SEQIDNO:78、SEQIDNO:80、SEQIDNO:82、SEQIDNO:84、SEQIDNO:86及其組合。[0094]在一個實施方式中，所述人源未經重排的免疫球蛋白重鏈可變區核苷酸序列與選自下組的人源或非人源重鏈恒定區核苷酸序列可操作地連接：CH1、鉸鏈、CH2、CH3及其組合。在一個實施方式中，所述重鏈恒定區核苷酸序列包含CH1、鉸鏈、CH2和CH3(即CH1-鉸鏈-CH2-CH3)。[0095]在一個實施方式中，重鏈恒定區核苷酸序列存在于內源性基因座（例如所述核苷酸序列位于野生型非人動物中）或存在于異位（即在與其基因組的內源性免疫球蛋白鏈基因座不同的基因座上），或在其內源性基因座中，例如在免疫球蛋白可變基因座中，其中所述內源性基因座位于或被移至基因組中的不同位置。[0096]在一個實施方式中，所述重鏈恒定區核苷酸序列包含在CH2或CH3中的修飾，其中所述修飾在酸性環境中（例如在pH范圍是約5.5至約6.0的核內體中）增加所述重鏈恒定區氨基酸序列對FcRn的親和性。[0097]在一個實施方式中，所述重鏈恒定區核苷酸序列編碼人源重鏈恒定區氨基酸序列，所述人源重鏈恒定區氨基酸序列包含在位置250(例如E或Q)的修飾；在位置250和428的修飾（例如L或F);在位置252的修飾（例如L/Y/F/W或T)、在254的修飾（例如S或T)和在256的修飾（例如S/R/Q/E/D或T);或在位置428和/或433的修飾（例如L/R/S/P/Q或K)和/或在434的修飾（例如H/F或Y);或在位置250和/或428的修飾；或在位置307或308的修飾（例如308F、V308F)和在434的修飾。在一個實施方式中，所述修飾包含428L(例如M428L)和434S(例如N434S)修飾；428L、259I(例如V259I)和308F(例如V308F)修飾；433K(例如H433K)和434(例如434Y)修飾；252、254和256(例如252Y、254T和256E)修飾；250Q和428L修飾（例如T250Q和M428L);以及307和/或308修飾(例如308F或308P)，其中所述修飾在酸性環境中（例如在pH范圍是約5.5至約6.0的核內體中）增加所述重鏈恒定區氨基酸序列對FcRn的親和性。[0098]在一個實施方式中，所述重鏈恒定區核苷酸序列編碼人源CH2氨基酸序列，所述氨基酸序列包含在位置252和257的氨基酸殘基之間的至少一個修飾，其中所述修飾在酸性環境中（例如在pH范圍是約5.5至約6.0的核內體中）增加所述人源Ch2氨基酸序列對FcRn的親和性。[0099]在一個實施方式中，所述重鏈恒定區核苷酸序列編碼人源CH2氨基酸序列，所述氨基酸序列包含在位置307和311的氨基酸殘基之間的至少一個修飾，其中所述修飾在酸性環境中（例如在pH范圍是約5.5至約6.0的核內體中）增加所述Ch2氨基酸序列對FcRn的親和性。[0100]在一個實施方式中，所述重鏈恒定區核苷酸序列編碼人源CH3氨基酸序列，所述人源CH3氨基酸序列包含在位置433和436的氨基酸殘基之間的至少一個修飾，其中所述修飾在酸性環境中（例如在pH范圍是約5.5至約6.0的核內體中）增加所述CH3氨基酸序列對FcRn的親和性。[0101]在一個實施方式中，所述重鏈恒定區核苷酸序列編碼人源重鏈恒定區氨基酸序列，所述人源重鏈恒定區氨基酸序列包含選自下組的突變：M428L、N434S及其組合。[0102]在一個實施方式中，所述重鏈恒定區核苷酸序列編碼人源重鏈恒定區氨基酸序列，所述人源重鏈恒定區氨基酸序列包含選自下組的突變：M428L、V259I、V308F及其組合。[0103]在一個實施方式中，所述重鏈恒定區核苷酸序列編碼人源重鏈恒定區氨基酸序列，所述人源重鏈恒定區氨基酸序列包含N434A突變。[0104]在一個實施方式中，所述重鏈恒定區核苷酸序列編碼人源重鏈恒定區氨基酸序列，所述人源重鏈恒定區氨基酸序列包含選自下組的突變：M252Y、S254T、T256E及其組合。[0105]在一個實施方式中，所述重鏈恒定區核苷酸序列編碼人源重鏈恒定區氨基酸序列，所述人源重鏈恒定區氨基酸序列包含選自下組的突變：T250Q、M248L或這兩者。[0106]在一個實施方式中，所述重鏈恒定區核苷酸序列編碼人源重鏈恒定區氨基酸序列，所述人源重鏈恒定區氨基酸序列包含選自下組的突變：H433K、N434Y或這兩者。[0107]在一個實施方式中，所述經基因修飾的免疫球蛋白基因座包含：（1)第一等位基因，其中如本申請所述的未經重排的人源免疫球蛋白重鏈可變區核苷酸序列與第一重鏈恒定區核苷酸序列可操作地連接，所述第一重鏈恒定區核苷酸序列編碼選自IgGl、IgG2、IgG4及其組合的人源IgG的第一CH3氨基酸序列；和（2)第二等位基因，其中如本申請所述的未經重排的人源免疫球蛋白重鏈可變區核苷酸序列與第二重鏈恒定區核苷酸序列可操作地連接，所述第二重鏈恒定區核苷酸序列編碼選自IgGl、IgG2、IgG4及其組合的人源IgG的第二CH3氨基酸序列，并且其中所述第二CH3氨基酸序列包含使所述第二CH3氨基酸序列與蛋白A的結合降低或消除的修飾（參見例如US2010/0331527A1，其整體通過引用并入本申請）。[0108]在一個實施方式中，所述第二CH3氨基酸序列包含H95R修飾（根據MGT外顯子編號；根據EU編號為H435R)。在一個實施方式中，所述第二CH3氨基酸序列還包含Y96F修飾(根據頂GT外顯子編號；根據EU編號為H436F)。在另一個實施方式中，所述第二CH3氨基酸序列包含！195R修飾（根據MGT外顯子編號；根據EU編號為H435R)和Y96F修飾（根據MGT外顯子編號；根據EU編號為H436F)這兩者。[0109]在一個實施方式中，所述第二CH3氨基酸序列來自經修飾的人源IgGl，并且還包含選自下組的突變：D16E、L18M、N44S、K52N、V57M和V82I(根據頂GT編號；根據EU編號為D356E、L38M、N384S、K392N、V397M和V422I)。[0110]在一個實施方式中，所述第二CH3氨基酸序列來自經修飾的人源IgG2,并且還包含選自下組的突變：N44S、K52N和V82I(根據MGT編號；根據EU編號為N384S、K392N和V422I)。[0111]在一個實施方式中，所述第二CH3氨基酸序列來自經修飾的人源IgG4,并且還包含選自下組的突變：0151?、財43、1(52隊￥57]\1、1?691(、￡790和￥821(根據頂61'編號；根據￡。編號為Q355R、N384S、K392N、V397M、R409K、E419Q和V422I)。[0112]在一個實施方式中，所述重鏈恒定區氨基酸序列是非人源恒定區氨基酸序列，并且所述重鏈恒定區氨基酸序列包含上文所述任意類型的修飾中的一種或多種。[0113]在一個實施方式中，所述重鏈恒定區核苷酸序列是人源重鏈恒定區氨基酸序列，并且所述人源重鏈恒定區氨基酸序列包含上文所述任意類型的修飾中的一種或多種。[0114]在一個實施方式中，全部或基本上全部的內源性VH、0和義基因區段從免疫球蛋白重鏈基因座中缺失或者使其不具有功能（例如通過在免疫球蛋白基因座中插入核苷酸序列例如外源性核苷酸序列，或者通過使內源性VH、D、JH區段產生不具有功能的重排或反轉）。在一個實施方式中，例如，約80%或更多的、約85%或更多的、約90%或更多的、約95%或更多的、約96%或更多的、約97%或更多的、約98%或更多的或者約99%或更多的全部的內源性VH、D或JH基因區段被缺失或使其不具有功能。在一個實施方式中，例如，至少95%、96%、97%、98%或99%的內源性具有功能的V、D或J基因區段被缺失或使其不具有功能。[0115]在一個實施方式中，所述經基因修飾的基因座包含使全部或基本上全部的內源性%、0和義基因區段缺失或使其不具有功能的修飾；并且所述基因組的基因座包含經基因修飾的、未經重排的人源重鏈可變區核苷酸序列，所述核苷酸序列含有在至少一個閱讀框架中使用組氨酸密碼子取代至少一個內源性非組氨酸密碼子。在一個實施方式中，所述經基因修飾的、未經重排的免疫球蛋白重鏈可變基因序列存在于內源性位置（即所述核苷酸序列位于野生型非人動物中）或存在于異位（即在與其基因組的內源性免疫球蛋白鏈基因座不同的基因座上），或在其內源性基因座中，例如在免疫球蛋白可變基因座中，其中所述內源性基因座位于或移至基因組中的不同位置。[0116]在一個實施方式中，所述經基因修飾的基因座包含內源性Adam6a基因、Adam6b基因或者這兩者，并且所述基因修飾不會影響所述內源性Adam6a基因、Adam6b基因或者這兩者的表達和/或功能。[0117]在一個實施方式中，所述經基因修飾的基因座包含異位存在的Adam6a基因、Adam6b基因或者這兩者。在一個實施方式中，所述Adam6a基因是非人源Adam6a基因。在一個實施方式中，所述Adam6a基因是小鼠Adam6a基因。在一個實施方式中，所述Adam6a基因是人源Adam6a基因。在一個實施方式中，所述Adam6b基因是非人源Adam6b基因。在一個實施方式中，所述Adam6b基因是小鼠Adam6b基因。在一個實施方式中，所述Adam6b基因是人源Adam6b基因。[0118]在一個實施方式中，所述經基因修飾的免疫球蛋白基因座還包含人源化的、未經重排的A和/或K輕鏈可變基因序列。在一個實施方式中，所述人源化的、未經重排的X和/或K輕鏈可變基因序列與免疫球蛋白輕鏈恒定區核苷酸序列可操作地連接，所述輕鏈恒定區核苷酸序列選自A輕鏈恒定區核苷酸序列和K輕鏈恒定區核苷酸序列。在一個實施方式中，所述人源化的、未經重排的A輕鏈可變區核苷酸序列與A輕鏈恒定區核苷酸序列可操作地連接。在一個實施方式中，所述A輕鏈恒定區核苷酸序列是小鼠、大鼠或人源序列。在一個實施方式中，所述人源化的、未經重排的K輕鏈可變區核苷酸序列與K輕鏈恒定區核苷酸序列可操作地連接。在一個實施方式中，所述K輕鏈恒定區核苷酸序列是小鼠、大鼠或人源序列。[0119]在一個實施方式中，所述經基因修飾的免疫球蛋白基因座包含未經重排的輕鏈可變基因序列，所述未經重排的輕鏈可變基因序列含有在編碼輕鏈可變結構域的至少一個閱讀框架中引入至少一個組氨酸密碼子的至少一個修飾。在一個實施方式中，所述經基因修飾的免疫球蛋白基因座包含重排的序列（例如重排的A或！CV/J序列），所述序列在輕鏈⑶R中含有1個、2個、3個或4個組氨酸密碼子。在一個實施方式中，所述⑶R選自⑶R1、CDR2、CDR3及其組合。在一個實施方式中，所述未經重排的或重排的輕鏈可變區核苷酸序列是未經重排的或重排的人源A或K輕鏈可變區核苷酸序列。在一個實施方式中，所述未經重排的或重排的人源A或k輕鏈可變區核苷酸序列存在于內源性小鼠免疫球蛋白輕鏈基因座中。在一個實施方式中，所述小鼠免疫球蛋白輕鏈基因座是小鼠k基因座。在一個實施方式中，所述小鼠免疫球蛋白輕鏈基因座是小鼠A基因座。[0120]在一個實施方式中，如本申請所述的經基因修飾的免疫球蛋白基因座存在于小鼠的免疫球蛋白重鏈基因座中。在一個實施方式中，所述經基因修飾的免疫球蛋白基因座存在于VELOCIMMUNE?小鼠中的人源化的免疫球蛋白重鏈基因座中。[0121]在一個實施方式中，由如本申請所述的經基因修飾的免疫球蛋白重鏈基因座表達的、含有重鏈可變結構域的抗原結合蛋白與不含如本申請所述的基因修飾的相應野生型重鏈可變結構域相比，在酸性環境中（例如在約5.5至約6.0的pH下）顯示出更弱的抗原結合。[0122]在一個實施方式中，由如本申請所述的經基因修飾的免疫球蛋白重鏈基因座表達的、含有重鏈可變結構域的抗原結合蛋白在25°C在酸性pH下（例如pH約5.5至約6.0)具有的解離半衰期（t1/2)少于2min。在一個實施方式中，由如本申請所述的經基因修飾的免疫球蛋白重鏈基因座表達的、含有重鏈可變結構域的抗原結合蛋白在37°C在酸性pH下（例如pH約5.5至約6.0)具有的解離半衰期（t1/2)少于2min。在一個實施方式中，由如本申請所述的經基因修飾的免疫球蛋白重鏈基因座表達的、含有重鏈可變結構域的抗原結合蛋白在25°C在酸性pH下（例如pH約5.5至約6.0)具有的解離半衰期（t1/2)少于lmin。在一個實施方式中，由如本申請所述的經基因修飾的免疫球蛋白重鏈基因座表達的、含有重鏈可變結構域的抗原結合蛋白在37°C在酸性pH下（例如pH約5.5至約6.0)具有的解離半衰期（t1/2)少于lmin。在一個實施方式中，由如本申請所述的經基因修飾的免疫球蛋白基因座表達的、含有重鏈可變結構域的抗原結合蛋白在酸性pH下（例如pH約5.5至約6.0)的解離半衰期（t1/2)比所述抗原結合蛋白在中性pH下（例如pH約7.0至約7.4)的解離半衰期（t1/2)降低至少約2倍、至少約3倍、至少約4倍、至少約5倍、至少約10倍、至少約15倍、至少約20倍、至少約25倍或至少約30倍。[0123]在一個實施方式中，由如本申請所述的經基因修飾的免疫球蛋白基因座表達的、含有重鏈可變結構域的抗原結合蛋白與不含基因修飾的野生型抗原結合蛋白相比，具有的特征為pH依賴的再循環性的提高、血清半衰期的增加或兩者兼而有之。[0124]在一個實施方式中，本申請所述的經基因修飾的免疫球蛋白基因座包含B細胞群，所述B細胞群經目標抗原刺激后能夠產生抗原結合蛋白例如抗體，所述抗原結合蛋白包含含有一個或多個組氨酸殘基的重鏈可變結構域。通過本申請所述的經基因修飾的免疫球蛋白基因座產生的抗原結合蛋白當給予對象時，與相應的野生型抗原結合蛋白相比顯示出增加的血清半衰期，所述野生型抗原結合蛋白具有相似的或足夠相似的編碼重鏈可變結構域的氨基酸序列，但是在所述重鏈可變結構域中不包含組氨酸殘基。在一些實施方式中，本申請所述的抗原結合蛋白顯示出的增加的血清半衰期，與相應的野生型抗原結合蛋白相比高至少約2倍、至少約5倍、至少約10倍、至少約15倍、至少約20倍，所述野生型抗原結合蛋白具有相似的或足夠相似的編碼重鏈可變結構域的氨基酸序列，但是在所述重鏈可變結構域中不包含組氨酸殘基。[0125]在一個方面，本申請提供了非人動物的經基因修飾的免疫球蛋白基因座，所述免疫球蛋白基因座包含人源VH、D和JH基因區段，其中至少一個人源D基因區段相對于相應的野生型序列從5'至3'反轉，并且其中所述反轉的人源D基因區段的至少一個閱讀框架包含一個或多個組氨酸密碼子。[0126]在一個實施方式中，所述非人動物是哺乳動物，包含嚙齒動物，例如小鼠、大鼠或倉鼠。[0127]在一個實施方式中，所述經基因修飾的免疫球蛋白基因座存在于種系基因組中。[0128]在一個實施方式中，所述經基因修飾的免疫球蛋白基因座編碼免疫球蛋白重鏈可變結構域，所述免疫球蛋白重鏈可變結構域含有1個或更多個、2個或更多個、3個或更多個、4個或更多個、5個或更多個、6個或更多個、7個或更多個、8個或更多個、9個或更多個、10個或更多個、11個或更多個、12個或更多個、13個或更多個、14個或更多個、15個或更多個、16個或更多個、17個或更多個、18個或更多個、19個或更多個、20個或更多個、21個或更多個、22個或更多個、23個或更多個、24個或更多個、25個或更多個、26個或更多個、27個或更多個、28個或更多個、29個或更多個、30個或更多個、31個或更多個、32個或更多個、33個或更多個或者34個或更多個組氨酸殘基。[0129]在一個實施方式中，至少2個、至少3個、至少4個、至少5個、至少6個、至少7個、至少8個、至少9個、至少10個、至少11個、至少12個、至少13個、至少14個、至少15個、至少16個、至少17個、至少18個、至少19個、至少20個、至少21個、至少22個、至少23個、至少24個或者全部或基本上全部的具有功能的人源D基因區段相對于對應的野生型序列是反向的。[0130]在一個實施方式中，全部或基本上全部的內源性免疫球蛋白VH、D、JH基因區段從所述免疫球蛋白重鏈基因座中缺失或使其不具有功能（例如通過在所述免疫球蛋白基因座中插入核苷酸序列例如外源性核苷酸序列，或通過使全部或基本上全部的內源性免疫球蛋白VH、D、JH區段產生不具有功能的重排或反轉），并且所述經基因修飾的免疫球蛋白基因座包含人源VH、D和JH基因區段，其中所述至少一個人源D基因區段以相對于對應的野生型序列相反的方向存在，并且其中在反轉的人源D基因區段中的至少一個閱讀框架包含至少一個組氨酸密碼子。[0131]在一個實施方式中，所述反轉的人源D基因區段與人源VH基因區段和/或人源JH基因區段可操作地連接。[0132]在一個實施方式中，所述人源D基因區段以相對于選自下組的相應的野生型序列相反的方向存在：Dl-1、Dl-7、Dl-20、Dl-26、D2-2、D2-8、D2-15、D2-21、D3-3、D3-9、D3-10、D3-16、D3-22、D4-4、D4-11、D4-17、D4-23、D5-5、D5-12、D5-18、D5-24、D6-6、D6-13、D6-19、D7-27及其組合。[0133]在一個實施方式中，以相對于相應的野生型序列相反的方向存在的所述人源D基因區段是選自下組的D1基因區段：Dl-1、Dl-7、Dl-20、D1-26及其組合。[0134]在一個實施方式中，以相對于相應的野生型序列相反的方向存在的所述人源D基因區段是選自下組的〇2基因區段：02-2、02-8、02-15、02-21及其組合。[0135]在一個實施方式中，以相對于相應的野生型序列相反的方向存在的所述人源D基因區段是選自下組的D3基因區段：D3-3、D3-9、D3-10、D3-16、D3-22及其組合。[0136]在一個實施方式中，以相對于相應的野生型序列相反的方向存在的所述人源D基因區段是選自下組的D4基因區段：D4-4、D4-11、D4-17、D4-23及其組合。[0137]在一個實施方式中，以相對于相應的野生型序列相反的方向存在的所述人源D基因區段是選自下組的D5基因區段：D5-5、D5-12、D5-18、D5-24及其組合。[0138]在一個實施方式中，以相對于相應的野生型序列相反的方向存在的所述人源D基因區段是選自下組的D6基因區段：D6-6、D6-13、D6-19及其組合。[0139]在一個實施方式中，以相對于相應的野生型序列相反的方向存在的所述人源D基因區段是D7-27。[0140]在一個實施方式中，所述人源D基因區段的閱讀框架選自終止閱讀框架、親水性閱讀框架和疏水性閱讀框架，并且所述反轉的人源D基因區段的至少一個閱讀框架包含一個或多個組氨酸密碼子。[0141]在一個實施方式中，包含所述反轉的人源D基因區段的所述未經重排的重鏈可變區核苷酸序列與編碼選自IgM、IgD、IgG、IgE和IgA的免疫球蛋白同種型的人源或非人源重鏈恒定區核苷酸序列可操作地連接。[0142]在一個實施方式中，包含所述反轉的人源D基因區段的所述未經重排的重鏈可變區核苷酸序列與編碼選自IgM、IgD、IgG、IgE和IgA的免疫球蛋白同種型的人源或非人源重鏈恒定區核苷酸序列可操作地連接。[0143]在一個實施方式中，所述人源未經重排的免疫球蛋白重鏈可變區核苷酸序列與選自下組的人源或非人源重鏈恒定區核苷酸序列可操作地連接：CH1、鉸鏈、CH2、CH3及其組合。在一個實施方式中，所述重鏈恒定區核苷酸序列包含CH1、鉸鏈、CH2和CH3(即CH1-鉸鏈-CH2-CH3)。[0144]在一個實施方式中，重鏈恒定區核苷酸序列存在于內源性基因座（即所述核苷酸序列位于野生型非人動物中）或存在于異位（即在與其基因組中的內源性免疫球蛋白鏈基因座不同的基因座），或在其內源性基因座中，例如在免疫球蛋白可變基因座中，其中所述內源性基因座位于或被移至基因組中的不同位置。[0145]在一個實施方式中，所述重鏈恒定區核苷酸序列包含在CH2或CH3中的修飾，其中所述修飾在酸性環境中（例如在pH范圍是約5.5至約6.0的核內體中）增加所述重鏈恒定區氨基酸序列對FcRn的親和性。[0146]在一個實施方式中，所述重鏈恒定區核苷酸序列編碼人源重鏈恒定區氨基酸序列，所述人源重鏈恒定區氨基酸序列包含在位置250的修飾（例如E或Q);在位置250和428的修飾（例如L或F);在位置252的修飾（例如L/Y/F/W或T)、在254的修飾（例如S或T)和在256的修飾（例如S/R/Q/E/D或T);或在位置428和/或433的修飾（例如L/R/S/P/Q或K)和/或在434的修飾（例如H/F或Y);或在位置250和/或428的修飾；或在位置307或308的修飾（例如308F、V308F)和在434的修飾。在一個實施方式中，所述修飾包含428L(例如M428L)和434S(例如N434S)修飾；428L、259I(例如V259I)和308F(例如V308F)修飾；433K(例如H433K)和434(例如434Y)修飾；252、254和256(例如252Y、254T和256E)修飾；250Q和428L修飾（例如T250Q和M428L)以及307和/或308修飾(例如308F或308P)，其中所述修飾在酸性環境中（例如在pH范圍是約5.5至約6.0的核內體中）增加所述重鏈恒定區氨基酸序列對FcRn的親和性。[0147]在一個實施方式中，所述重鏈恒定區核苷酸序列編碼人源CH2氨基酸序列，所述氨基酸序列包含在位置252和257的氨基酸殘基之間的至少一個修飾，其中所述修飾在酸性環境中（例如在pH范圍是約5.5至約6.0的核內體中）增加所述人源Ch2氨基酸序列對FcRn的親和性。[0148]在一個實施方式中，所述重鏈恒定區核苷酸序列編碼人源CH2氨基酸序列，所述氨基酸序列包含在位置307和311的氨基酸殘基之間的至少一個修飾，其中所述修飾在酸性環境中（例如在pH范圍是約5.5至約6.0的核內體中）增加所述CH2氨基酸序列對FcRn的親和性。[0149]在一個實施方式中，所述重鏈恒定區核苷酸序列編碼人源CH3氨基酸序列，所述CH3氨基酸序列包含在位置433和436的氨基酸殘基之間的至少一個修飾，其中所述修飾在酸性環境中（例如在pH范圍是約5.5至約6.0的核內體中）增加所述CH3氨基酸序列對FcRn的親和性。[0150]在一個實施方式中，所述重鏈恒定區核苷酸序列編碼人源重鏈恒定區氨基酸序列，所述氨基酸序列包含選自下組的突變：M428L、N434S及其組合。[0151]在一個實施方式中，所述重鏈恒定區核苷酸序列編碼人源重鏈恒定區氨基酸序列，所述氨基酸序列包含選自下組的突變：M428L、V259I、V308F及其組合。[0152]在一個實施方式中，所述重鏈恒定區核苷酸序列編碼人源重鏈恒定區氨基酸序列，所述氨基酸序列包含N434A突變。[0153]在一個實施方式中，所述重鏈恒定區核苷酸序列編碼人源重鏈恒定區氨基酸序列，所述氨基酸序列包含選自下組的突變：M252Y、S254T、T256E及其組合。[0154]在一個實施方式中，所述重鏈恒定區核苷酸序列編碼人源重鏈恒定區氨基酸序列，所述氨基酸序列包含選自下組的突變：T250Q、M248L或這兩者。[0155]在一個實施方式中，所述重鏈恒定區核苷酸序列編碼人源重鏈恒定區氨基酸序列，所述氨基酸序列包含選自下組的突變：H433K、N434Y或這兩者。[0156]在一個實施方式中，所述經基因修飾的免疫球蛋白基因座包含：（1)第一等位基因，其中如本申請所述的未經重排的人源免疫球蛋白重鏈可變區核苷酸序列與第一重鏈恒定區核苷酸序列可操作地連接，所述第一重鏈恒定區核苷酸序列編碼選自IgGl、IgG2、IgG4及其組合的人源IgG的第一CH3氨基酸序列；和（2)第二等位基因，其中如本申請所述的未經重排的人源免疫球蛋白重鏈可變區核苷酸序列與第二重鏈恒定區核苷酸序列可操作地連接，所述第二重鏈恒定區核苷酸序列編碼選自IgGl、IgG2、IgG4及其組合的人源IgG的第二CH3氨基酸序列，并且其中所述第二CH3氨基酸序列包含使所述第二CH3氨基酸序列與蛋白A的結合降低或消除的修飾（參見例如US2010/0331527A1，其通過引用整體并入本申請）。[0157]在一個實施方式中，所述第二CH3氨基酸序列包含H95R修飾（根據MGT外顯子編號；根據EU編號為H435R)。在一個實施方式中，所述第二CH3氨基酸序列還包含Y96F修飾(根據頂GT外顯子編號；根據EU編號為H436F)。在另一個實施方式中，所述第二CH3氨基酸序列包含！195R修飾（根據MGT外顯子編號；根據EU編號為H435R)和Y96F修飾（根據MGT外顯子編號；根據EU編號為H436F)這兩者。[0158]在一個實施方式中，所述第二CH3氨基酸序列來自經修飾的人源IgGl并且還包含選自下組的突變：D16E、L18M、N44S、K52N、V57M和V82I(根據MGT編號；根據EU編號為D356E、L38M、N384S、K392N、V397M和V422I)。[0159]在一個實施方式中，所述第二CH3氨基酸序列來自經修飾的人源IgG2并且還包含選自下組的突變：N44S、K52N和V82I(根據MGT編號；根據EU編號為N384S、K392N和V422I)。[0160]在一個實施方式中，所述第二CH3氨基酸序列來自經修飾的人源IgG4并且還包含選自下組的突變：0151?、財43、1(52隊￥57]\1、1?691(、￡790和￥821(根據頂61'編號；根據￡。編號為Q355R、N384S、K392N、V397M、R409K、E419Q和V422I)。[0161]在一個實施方式中，所述重鏈恒定區氨基酸序列是非人源恒定區氨基酸序列，并且所述重鏈恒定區氨基酸序列包含上文所述任意類型的修飾中的一種或多種。[0162]在一個實施方式中，所述重鏈恒定區核苷酸序列是人源重鏈恒定區氨基酸序列，并且所述人源重鏈恒定區氨基酸序列包含上文所述任意類型的修飾中的一種或多種。[0163]在一個實施方式中，全部或基本上全部的內源性VH、0和義基因區段從免疫球蛋白重鏈基因座中缺失或者使其不具有功能（例如通過在免疫球蛋白基因座中插入核苷酸序列（例如外源性核苷酸序列）或者通過使內源性VH、D、JHg段進行不具有功能的重排或反轉）。在一個實施方式中，例如，約80%或更多的、約85%或更多的、約90%或更多的、約95%或更多的、約96%或更多的、約97%或更多的、約98%或更多的或者約99%或更多的全部的內源性VH、D或JH基因區段被缺失或使其不具有功能。在一個實施方式中，例如，至少95%、96%、97%、98%或99%的內源性具有功能的V、D或J基因區段被缺失或使其不具有功能。[0164]在一個實施方式中，所述經基因修飾的免疫球蛋白重鏈基因座包含使全部或基本上全部的內源性VH、D和JH基因區段缺失或使其不具有功能的修飾；并且所述經基因修飾的基因座包含未經重排的重鏈可變區核苷酸序列，所述核苷酸序列含有如本申請所述的至少一個反轉的人源D基因區段，其中所述未經重排的重鏈可變區核苷酸序列存在于內源性位置（即所述核苷酸序列位于野生型非人動物中）或存在于異位（即在與其基因組的內源性免疫球蛋白鏈基因座不同的基因座，或在其內源性基因座中，例如在免疫球蛋白可變基因座中，其中所述內源性基因座位于或移至基因組中的不同位置）。[0165]在一個實施方式中，所述經基因修飾的免疫球蛋白基因座包含內源性Adam6a基因、Adam6b基因或者這兩者，并且所述基因修飾不會影響所述內源性Adam6a基因、Adam6b基因或者這兩者的表達和/或功能。[0166]在一個實施方式中，所述經基因修飾的免疫球蛋白基因座包含異位存在的Adam6a基因、Adam6b基因或者這兩者。在一個實施方式中，所述Adam6a基因是非人源Adam6a基因。在一個實施方式中，所述Adam6a基因是小鼠Adam6a基因。在一個實施方式中，所述Adam6a基因是人源Adam6a基因。在一個實施方式中，所述Adam6b基因是非人源Adam6b基因。在一個實施方式中，所述Adam6b基因是小鼠Adam6b基因。在一個實施方式中，所述Adam6b基因是人源Adam6b基因。[0167]在一個實施方式中，所述經基因修飾的免疫球蛋白基因座還包含人源化的、未經重排的A和/或K輕鏈可變基因序列。在一個實施方式中，所述人源化的、未經重排的X和/或K輕鏈可變基因序列與免疫球蛋白輕鏈恒定區核苷酸序列可操作地連接，所述輕鏈恒定區核苷酸序列選自A輕鏈恒定區核苷酸序列和K輕鏈恒定區核苷酸序列。在一個實施方式中，所述人源化的、未經重排的A輕鏈可變區核苷酸序列與A輕鏈恒定區核苷酸序列可操作地連接。在一個實施方式中，所述A輕鏈恒定區核苷酸序列是小鼠、大鼠或人源序列。在一個實施方式中，所述人源化的、未經重排的K輕鏈可變區核苷酸序列與K輕鏈恒定區核苷酸序列可操作地連接。在一個實施方式中，所述K輕鏈恒定區核苷酸序列是小鼠、大鼠或人源序列。[0168]在一個實施方式中，所述經基因修飾的免疫球蛋白基因座包含未經重排的輕鏈可變基因序列，所述未經重排的輕鏈可變基因序列含有在編碼輕鏈可變結構域的至少一個閱讀框架中引入至少一個組氨酸密碼子的至少一個修飾。在一個實施方式中，所述經基因修飾的免疫球蛋白基因座包含重排的序列（例如重排的A或！CV/J序列），所述序列在輕鏈⑶R中含有1個、2個、3個或4個組氨酸密碼子。在一個實施方式中，所述⑶R選自⑶R1、CDR2、CDR3及其組合。在一個實施方式中，所述未經重排的或重排的輕鏈可變區核苷酸序列是未經重排的或重排的人源A或K輕鏈可變區核苷酸序列。在一個實施方式中，所述未經重排的或重排的人源A或k輕鏈可變區核苷酸序列存在于內源性小鼠免疫球蛋白輕鏈基因座。在一個實施方式中，所述小鼠免疫球蛋白輕鏈基因座是小鼠k基因座。在一個實施方式中，所述小鼠免疫球蛋白輕鏈基因座是小鼠A基因座。[0169]在一個實施方式中，如本申請所述的經基因修飾的免疫球蛋白基因座存在于小鼠的免疫球蛋白重鏈基因座中。在一個實施方式中，所述經基因修飾的免疫球蛋白基因座存在于VEL.OCIMMUNE--小鼠中的人源化的免疫球蛋白重鏈基因座中。[0170]在一個實施方式中，由如本申請所述的經基因修飾的免疫球蛋白重鏈基因座表達的、含有重鏈可變結構域的抗原結合蛋白與不含所述的基因修飾的相應野生型重鏈可變結構域相比，在酸性環境中（例如在約5.5至約6.0的pH下）顯示出更弱的抗原結合。[0171]在一個實施方式中，由如本申請所述的經基因修飾的免疫球蛋白重鏈基因座表達的、含有重鏈可變結構域的抗原結合蛋白在25°C在酸性pH下（例如pH約5.5至約6.0)具有的解離半衰期（t1/2)少于2min。在一個實施方式中，由如本申請所述的經基因修飾的免疫球蛋白重鏈基因座表達的、含有重鏈可變結構域的抗原結合蛋白在37°C在酸性pH下（例如pH約5.5至約6.0)具有的解離半衰期（t1/2)少于2min。在一個實施方式中，由如本申請所述的經基因修飾的免疫球蛋白重鏈基因座表達的、含有重鏈可變結構域的抗原結合蛋白在25°C在酸性pH下（例如pH約5.5至約6.0)具有的解離半衰期（t1/2)少于lmin。在一個實施方式中，由如本申請所述的經基因修飾的免疫球蛋白重鏈基因座表達的、含有重鏈可變結構域的抗原結合蛋白在37°C在酸性pH下（例如pH約5.5至約6.0)具有的解離半衰期（t1/2)少于lmin。在一個實施方式中，由如本申請所述的經基因修飾的免疫球蛋白基因座表達的、含有重鏈可變結構域的抗原結合蛋白在酸性pH下（例如pH約5.5至約6.0)的解離半衰期（t1/2)比所述抗原結合蛋白在中性pH下（例如pH約7.0至約7.4)的解離半衰期（t1/2)降低至少約2倍、至少約3倍、至少約4倍、至少約5倍、至少約10倍、至少約15倍、至少約20倍、至少約25倍或至少約30倍。[0172]在一個實施方式中，由如本申請所述的經基因修飾的免疫球蛋白基因座表達的、含有重鏈可變結構域的抗原結合蛋白與不含所述的基因修飾的野生型抗原結合蛋白相比，具有的特征為pH依賴的再循環性的提高、血清半衰期的增加或兩者兼而有之。[0173]在一個實施方式中，本申請所述的經基因修飾的免疫球蛋白基因座包含B細胞群，所述B細胞群經目標抗原刺激后能夠產生抗原結合蛋白例如抗體，所述抗原結合蛋白包含含有一個或多個組氨酸殘基的重鏈可變結構域。如本申請所述的抗原結合蛋白當給予對象時，與相應的野生型抗原結合蛋白相比顯示出增加的血清半衰期，所述野生型抗原結合蛋白具有相似的或足夠相似的編碼重鏈可變結構域的氨基酸序列，但是在所述重鏈可變結構域中不包含組氨酸殘基。在一些實施方式中，本申請所述的抗原結合蛋白顯示出的增加的血清半衰期與相應的野生型抗原結合蛋白相比，高至少約2倍、至少約5倍、至少約10倍、至少約15倍、至少約20倍，所述野生型抗原結合蛋白具有相似的或足夠相似的編碼重鏈可變結構域的氨基酸序列，但是在所述重鏈可變結構域中不包含組氨酸殘基。[0174]在一個方面，本申請提供了在種系基因組中包含經基因修飾的免疫球蛋白基因座的非人動物，所述經基因修飾的免疫球蛋白基因座含有未經重排的人源重鏈可變區核苷酸序列，其中所述未經重排的重鏈可變區核苷酸序列包含加入至少一個組氨酸密碼子或使用組氨酸密碼子取代至少一個內源性非組氨酸密碼子。[0175]在一個實施方式中，所述非人動物是哺乳動物，包含嚙齒動物，例如小鼠、大鼠或倉鼠。[0176]在一個實施方式中，所述加入的或取代的組氨酸密碼子存在于選自下組的免疫球蛋白重鏈基因區段：人源％基因區段、人源D基因區段、人源JH基因區段及其組合。在一個實施方式中，所述免疫球蛋白重鏈基因區段選自人源種系％基因區段、人源種系D基因區段、人源種系JH基因區段及其組合。[0177]在一個實施方式中，所述人源VH基因區段選自下組：Vh1_2、Vh1_3、Vh1_8、Vh1_18、Vh1-24、Vh1-45、Vh1-46、Vh1-58、Vh1-69、Vh2-5、Vh2-26、Vh2-70、Vh3-7、Vh3-9、Vh3-11、Vh3-13、Vh3-15、Vh3-16、Vh3-20、Vh3-21、Vh3-23、Vh3-30、Vh3-30-3、Vh3-30-5、Vh3-33、Vh3-35、Vh3-38、Vh3-43、Vh3-48、Vh3-49、Vh3-53、Vh3-64、Vh3-66、Vh3-72、Vh3-73、Vh3-74、Vh4-4、Vh4-28、Vh4-30-1、Vh4-30-2、Vh4-30-4、Vh4-31、Vh4-34、Vh4-39、Vh4-59、Vh4-61、Vh5-51、Vh6-1、Vh7-4-1、Vh7-81及其組合。[0178]在一個實施方式中，所述人源D基因區段選自下組：Dl-1、Dl-7、Dl-14、Dl-20、Dl-26、D2-2、D2-8、D2-15、D2-21、D3-3、D3-9、D3-10、D3-16、D3-22、D4-4、D4-11、D4-17、D4-23、D5-12、D5-5、D5-18、D5-24、D6-6、D6-13、D6-19、D6-25、D7-27及其組合。[0179]在一個實施方式中，所述人源JH基因區段選自下組：JH1、JH2、JH3、JH4、JH5、JH6及其組合。[0180]在一個實施方式中，所述加入的或取代的組氨酸密碼子存在于編碼N-末端區、環4區、⑶R1、⑶R2、⑶R3及其組合的未經重排的重鏈可變區核苷酸序列中。[0181]在一個實施方式中，所述未經重排的重鏈可變區核苷酸序列包含2個或更多個、3個或更多個、4個或更多個、5個或更多個、6個或更多個、7個或更多個、8個或更多個、9個或更多個、10個或更多個、11個或更多個、12個或更多個、13個或更多個、14個或更多個、15個或更多個、16個或更多個、17個或更多個、18個或更多個、19個或更多個、20個或更多個、21個或更多個、22個或更多個、23個或更多個、24個或更多個、25個或更多個、26個或更多個、27個或更多個、28個或更多個、29個或更多個、30個或更多個、31個或更多個、32個或更多個、33個或更多個、34個或更多個、35個或更多個、36個或更多個、37個或更多個、38個或更多個、39個或更多個、40個或更多個、41個或更多個、42個或更多個、43個或更多個、44個或更多個、45個或更多個、46個或更多個、47個或更多個、48個或更多個、49個或更多個、50個或更多個、51個或更多個、52個或更多個、53個或更多個、54個或更多個、55個或更多個、56個或更多個、57個或更多個、58個或更多個、59個或更多個、60個或更多個或者61個或更多個組氨酸密碼子。[0182]在一個實施方式中，包含所述反轉的人源D基因區段的所述未經重排的重鏈可變區核苷酸序列與編碼選自IgM、IgD、IgG、IgE和IgA的免疫球蛋白同種型的人源或非人源重鏈恒定區核苷酸序列可操作地連接。[0183]在一個實施方式中，所述人源未經重排的免疫球蛋白重鏈可變區核苷酸序列與選自CH1、鉸鏈、CH2、CH3及其組合的人源或非人源重鏈恒定區核苷酸序列可操作地連接。在一個實施方式中，所述重鏈恒定區核苷酸序列含有CH1、鉸鏈、CH2和CH3(即CH1-鉸鏈-CH2-CH3)。[0184]在一個實施方式中，重鏈恒定區核苷酸序列存在于內源性基因座（即所述核苷酸序列位于野生型非人動物中）或存在于異位（即在與其基因組的內源性免疫球蛋白鏈基因座不同的基因座中），或在其內源性基因座中，例如在免疫球蛋白可變基因座中，其中所述內源性基因座位于或移至基因組中的不同位置。[0185]在一個實施方式中，所述重鏈恒定區核苷酸序列含有在CH2或CH3中的修飾，其中所述修飾在酸性環境中（例如在pH范圍是約5.5至約6.0的核內體中）增加所述重鏈恒定區氨基酸序列與FcRn的親和性。[0186]在一個實施方式中，所述重鏈恒定區核苷酸序列編碼人源重鏈恒定區氨基酸序列，所述人源重鏈恒定區氨基酸序列包含在位置250的修飾（例如E或Q);在250和428的修飾（例如L或F);在252的修飾（例如L/Y/F/W或T)、在254的修飾（例如S或T)和在256的修飾（例如S/R/Q/E/D或T);或在位置428和/或433的修飾（例如L/R/S/P/Q或K)和/或在434的修飾（例如H/F或Y);或在位置250和/或428的修飾；或在位置307或308的修飾（例如308F、V308F)和在434的修飾。在一個實施方式中，所述修飾包含428L(例如M428L)和434S(例如N434S)修飾；428L、259I(例如V259I)和308F(例如V308F)修飾；433K(例如H433K)和434(例如434Y)修飾；252、254和256(例如252Y、254T和256E)修飾；250Q和428L修飾（例如T250Q和M428L);以及307和/或308修飾（例如308F或308P)，其中所述修飾在酸性環境中（例如在pH范圍是約5.5至約6.0的核內體中）增加所述重鏈恒定區氨基酸序列對FcRn的親和性。[0187]在一個實施方式中，所述重鏈恒定區核苷酸序列編碼人源CH2氨基酸序列，所述人源CH2氨基酸序列包含在位置252和257的氨基酸殘基之間的至少一個修飾，其中所述修飾在酸性環境中（例如在pH范圍是約5.5至約6.0的核內體中）增加所述人源CH2氨基酸序列對FcRn的親和性。[0188]在一個實施方式中，所述重鏈恒定區核苷酸序列編碼人源CH2氨基酸序列，所述人源CH2氨基酸序列包含在位置307和311的氨基酸殘基之間的至少一個修飾，其中所述修飾在酸性環境中（例如在pH范圍是約5.5至約6.0的核內體中）增加所述CH2氨基酸序列對FcRn的親和性。[0189]在一個實施方式中，所述重鏈恒定區核苷酸序列編碼人源CH3氨基酸序列，所述人源CH3氨基酸序列包含在位置433和436的氨基酸殘基之間的至少一個修飾，其中所述修飾在酸性環境中（例如在pH范圍是約5.5至約6.0的核內體中）增加所述CH3氨基酸序列對FcRn的親和性。[0190]在一個實施方式中，所述重鏈恒定區核苷酸序列編碼人源重鏈恒定區氨基酸序列，所述人源重鏈恒定區氨基酸序列包含選自下組的突變：M428L、N434S及其組合。[0191]在一個實施方式中，所述重鏈恒定區核苷酸序列編碼人源重鏈恒定區氨基酸序列，所述人源重鏈恒定區氨基酸序列包含選自下組的突變：M428L、V259I、V308F及其組合。[0192]在一個實施方式中，所述重鏈恒定區核苷酸序列編碼人源重鏈恒定區氨基酸序列，所述人源重鏈恒定區氨基酸序列包含N434A突變。[0193]在一個實施方式中，所述重鏈恒定區核苷酸序列編碼人源重鏈恒定區氨基酸序列，所述人源重鏈恒定區氨基酸序列包含選自下組的突變：M252Y、S254T、T256E及其組合。[0194]在一個實施方式中，所述重鏈恒定區核苷酸序列編碼人源重鏈恒定區氨基酸序列，所述人源重鏈恒定區氨基酸序列包含選自下組的突變：T250Q、M248L或這兩者。[0195]在一個實施方式中，所述重鏈恒定區核苷酸序列編碼人源重鏈恒定區氨基酸序列，所述人源重鏈恒定區氨基酸序列包含選自下組的突變：H433K、N434Y或這兩者。[0196]在一個實施方式中，所述經基因修飾的免疫球蛋白基因座包含：（1)第一等位基因，其中如本申請所述的未經重排的人源免疫球蛋白重鏈可變區核苷酸序列與第一重鏈恒定區核苷酸序列可操作地連接，所述第一重鏈恒定區核苷酸序列編碼選自IgGl、IgG2、IgG4及其組合的人源IgG的第一CH3氨基酸序列；和（2)第二等位基因，其中如本申請所述的未經重排的人源免疫球蛋白重鏈可變區核苷酸序列與第二重鏈恒定區核苷酸序列可操作地連接，所述第二重鏈恒定區核苷酸序列編碼選自IgGl、IgG2、IgG4及其組合的人源IgG的第二CH3氨基酸序列，并且其中所述第二CH3氨基酸序列包含使所述第二CH3氨基酸序列與蛋白A的結合降低或消除的修飾（參見例如US2010/0331527A1，其通過引用整體并入本申請）。[0197]在一個實施方式中，所述第二CH3氨基酸序列包含H95R修飾（根據MGT外顯子編號；根據EU編號為H435R)。在一個實施方式中，所述第二CH3氨基酸序列還包含Y96F修飾(根據頂GT外顯子編號；根據EU編號為H436F)。在另一個實施方式中，所述第二CH3氨基酸序列包含！195R修飾（根據MGT外顯子編號；根據EU編號為H435R)和Y96F修飾（根據MGT外顯子編號；根據EU編號為H436F)這兩者。[0198]在一個實施方式中，所述第二CH3氨基酸序列來自經修飾的人源IgGl并且還包含選自下組的突變：D16E、L18M、N44S、K52N、V57M和V82I(根據MGT編號；根據EU編號為D356E、L38M、N384S、K392N、V397M和V422I)。[0199]在一個實施方式中，所述第二CH3氨基酸序列來自經修飾的人源IgG2并且還包含選自下組的突變：N44S、K52N和V82I(根據MGT編號；根據EU編號為N384S、K392N和V422I)。[0200]在一個實施方式中，所述第二CH3氨基酸序列來自經修飾的人源IgG4并且還包含選自下組的突變：0151?、財43、1(52隊￥57]\1、1?691(、￡790和￥821(根據頂61'編號；根據￡。編號為Q355R、N384S、K392N、V397M、R409K、E419Q和V422I)。[0201]在一個實施方式中，所述重鏈恒定區氨基酸序列是非人源恒定區氨基酸序列，并且所述重鏈恒定區氨基酸序列包含上文所述任意類型的修飾中的一種或多種。[0202]在一個實施方式中，所述重鏈恒定區核苷酸序列是人源重鏈恒定區氨基酸序列，并且所述人源重鏈恒定區氨基酸序列包含上文所述任意類型的修飾中的一種或多種。[0203]在一個實施方式中，全部或基本上全部的內源性VH、0和義基因區段從免疫球蛋白重鏈基因座中缺失或者使其不具有功能（例如通過在免疫球蛋白基因座中插入核苷酸序列（例如外源性核苷酸序列）或者通過使內源性VH、D、JHg段進行不具有功能的重排或反轉）。在一個實施方式中，例如，約80%或更多的、約85%或更多的、約90%或更多的、約95%或更多的、約96%或更多的、約97%或更多的、約98%或更多的或者約99%或更多的全部的內源性VH、D或JH基因區段被缺失或使其不具有功能。在一個實施方式中，例如，至少95%、96%、97%、98%或99%的內源性具有功能的V、D或J基因區段被缺失或使其不具有功能。[0204]在一個實施方式中，所述經基因修飾的免疫球蛋白重鏈基因座包含使全部或基本上全部的內源性VH、D和JH基因區段缺失或使其不具有功能的修飾；并且所述經基因修飾的基因座包含未經重排的重鏈可變區核苷酸序列，所述核苷酸序列含有具有一個或多個組氨酸密碼子的一個或多個人源VH、D和/或JH基因區段，其中所述未經重排的重鏈可變區核苷酸序列存在于內源性位置（即所述核苷酸序列位于野生型非人動物中）或存在于異位(即在與其基因組的內源性免疫球蛋白鏈基因座不同的位置，或在其內源性基因座中，例如在免疫球蛋白可變基因座中，其中所述內源性基因座位于或移至基因組中的不同位置）。[0205]在一個實施方式中，所述經基因修飾的免疫球蛋白基因座包含內源性Adam6a基因、Adam6b基因或者這兩者，并且所述基因修飾不會影響所述內源性Adam6a基因、Adam6b基因或者這兩者的表達和/或功能。[0206]在一個實施方式中，所述經基因修飾的免疫球蛋白基因座包含異位存在的Adam6a基因、Adam6b基因或者這兩者。在一個實施方式中，所述Adam6a基因是非人源Adam6a基因。在一個實施方式中，所述Adam6a基因是人源Adam6a基因。在一個實施方式中，所述Adam6b基因是非人源Adam6b基因。在一個實施方式中，所述Adam6b基因是人源Adam6b基因。[0207]在一個實施方式中，所述經基因修飾的免疫球蛋白基因座還包含人源化的、未經重排的A和/或K輕鏈可變基因序列。在一個實施方式中，所述人源化的、未經重排的X和/或K輕鏈可變基因序列與免疫球蛋白輕鏈恒定區核苷酸序列可操作地連接，所述輕鏈恒定區核苷酸序列選自A輕鏈恒定區核苷酸序列和K輕鏈恒定區核苷酸序列。在一個實施方式中，所述人源化的、未經重排的A輕鏈可變區核苷酸序列與A輕鏈恒定區核苷酸序列可操作地連接。在一個實施方式中，所述A輕鏈恒定區核苷酸序列是小鼠、大鼠或人源序列。在一個實施方式中，所述人源化的、未經重排的K輕鏈可變區核苷酸序列與K輕鏈恒定區核苷酸序列可操作地連接。在一個實施方式中，所述K輕鏈恒定區核苷酸序列是小鼠、大鼠或人源序列。[0208]在一個實施方式中，所述經基因修飾的免疫球蛋白基因座包含未經重排的輕鏈可變基因序列，所述未經重排的輕鏈可變基因序列含有在編碼輕鏈可變結構域的至少一個閱讀框架中引入至少一個組氨酸密碼子的至少一個修飾。在一個實施方式中，所述經基因修飾的免疫球蛋白基因座包含重排的序列（例如重排的A或！CV/J序列），所述序列在輕鏈⑶R中含有1個、2個、3個或4個組氨酸密碼子。在一個實施方式中，所述⑶R選自⑶R1、CDR2、CDR3及其組合。在一個實施方式中，所述未經重排的或重排的輕鏈可變區核苷酸序列是未經重排的或重排的人源A或K輕鏈可變區核苷酸序列。在一個實施方式中，所述未經重排的或重排的人源A或k輕鏈可變區核苷酸序列存在于內源性小鼠免疫球蛋白輕鏈基因座。在一個實施方式中，所述小鼠免疫球蛋白輕鏈基因座是小鼠k基因座。在一個實施方式中，所述小鼠免疫球蛋白輕鏈基因座是小鼠A基因座。[0209]在一個實施方式中，如本申請所述的經基因修飾的免疫球蛋白基因座存在于小鼠的免疫球蛋白重鏈基因座中。在一個實施方式中，所述經基因修飾的免疫球蛋白基因座存在于VELOCIMMUNE?小鼠中的人源化的免疫球蛋白重鏈基因座中。[0210]在一個實施方式中，所述非人動物是針對經基因修飾的免疫球蛋白重鏈基因座的雜合子，并且所述非人動物能夠表達人源免疫球蛋白重鏈可變結構域，所述人源免疫球蛋白重鏈可變結構域包含主要來源于如本申請所述的經基因修飾的免疫球蛋白重鏈基因座的至少一個組氨酸殘基。[0211]在一個實施方式中，由如本申請所述的經基因修飾的免疫球蛋白重鏈基因座表達的、含有重鏈可變結構域的抗原結合蛋白與不含所述基因修飾的相應野生型重鏈可變結構域相比，在酸性環境中（例如在約5.5至約6.0的pH下）顯示出更弱的抗原結合。[0212]在一個實施方式中，由如本申請所述的經基因修飾的免疫球蛋白重鏈基因座表達的、含有重鏈可變結構域的抗原結合蛋白在25°C在酸性pH下（例如pH約5.5至約6.0)具有的解離半衰期（t1/2)少于2min。在一個實施方式中，由如本申請所述的經基因修飾的免疫球蛋白重鏈基因座表達的、含有重鏈可變結構域的抗原結合蛋白在37°C在酸性pH下（例如pH約5.5至約6.0)具有的解離半衰期（t1/2)少于2min。在一個實施方式中，由如本申請所述的經基因修飾的免疫球蛋白重鏈基因座表達的、含有重鏈可變結構域的抗原結合蛋白在25°C在酸性pH下（例如pH約5.5至約6.0)具有的解離半衰期（t1/2)少于lmin。在一個實施方式中，由如本申請所述的經基因修飾的免疫球蛋白重鏈基因座表達的、含有重鏈可變結構域的抗原結合蛋白在37°C在酸性pH下（例如pH約5.5至約6.0)具有的解離半衰期（t1/2)少于lmin。在一個實施方式中，由如本申請所述的經基因修飾的免疫球蛋白基因座表達的、含有重鏈可變結構域的抗原結合蛋白在酸性pH下（例如pH約5.5至約6.0)的解離半衰期（t1/2)比所述抗原結合蛋白在中性pH下（例如pH約7.0至約7.4)的解離半衰期（t1/2)降低至少約2倍、至少約3倍、至少約4倍、至少約5倍、至少約10倍、至少約15倍、至少約20倍、至少約25倍或至少約30倍。[0213]在一個實施方式中，由如本申請所述的經基因修飾的免疫球蛋白基因座表達的、含有重鏈可變結構域的抗原結合蛋白與不含所述的基因修飾的野生型抗原結合蛋白相比，具有的特征為pH依賴的再循環性的提高、血清半衰期的增加或兩者兼而有之。[0214]在一個實施方式中，本申請所述的經基因修飾的免疫球蛋白基因座包含B細胞群，所述B細胞群經目標抗原刺激后能夠產生抗原結合蛋白例如抗體，所述抗原結合蛋白包含含有一個或多個組氨酸殘基的重鏈可變結構域。如本申請所述的抗原結合蛋白當給予對象時，與相應的野生型抗原結合蛋白相比顯示出增加的血清半衰期，所述野生型抗原結合蛋白具有相似的或足夠相似的編碼重鏈可變結構域的氨基酸序列，但是在所述重鏈可變結構域中不包含組氨酸殘基。在一些實施方式中，本申請所述的抗原結合蛋白顯示出的增加的血清半衰期，與相應的野生型抗原結合蛋白相比高至少約2倍、至少約5倍、至少約10倍、至少約15倍、至少約20倍，所述野生型抗原結合蛋白具有相似的或足夠相似的編碼重鏈可變結構域的氨基酸序列，但是在所述重鏈可變結構域中不包含組氨酸殘基。[0215]在一個方面，本申請提供了包含經基因修飾的免疫球蛋白基因座的非人動物，其中所述經基因修飾的免疫球蛋白基因座含有未經重排的人源重鏈可變區核苷酸序列，并且其中所述人源未經重排的重鏈可變區核苷酸序列包含使用組氨酸密碼子取代至少一個內源性非組氨酸密碼子。[0216]在一個實施方式中，所述非人動物是哺乳動物，包含嚙齒動物，例如小鼠、大鼠或倉鼠。[0217]在一個實施方式中，2個或更多個、3個或更多個、4個或更多個、5個或更多個、6個或更多個、7個或更多個、8個或更多個、9個或更多個、10個或更多個、11個或更多個、12個或更多個、13個或更多個、14個或更多個、15個或更多個、16個或更多個、17個或更多個、18個或更多個、19個或更多個、20個或更多個、21個或更多個、22個或更多個、23個或更多個、24個或更多個、25個或更多個、26個或更多個、27個或更多個、28個或更多個、29個或更多個、30個或更多個、31個或更多個、32個或更多個、33個或更多個、34個或更多個、35個或更多個、36個或更多個、37個或更多個、38個或更多個、39個或更多個、40個或更多個、41個或更多個、42個或更多個、43個或更多個、44個或更多個、45個或更多個、46個或更多個、47個或更多個、48個或更多個、49個或更多個、50個或更多個、51個或更多個、52個或更多個、53個或更多個、54個或更多個、55個或更多個、56個或更多個、57個或更多個、58個或更多個、59個或更多個、60個或更多個或者61個或更多個內源性非組氨酸密碼子被組氨酸密碼子取代。[0218]在一個實施方式中，所述內源性非組氨酸密碼子編碼選自下組的氨基酸：Y、N、D、Q、S、W和R。[0219]在一個實施方式中，所述取代的組氨酸密碼子存在于未經重排的重鏈可變區核苷酸序列中，所述未經重排的重鏈可變區核苷酸序列編碼選自下組的免疫球蛋白可變結構域：N-末端區、環4區、⑶R1、⑶R2、⑶R3及其組合。[0220]在一個實施方式中，所述取代的組氨酸密碼子存在于未經重排的重鏈可變區核苷酸序列中，所述未經重排的重鏈可變區核苷酸序列編碼選自下組的互補性決定區（CDR):CDR1、CDR2、CDR3及其組合。[0221]在一個實施方式中，所述取代的組氨酸密碼子存在于未經重排的重鏈可變區核苷酸序列中，所述未經重排的重鏈可變區核苷酸序列編碼選自下組的框架區（FR):FR1、FR2、FR3、FR4及其組合。[0222]在一個實施方式中，所述未經重排的重鏈可變區核苷酸序列包含經基因修飾的人源％基因區段，其中所述人源￥11基因區段的至少一個閱讀框架中的一個或多個內源性非組氨酸密碼子被組氨酸密碼子取代。[0223]在一個實施方式中，所述人源未經重排的重鏈可變區核苷酸序列包含使用組氨酸密碼子取代人源％基因區段的至少一個內源性非組氨酸密碼子的修飾，其中所述人源￥11基因區段選自下組：Vh1-2、Vh1-3、Vh1-8、Vh1-18、Vh1-24、Vh1-45、Vh1-46、Vh1-58、Vh1-69、Vh2-5、Vh2-26、Vh2-70、Vh3-7、Vh3-9、Vh3-11、Vh3-13、Vh3-15、Vh3-16、Vh3-20、Vh3-21、Vh3-23、Vh3-30、Vh3-30-3、Vh3-30-5、Vh3-33、Vh3-35、Vh3-38、Vh3-43、Vh3-48、Vh3-49、Vh3-53、Vh3-64、Vh3-66、VH3-72、VH3-73、VH3-74、VH4-4、VH4-28、VH4-30-1、VH4-30-2、VH4-30-4、VH4-31、VH4-34、VH4-39、VH4-59、VH4-61、VH5-51、VH6-1、VH7-4-l、VH7-81及其組合。[0224]在一個實施方式中，所述人源未經重排的重鏈可變區核苷酸序列包含經基因修飾的人源義基因區段，其中所述人源義基因區段的至少一個閱讀框架中的一個或多個內源性非組氨酸密碼子被組氨酸密碼子取代。[0225]在一個實施方式中，所述人源未經重排的重鏈可變區核苷酸序列包含使用組氨酸密碼子取代人源JH區段的至少一個內源性非組氨酸密碼子的取代，其中所述人源JH基因區段選自下組：JH1、JH2、JH3、JH4、JH5、JH6及其組合。[0226]在一個實施方式中，所述取代的組氨酸密碼子存在于編碼⑶R3的一部分的重鏈可變區核苷酸序列中。在一個實施方式中，所述CDR3的一部分包含來源于經基因修飾的人源D基因區段的閱讀框架的氨基酸序列，所述經基因修飾的人源D基因區段含有使用組氨酸密碼子取代在閱讀框架中的至少一個內源性非組氨酸密碼子的修飾。[0227]在一個實施方式中，所述被組氨酸密碼子取代的內源性非組氨酸密碼子編碼選自下組的氨基酸：￥、隊0、〇、5、1和1?。[0228]在一個實施方式中，所述取代的組氨酸密碼子存在于在VEL0C1MMUNE_?人源化免疫球蛋白小鼠中最常見的人源D基因區段的至少一個閱讀框架中。[0229]在一個實施方式中，編碼CDR3的一部分的所述經基因修飾的人源D基因區段的閱讀框架選自疏水性框架、終止框架和親水性框架。[0230]在一個實施方式中，所述閱讀框架是人源D基因區段的疏水性框架。[0231]在一個實施方式中，所述人源D基因區段的疏水性框架包含編碼選自下組的氨基酸序列的核苷酸序列：D1_1(GTTGT;SEQIDN0:88)、D1-7(GITGT;SEQIDN0:89)、D1-20(GITGT;SEQIDN0:89)和D1-26(GIVGAT;SEQIDN0:90)，并且所述人源D基因區段還包含使用組氨酸密碼子取代在所述核苷酸序列中的至少一個內源性非組氨酸密碼子的修飾。[0232]在一個實施方式中，所述人源D基因區段的疏水性框架包含編碼選自下組的氨基酸序列的核苷酸序列：D2-2(DIVVVPAAI;SEQIDN0:92)、D2-8(DIVLMVYAI;SEQIDN0:94)、D2-15(DIVVVVAAT;SEQIDN0:95)和D2-21(HIVVVTAI;SEQIDN0:97)，并且所述人源D基因區段還包含使用組氨酸密碼子取代在所述核苷酸序列中的至少一個內源性非組氨酸密碼子的修飾。[0233]在一個實施方式中，所述人源D基因區段的疏水性框架包含編碼選自下組的氨基酸序列的核苷酸序列：D3-3(ITIFGVVII;SEQIDN0:98)、D3-9(ITIF*LVII;SEQIDN0:99,SEQIDNO:100),D3-10(ITMVRGVII；SEQIDNO:101),D3-16(IMITFGGVIVI；SEQIDN0:102)和D3-22(ITMIVVVIT;SEQIDN0:103)，并且所述人源D基因區段還包含使用組氨酸密碼子取代在所述核苷酸序列中的至少一個內源性密碼子的修飾。[0234]在一個實施方式中，所述人源D基因區段的疏水性框架包含編碼選自下組的氨基酸序列的核苷酸序列：D4-4CTTVT;SEQIDN0:105)、D4-llCTTVT;SEQIDN0:105)、D4-17CTTVT;SEQIDN0:105)、D4-23CTTVVT;SEQID勵：106)，并且所述人源0基因區段還包含使用組氨酸密碼子取代在所述核苷酸序列中的至少一個內源性非組氨酸密碼子的修飾。[0235]在一個實施方式中，所述人源D基因區段的疏水性框架包含編碼選自下組的氨基酸序列的核苷酸序列：D5-5(VDTAMV;SEQIDN0:107)、D5-12(VDIVATI;SEQIDN0:108)、D5-18(VDTAMV;SEQIDN0:107)和D5-24(VEMATI;SEQIDN0:109)，并且所述人源D基因區段還包含使用組氨酸密碼子取代在所述核苷酸序列中的至少一個內源性非組氨酸密碼子的修飾。[0236]在一個實施方式中，所述人源D基因區段的疏水性框架包含編碼選自下組的氨基酸序列的核苷酸序列：D6-6(SIAAR;SEQIDN0:111)、D6-13(GIAAAG;SEQIDN0:113)和D6-19(GIAVAG;SEQID勵:115)，并且所述人源0基因區段還包含使用組氨酸密碼子取代在所述核苷酸序列中的至少一個內源性非組氨酸密碼子的修飾。[0237]在一個實施方式中，所述疏水性框架包含編碼人源D7-27(LTG)的核苷酸序列，并且所述人源D基因區段還包含使用組氨酸密碼子取代在所述核苷酸序列中的至少一個內源性非組氨酸密碼子的修飾。[0238]在一個實施方式中，所述閱讀框架是人源D基因區段的終止閱讀框架。[0239]在一個實施方式中，所述人源D基因區段的終止閱讀框架包含編碼選自下組的氨基酸序列的核苷酸序列：D1_1(VQLER;SEQIDN0:8)、D1-7(V*LEL)、D1-20(V*LER)、D1-26(V*WELL;SEQID勵:12)，并且所述人源0基因區段還包含使用組氨酸密碼子取代在所述核苷酸序列中的至少一個內源性非組氨酸密碼子的修飾。[0240]在一個實施方式中，所述人源D基因區段的終止閱讀框架包含編碼選自下組的氨基酸序列的核苷酸序列：D2-2(RIL#YQLLY;SEQIDN0:14)、D2-8(RILY*WCMLY;SEQID勵：16和5￡〇10勵：17)、02-15〇?11>醫札1^)和02-21(511醫札1^;5￡〇10勵：19)，并且所述人源D基因區段還包含使用組氨酸密碼子取代在所述核苷酸序列中的至少一個內源性非組氨酸密碼子的修飾。[0241]在一個實施方式中，所述人源D基因區段的終止閱讀框架包含編碼選自下組的氨基酸序列的核苷酸序列：D3-3(VLRFLEWLLY;SEQIDN0:21)、D3-9(VLRYFDWLL*;SEQIDN0:23)、D3-10(VLLWFGELL*;SEQIDN0:25)、D3-16(VL*LRLGELSLY;SEQIDN0:27)和D3-22(VLL*#WLLL;SEQIDN0:29)，并且所述人源D基因區段包含使用組氨酸密碼子取代在所述核苷酸序列中的至少一個內源性非組氨酸密碼子的修飾。[0242]在一個實施方式中，所述人源D基因區段的終止閱讀框架包含編碼選自下組的氨基酸序列的核苷酸序列：D4-4(*LQ*L)、D4-11(*LQ*L)、D4-17(*LR*L)和D4-23(*LRW*L)，并且所述人源D基因區段包含使用組氨酸密碼子取代在所述核苷酸序列中的至少一個內源性非組氨酸密碼子的修飾。[0243]在一個實施方式中，所述人源D基因區段的終止閱讀框架包含編碼選自下組的氨基酸序列的核苷酸序列：D5-5(WIQLWL;SEQIDN0:35);D5-12(WI*WLRL;SEQIDN0:37)、D5-18(WIQLWL;SEQIDN0:35)和D5-24(*RWLQL;SEQIDN0:39)，并且所述人源D基因區段包含使用組氨酸密碼子取代在所述核苷酸序列中的至少一個內源性非組氨酸密碼子的修飾。[0244]在一個實施方式中，所述人源D基因區段的終止閱讀框架包含編碼選自下組的氨基酸序列的核苷酸序列：D6-6(V*QLV)、D6-13(V*QQLV;SEQIDN0:41)和D6-19(V*QWLV;SEQIDN0:43)，并且所述人源D基因區段還包含使用組氨酸密碼子取代在所述核苷酸序列中的至少一個內源性非組氨酸密碼子的修飾。[0245]在一個實施方式中，所述人源D基因區段的終止閱讀框架包含編碼D7-27(*LG)的核苷酸序列，并且所述人源D基因區段還包含使用組氨酸密碼子取代在所述核苷酸序列中人源D基因區段的至少一個內源性密碼子的修飾。[0246]在一個實施方式中，所述閱讀框架是人源D基因區段的親水性框架。[0247]在一個實施方式中，所述人源D基因區段的親水性框架包含編碼選自下組的氨基酸序列的核苷酸序列：D1_1(YNWND;SEQIDN0:45)、D1-7(YNWNY;SEQIDN0:47)、D1-20(YNWND;SEQIDN0:45)和D1-26(YSGSYY;SEQIDN0:49)，并且所述人源D基因區段還包含使用組氨酸密碼子取代在所述核苷酸序列中的至少一個內源性密碼子的修飾。在一個實施方式中，所述親水性框架包含編碼選自下組的氨基酸序列的核苷酸序列：SEQID勵：46、5￡〇10勵：48、5￡〇10勵：50及其組合。[0248]在一個實施方式中，所述人源D基因區段的親水性框架包含編碼選自下組的氨基酸序列的核苷酸序列：D2-2(GYCSSTSCYT;SEQIDN0:51)、D2-8(GYCTNGVCYT;SEQIDN0:53)、D2-15(GYCSGGSCYS;SEQIDN0:55)和D2-21(AYCGGDCYS;SEQIDN0:57)，并且所述人源D基因區段還包含使用組氨酸密碼子取代在所述核苷酸序列中的至少一個內源性密碼子的修飾。在一個實施方式中，所述親水性框架包含編碼選自下組的氨基酸序列的核苷酸序列：3￡〇10勵：52、5￡〇10勵：54、5￡〇10勵：56、5￡〇10勵：58及其組合。[0249]在一個實施方式中，所述人源D基因區段的親水性框架包含編碼選自下組的氨基酸序列的核苷酸序列：D3-3(YYDFWSGYYT;SEQIDN0:59)、D3-9(YYDILTGYYN;SEQIDN0:61)、D3-10(YYYGSGSYYN;SEQIDN0:63)、D3-16(YYDYVWGSYRYT;SEQIDN0:65)和D3-22(YYYDSSGYYY;SEQIDN0:67)，并且所述人源D基因區段還包含使用組氨酸密碼子取代在所述核苷酸序列中的至少一個內源性密碼子的修飾。在一個實施方式中，所述親水性框架包含編碼選自下組的氨基酸序列的核苷酸序列：SEQIDN0:60、SEQIDN0:62、SEQIDNO:64、SEQIDNO:66、SEQIDNO:68及其組合。[0250]在一個實施方式中，所述人源D基因區段的親水性框架包含編碼選自下組的氨基酸序列的核苷酸序列：D4-4(DYSNY;SEQIDN0:69)、D4-11(DYSNY;SEQIDN0:69)、D4-17(DYGDY;SEQIDN0:71)和D4-23(DYGGNS;SEQIDN0:73)，并且所述人源D基因區段包含使用組氨酸密碼子取代在所述核苷酸序列中的至少一個內源性密碼子的修飾。在一個實施方式中，所述親水性框架包含編碼選自下組的氨基酸序列的核苷酸序列：SEQIDNO:70、SEQIDNO:72、SEQIDNO:74及其組合。[0251]在一個實施方式中，所述人源D基因區段的親水性框架包含編碼選自下組的氨基酸序列的核苷酸序列：D5-5(GYSYGY;SEQIDN0:75)、D5-12(GYSGYDY;SEQIDN0:77)、D5-18(GYSYGY;SEQIDN0:75)和D5-24(RDGYNY;SEQIDN0:79)，并且所述人源D基因區段還包含使用組氨酸密碼子取代在所述核苷酸序列中的至少一個內源性密碼子的修飾。在一個實施方式中，所述親水性框架包含編碼選自下組的氨基酸序列的核苷酸序列：SEQIDNO:76、SEQIDNO:78、SEQIDNO:80及其組合。[0252]在一個實施方式中，所述人源D基因區段的親水性框架包含編碼選自下組的氨基酸序列的核苷酸序列：D6-6(EYSSSS;SEQIDN0:81)、D6-13(GYSSSWY;SEQIDN0:83)和D6-19(GYSSGWY;SEQIDN0:85)，并且所述人源D基因區段還包含使用組氨酸密碼子取代在所述核苷酸序列中的至少一個內源性密碼子的修飾。在一個實施方式中，所述親水性框架包含編碼選自下組的氨基酸序列的核苷酸序列：SEQIDN0:82、SEQIDN0:84、SEQIDNO:86、SEQIDNO:76及其組合。[0253]在一個實施方式中，所述人源D基因區段的親水性框架包含編碼D7-27(NWG)的核苷酸序列，并且所述人源D基因區段還包含使用組氨酸密碼子取代在所述核苷酸序列中的至少一個內源性密碼子的修飾。[0254]在一個實施方式中，所述人源D基因區段的親水性框架包含編碼選自下組的氨基酸序列的核苷酸序列：SEQIDN0:46、SEQIDN0:48、SEQIDN0:50、SEQIDN0:52、SEQIDN0:54、SEQIDN0:56、SEQIDN0:58、SEQIDN0:60、SEQIDN0:62、SEQIDN0:64、SEQIDN0:66、SEQIDN0:68、SEQIDN0:70、SEQIDN0:72、SEQIDN0:74、SEQIDN0:76、SEQID吣：78、5￡〇10吣:80、5￡〇10吣:82、5￡〇10吣:84、5￡〇10吣:86及其組合。[0255]在一個實施方式中，包含所述反轉的人源D基因區段的所述未經重排的重鏈可變區核苷酸序列與編碼選自IgM、IgD、IgG、IgE和IgA的免疫球蛋白同種型的人源或非人源重鏈恒定區核苷酸序列可操作地連接。[0256]在一個實施方式中，所述人源未經重排的免疫球蛋白重鏈可變區核苷酸序列與選自下組的人源或非人源重鏈恒定區核苷酸序列可操作地連接：Ch1、鉸鏈、CH2、CH3及其組合。在一個實施方式中，所述重鏈恒定區核苷酸序列包含CH1、鉸鏈、CH2和CH3(即CH1-鉸鏈-CH2-CH3)。[0257]在一個實施方式中，重鏈恒定區核苷酸序列存在于內源性基因座（例如所述核苷酸序列位于野生型非人動物中）或存在于異位（即在與其基因組的內源性免疫球蛋白鏈基因座不同的基因座中，或在其內源性基因座中，例如在免疫球蛋白可變基因座中，其中所述內源性基因座位于或移至基因組中的不同位置）。[0258]在一個實施方式中，所述重鏈恒定區核苷酸序列包含在CH2或CH3中的修飾，其中所述修飾在酸性環境中（例如在pH范圍是約5.5至約6.0的核內體中）增加所述重鏈恒定區氨基酸序列對FcRn的親和性。[0259]在一個實施方式中，所述重鏈恒定區核苷酸序列編碼人源重鏈恒定區氨基酸序列，所述人源重鏈恒定區氨基酸序列包含在位置250的修飾（例如E或Q);在250和428的修飾（例如L或F);在252的修飾（例如L/Y/F/W或T)、在254的修飾（例如S或T)和在256的修飾（例如S/R/Q/E/D或T);或在位置428和/或433的修飾（例如L/R/S/P/Q或K)和/或在434的修飾（例如H/F或Y);或在位置250和/或428的修飾；或在位置307或308的修飾（例如308F、V308F)和434的修飾。在一個實施方式中，所述修飾包含428L(例如M428L)和434S(例如N434S)修飾；428L、259I(例如V259I)和308F(例如V308F)修飾；433K(例如H433K)和434(例如434Y)修飾；252、254和256(例如252Y、254T和256E)修飾；250Q和428L修飾（例如T250Q和M428L);以及307和/或308修飾（例如308F或308P)，其中所述修飾在酸性環境中（例如在pH范圍是約5.5至約6.0的核內體中）增加所述重鏈恒定區氨基酸序列對FcRn的親和性。[0260]在一個實施方式中，所述重鏈恒定區核苷酸序列編碼人源CH2氨基酸序列，所述人源CH2氨基酸序列包含在位置252和257的氨基酸殘基之間的至少一個修飾，其中所述修飾在酸性環境中（例如在pH范圍是約5.5至約6.0的核內體中）增加所述人源CH2氨基酸序列對FcRn的親和性。[0261]在一個實施方式中，所述重鏈恒定區核苷酸序列編碼人源CH2氨基酸序列，所述人源CH2氨基酸序列包含在位置307和311的氨基酸殘基之間的至少一個修飾，其中所述修飾在酸性環境中（例如在pH范圍是約5.5至約6.0的核內體中）增加所述CH2氨基酸序列對FcRn的親和性。[0262]在一個實施方式中，所述重鏈恒定區核苷酸序列編碼人源CH3氨基酸序列，所述人源CH3氨基酸序列包含在位置433和436的氨基酸殘基之間的至少一個修飾，其中所述修飾在酸性環境中（例如在pH范圍是約5.5至約6.0的核內體中）增加所述CH3氨基酸序列對FcRn的親和性。[0263]在一個實施方式中，所述重鏈恒定區核苷酸序列編碼人源重鏈恒定區氨基酸序列，所述氨基酸序列包含選自下組的突變：M428L、N434S及其組合。[0264]在一個實施方式中，所述重鏈恒定區核苷酸序列編碼人源重鏈恒定區氨基酸序列，所述人源重鏈恒定區氨基酸序列包含選自下組的突變：M428L、V259I、V308F及其組合。[0265]在一個實施方式中，所述重鏈恒定區核苷酸序列編碼人源重鏈恒定區氨基酸序列，所述人源重鏈恒定區氨基酸序列包含N434A突變。[0266]在一個實施方式中，所述重鏈恒定區核苷酸序列編碼人源重鏈恒定區氨基酸序列，所述人源重鏈恒定區氨基酸序列包含選自下組的突變：M252Y、S254T、T256E及其組合。[0267]在一個實施方式中，所述重鏈恒定區核苷酸序列編碼人源重鏈恒定區氨基酸序列，所述人源重鏈恒定區氨基酸序列包含選自下組的突變：T250Q、M248L或這兩者。[0268]在一個實施方式中，所述重鏈恒定區核苷酸序列編碼人源重鏈恒定區氨基酸序列，所述人源重鏈恒定區氨基酸序列包含選自下組的突變：H433K、N434Y或這兩者。[0269]在一個實施方式中，所述經基因修飾的免疫球蛋白基因座包含：（1)第一等位基因，其中如本申請所述的未經重排的人源免疫球蛋白重鏈可變區核苷酸序列與第一重鏈恒定區核苷酸序列可操作地連接，所述第一重鏈恒定區核苷酸序列編碼選自IgGl、IgG2、IgG4及其組合的人源IgG的第一CH3氨基酸序列；和（2)第二等位基因，其中如本申請所述的未經重排的人源免疫球蛋白重鏈可變區核苷酸序列與第二重鏈恒定區核苷酸序列可操作地連接，所述第二重鏈恒定區核苷酸序列編碼選自IgGl、IgG2、IgG4及其組合的人源IgG的第二CH3氨基酸序列，并且其中所述第二CH3氨基酸序列包含使所述第二CH3氨基酸序列與蛋白A的結合降低或消除的修飾（參見例如US2010/0331527A1，其通過引用整體并入本申請）。[0270]在一個實施方式中，所述第二CH3氨基酸序列包含H95R修飾（根據MGT外顯子編號；根據EU編號為H435R)。在一個實施方式中，所述第二CH3氨基酸序列還包含Y96F修飾(根據頂GT外顯子編號；根據EU編號為H436F)。在另一個實施方式中，所述第二CH3氨基酸序列包含！195R修飾（根據MGT外顯子編號；根據EU編號為H435R)和Y96F修飾（根據MGT外顯子編號；根據EU編號為H436F)這兩者。[0271]在一個實施方式中，所述第二CH3氨基酸序列來自經修飾的人源IgGl并且還包含選自下組的突變：D16E、L18M、N44S、K52N、V57M和V82I(根據MGT編號；根據EU編號為D356E、L38M、N384S、K392N、V397M和V422I)。[0272]在一個實施方式中，所述第二CH3氨基酸序列來自經修飾的人源IgG2并且還包含選自下組的突變：N44S、K52N和V82I(根據MGT編號；根據EU編號為N384S、K392N和V422I)。[0273]在一個實施方式中，所述第二CH3氨基酸序列來自經修飾的人源IgG4并且還包含選自下組的突變：0151?、財43、1(52隊￥57]\1、1?691(、￡790和￥821(根據頂61'編號；根據￡。編號為Q355R、N384S、K392N、V397M、R409K、E419Q和V422I)。[0274]在一個實施方式中，所述重鏈恒定區氨基酸序列是非人源恒定區氨基酸序列，并且所述重鏈恒定區氨基酸序列包含上文所述任意類型的修飾中的一種或多種。[0275]在一個實施方式中，所述重鏈恒定區核苷酸序列是人源重鏈恒定區氨基酸序列，并且所述人源重鏈恒定區氨基酸序列包含上文所述任意類型的修飾中的一種或多種。[0276]在一個實施方式中，全部或基本上全部的內源性VH、0和義基因區段從免疫球蛋白重鏈基因座中缺失或者使其不具有功能（例如通過在免疫球蛋白基因座中插入核苷酸序列（例如外源性核苷酸序列）或者通過使內源性VH、D、JHg段進行不具有功能的重排或反轉）。在一個實施方式中，例如，約80%或更多的、約85%或更多的、約90%或更多的、約95%或更多的、約96%或更多的、約97%或更多的、約98%或更多的或者約99%或更多的全部的內源性VH、D或JH基因區段被缺失或使其不具有功能。在一個實施方式中，例如，至少95%、96%、97%、98%或99%的內源性具有功能的V、D或J基因區段被缺失或使其不具有功能。[0277]在一個實施方式中，所述經基因修飾的基因座包含使全部或基本上全部的內源性%、0和義基因區段缺失或使其不具有功能的修飾；并且所述基因組基因座包含經基因修飾的、未經重排的人源重鏈可變區核苷酸序列，所述核苷酸序列包含在至少一個閱讀框架中使用組氨酸密碼子取代至少一個內源性非組氨酸密碼子。在一個實施方式中，所述經基因修飾的、未經重排的免疫球蛋白重鏈可變基因序列存在于內源性位置（即所述核苷酸序列位于野生型非人動物中）或存在于異位（即在與其基因組的內源性免疫球蛋白鏈基因座不同的基因座中），或在其內源性基因座中，例如在免疫球蛋白可變基因座中，其中所述內源性基因座位于或移至基因組中的不同位置。[0278]在一個實施方式中，所述經基因修飾的基因座包含內源性Adam6a基因、Adam6b基因或者這兩者，并且所述基因修飾不會影響所述內源性Adam6a基因、Adam6b基因或者這兩者的表達和/或功能。[0279]在一個實施方式中，所述經基因修飾的基因座包含異位存在的Adam6a基因、Adam6b基因或者這兩者。在一個實施方式中，所述Adam6a基因是非人源Adam6a基因。在一個實施方式中，所述Adam6a基因是小鼠Adam6a基因。在一個實施方式中，所述Adam6a基因是人源Adam6a基因。在一個實施方式中，所述Adam6b基因是非人源Adam6b基因。在一個實施方式中，所述Adam6b基因是小鼠Adam6b基因。在一個實施方式中，所述Adam6b基因是人源Adam6b基因。[0280]在一個實施方式中，所述經基因修飾的免疫球蛋白基因座還包含人源化的、未經重排的A和/或K輕鏈可變基因序列。在一個實施方式中，所述人源化的、未經重排的X和/或K輕鏈可變基因序列與免疫球蛋白輕鏈恒定區核苷酸序列可操作地連接，所述輕鏈恒定區核苷酸序列選自A輕鏈恒定區核苷酸序列和K輕鏈恒定區核苷酸序列。在一個實施方式中，所述人源化的、未經重排的A輕鏈可變區核苷酸序列與A輕鏈恒定區核苷酸序列可操作地連接。在一個實施方式中，所述A輕鏈恒定區核苷酸序列是小鼠、大鼠或人源序列。在一個實施方式中，所述人源化的、未經重排的K輕鏈可變區核苷酸序列與K輕鏈恒定區核苷酸序列可操作地連接。在一個實施方式中，所述K輕鏈恒定區核苷酸序列是小鼠、大鼠或人源序列。[0281]在一個實施方式中，所述經基因修飾的免疫球蛋白基因座包含未經重排的輕鏈可變基因序列，所述未經重排的輕鏈可變基因序列含有在編碼輕鏈可變結構域的至少一個閱讀框架中引入至少一個組氨酸密碼子的至少一個修飾。在一個實施方式中，所述經基因修飾的免疫球蛋白基因座包含重排的序列（例如重排的A或！CV/J序列），所述序列在輕鏈⑶R中含有1個、2個、3個或4個組氨酸密碼子。在一個實施方式中，所述⑶R選自⑶R1、CDR2、CDR3及其組合。在一個實施方式中，所述未經重排的或重排的輕鏈可變區核苷酸序列是未經重排的或重排的人源A或K輕鏈可變區核苷酸序列。在一個實施方式中，所述未經重排的或重排的人源A或k輕鏈可變區核苷酸序列存在于內源性小鼠免疫球蛋白輕鏈基因座。在一個實施方式中，所述小鼠免疫球蛋白輕鏈基因座是小鼠k基因座。在一個實施方式中，所述小鼠免疫球蛋白輕鏈基因座是小鼠A基因座。[0282]在一個實施方式中，如本申請所述的經基因修飾的免疫球蛋白基因座存在于小鼠的免疫球蛋白重鏈基因座中。在一個實施方式中，所述經基因修飾的免疫球蛋白基因座存在于VELOCIMMUNE?小鼠中的人源化的免疫球蛋白重鏈基因座中。[0283]在一個實施方式中，由如本申請所述的經基因修飾的免疫球蛋白重鏈基因座表達的、含有重鏈可變結構域的抗原結合蛋白與不含所述的基因修飾的相應野生型重鏈可變結構域相比，在酸性環境中（例如在約5.5至約6.0的pH下）顯示出更弱的抗原結合。[0284]在一個實施方式中，由如本申請所述的經基因修飾的免疫球蛋白重鏈基因座表達的、含有重鏈可變結構域的抗原結合蛋白在25°C在酸性pH下（例如pH約5.5至約6.0)具有的解離半衰期（t1/2)少于2min。在一個實施方式中，由如本申請所述的經基因修飾的免疫球蛋白重鏈基因座表達的、含有重鏈可變結構域的抗原結合蛋白在37°C在酸性pH下（例如pH約5.5至約6.0)具有的解離半衰期（t1/2)少于2min。在一個實施方式中，由如本申請所述的經基因修飾的免疫球蛋白重鏈基因座表達的、含有重鏈可變結構域的抗原結合蛋白在25°C在酸性pH下（例如pH約5.5至約6.0)具有的解離半衰期（t1/2)少于lmin。在一個實施方式中，由如本申請所述的經基因修飾的免疫球蛋白重鏈基因座表達的、含有重鏈可變結構域的抗原結合蛋白在37°C在酸性pH下（例如pH約5.5至約6.0)具有的解離半衰期（t1/2)少于lmin。在一個實施方式中，由如本申請所述的經基因修飾的免疫球蛋白基因座表達的、含有重鏈可變結構域的抗原結合蛋白在酸性pH下（例如pH約5.5至約6.0)的解離半衰期（t1/2)比所述抗原結合蛋白在中性pH下（例如pH約7.0至約7.4)的解離半衰期（t1/2)降低至少約2倍、至少約3倍、至少約4倍、至少約5倍、至少約10倍、至少約15倍、至少約20倍、至少約25倍或至少約30倍。[0285]在一個實施方式中，由如本申請所述的經基因修飾的免疫球蛋白基因座表達的、含有重鏈可變結構域的抗原結合蛋白與不含所述的基因修飾的野生型抗原結合蛋白相比，具有的特征為pH依賴的再循環性的提高、血清半衰期的增加或兩者兼而有之。[0286]在一個實施方式中，如本申請所述的經基因修飾的免疫球蛋白基因座包含B細胞群，所述B細胞群經目標抗原刺激后能夠產生抗原結合蛋白例如抗體，所述抗原結合蛋白包含含有一個或多個組氨酸殘基的重鏈可變結構域。如本申請所述的抗原結合蛋白當給予對象時，與相應的野生型抗原結合蛋白相比顯示出增加的血清半衰期，所述野生型抗原結合蛋白具有相似的或足夠相似的編碼重鏈可變結構域的氨基酸序列，但是在所述重鏈可變結構域中不包含組氨酸殘基。在一些實施方式中，本申請所述的抗原結合蛋白顯示出的增加的血清半衰期，與相應的野生型抗原結合蛋白相比高至少約2倍、至少約5倍、至少約10倍、至少約15倍、至少約20倍，所述野生型抗原結合蛋白具有相似的或足夠相似的編碼重鏈可變結構域的氨基酸序列，但是在所述重鏈可變結構域中不包含組氨酸殘基。[0287]在一個實施方式中，所述非人動物是針對經基因修飾的免疫球蛋白重鏈基因座的雜合子，并且所述非人動物能夠表達人源免疫球蛋白重鏈可變結構域，所述人源免疫球蛋白重鏈可變結構域包含主要來源于如本申請所述的經基因修飾的免疫球蛋白重鏈基因座的至少一個組氨酸殘基。[0288]在一個方面，本申請提供了包含經基因修飾的免疫球蛋白基因座的非人動物，所述經基因修飾的免疫球蛋白基因座包含人源VH、D和JH基因區段，其中至少一個所述人源D基因區段相對于相應的野生型序列從5'至3'反轉，并且其中所述反轉的人源D基因區段的至少一個閱讀框架包含組氨酸密碼子。[0289]在一個實施方式中，所述非人動物是哺乳動物，包含嚙齒動物，例如小鼠、大鼠或倉鼠。[0290]在一個實施方式中，所述經基因修飾的免疫球蛋白基因座存在于種系基因組中。[0291]在一個實施方式中，其中所述反轉的人源D基因區段的閱讀框架包含1個或更多個、2個或更多個、3個或更多個、4個或更多個、5個或更多個、6個或更多個、7個或更多個、8個或更多個、9個或更多個、10個或更多個、11個或更多個、12個或更多個、13個或更多個、14個或更多個、15個或更多個、16個或更多個、17個或更多個、18個或更多個、19個或更多個、20個或更多個、21個或更多個、22個或更多個、23個或更多個、24個或更多個、25個或更多個、26個或更多個、27個或更多個、28個或更多個、29個或更多個、30個或更多個、31個或更多個、32個或更多個、33個或更多個或者34個或更多個組氨酸密碼子。[0292]在一個實施方式中，至少兩個、至少3個、至少4個、至少5個、至少6個、至少7個、至少8個、至少9個、至少10個、至少11個、至少12個、至少13個、至少14個、至少15個、至少16個、至少17個、至少18個、至少19個、至少20個、至少21個、至少22個、至少23個、至少24個或者全部或基本上全部的具有功能的人源D基因區段相對于對應的野生型序列是反向的。[0293]在一個實施方式中，全部或基本上全部的內源性免疫球蛋白VH、D、JH基因區段從所述免疫球蛋白重鏈基因座中缺失或使其不具有功能（例如通過在所述免疫球蛋白基因座插入核苷酸序列例如外源性核苷酸序列，或通過使全部或基本上全部的內源性免疫球蛋白VH、D、JH區段產生不具有功能的重排或反轉），并且所述經基因修飾的免疫球蛋白基因座包含人源VH、D和JH基因區段，其中至少一個所述人源D基因區段以相對于對應野生型序列相反的方向存在，并且其中在反轉的人源D基因區段中的至少一個閱讀框架包含至少一個組氨酸密碼子。[0294]在一個實施方式中，所述反轉的人源D基因區段與人源VH基因區段和/或人源JH基因區段可操作地連接。[0295]在一個實施方式中，所述人源D基因區段以相對于選自下組的相應的野生型序列相反的方向存在：Dl-1、Dl-7、Dl-20、Dl-26、D2-2、D2-8、D2-15、D2-21、D3-3、D3-9、D3-10、D3-16、D3-22、D4-4、D4-11、D4-17、D4-23、D5-5、D5-12、D5-18、D5-24、D6-6、D6-13、D6-19、D7-27及其組合。[0296]在一個實施方式中，以相對于相應的野生型序列相反的方向存在的所述人源D基因區段是選自下組的D1基因區段：01-1、01-7、01-20、01-26及其組合。[0297]在一個實施方式中，以相對于相應的野生型序列相反的方向存在的所述人源D基因區段是選自下組的D2基因區段：D2-2、D2-8、D2-15、D2-21及其組合。[0298]在一個實施方式中，以相對于相應的野生型序列相反的方向存在的所述人源D基因區段是選自下組的D3基因區段：D3-3、D3-9、D3-10、D3-16、D3-22及其組合。[0299]在一個實施方式中，以相對于相應的野生型序列相反的方向存在的所述人源D基因區段是選自下組的D4基因區段：D4-4、D4-11、D4-17、D4-23及其組合。[0300]在一個實施方式中，以相對于相應的野生型序列相反的方向存在的所述人源D基因區段是選自下組的D5基因區段：D5-5、D5-12、D5-18、D5-24及其組合。[0301]在一個實施方式中，以相對于相應的野生型序列相反的方向存在的所述人源D基因區段是選自下組的D6基因區段：D6-6、D6-13、D6-19及其組合。[0302]在一個實施方式中，以相對于相應的野生型序列相反的方向存在的所述人源D基因區段是D7-27。[0303]在一個實施方式中，所述人源D基因區段的閱讀框架選自終止閱讀框架、親水性閱讀框架、疏水性閱讀框架及其組合，其中所述反轉的人源D基因區段的至少一個閱讀框架包含組氨酸密碼子。[0304]在一個實施方式中，包含所述反轉的人源D基因區段的所述未經重排的重鏈可變區核苷酸序列與編碼選自IgM、IgD、IgG、IgE和IgA的免疫球蛋白同種型的人源或非人源重鏈恒定區核苷酸序列可操作地連接。[0305]在一個實施方式中，所述人源未經重排的免疫球蛋白重鏈可變區核苷酸序列與選自下組的人源或非人源重鏈恒定區核苷酸序列可操作地連接：Ch1、鉸鏈、CH2、CH3及其組合。在一個實施方式中，所述重鏈恒定區核苷酸序列包含CH1、鉸鏈、CH2和CH3(即CH1-鉸鏈-CH2-CH3)。[0306]在一個實施方式中，重鏈恒定區核苷酸序列存在于內源性基因座（例如所述核苷酸序列位于野生型非人動物中）或存在于異位（即在與其基因組的內源性免疫球蛋白鏈基因座不同的基因座，或在其內源性基因座中，例如在免疫球蛋白可變基因座中，其中所述內源性基因座位于或移至基因組中的不同位置）。[0307]在一個實施方式中，所述重鏈恒定區核苷酸序列包含在CH2或CH3中的修飾，其中所述修飾在酸性環境中（例如在pH范圍是約5.5至約6.0的核內體中）增加所述重鏈恒定區氨基酸序列對FcRn的親和性。[0308]在一個實施方式中，所述重鏈恒定區核苷酸序列編碼人源重鏈恒定區氨基酸序列，所述人源重鏈恒定區氨基酸序列包含在位置250的修飾（例如E或Q);在250和428(例如L或F);在252的修飾（例如L/Y/F/W或T)、在254的修飾（例如S或T)和在256的修飾(例如S/R/Q/E/D或T);或在位置428和/或433的修飾（例如L/R/S/P/Q或K)和/或在434的修飾（例如H/F或Y);或在位置250和/或428的修飾；或在位置307或308的修飾(例如308F、V308F)和434的修飾。在一個實施方式中，所述修飾包含428L(例如M428L)和434S(例如N434S)修飾；428L、259I(例如V259I)和308F(例如V308F)修飾；433K(例如H433K)和434(例如434Y)修飾；252、254和256(例如252Y、254T和256E)修飾；250Q和428L修飾（例如T250Q和M428L);以及307和/或308修飾（例如308F或308P)，其中所述修飾在酸性環境中（例如在pH范圍是約5.5至約6.0的核內體中）增加所述重鏈恒定區氨基酸序列對FcRn的親和性。[0309]在一個實施方式中，所述重鏈恒定區核苷酸序列編碼人源CH2氨基酸序列，所述氨基酸序列包含在位置252和257的氨基酸殘基之間的至少一個修飾，其中所述修飾在酸性環境中（例如在pH范圍是約5.5至約6.0的核內體中）增加所述人源Ch2氨基酸序列對FcRn的親和性。[0310]在一個實施方式中，所述重鏈恒定區核苷酸序列編碼人源CH2氨基酸序列，所述氨基酸序列包含在位置307和311的氨基酸殘基之間的至少一個修飾，其中所述修飾在酸性環境中（例如在pH范圍是約5.5至約6.0的核內體中）增加所述Ch2氨基酸序列對FcRn的親和性。[0311]在一個實施方式中，所述重鏈恒定區核苷酸序列編碼人源CH3氨基酸序列，其中所述CH3氨基酸序列包含在位置433和436的氨基酸殘基之間的至少一個修飾，其中所述修飾在酸性環境中（例如在pH范圍是約5.5至約6.0的核內體中）增加所述CH3氨基酸序列對FcRn的親和性。[0312]在一個實施方式中，所述重鏈恒定區核苷酸序列編碼人源重鏈恒定區氨基酸序列，所述氨基酸序列包含選自下組的突變：M428L、N434S及其組合。[0313]在一個實施方式中，所述重鏈恒定區核苷酸序列編碼人源重鏈恒定區氨基酸序列，所述氨基酸序列包含選自下組的突變：M428L、V259I、V308F及其組合。[0314]在一個實施方式中，所述重鏈恒定區核苷酸序列編碼人源重鏈恒定區氨基酸序列，所述氨基酸序列包含N434A突變。[0315]在一個實施方式中，所述重鏈恒定區核苷酸序列編碼人源重鏈恒定區氨基酸序列，所述氨基酸序列包含選自下組的突變：M252Y、S254T、T256E及其組合。[0316]在一個實施方式中，所述重鏈恒定區核苷酸序列編碼人源重鏈恒定區氨基酸序列，所述氨基酸序列包含選自下組的突變：T250Q、M248L或這兩者。[0317]在一個實施方式中，所述重鏈恒定區核苷酸序列編碼人源重鏈恒定區氨基酸序列，所述氨基酸序列包含選自下組的突變：H433K、N434Y或這兩者。[0318]在一個實施方式中，所述經基因修飾的免疫球蛋白基因座包含：（1)第一等位基因，其中如本申請所述的未經重排的人源免疫球蛋白重鏈可變區核苷酸序列與第一重鏈恒定區核苷酸序列可操作地連接，所述第一重鏈恒定區核苷酸序列編碼選自IgGl、IgG2、IgG4及其組合的人源IgG的第一CH3氨基酸序列；和（2)第二等位基因，其中如本申請所述的未經重排的人源免疫球蛋白重鏈可變區核苷酸序列與第二重鏈恒定區核苷酸序列可操作地連接，所述第二重鏈恒定區核苷酸序列編碼選自IgGl、IgG2、IgG4及其組合的人源IgG的第二CH3氨基酸序列，并且其中所述第二CH3氨基酸序列包含使所述第二CH3氨基酸序列與蛋白A的結合降低或消除的修飾（參見例如US2010/0331527A1，其通過引用整體并入本申請）。[0319]在一個實施方式中，所述第二CH3氨基酸序列包含H95R修飾（根據MGT外顯子編號；根據EU編號為H435R)。在一個實施方式中，所述第二CH3氨基酸序列還包含Y96F修飾(根據頂GT外顯子編號；根據EU編號為H436F)。在另一個實施方式中，所述第二CH3氨基酸序列包含！195R修飾（根據MGT外顯子編號；根據EU編號為H435R)和Y96F修飾（根據MGT外顯子編號；根據EU編號為H436F)這兩者。[0320]在一個實施方式中，所述第二CH3氨基酸序列來自經修飾的人源IgGl并且還包含選自下組的突變：D16E、L18M、N44S、K52N、V57M和V82I(根據MGT編號；根據EU編號為D356E、L38M、N384S、K392N、V397M和V422I)。[0321]在一個實施方式中，所述第二CH3氨基酸序列來自經修飾的人源IgG2并且還包含選自下組的突變：N44S、K52N和V82I(根據MGT編號；根據EU編號為N384S、K392N和V422I)。[0322]在一個實施方式中，所述第二CH3氨基酸序列來自經修飾的人源IgG4并且還包含選自下組的突變：0151?、財43、1(52隊￥57]\1、1?691(、￡790和￥821(根據頂61'編號；根據￡。編號為Q355R、N384S、K392N、V397M、R409K、E419Q和V422I)。[0323]在一個實施方式中，所述重鏈恒定區氨基酸序列是非人源恒定區氨基酸序列，并且所述重鏈恒定區氨基酸序列包含上文所述任意類型的修飾中的一種或多種。[0324]在一個實施方式中，所述重鏈恒定區核苷酸序列是人源重鏈恒定區氨基酸序列，并且所述人源重鏈恒定區氨基酸序列包含上文所述任意類型的修飾中的一種或多種。[0325]在一個實施方式中，全部或基本上全部的內源性VH、0和義基因區段從免疫球蛋白重鏈基因座中缺失或者使其不具有功能（例如通過在免疫球蛋白基因座中插入核苷酸序列（例如外源性核苷酸序列）或者通過使內源性VH、D、JHg段進行不具有功能的重排或反轉）。在一個實施方式中，例如，約80%或更多的、約85%或更多的、約90%或更多的、約95%或更多的、約96%或更多的、約97%或更多的、約98%或更多的或者約99%或更多的全部的內源性VH、D或JH基因區段被缺失或使其不具有功能。在一個實施方式中，例如，至少95%、96%、97%、98%或99%的內源性具有功能的V、D或J基因區段被缺失或使其不具有功能。[0326]在一個實施方式中，所述經基因修飾的免疫球蛋白重鏈基因座包含使全部或基本上全部的內源性VH、D和JH基因區段缺失或使其不具有功能的修飾；并且所述經基因修飾的基因座包含未經重排的重鏈可變區核苷酸序列，所述核苷酸序列含有如本申請所述的至少一個反轉的人源D基因區段，其中所述未經重排的重鏈可變區核苷酸序列存在于內源性位置（即所述核苷酸序列位于野生型非人動物中）或存在于異位（即在與其基因組的內源性免疫球蛋白鏈基因座不同的基因座，或在其內源性基因座中，例如在免疫球蛋白可變基因座中，其中所述內源性基因座位于或移至基因組中的不同位置）。[0327]在一個實施方式中，所述經基因修飾的免疫球蛋白基因座包含內源性Adam6a基因、Adam6b基因或者這兩者，并且所述基因修飾不會影響所述內源性Adam6a基因、Adam6b基因或者這兩者的表達和/或功能。[0328]在一個實施方式中，所述經基因修飾的免疫球蛋白基因座包含異位存在的Adam6a基因、Adam6b基因或者這兩者。在一個實施方式中，所述Adam6a基因是非人源Adam6a基因。在一個實施方式中，所述Adam6a基因是小鼠Adam6a基因。在一個實施方式中，所述Adam6a基因是人源Adam6a基因。在一個實施方式中，所述Adam6b基因是非人源Adam6b基因。在一個實施方式中，所述Adam6b基因是小鼠Adam6b基因。在一個實施方式中，所述Adam6b基因是人源Adam6b基因。[0329]在一個實施方式中，所述經基因修飾的免疫球蛋白基因座還包含人源化的、未經重排的A和/或K輕鏈可變基因序列。在一個實施方式中，所述人源化的、未經重排的X和/或K輕鏈可變基因序列與免疫球蛋白輕鏈恒定區核苷酸序列可操作地連接，所述輕鏈恒定區核苷酸序列選自A輕鏈恒定區核苷酸序列和K輕鏈恒定區核苷酸序列。在一個實施方式中，所述人源化的、未經重排的A輕鏈可變區核苷酸序列與A輕鏈恒定區核苷酸序列可操作地連接。在一個實施方式中，所述A輕鏈恒定區核苷酸序列是小鼠、大鼠或人源序列。在一個實施方式中，所述人源化的、未經重排的K輕鏈可變區核苷酸序列與K輕鏈恒定區核苷酸序列可操作地連接。在一個實施方式中，所述K輕鏈恒定區核苷酸序列是小鼠、大鼠或人源序列。[0330]在一個實施方式中，所述經基因修飾的免疫球蛋白基因座包含未經重排的輕鏈可變基因序列，所述未經重排的輕鏈可變基因序列含有在編碼輕鏈可變結構域的至少一個閱讀框架中引入至少一個組氨酸密碼子的至少一個修飾。在一個實施方式中，所述經基因修飾的免疫球蛋白基因座包含重排的序列（例如重排的A或！CV/J序列），所述序列在輕鏈⑶R中含有1個、2個、3個或4個組氨酸密碼子。在一個實施方式中，所述⑶R選自⑶R1、CDR2、CDR3及其組合。在一個實施方式中，所述未經重排的或重排的輕鏈可變區核苷酸序列是未經重排的或重排的人源A或K輕鏈可變區核苷酸序列。在一個實施方式中，所述未經重排的或重排的人源A或k輕鏈可變區核苷酸序列存在于內源性小鼠免疫球蛋白輕鏈基因座。在一個實施方式中，所述小鼠免疫球蛋白輕鏈基因座是小鼠k基因座。在一個實施方式中，所述小鼠免疫球蛋白輕鏈基因座是小鼠A基因座。[0331]在一個實施方式中，如本申請所述的經基因修飾的免疫球蛋白基因座存在于小鼠的免疫球蛋白重鏈基因座中。在一個實施方式中，所述經基因修飾的免疫球蛋白基因座存在于VELOC丨MMUNE?小鼠中的人源化的免疫球蛋白重鏈基因座中。[0332]在一個實施方式中，所述非人源動物是針對經基因修飾的免疫球蛋白重鏈基因座的雜合子，并且所述非人動物能夠表達人源免疫球蛋白重鏈可變結構域，所述人源免疫球蛋白重鏈可變結構域包含主要來源于如本申請所述的經基因修飾的免疫球蛋白重鏈基因座的至少一個組氨酸殘基。[0333]在一個實施方式中，由如本申請所述的經基因修飾的免疫球蛋白重鏈基因座表達的、含有重鏈可變結構域的抗原結合蛋白與不含所述的基因修飾的相應野生型重鏈可變結構域相比，在酸性環境中（例如在約5.5至約6.0的pH下）顯示出更弱的抗原結合。[0334]在一個實施方式中，由如本申請所述的經基因修飾的免疫球蛋白重鏈基因座表達的、含有重鏈可變結構域的抗原結合蛋白在25°C在酸性pH下（例如pH約5.5至約6.0)具有的解離半衰期（t1/2)少于2min。在一個實施方式中，由如本申請所述的經基因修飾的免疫球蛋白重鏈基因座表達的、含有重鏈可變結構域的抗原結合蛋白在37°C在酸性pH下（例如pH約5.5至約6.0)具有的解離半衰期（t1/2)少于2min。在一個實施方式中，由如本申請所述的經基因修飾的免疫球蛋白重鏈基因座表達的、含有重鏈可變結構域的抗原結合蛋白在25°C在酸性pH下（例如pH約5.5至約6.0)具有的解離半衰期（t1/2)少于lmin。在一個實施方式中，由如本申請所述的經基因修飾的免疫球蛋白重鏈基因座表達的、含有重鏈可變結構域的抗原結合蛋白在37°C在酸性pH下（例如pH約5.5至約6.0)具有的解離半衰期（t1/2)少于lmin。在一個實施方式中，由如本申請所述的經基因修飾的免疫球蛋白基因座表達的、含有重鏈可變結構域的抗原結合蛋白在酸性pH下（例如pH約5.5至約6.0)的解離半衰期（t1/2)比所述抗原結合蛋白在中性pH下（例如pH約7.0至約7.4)的解離半衰期（t1/2)降低至少約2倍、至少約3倍、至少約4倍、至少約5倍、至少約10倍、至少約15倍、至少約20倍、至少約25倍或至少約30倍。[0335]在一個實施方式中，由如本申請所述的經基因修飾的免疫球蛋白基因座表達的、含有重鏈可變結構域的抗原結合蛋白與不含所述基因修飾的野生型抗原結合蛋白相比，具有的特征為pH依賴的再循環性的提高、血清半衰期的增加或兩者兼而有之。[0336]在一個實施方式中，本申請所述的經基因修飾的免疫球蛋白基因座包含B細胞群，所述B細胞群經目標抗原刺激后能夠產生抗原結合蛋白例如抗體，所述抗原結合蛋白包含含有一個或多個組氨酸殘基的重鏈可變結構域。如本申請所述的抗原結合蛋白當給予對象時，與相應的野生型抗原結合蛋白相比顯示出增加的血清半衰期，所述野生型抗原結合蛋白具有相似的或足夠相似的編碼重鏈可變結構域的氨基酸序列，但是在所述重鏈可變結構域中不包含組氨酸殘基。在一些實施方式中，本申請所述的抗原結合蛋白顯示出的增加的血清半衰期，與相應的野生型抗原結合蛋白相比高至少約2倍、至少約5倍、至少約10倍、至少約15倍、至少約20倍，所述野生型抗原結合蛋白具有相似的或足夠相似的編碼重鏈可變結構域的氨基酸序列，但是在所述重鏈可變結構域中不包含組氨酸殘基。[0337]在一個方面，本申請提供了非人動物，所述非人動物能夠表達具有增強的pH依賴的再循環性和/或增加的血清半衰期的抗原結合蛋白，其中所述非人動物在其種系基因組中包含未經重排的人源免疫球蛋白重鏈可變區核苷酸序列，其中所述未經重排的重鏈可變區核苷酸序列包含如本申請所述的加入至少一個組氨酸密碼子或使用組氨酸密碼子取代至少一個內源性非組氨酸密碼子。[0338]在一個實施方式中，由如本申請所述的經基因修飾的免疫球蛋白重鏈基因座表達的、含有重鏈可變結構域的抗原結合蛋白與不含所述的基因修飾的相應野生型重鏈可變結構域相比，在酸性環境中（例如在約5.5至約6.0的pH下）顯示出更弱的抗原結合。[0339]在一個實施方式中，由如本申請所述的經基因修飾的免疫球蛋白重鏈基因座表達的、含有重鏈可變結構域的抗原結合蛋白在25°C在酸性pH下（例如pH約5.5至約6.0)具有的解離半衰期（t1/2)少于2min。在一個實施方式中，由如本申請所述的經基因修飾的免疫球蛋白重鏈基因座表達的、含有重鏈可變結構域的抗原結合蛋白在37°C在酸性pH下（例如pH約5.5至約6.0)具有的解離半衰期（t1/2)少于2min。在一個實施方式中，由如本申請所述的經基因修飾的免疫球蛋白重鏈基因座表達的、含有重鏈可變結構域的抗原結合蛋白在25°C在酸性pH下（例如pH約5.5至約6.0)具有的解離半衰期（t1/2)少于lmin。在一個實施方式中，由如本申請所述的經基因修飾的免疫球蛋白重鏈基因座表達的、含有重鏈可變結構域的抗原結合蛋白在37°C在酸性pH下（例如pH約5.5至約6.0)具有的解離半衰期（t1/2)少于lmin。在一個實施方式中，由如本申請所述的經基因修飾的免疫球蛋白基因座表達的、含有重鏈可變結構域的抗原結合蛋白在酸性pH下（例如pH約5.5至約6.0)的解離半衰期（t1/2)比所述抗原結合蛋白在中性pH下（例如pH約7.0至約7.4)的解離半衰期（t1/2)降低至少約2倍、至少約3倍、至少約4倍、至少約5倍、至少約10倍、至少約15倍、至少約20倍、至少約25倍或至少約30倍。[0340]在一個實施方式中，由如本申請所述的經基因修飾的免疫球蛋白基因座表達的、含有重鏈可變結構域的抗原結合蛋白與不含所述的基因修飾的野生型抗原結合蛋白相比，具有的特征為pH依賴的再循環性的提高、血清半衰期的增加或兩者兼而有之。[0341]在一個實施方式中，本申請所述的經基因修飾的免疫球蛋白基因座包含B細胞群，所述B細胞群經目標抗原刺激后能夠產生抗原結合蛋白例如抗體，所述抗原結合蛋白包含含有一個或多個組氨酸殘基的重鏈可變結構域。如本申請所述的抗原結合蛋白當給予對象時，與相應的野生型抗原結合蛋白相比顯示出增加的血清半衰期，所述野生型抗原結合蛋白具有相似的或足夠相似的編碼重鏈可變結構域的氨基酸序列，但是在所述重鏈可變結構域中不包含組氨酸殘基。在一些實施方式中，本申請所述的抗原結合蛋白顯示出的增加的血清半衰期，與相應的野生型抗原結合蛋白相比高至少約2倍、至少約5倍、至少約10倍、至少約15倍、至少約20倍，所述野生型抗原結合蛋白具有相似的或足夠相似的編碼重鏈可變結構域的氨基酸序列，但是在所述重鏈可變結構域中不包含組氨酸殘基。[0342]在一個方面，本申請提供了靶向構建體，所述靶向構建體包含與非人動物的基因組D區或者基因組V和J區具有同源性的5'和3'靶向臂，其中至少一個VH、D*JH基因區段包含如本申請所述的任意修飾，例如加入至少一個組氨酸密碼子、將至少一個內源性非組氨酸密碼子取代為組氨酸密碼子，和/或相對于相應的野生型序列反轉至少一個具有功能的D基因區段。[0343]在一個方面，本申請提供了雜交瘤或四價體雜交瘤，所述雜交瘤或四價體雜交瘤來源于如本申請所述的任意非人動物的細胞。在一個實施方式中，所述非人動物是嚙齒動物，例如小鼠、大鼠或倉鼠。[0344]在一個方面，本申請提供了來源于非人動物的多能干細胞、誘導性多能干細胞或全能干細胞，所述非人動物包含本申請所述的多種基因組修飾。在一個特定的實施方式中，所述多能干細胞、誘導性多能干細胞或全能干細胞是小鼠或大鼠胚胎干（ES)細胞。在一個實施方式中，所述多能干細胞、誘導性多能干細胞或全能干細胞具有XX染色體組型或XY染色體組型。在一個實施方式中，所述多能干細胞或誘導性多能干細胞是造血干細胞。[0345]在一個方面，本申請還提供了細胞，所述細胞含有包含如本申請所述的基因修飾的細胞核，所述修飾例如通過前核顯微注射（pronuclearinjection)引入細胞的修飾。在一個實施方式中，所述多能干細胞、誘導性多能干細胞或全能干細胞包含經基因修飾的免疫球蛋白基因組基因座，其中所述基因組基因座從5'至3'包含（l)FRT重組位點，（2)人源VH基因區段，（3)小鼠adam6基因，（4)loxP重組位點，（5)組氨酸取代的人源D基因區段，(6)人源JH基因區段，隨后為（7)小鼠Ei(內含子增強子（intronicenhancer))和⑶小鼠IgM恒定區核苷酸序列。[0346]在一個方面，本申請提供了淋巴細胞，所述淋巴細胞分離自如本申請所述的經基因修飾的非人動物。在一個實施方式中，所述淋巴細胞是B細胞，其中所述B細胞包含免疫球蛋白基因組基因座，所述基因座含有未經重排的重鏈可變區核苷酸序列，其中所述未經重排的重鏈可變基因序列包含加入至少一個組氨酸密碼子或使用組氨酸密碼子取代至少一個內源性非組氨酸密碼子。[0347]在一個方面，本申請提供了淋巴細胞，所述淋巴細胞分離自如本申請所述的經基因修飾的非人動物。在一個實施方式中，所述淋巴細胞是B細胞，其中所述B細胞包含免疫球蛋白基因座，所述基因座含有人源V、D和J基因區段，其中至少一個所述人源D基因區段相對于野生型序列從5'至3'反轉，并且其中所述反轉的人源D基因區段的至少一個閱讀框架編碼至少一個組氨酸殘基。在一個實施方式中，所述B細胞能夠產生抗原結合蛋白，所述抗原結合蛋白包含如本申請所述的經基因修飾的重鏈可變結構域。在一個實施方式中，如本申請所述的經基因修飾的重鏈可變結構域與重鏈恒定區氨基酸序列可操作地連接。[0348]在一個方面，本申請提供了B細胞群，所述B細胞群能夠表達在重鏈可變結構域中包含至少一個組氨酸殘基的抗原結合蛋白，其中所述B細胞群包含如本申請所述的任意基因修飾。在一個實施方式中，所述至少一個組氨酸殘基存在于重鏈⑶R中。在一個實施方式中，所述⑶R選自⑶R1、⑶R2、⑶R3及其組合。在一個實施方式中，所述至少一個組氨酸殘基存在于⑶R3中。[0349]在一個方面，本申請提供了B細胞群，所述B細胞群能夠表達具有增加的血清半衰期和/或增強的pH依賴的再循環性的抗原結合蛋白，其中所述B細胞群包含如本申請所述的任意基因修飾。[0350]在一個方面，本申請提供了制備非人動物的方法，所述非人動物包含經基因修飾的免疫球蛋白重鏈可變基因座，所述方法包括：[0351](a)修飾非人動物的基因組以使內源性免疫球蛋白重鏈V、D和J基因區段缺失或使其不具有功能（例如通過在免疫球蛋白基因座中插入核苷酸序列例如外源性核苷酸序列，或通過使內源性VH、D、JH區段產生不具有功能的重排或反轉）；和[0352](b)在基因組中放置未經重排的重鏈可變區核苷酸序列，其中所述未經重排的重鏈可變區核苷酸序列包含如本申請所述加入至少一個組氨酸密碼子或使用組氨酸密碼子取代至少一個內源性非組氨酸密碼子。[0353]在一個實施方式中，所述非人動物是哺乳動物，包含嚙齒動物，例如小鼠、大鼠或倉鼠。[0354]在一個實施方式中，2個或更多個、3個或更多個、4個或更多個、5個或更多個、6個或更多個、7個或更多個、8個或更多個、9個或更多個、10個或更多個、11個或更多個、12個或更多個、13個或更多個、14個或更多個、15個或更多個、16個或更多個、17個或更多個、18個或更多個、19個或更多個、20個或更多個、21個或更多個、22個或更多個、23個或更多個、24個或更多個、25個或更多個、26個或更多個、27個或更多個、28個或更多個、29個或更多個、30個或更多個、31個或更多個、32個或更多個、33個或更多個、34個或更多個、35個或更多個、36個或更多個、37個或更多個、38個或更多個、39個或更多個、40個或更多個、41個或更多個、42個或更多個、43個或更多個、44個或更多個、45個或更多個、46個或更多個、47個或更多個、48個或更多個、49個或更多個、50個或更多個、51個或更多個、52個或更多個、53個或更多個、54個或更多個、55個或更多個、56個或更多個、57個或更多個、58個或更多個、59個或更多個、60個或更多個或者61個或更多個內源性非組氨酸密碼子被組氨酸密碼子取代。[0355]在一個實施方式中，所述內源性非組氨酸密碼子編碼選自下組的氨基酸：Y、N、D、Q、S、W和R。[0356]在一個實施方式中，所述加入或取代的組氨酸密碼子存在于未經重排的重鏈可變區核苷酸序列中，所述未經重排的重鏈可變區核苷酸序列編碼選自下組的免疫球蛋白可變結構域：N-末端區、環4區、⑶R1、⑶R2、⑶R3及其組合。[0357]在一個實施方式中，所述加入或取代的組氨酸密碼子存在于未經重排的重鏈可變區核苷酸序列中，所述未經重排的重鏈可變區核苷酸序列編碼選自下組的互補性決定區(CDR):CDR1、CDR2、CDR3及其組合。[0358]在一個實施方式中，所述加入或取代的組氨酸密碼子存在于未經重排的重鏈可變區核苷酸序列中，所述未經重排的重鏈可變區核苷酸序列編碼選自下組的框架區（FR):FR1、FR2、FR3、FR4及其組合。[0359]在一個實施方式中，所述未經重排的重鏈可變區核苷酸序列包含經基因修飾的人源％基因區段，其中所述人源￥11基因區段的至少一個閱讀框架中的一個或多個內源性非組氨酸密碼子被組氨酸密碼子取代。[0360]在一個實施方式中，所述人源未經重排的重鏈可變區核苷酸序列包含使用組氨酸密碼子取代人源％基因區段的至少一個內源性非組氨酸密碼子的修飾，其中所述人源￥11基因區段選自下組：Vh1-2、Vh1-3、Vh1-8、Vh1-18、Vh1-24、Vh1-45、Vh1-46、Vh1-58、Vh1-69、Vh2-5、Vh2-26、Vh2-70、Vh3-7、Vh3-9、Vh3-11、Vh3-13、Vh3-15、Vh3-16、Vh3-20、Vh3-21、Vh3-23、Vh3-30、Vh3-30-3、Vh3-30-5、Vh3-33、Vh3-35、Vh3-38、Vh3-43、Vh3-48、Vh3-49、Vh3-53、Vh3-64、Vh3-66、VH3-72、VH3-73、VH3-74、VH4-4、VH4-28、VH4-30-1、VH4-30-2、VH4-30-4、VH4-31、VH4-34、VH4-39、VH4-59、VH4-61、VH5-51、VH6-1、VH7-4-l、VH7-81及其組合。[0361]在一個實施方式中，所述人源未經重排的重鏈可變區核苷酸序列包含經基因修飾的人源義基因區段，其中所述人源義基因區段的至少一個閱讀框架中的一個或多個內源性非組氨酸密碼子被組氨酸密碼子取代。[0362]在一個實施方式中，所述人源未經重排的重鏈可變區核苷酸序列包含使用組氨酸密碼子取代人源JH區段的至少一個內源性非組氨酸密碼子的修飾，其中所述人源JH基因區段選自下組：JH1、JH2、JH3、JH4、JH5、JH6及其組合。[0363]在一個實施方式中，所述加入或取代的組氨酸密碼子存在于編碼CDR3的一部分的重鏈可變區核苷酸序列中。在一個實施方式中，所述CDR3的一部分包含來源于經基因修飾的人源D基因區段的閱讀框架的氨基酸序列，所述經基因修飾的D基因區段含有使用組氨酸密碼子取代在閱讀框架中的至少一個內源性非組氨酸密碼子的修飾。[0364]在一個實施方式中，所述被組氨酸密碼子取代的內源性非組氨酸密碼子編碼選自下組的氨基酸：￥、隊0、〇、5、1和1?。[0365]在一個實施方式中，所述加入的或取代的組氨酸密碼子存在于在VELOCIMMUNE?人源化免疫球蛋白小鼠中最常見的人源D基因區段的至少一個閱讀框架中。[0366]在一個實施方式中，編碼CDR3的一部分的所述經基因修飾的人源D基因區段的閱讀框架選自疏水性框架、終止框架和親水性框架。[0367]在一個實施方式中，所述閱讀框架是人源D基因區段的疏水性框架。[0368]在一個實施方式中，所述人源D基因區段的疏水性框架包含編碼選自下組的氨基酸序列的核苷酸序列：D1_1(GTTGT;SEQIDN0:88)、D1-7(GITGT;SEQIDN0:89)、D1-20(GITGT;SEQIDN0:89)和D1-26(GIVGAT;SEQIDN0:90)，并且所述人源D基因區段還包含使用組氨酸密碼子取代在所述核苷酸序列中的至少一個內源性非組氨酸密碼子的修飾。[0369]在一個實施方式中，所述人源D基因區段的疏水性框架包含編碼選自下組的氨基酸序列的核苷酸序列：D2-2(DIVVVPAAI;SEQIDN0:92)、D2-8(DIVLMVYAI;SEQIDN0:94)、D2-15(DIVVVVAAT;SEQIDN0:95)和D2-21(HIVVVTAI;SEQIDN0:97)，并且所述人源D基因區段還包含使用組氨酸密碼子取代在所述核苷酸序列中的至少一個內源性非組氨酸密碼子的修飾。[0370]在一個實施方式中，所述人源D基因區段的疏水性框架包含編碼選自下組的氨基酸序列的核苷酸序列：D3-3(ITIFGVVII;SEQIDN0:98)、D3-9(ITIF*LVII;SEQIDN0:99,SEQIDNO:100),D3-10(ITMVRGVII；SEQIDNO:101),D3-16(IMITFGGVIVI；SEQIDN0:102)和D3-22(ITMIVVVIT;SEQIDN0:103)，并且所述人源D基因區段還包含使用組氨酸密碼子取代在所述核苷酸序列中的至少一個內源性密碼子的修飾。[0371]在一個實施方式中，所述人源D基因區段的疏水性框架包含編碼選自下組的氨基酸序列的核苷酸序列：D4-4CTTVT;SEQIDN0:105)、D4-llCTTVT;SEQIDN0:105)、D4-17CTTVT;SEQIDN0:105)、D4-23CTTVVT;SEQID勵：106)，并且所述人源0基因區段還包含使用組氨酸密碼子取代在所述核苷酸序列中的至少一個內源性非組氨酸密碼子的修飾。[0372]在一個實施方式中，所述人源D基因區段的疏水性框架包含編碼選自下組的氨基酸序列的核苷酸序列：D5-5(VDTAMV;SEQIDN0:107)、D5-12(VDIVATI;SEQIDN0:108)、D5-18(VDTAMV;SEQIDN0:107)和D5-24(VEMATI;SEQIDN0:109)，并且所述人源D基因區段還包含使用組氨酸密碼子取代在所述核苷酸序列中的至少一個內源性非組氨酸密碼子的修飾。[0373]在一個實施方式中，所述人源D基因區段的疏水性框架包含編碼選自下組的氨基酸序列的核苷酸序列：D6-6(SIAAR;SEQIDN0:111)、D6-13(GIAAAG;SEQIDN0:113)和D6-19(GIAVAG;SEQID勵:115)，并且所述人源0基因區段還包含使用組氨酸密碼子取代在所述核苷酸序列中的至少一個內源性非組氨酸密碼子的修飾。[0374]在一個實施方式中，所述疏水性框架包含編碼人源D7-27(LTG)的核苷酸序列，并且所述人源D基因區段還包含使用組氨酸密碼子取代在所述核苷酸序列中的至少一個內源性非組氨酸密碼子的修飾。[0375]在一個實施方式中，所述閱讀框架是人源D基因區段的終止閱讀框架。[0376]在一個實施方式中，所述人源D基因區段的終止閱讀框架包含編碼選自下組的氨基酸序列的核苷酸序列：D1_1(VQLER;SEQIDN0:8)、D1-7(V*LEL)、D1-20(V*LER)、D1-26(V*WELL;SEQID勵:12)，并且所述人源0基因區段還包含使用組氨酸密碼子取代在所述核苷酸序列中的至少一個內源性非組氨酸密碼子的修飾。[0377]在一個實施方式中，所述人源D基因區段的終止閱讀框架包含編碼選自下組的氨基酸序列的核苷酸序列：D2-2(RIL#YQLLY;SEQIDN0:14)、D2-8(RILY*WCMLY;SEQID勵：16和5￡〇10勵：17)、02-15〇?11>醫札1^)和02-21(511醫札1^;5￡〇10勵：19)，并且所述人源D基因區段還包含使用組氨酸密碼子取代在所述核苷酸序列中的至少一個內源性非組氨酸密碼子的修飾。[0378]在一個實施方式中，所述人源D基因區段的終止閱讀框架包含編碼選自下組的氨基酸序列的核苷酸序列：D3-3(VLRFLEWLLY;SEQIDN0:21)、D3-9(VLRYFDWLL*;SEQIDN0:23)、D3-10(VLLWFGELL*;SEQIDN0:25)、D3-16(VL*LRLGELSLY;SEQIDN0:27)和D3-22(VLL*#WLLL;SEQID勵:29)，并且所述人源0基因區段包含使用組氨酸密碼子取代在所述核苷酸序列中的至少一個內源性非組氨酸密碼子的修飾。[0379]在一個實施方式中，所述人源D基因區段的終止閱讀框架包含編碼選自下組的氨基酸序列的核苷酸序列：D4-4(*LQ*L)、D4-11(*LQ*L)、D4-17(*LR*L)和D4-23(*LRW*L)，并且所述人源D基因區段包含使用組氨酸密碼子取代在所述核苷酸序列中的至少一個內源性非組氨酸密碼子的修飾。[0380]在一個實施方式中，所述人源D基因區段的終止閱讀框架包含編碼選自下組的氨基酸序列的核苷酸序列：D5-5(WIQLWL;SEQIDN0:35);D5-12(WI*WLRL;SEQIDN0:37)、D5-18(WIQLWL;SEQIDN0:35)和D5-24(*RWLQL;SEQIDN0:39)，并且所述人源D基因區段包含使用組氨酸密碼子取代在所述核苷酸序列中的至少一個內源性非組氨酸密碼子的修飾。[0381]在一個實施方式中，所述人源D基因區段的終止閱讀框架包含編碼選自下組的氨基酸序列的核苷酸序列：D6-6(V*QLV)、D6-13(V*QQLV;SEQIDN0:41)和D6-19(V*QWLV;SEQIDN0:43)，并且所述人源D基因區段還包含使用組氨酸密碼子取代在所述核苷酸序列中的至少一個內源性非組氨酸密碼子的修飾。[0382]在一個實施方式中，所述人源D基因區段的終止閱讀框架包含編碼D7-27(*LG)的核苷酸序列，并且所述人源D基因區段還包含使用組氨酸密碼子取代在所述核苷酸序列中人源D基因區段的至少一個內源性密碼子的修飾。[0383]在一個實施方式中，所述閱讀框架是人源D基因區段的親水性框架。[0384]在一個實施方式中，所述人源D基因區段的親水性框架包含編碼選自下組的氨基酸序列的核苷酸序列：D1_1(YNWND;SEQIDN0:45)、D1-7(YNWNY;SEQIDN0:47)、D1-20(YNWND;SEQIDN0:45)和D1-26(YSGSYY;SEQIDN0:49)，并且所述人源D基因區段還包含使用組氨酸密碼子取代在所述核苷酸序列中的至少一個內源性密碼子的修飾。在一個實施方式中，所述親水性框架包含編碼選自下組的氨基酸序列的核苷酸序列：SEQIDNO:46、SEQIDNO:48、SEQIDNO:50及其組合。[0385]在一個實施方式中，所述人源D基因區段的親水性框架包含編碼選自下組的氨基酸序列的核苷酸序列：D2-2(GYCSSTSCYT;SEQIDN0:51)、D2-8(GYCTNGVCYT;SEQIDN0:53)、D2-15(GYCSGGSCYS;SEQIDN0:55)和D2-21(AYCGGDCYS;SEQIDN0:57)，并且所述人源D基因區段還包含使用組氨酸密碼子取代在所述核苷酸序列中的至少一個內源性密碼子的修飾。在一個實施方式中，所述親水性框架包含編碼選自下組的氨基酸序列的核苷酸序列：3￡〇10勵：52、5￡〇10勵：54、5￡〇10勵：56、5￡〇10勵：58及其組合。[0386]在一個實施方式中，所述人源D基因區段的親水性框架包含編碼選自下組的氨基酸序列的核苷酸序列：D3-3(YYDFWSGYYT;SEQIDN0:59)、D3-9(YYDILTGYYN;SEQIDN0:61)、D3-10(YYYGSGSYYN;SEQIDN0:63)、D3-16(YYDYVWGSYRYT;SEQIDN0:65)和D3-22(YYYDSSGYYY;SEQIDN0:67)，并且所述人源D基因區段還包含使用組氨酸密碼子取代在所述核苷酸序列中的至少一個內源性密碼子的修飾。在一個實施方式中，所述親水性框架包含編碼選自下組的氨基酸序列的核苷酸序列：SEQIDN0:60、SEQIDN0:62、SEQIDNO:64、SEQIDNO:66、SEQIDNO:68及其組合。[0387]在一個實施方式中，所述人源D基因區段的親水性框架包含編碼選自下組的氨基酸序列的核苷酸序列：D4-4(DYSNY;SEQIDN0:69)、D4-11(DYSNY;SEQIDN0:69)、D4-17(DYGDY;SEQIDN0:71)和D4-23(DYGGNS;SEQIDN0:73)，并且所述人源D基因區段包含使用組氨酸密碼子取代在所述核苷酸序列中的至少一個內源性密碼子的修飾。在一個實施方式中，所述親水性框架包含編碼選自下組的氨基酸序列的核苷酸序列：SEQID勵：70、5￡〇10勵：72、5￡〇10勵：74及其組合。[0388]在一個實施方式中，所述人源D基因區段的親水性框架包含編碼選自下組的氨基酸序列的核苷酸序列：D5-5(GYSYGY;SEQIDN0:75)、D5-12(GYSGYDY;SEQIDN0:77)、D5-18(GYSYGY;SEQIDN0:75)和D5-24(RDGYNY;SEQIDN0:79)，并且所述人源D基因區段還包含使用組氨酸密碼子取代在所述核苷酸序列中的至少一個內源性密碼子的修飾。在一個實施方式中，所述親水性框架包含編碼選自下組的氨基酸序列的核苷酸序列：SEQIDNO:76、SEQIDNO:78、SEQIDNO:80及其組合。[0389]在一個實施方式中，所述人源D基因區段的親水性框架包含編碼選自下組的氨基酸序列的核苷酸序列：D6-6(EYSSSS;SEQIDN0:81)、D6-13(GYSSSWY;SEQIDN0:83)和D6-19(GYSSGWY;SEQIDN0:85)，并且所述人源D基因區段還包含使用組氨酸密碼子取代在所述核苷酸序列中的至少一個內源性密碼子的修飾。在一個實施方式中，所述親水性框架包含編碼選自下組的氨基酸序列的核苷酸序列：SEQIDN0:82、SEQIDN0:84、SEQIDNO:86、SEQIDNO:76及其組合。[0390]在一個實施方式中，所述人源D基因區段的親水性框架包含編碼D7-27(NWG)的核苷酸序列，并且所述人源D基因區段還包含使用組氨酸密碼子取代在所述核苷酸序列中的至少一個內源性密碼子的修飾。[0391]在一個實施方式中，所述人源D基因區段的親水性框架包含編碼選自下組的氨基酸序列的核苷酸序列：SEQIDN0:46、SEQIDN0:48、SEQIDN0:50、SEQIDN0:52、SEQIDNO:54、SEQIDNO:56、SEQIDNO:58、SEQIDNO:60、SEQIDNO:62、SEQIDNO:64、SEQIDNO:66、SEQIDNO:68、SEQIDNO:70、SEQIDNO:72、SEQIDNO:74、SEQIDNO:76、SEQIDNO:78、SEQIDNO:80、SEQIDNO:82、SEQIDNO:84、SEQIDNO:86及其組合。[0392]在一個實施方式中，包含所述反轉的人源D基因區段的所述未經重排的重鏈可變區核苷酸序列與編碼選自IgM、IgD、IgG、IgE和IgA的免疫球蛋白同種型的人源或非人源重鏈恒定區核苷酸序列可操作地連接。[0393]在一個實施方式中，所述人源未經重排的免疫球蛋白重鏈可變區核苷酸序列與選自下組的人源或非人源重鏈恒定區核苷酸序列可操作地連接：Ch1、鉸鏈、CH2、CH3及其組合。在一個實施方式中，所述重鏈恒定區核苷酸序列包含CH1、鉸鏈、CH2和CH3(即CH1-鉸鏈-CH2-CH3)。[0394]在一個實施方式中，重鏈恒定區核苷酸序列存在于內源性基因座（例如所述核苷酸序列位于野生型非人動物中）或存在于異位（即在與其基因組的內源性免疫球蛋白鏈基因座不同的基因座，或在其內源性基因座中，例如在免疫球蛋白可變基因座中，其中所述內源性基因座位于或移至基因組中的不同位置）。[0395]在一個實施方式中，所述重鏈恒定區核苷酸序列包含在CH2或CH3中的修飾，其中所述修飾在酸性環境中（例如，在pH范圍是約5.5至約6.0的核內體中）增加所述重鏈恒定區氨基酸序列對FcRn的親和性。[0396]在一個實施方式中，所述重鏈恒定區核苷酸序列編碼人源重鏈恒定區氨基酸序列，所述人源重鏈恒定區氨基酸序列包含在位置250的修飾（例如E或Q);在250和428的修飾（例如L或F);在252的修飾（例如L/Y/F/W或T)、在254的修飾（例如S或T)和在256的修飾（例如S/R/Q/E/D或T);或在位置428和/或433的修飾（例如L/R/S/P/Q或K)和/或在434的修飾（例如H/F或Y);或在位置250和/或428的修飾；或在位置307或308的修飾（例如308F、V308F)和434的修飾。在一個實施方式中，所述修飾包含428L(例如M428L)和434S(例如N434S)修飾；428L、259I(例如V259I)和308F(例如V308F)修飾；433K(例如H433K)和434(例如434Y)修飾；252、254和256(例如252￥、2541'和256￡)修飾；250Q和428L修飾（例如T250Q和M428L);以及307和/或308修飾（例如308F或308P)，其中所述修飾在酸性環境中（例如在pH范圍是約5.5至約6.0的核內體中）增加所述重鏈恒定區氨基酸序列對FcRn的親和性。[0397]在一個實施方式中，所述重鏈恒定區核苷酸序列編碼人源CH2氨基酸序列，所述人源CH2氨基酸序列包含在位置252和257的氨基酸殘基之間的至少一個修飾，其中所述修飾在酸性環境中（例如在pH范圍是約5.5至約6.0的核內體中）增加所述人源CH2氨基酸序列對FcRn的親和性。[0398]在一個實施方式中，所述重鏈恒定區核苷酸序列編碼人源CH2氨基酸序列，所述人源CH2氨基酸序列包含在位置307和311的氨基酸殘基之間的至少一個修飾，其中所述修飾在酸性環境中（例如在pH范圍是約5.5至約6.0的核內體中）增加所述CH2氨基酸序列對FcRn的親和性。[0399]在一個實施方式中，所述重鏈恒定區核苷酸序列編碼人源CH3氨基酸序列，所述人源CH3氨基酸序列包含在位置433和436的氨基酸殘基之間的至少一個修飾，其中所述修飾在酸性環境中（例如在pH范圍是約5.5至約6.0的核內體中）增加所述CH3氨基酸序列對FcRn的親和性。[0400]在一個實施方式中，所述重鏈恒定區核苷酸序列編碼人源重鏈恒定區氨基酸序列，所述氨基酸序列包含選自下組的突變：M428L、N434S及其組合。[0401]在一個實施方式中，所述重鏈恒定區核苷酸序列編碼人源重鏈恒定區氨基酸序列，所述氨基酸序列包含選自下組的突變：M428L、V259I、V308F及其組合。[0402]在一個實施方式中，所述重鏈恒定區核苷酸序列編碼人源重鏈恒定區氨基酸序列，所述氨基酸序列包含N434A突變。[0403]在一個實施方式中，所述重鏈恒定區核苷酸序列編碼人源重鏈恒定區氨基酸序列，所述氨基酸序列包含選自下組的突變：M252Y、S254T、T256E及其組合。[0404]在一個實施方式中，所述重鏈恒定區核苷酸序列編碼人源重鏈恒定區氨基酸序列，所述氨基酸序列包含選自下組的突變：T250Q、M248L或這兩者。[0405]在一個實施方式中，所述重鏈恒定區核苷酸序列編碼人源重鏈恒定區氨基酸序列，所述氨基酸序列包含選自下組的突變：H433K、N434Y或這兩者。[0406]在一個實施方式中，所述經基因修飾的免疫球蛋白基因座包含：（1)第一等位基因，其中如本申請所述的未經重排的人源免疫球蛋白重鏈可變區核苷酸序列與第一重鏈恒定區核苷酸序列可操作地連接，所述第一重鏈恒定區核苷酸序列編碼選自IgGl、IgG2、IgG4及其組合的人源IgG的第一CH3氨基酸序列；和（2)第二等位基因，其中如本申請所述的未經重排的人源免疫球蛋白重鏈可變區核苷酸序列與第二重鏈恒定區核苷酸序列可操作地連接，所述第二重鏈恒定區核苷酸序列編碼選自IgGl、IgG2、IgG4及其組合的人源IgG的第二CH3氨基酸序列，并且其中所述第二CH3氨基酸序列包含使所述第二CH3氨基酸序列與蛋白A的結合降低或消除的修飾（參見例如US2010/0331527A1，其通過引用整體并入本申請）。[0407]在一個實施方式中，所述第二CH3氨基酸序列包含H95R修飾（根據MGT外顯子編號；根據EU編號為H435R)。在一個實施方式中，所述第二CH3氨基酸序列還包含Y96F修飾(根據頂GT外顯子編號；根據EU編號為H436F)。在另一個實施方式中，所述第二CH3氨基酸序列包含！195R修飾（根據MGT外顯子編號；根據EU編號為H435R)和Y96F修飾（根據MGT外顯子編號；根據EU編號為H436F)這兩者。[0408]在一個實施方式中，所述第二CH3氨基酸序列來自經修飾的人源IgGl并且還包含選自下組的突變：D16E、L18M、N44S、K52N、V57M和V82I(根據MGT編號；根據EU編號為D356E、L38M、N384S、K392N、V397M和V422I)。[0409]在一個實施方式中，所述第二CH3氨基酸序列來自經修飾的人源IgG2并且還包含選自下組的突變：N44S、K52N和V82I(根據MGT編號；根據EU編號為N384S、K392N和V422I)。[0410]在一個實施方式中，所述第二CH3氨基酸序列來自經修飾的人源IgG4并且還包含選自下組的突變：0151?、財43、1(52隊￥57]\1、1?691(、￡790和￥821(根據頂61'編號；根據￡。編號為Q355R、N384S、K392N、V397M、R409K、E419Q和V422I)。[0411]在一個實施方式中，所述重鏈恒定區氨基酸序列是非人源恒定區氨基酸序列，并且所述重鏈恒定區氨基酸序列包含上文所述任意類型的修飾中的一種或多種。[0412]在一個實施方式中，所述重鏈恒定區核苷酸序列是人源重鏈恒定區氨基酸序列，并且所述人源重鏈恒定區氨基酸序列包含上文所述任意類型的修飾中的一種或多種。[0413]在一個實施方式中，全部或基本上全部的內源性VH、0和義基因區段從免疫球蛋白重鏈基因座中缺失或者使其不具有功能（例如通過在免疫球蛋白基因座中插入核苷酸序列（例如外源性核苷酸序列）或者通過使內源性VH、D、JHg段進行不具有功能的重排或反轉）。在一個實施方式中，例如，約80%或更多的、約85%或更多的、約90%或更多的、約95%或更多的、約96%或更多的、約97%或更多的、約98%或更多的或者約99%或更多的全部的內源性VH、D或JH基因區段被缺失或使其不具有功能。在一個實施方式中，例如，至少95%、96%、97%、98%或99%的內源性具有功能的V、D或J基因區段被缺失或使其不具有功能。[0414]在一個實施方式中，所述經基因修飾的基因座包含使全部或基本上全部的內源性%、0和1基因區段缺失或使其不具有功能的修飾；并且所述基因組的基因座包含經基因修飾的、未經重排的人源重鏈可變區核苷酸序列，所述核苷酸序列含有在至少一個閱讀框架中使用組氨酸密碼子取代至少一個內源性非組氨酸密碼子。在一個實施方式中，所述經基因修飾的、未經重排的免疫球蛋白重鏈可變基因序列存在于內源性位置（即所述核苷酸序列位于野生型非人動物中）或存在于異位（即在與其基因組的內源性免疫球蛋白鏈基因座不同的基因座），或在其內源性基因座中，例如在免疫球蛋白可變基因座中，其中所述內源性基因座位于或移至基因組中的不同位置。[0415]在一個實施方式中，所述經基因修飾的基因座包含內源性Adam6a基因、Adam6b基因或者這兩者，并且所述基因修飾不會影響所述內源性Adam6a基因、Adam6b基因或者這兩者的表達和/或功能。[0416]在一個實施方式中，所述經基因修飾的基因座包含異位存在的Adam6a基因、Adam6b基因或者這兩者。在一個實施方式中，所述Adam6a基因是非人源Adam6a基因。在一個實施方式中，所述Adam6a基因是小鼠Adam6a基因。在一個實施方式中，所述Adam6a基因是人源Adam6a基因。在一個實施方式中，所述Adam6b基因是非人源Adam6b基因。在一個實施方式中，所述Adam6b基因是小鼠Adam6b基因。在一個實施方式中，所述Adam6b基因是人源Adam6b基因。[0417]在一個實施方式中，所述經基因修飾的免疫球蛋白基因座還包含人源化的、未經重排的A和/或K輕鏈可變基因序列。在一個實施方式中，所述人源化的、未經重排的X和/或K輕鏈可變基因序列與免疫球蛋白輕鏈恒定區核苷酸序列可操作地連接，所述輕鏈恒定區核苷酸序列選自A輕鏈恒定區核苷酸序列和K輕鏈恒定區核苷酸序列。在一個實施方式中，所述人源化的、未經重排的A輕鏈可變區核苷酸序列與A輕鏈恒定區核苷酸序列可操作地連接。在一個實施方式中，所述A輕鏈恒定區核苷酸序列是小鼠、大鼠或人源序列。在一個實施方式中，所述人源化的、未經重排的K輕鏈可變區核苷酸序列與K輕鏈恒定區核苷酸序列可操作地連接。在一個實施方式中，所述K輕鏈恒定區核苷酸序列是小鼠、大鼠或人源序列。[0418]在一個實施方式中，所述經基因修飾的免疫球蛋白基因座包含未經重排的輕鏈可變基因序列，所述未經重排的輕鏈可變基因序列含有在編碼輕鏈可變結構域的至少一個閱讀框架中引入至少一個組氨酸密碼子的至少一個修飾。在一個實施方式中，所述經基因修飾的免疫球蛋白基因座包含重排的序列（例如重排的A或！CV/J序列），所述序列在輕鏈⑶R中含有1個、2個、3個或4個組氨酸密碼子。在一個實施方式中，所述⑶R選自⑶R1、CDR2、CDR3及其組合。在一個實施方式中，所述未經重排的或重排的輕鏈可變區核苷酸序列是未經重排的或重排的人源A或K輕鏈可變區核苷酸序列。在一個實施方式中，所述未經重排的或重排的人源A或k輕鏈可變區核苷酸序列存在于內源性小鼠免疫球蛋白輕鏈基因座。在一個實施方式中，所述小鼠免疫球蛋白輕鏈基因座是小鼠k基因座。在一個實施方式中，所述小鼠免疫球蛋白輕鏈基因座是小鼠A基因座。[0419]在一個實施方式中，如本申請所述的經基因修飾的免疫球蛋白基因座存在于小鼠的免疫球蛋白重鏈基因座中。在一個實施方式中，所述經基因修飾的免疫球蛋白基因座存在于VELOCIMMUNE_3￡小鼠的人源化的免疫球蛋白重鏈基因座中。[0420]在一個實施方式中，由如本申請所述的經基因修飾的免疫球蛋白重鏈基因座表達的、含有重鏈可變結構域的抗原結合蛋白與不含所述基因修飾的相應野生型重鏈可變結構域相比，在酸性環境中（例如在約5.5至約6.0的pH下）顯示出更弱的抗原結合。[0421]在一個實施方式中，由如本申請所述的經基因修飾的免疫球蛋白重鏈基因座表達的、含有重鏈可變結構域的抗原結合蛋白在25°C在酸性pH下（例如pH約5.5至約6.0)具有的解離半衰期（t1/2)少于2min。在一個實施方式中，由如本申請所述的經基因修飾的免疫球蛋白重鏈基因座表達的、含有重鏈可變結構域的抗原結合蛋白在37°C在酸性pH下（例如pH約5.5至約6.0)具有的解離半衰期（t1/2)少于2min。在一個實施方式中，由如本申請所述的經基因修飾的免疫球蛋白重鏈基因座表達的、含有重鏈可變結構域的抗原結合蛋白在25°C在酸性pH下（例如pH約5.5至約6.0)具有的解離半衰期（t1/2)少于lmin。在一個實施方式中，由如本申請所述的經基因修飾的免疫球蛋白重鏈基因座表達的、含有重鏈可變結構域的抗原結合蛋白在37°C在酸性pH下（例如pH約5.5至約6.0)具有的解離半衰期（t1/2)少于lmin。在一個實施方式中，由如本申請所述的經基因修飾的免疫球蛋白基因座表達的、含有重鏈可變結構域的抗原結合蛋白在酸性pH下（例如pH約5.5至約6.0)的解離半衰期（t1/2)比所述抗原結合蛋白在中性pH下（例如pH約7.0至約7.4)的解離半衰期（t1/2)降低至少約2倍、至少約3倍、至少約4倍、至少約5倍、至少約10倍、至少約15倍、至少約20倍、至少約25倍或至少約30倍。[0422]在一個實施方式中，由如本申請所述的經基因修飾的免疫球蛋白基因座表達的、含有重鏈可變結構域的抗原結合蛋白與沒有所述基因修飾的野生型抗原結合蛋白相比，具有的特征為pH依賴的再循環性的提高、血清半衰期的增加或兩者兼而有之。[0423]在一個實施方式中，本申請所述的經基因修飾的免疫球蛋白基因座包含B細胞群，所述B細胞群經目標抗原刺激后能夠產生抗原結合蛋白例如抗體，所述抗原結合蛋白包含含有一個或多個組氨酸殘基的重鏈可變結構域。如本申請所述的抗原結合蛋白當給予對象時，與相應的野生型抗原結合蛋白相比顯示出增加的血清半衰期，所述野生型抗原結合蛋白具有相似的或足夠相似的編碼重鏈可變結構域的氨基酸序列，但是在所述重鏈可變結構域中不包含組氨酸殘基。在一些實施方式中，本申請所述的抗原結合蛋白顯示出的增加的血清半衰期，與相應的野生型抗原結合蛋白相比高至少約2倍、至少約5倍、至少約10倍、至少約15倍、至少約20倍，所述野生型抗原結合蛋白具有相似的或足夠相似的編碼重鏈可變結構域的氨基酸序列，但是在所述重鏈可變結構域中不包含組氨酸殘基。[0424]在一個方面，本申請提供了制備非人動物的方法，所述非人動物包括經基因修飾的免疫球蛋白重鏈可變基因座，所述方法包括：[0425](a)修飾非人動物的基因組以缺失內源性免疫球蛋白重鏈V、D和J基因區段或使其不具有功能（例如通過在免疫球蛋白基因座中插入核苷酸序列（例如外源性核苷酸序列）或通過使內源性VH、D、JH區段產生不具有功能的重排或反轉）；和[0426](b)在基因組中放置人源VH、D和義基因區段，其中至少一個人源D基因區段相對于相應的野生型序列從5'至3'反轉，并且其中所述反轉的人源D基因區段的至少一個閱讀框架包含組氨酸密碼子。[0427]在一個實施方式中，所述非人動物是哺乳動物，包含嚙齒動物，例如小鼠、大鼠或倉鼠。[0428]在一個實施方式中，所述經基因修飾的免疫球蛋白基因座存在于種系基因組中。[0429]在一個實施方式中，所述經基因修飾的免疫球蛋白基因座編碼免疫球蛋白重鏈可變結構域，所述免疫球蛋白重鏈可變結構域含有1個或更多個、2個或更多個、3個或更多個、4個或更多個、5個或更多個、6個或更多個、7個或更多個、8個或更多個、9個或更多個、10個或更多個、11個或更多個、12個或更多個、13個或更多個、14個或更多個、15個或更多個、16個或更多個、17個或更多個、18個或更多個、19個或更多個、20個或更多個、21個或更多個、22個或更多個、23個或更多個、24個或更多個、25個或更多個、26個或更多個、27個或更多個、28個或更多個、29個或更多個、30個或更多個、31個或更多個、32個或更多個、33個或更多個或者34個或更多個組氨酸殘基。[0430]在一個實施方式中，至少兩個、至少3個、至少4個、至少5個、至少6個、至少7個、至少8個、至少9個、至少10個、至少11個、至少12個、至少13個、至少14個、至少15個、至少16個、至少17個、至少18個、至少19個、至少20個、至少21個、至少22個、至少23個、至少24個或者全部或基本上全部的具有功能的人源D基因區段相對于對應的野生型序列是反向的。[0431]在一個實施方式中，全部或基本上全部的內源性免疫球蛋白VH、D、JH基因區段從所述免疫球蛋白重鏈基因座中缺失或使其不具有功能（例如通過在所述免疫球蛋白基因座插入核苷酸序列例如外源性核苷酸序列，或通過使全部或基本上全部的內源性免疫球蛋白vh、d、jh區段產生不具有功能的重排或反轉），并且所述經基因修飾的免疫球蛋白基因座包含人源VH、D和JH基因區段，其中所述至少一個人源D基因區段以相對于對應的野生型序列相反的方向存在，并且其中在反轉的人源D基因區段中的至少一個閱讀框架包含至少一個組氨酸密碼子。[0432]在一個實施方式中，所述反轉的人源D基因區段與人源VH基因區段和/或人源JH基因區段可操作地連接。[0433]在一個實施方式中，所述人源D基因區段以相對于選自下組的野生型序列相反的方向存在：Dl-1、Dl-7、Dl-20、Dl-26、D2-2、D2-8、D2-15、D2-21、D3-3、D3-9、D3-10、D3-16、D3-22、D4-4、D4-11、D4-17、D4-23、D5-5、D5-12、D5-18、D5-24、D6-6、D6-13、D6-19、D7-27及其組合。[0434]在一個實施方式中，以相對于相應的野生型序列相反的方向存在的所述人源D基因區段是選自下組的D1基因區段：Dl-1、Dl-7、Dl-20、D1-26及其組合。[0435]在一個實施方式中，以相對于相應的野生型序列相反的方向存在的所述人源D基因區段是選自下組的D2基因區段：D2-2、D2-8、D2-15、D2-21及其組合。[0436]在一個實施方式中，以相對于相應的野生型序列相反的方向存在的所述人源D基因區段是選自下組的D3基因區段：D3-3、D3-9、D3-10、D3-16、D3-22及其組合。[0437]在一個實施方式中，以相對于相應的野生型序列相反的方向存在的所述人源D基因區段是選自下組的D4基因區段：D4-4、D4-11、D4-17、D4-23及其組合。[0438]在一個實施方式中，以相對于相應的野生型序列相反的方向存在的所述人源D基因區段是選自下組的D5基因區段：D5-5、D5-12、D5-18、D5-24及其組合。[0439]在一個實施方式中，以相對于相應的野生型序列相反的方向存在的所述人源D基因區段是選自下組的D6基因區段：D6-6、D6-13、D6-19及其組合。[0440]在一個實施方式中，以相對于相應的野生型序列相反的方向存在的所述人源D基因區段是D7-27。[0441]在一個實施方式中，所述人源D基因區段的閱讀框架選自終止閱讀框架、親水性閱讀框架、疏水性閱讀框架及其組合。[0442]在一個實施方式中，包含所述反轉的人源D基因區段的所述未經重排的重鏈可變區核苷酸序列與編碼選自IgM、IgD、IgG、IgE和IgA的免疫球蛋白同種型的人源或非人源重鏈恒定區核苷酸序列可操作地連接。[0443]在一個實施方式中，所述人源未經重排的免疫球蛋白重鏈可變區核苷酸序列與選自下組的人源或非人源重鏈恒定區核苷酸序列可操作地連接：CH1、鉸鏈、CH2、CH3及其組合。在一個實施方式中，所述重鏈恒定區核苷酸序列包含CH1、鉸鏈、CH2和CH3(即CH1-鉸鏈-CH2-CH3)。[0444]在一個實施方式中，重鏈恒定區核苷酸序列存在于內源性基因座（例如所述核苷酸序列位于野生型非人動物中）或存在于異位（即在與其基因組的內源性免疫球蛋白鏈基因座不同的基因座，或在其內源性基因座中，例如在免疫球蛋白可變基因座中，其中所述內源性基因座位于或移至基因組中的不同位置）。[0445]在一個實施方式中，所述重鏈恒定區核苷酸序列包含在CH2或CH3中的修飾，其中所述修飾在酸性環境中（例如，在pH范圍是約5.5至約6.0的核內體中）增加所述重鏈恒定區氨基酸序列對FcRn的親和性。[0446]在一個實施方式中，所述重鏈恒定區核苷酸序列編碼人源重鏈恒定區氨基酸序列，所述人源重鏈恒定區氨基酸序列包含在位置250的修飾（例如E或Q);在250和428的修飾（例如L或F);在252的修飾（例如L/Y/F/W或T)、在254的修飾（例如S或T)和在256的修飾（例如S/R/Q/E/D或T);或在位置428和/或433的修飾（例如L/R/S/P/Q或K)和/或434的修飾（例如H/F或Y);或在位置250和/或428的修飾；或在位置307或308的修飾（例如308F、V308F)和434的修飾。在一個實施方式中，所述修飾包含428L(例如M428L)和434S(例如N434S)修飾；428L、259I(例如V259I)和308F(例如V308F)修飾；433K(例如H433K)和434(例如434Y)修飾；252、254和256(例如252Y、254T和256E)修飾；250Q和428L修飾（例如T250Q和M428L);以及307和/或308修飾（例如308F或308P)，其中所述修飾在酸性環境中（例如在pH范圍是約5.5至約6.0的核內體中）增加所述重鏈恒定區氨基酸序列對FcRn的親和性。[0447]在一個實施方式中，所述重鏈恒定區核苷酸序列編碼人源CH2氨基酸序列，所述氨基酸序列包含在位置252和257的氨基酸殘基之間的至少一個修飾，其中所述修飾在酸性環境中（例如在pH范圍是約5.5至約6.0的核內體中）增加所述人源Ch2氨基酸序列對FcRn的親和性。[0448]在一個實施方式中，所述重鏈恒定區核苷酸序列編碼人源CH2氨基酸序列，所述氨基酸序列包含在位置307和311的氨基酸殘基之間的至少一個修飾，其中所述修飾在酸性環境中（例如在pH范圍是約5.5至約6.0的核內體中）增加所述Ch2氨基酸序列對FcRn的親和性。[0449]在一個實施方式中，所述重鏈恒定區核苷酸序列編碼人源CH3氨基酸序列，所述人源CH3氨基酸序列包含在位置433和436的氨基酸殘基之間的至少一個修飾，其中所述修飾在酸性環境中（例如在pH范圍是約5.5至約6.0的核內體中）增加所述CH3氨基酸序列對FcRn的親和性。[0450]在一個實施方式中，所述重鏈恒定區核苷酸序列編碼人源重鏈恒定區氨基酸序列，所述氨基酸序列包含選自下組的突變：M428L、N434S及其組合。[0451]在一個實施方式中，所述重鏈恒定區核苷酸序列編碼人源重鏈恒定區氨基酸序列，所述氨基酸序列包含選自下組的突變：M428L、V259I、V308F及其組合。[0452]在一個實施方式中，所述重鏈恒定區核苷酸序列編碼人源重鏈恒定區氨基酸序列，所述氨基酸序列包含N434A突變。[0453]在一個實施方式中，所述重鏈恒定區核苷酸序列編碼人源重鏈恒定區氨基酸序列，所述氨基酸序列包含選自下組的突變：M252Y、S254T、T256E及其組合。[0454]在一個實施方式中，所述重鏈恒定區核苷酸序列編碼人源重鏈恒定區氨基酸序列，所述氨基酸序列包含選自下組的突變：T250Q、M248L或這兩者。[0455]在一個實施方式中，所述重鏈恒定區核苷酸序列編碼人源重鏈恒定區氨基酸序列，所述氨基酸序列包含選自下組的突變：H433K、N434Y或這兩者。[0456]在一個實施方式中，所述經基因修飾的免疫球蛋白基因座包含：（1)第一等位基因，其中如本申請所述的未經重排的人源免疫球蛋白重鏈可變區核苷酸序列與第一重鏈恒定區核苷酸序列可操作地連接，所述第一重鏈恒定區核苷酸序列編碼選自IgGl、IgG2、IgG4及其組合的人源IgG的第一CH3氨基酸序列；和（2)第二等位基因，其中如本申請所述的未經重排的人源免疫球蛋白重鏈可變區核苷酸序列與第二重鏈恒定區核苷酸序列可操作地連接，所述第二重鏈恒定區核苷酸序列編碼選自IgGl、IgG2、IgG4及其組合的人源IgG的第二CH3氨基酸序列，并且其中所述第二CH3氨基酸序列包含使所述第二CH3氨基酸序列與蛋白A的結合降低或消除的修飾（參見例如US2010/0331527A1，其通過引用整體并入本申請）。[0457]在一個實施方式中，所述第二CH3氨基酸序列包含H95R修飾（根據MGT外顯子編號；根據EU編號為H435R)。在一個實施方式中，所述第二CH3氨基酸序列還包含Y96F修飾(根據頂GT外顯子編號；根據EU編號為H436F)。在另一個實施方式中，所述第二CH3氨基酸序列包含！195R修飾（根據MGT外顯子編號；根據EU編號為H435R)和Y96F修飾（根據MGT外顯子編號；根據EU編號為H436F)這兩者。[0458]在一個實施方式中，所述第二CH3氨基酸序列來自經修飾的人源IgGl并且還包含選自下組的突變：D16E、L18M、N44S、K52N、V57M和V82I(根據MGT編號；根據EU編號為D356E、L38M、N384S、K392N、V397M和V422I)。[0459]在一個實施方式中，所述第二CH3氨基酸序列來自經修飾的人源IgG2并且還包含選自下組的突變：N44S、K52N和V82I(根據MGT編號；根據EU編號為N384S、K392N和V422I)。[0460]在一個實施方式中，所述第二CH3氨基酸序列來自經修飾的人源IgG4并且還包含選自下組的突變：0151?、財43、1(52隊￥57]\1、1?691(、￡790和￥821(根據頂61'編號；根據￡。編號為Q355R、N384S、K392N、V397M、R409K、E419Q和V422I)。[0461]在一個實施方式中，所述重鏈恒定區氨基酸序列是非人源恒定區氨基酸序列，并且所述重鏈恒定區氨基酸序列包含上文所述任意類型的修飾中的一種或多種。[0462]在一個實施方式中，所述重鏈恒定區核苷酸序列是人源重鏈恒定區氨基酸序列，并且所述人源重鏈恒定區氨基酸序列包含上文所述任意類型的修飾中的一種或多種。[0463]在一個實施方式中，全部或基本上全部的內源性VH、0和義基因區段從免疫球蛋白重鏈基因座中缺失或者使其不具有功能（例如通過在免疫球蛋白基因座中插入核苷酸序列（例如外源性核苷酸序列）或者通過使內源性VH、D、JHg段進行不具有功能的重排或反轉）。在一個實施方式中，例如，約80%或更多的、約85%或更多的、約90%或更多的、約95%或更多的、約96%或更多的、約97%或更多的、約98%或更多的或者約99%或更多的全部的內源性VH、D或JH基因區段被缺失或使其不具有功能。在一個實施方式中，例如，至少95%、96%、97%、98%或99%的內源性具有功能的V、D或J基因區段被缺失或使其不具有功能。[0464]在一個實施方式中，所述經基因修飾的免疫球蛋白重鏈基因座包含使全部或基本上全部的內源性VH、D和JH基因區段缺失或使其不具有功能的修飾；并且所述經基因修飾的基因座包含未經重排的重鏈可變區核苷酸序列，所述核苷酸序列包含至少一個如本申請所述的反轉的人源D基因區段，其中所述未經重排的重鏈可變區核苷酸序列存在于內源性位置（即所述核苷酸序列位于野生型非人動物中）或存在于異位（即在與其基因組的內源性免疫球蛋白鏈基因座不同的基因座，或在其內源性基因座中，例如在免疫球蛋白可變基因座中，其中所述內源性基因座位于或移至基因組中的不同位置）。[0465]在一個實施方式中，所述經基因修飾的免疫球蛋白基因座包含內源性Adam6a基因、Adam6b基因或者這兩者，并且所述基因修飾不會影響所述內源性Adam6a基因、Adam6b基因或者這兩者的表達和/或功能。[0466]在一個實施方式中，所述經基因修飾的免疫球蛋白基因座包含異位存在的Adam6a基因、Adam6b基因或者這兩者。在一個實施方式中，所述Adam6a基因是非人源Adam6a基因。在一個實施方式中，所述Adam6a基因是小鼠Adam6a基因。在一個實施方式中，所述Adam6a基因是人源Adam6a基因。在一個實施方式中，所述Adam6b基因是非人源Adam6b基因。在一個實施方式中，所述Adam6b基因是小鼠Adam6b基因。在一個實施方式中，所述Adam6b基因是人源Adam6b基因。[0467]在一個實施方式中，所述經基因修飾的免疫球蛋白基因座還包含人源化的、未經重排的A和/或K輕鏈可變基因序列。在一個實施方式中，所述人源化的、未經重排的X和/或K輕鏈可變基因序列與免疫球蛋白輕鏈恒定區核苷酸序列可操作地連接，所述輕鏈恒定區核苷酸序列選自A輕鏈恒定區核苷酸序列和K輕鏈恒定區核苷酸序列。在一個實施方式中，所述人源化的、未經重排的A輕鏈可變區核苷酸序列與A輕鏈恒定區核苷酸序列可操作地連接。在一個實施方式中，所述A輕鏈恒定區核苷酸序列是小鼠、大鼠或人源序列。在一個實施方式中，所述人源化的、未經重排的K輕鏈可變區核苷酸序列與K輕鏈恒定區核苷酸序列可操作地連接。在一個實施方式中，所述K輕鏈恒定區核苷酸序列是小鼠、大鼠或人源序列。[0468]在一個實施方式中，所述經基因修飾的免疫球蛋白基因座包含未經重排的輕鏈可變基因序列，所述未經重排的輕鏈可變基因序列含有在編碼輕鏈可變結構域的至少一個閱讀框架中引入至少一個組氨酸密碼子的至少一個修飾。在一個實施方式中，所述經基因修飾的免疫球蛋白基因座包含重排的序列（例如重排的A或！CV/J序列），所述序列在輕鏈⑶R中含有1個、2個、3個或4個組氨酸密碼子。在一個實施方式中，所述⑶R選自⑶R1、CDR2、CDR3及其組合。在一個實施方式中，所述未經重排的或重排的輕鏈可變區核苷酸序列是未經重排的或重排的人源A或K輕鏈可變區核苷酸序列。在一個實施方式中，所述未經重排的或重排的人源A或k輕鏈可變區核苷酸序列存在于內源性小鼠免疫球蛋白輕鏈基因座。在一個實施方式中，所述小鼠免疫球蛋白輕鏈基因座是小鼠k基因座。在一個實施方式中，所述小鼠免疫球蛋白輕鏈基因座是小鼠A基因座。[0469]在一個實施方式中，如本申請所述的經基因修飾的免疫球蛋白基因座存在于小鼠的免疫球蛋白重鏈基因座中。在一個實施方式中，所述經基因修飾的免疫球蛋白基因座存在于VELOCIMMUNE??小鼠的人源化的免疫球蛋白重鏈基因座中。[0470]在一個實施方式中，由如本申請所述的經基因修飾的免疫球蛋白重鏈基因座表達的、含有重鏈可變結構域的抗原結合蛋白與不含所述的基因修飾的相應野生型重鏈可變結構域相比，在酸性環境中（例如在約5.5至約6.0的pH下）顯示出更弱的抗原結合。[0471]在一個實施方式中，由如本申請所述的經基因修飾的免疫球蛋白重鏈基因座表達的、含有重鏈可變結構域的抗原結合蛋白在25°C在酸性pH下（例如pH約5.5至約6.0)具有的解離半衰期（t1/2)少于2min。在一個實施方式中，由如本申請所述的經基因修飾的免疫球蛋白重鏈基因座表達的、含有重鏈可變結構域的抗原結合蛋白在37°C在酸性pH下（例如pH約5.5至約6.0)具有的解離半衰期（t1/2)少于2min。在一個實施方式中，由如本申請所述的經基因修飾的免疫球蛋白重鏈基因座表達的、含有重鏈可變結構域的抗原結合蛋白在25°C在酸性pH下（例如pH約5.5至約6.0)具有的解離半衰期（t1/2)少于lmin。在一個實施方式中，由如本申請所述的經基因修飾的免疫球蛋白重鏈基因座表達的、含有重鏈可變結構域的抗原結合蛋白在37°C在酸性pH下（例如pH約5.5至約6.0)具有的解離半衰期（t1/2)少于lmin。在一個實施方式中，由如本申請所述的經基因修飾的免疫球蛋白基因座表達的、含有重鏈可變結構域的抗原結合蛋白在酸性pH下（例如pH約5.5至約6.0)的解離半衰期（t1/2)比所述抗原結合蛋白在中性pH下（例如pH約7.0至約7.4)的解離半衰期（t1/2)降低至少約2倍、至少約3倍、至少約4倍、至少約5倍、至少約10倍、至少約15倍、至少約20倍、至少約25倍或至少約30倍。[0472]在一個實施方式中，由如本申請所述的經基因修飾的免疫球蛋白基因座表達的、含有重鏈可變結構域的抗原結合蛋白與不含所述的基因修飾的野生型抗原結合蛋白相比，具有的特征為pH依賴的再循環性的提高、血清半衰期的增加或兩者兼而有之。[0473]在一個實施方式中，本申請所述的經基因修飾的免疫球蛋白基因座包含B細胞群，所述B細胞群經目標抗原刺激后能夠產生抗原結合蛋白例如抗體，所述抗原結合蛋白包含含有一個或多個組氨酸殘基的重鏈可變結構域。如本申請所述的抗原結合蛋白當給予對象時，與相應的野生型抗原結合蛋白相比顯示出增加的血清半衰期，所述野生型抗原結合蛋白具有相似的或足夠相似的編碼重鏈可變結構域的氨基酸序列，但是在所述重鏈可變結構域中不包含組氨酸殘基。在一些實施方式中，本申請所述的抗原結合蛋白顯示出的增加的血清半衰期，與相應的野生型抗原結合蛋白相比，高至少約2倍、至少約5倍、至少約10倍、至少約15倍、至少約20倍，所述野生型抗原結合蛋白具有相似的或足夠相似的編碼重鏈可變結構域的氨基酸序列，但是在所述重鏈可變結構域中不包含組氨酸殘基。[0474]在一個方面，本申請提供了制備非人動物的方法，所述非人動物能夠生成具有增加的血清半衰期和/或增強的pH依賴的再循環性的免疫球蛋白重鏈可變結構域，所述方法包括[0475](a)修飾非人動物的基因組以缺失內源性免疫球蛋白重鏈V、D和J基因區段或使其不具有功能（例如通過在免疫球蛋白基因座中插入核苷酸序列（例如外源性核苷酸序列）或者通過使內源性VH、D、JH區段進行不具有功能的重排或反轉）；和[0476](b)在基因組中放置未經重排的人源重鏈可變區核苷酸序列，其中所述未經重排的重鏈可變區核苷酸序列包含加入至少一個組氨酸密碼子或使用組氨酸密碼子取代至少一個內源性非組氨酸密碼子，并且其中由所述非人動物生成的、包含所述免疫球蛋白重鏈可變結構域的抗原結合蛋白，與野生型免疫球蛋白重鏈結構域相比顯示出增加的血清半衰期和/或增強的pH依賴的再循環性。[0477]在一個實施方式中，所述非人動物在與抗原接觸后能夠產生富集的B細胞群的庫，所述B細胞群的庫表達具有增加的血清半衰期和/或增強的pH依賴的再循環性的抗原結合蛋白，其中所述富集的B細胞群包含如本申請所述的任意基因修飾。[0478]在一個實施方式中，由經基因修飾的非人動物生成的抗原結合蛋白的特征為在中性pH下（例如pH約7.0至約7.4)對目標抗原具有足夠的親和性，在低于中性pH的pH下(例如在核內體pH下，例如pH約5.5至6.0)所述抗體從抗原-抗原結合蛋白復合物中的解離增強。[0479]在一個實施方式中，由如本申請所述的經基因修飾的免疫球蛋白重鏈基因座表達的、含有重鏈可變結構域的抗原結合蛋白在25°C在酸性pH下（例如pH約5.5至約6.0)具有的解離半衰期（t1/2)少于2min。在一個實施方式中，由如本申請所述的經基因修飾的免疫球蛋白重鏈基因座表達的、含有重鏈可變結構域的抗原結合蛋白在37°C在酸性pH下（例如pH約5.5至約6.0)具有的解離半衰期（t1/2)少于2min。在一個實施方式中，由如本申請所述的經基因修飾的免疫球蛋白重鏈基因座表達的、含有重鏈可變結構域的抗原結合蛋白在25°C在酸性pH下（例如pH約5.5至約6.0)具有的解離半衰期（t1/2)少于lmin。在一個實施方式中，由如本申請所述的經基因修飾的免疫球蛋白重鏈基因座表達的、含有重鏈可變結構域的抗原結合蛋白在37°C在酸性pH下（例如pH約5.5至約6.0)具有的解離半衰期（t1/2)少于lmin。在一個實施方式中，由如本申請所述的經基因修飾的免疫球蛋白基因座表達的、含有重鏈可變結構域的抗原結合蛋白在酸性pH下（例如pH約5.5至約6.0)的解離半衰期（t1/2)比所述抗原結合蛋白在中性pH下（例如pH約7.0至約7.4)的解離半衰期（t1/2)降低至少約2倍、至少約3倍、至少約4倍、至少約5倍、至少約10倍、至少約15倍、至少約20倍、至少約25倍或至少約30倍。[0480]在一個實施方式中，由如本申請所述的經基因修飾的免疫球蛋白基因座表達的、含有重鏈可變結構域的抗原結合蛋白與不含所述的基因修飾的野生型抗原結合蛋白相比，具有的特征為pH依賴的再循環性的提高、血清半衰期的增加或兩者兼而有之。[0481]在一個實施方式中，本申請所述的經基因修飾的免疫球蛋白基因座包含富集的B細胞群，所述B細胞群經目標抗原刺激后能夠產生抗原結合蛋白例如抗體，所述抗原結合蛋白包含含有一個或多個組氨酸殘基的重鏈可變結構域。如本申請所述的抗原結合蛋白當給予對象時，與相應的野生型抗原結合蛋白相比顯示出增加的血清半衰期，所述野生型抗原結合蛋白具有相似的或足夠相似的編碼重鏈可變結構域的氨基酸序列，但是在所述重鏈可變結構域中不包含組氨酸殘基。在一些實施方式中，本申請所述的抗原結合蛋白顯示出的增加的血清半衰期與相應的野生型抗原結合蛋白相比，高至少約2倍、至少約5倍、至少約10倍、至少約15倍、至少約20倍，所述野生型抗原結合蛋白具有相似的或足夠相似的編碼重鏈可變結構域的氨基酸序列，但是在所述重鏈可變結構域中不包含組氨酸殘基。[0482]在一個實施方式中，所述抗原結合蛋白包含免疫球蛋白重鏈可變結構域，所述免疫球蛋白重鏈可變結構域在中性pH(例如pH約7.0至約7.4)下能夠以低于10'10'KT8、lO'KT'KT11和1(T12的親和性（KD)特異性結合目標抗原。[0483]在一個方面，本申請提供了獲得具有增強的再循環性和/或改善的血清半衰期的抗原結合蛋白的方法，所述方法包括：[0484](a)免疫如本申請所述的具有經基因修飾的免疫球蛋白基因座的非人動物，其中所述非人動物包含未經重排的人源重鏈可變區核苷酸序列，所述核苷酸序列含有加入至少一個組氨酸密碼子或使用組氨酸密碼子取代至少一個內源性非組氨酸密碼子；[0485](b)使所述非人動物產生免疫應答；[0486](c)從免疫的非人動物中收集淋巴細胞（例如B細胞）；[0487](d)將所述淋巴細胞與骨髓瘤細胞融合以形成雜交瘤細胞，和[0488](e)獲得由所述雜交瘤細胞生產的抗原結合蛋白，其中所述抗原結合蛋白顯示出增強的再循環性和/或血清穩定性。[0489]在一個方面，本申請提供了由如本申請所述的任意方法獲得的經基因修飾的免疫球蛋白重鏈基因座。[0490]在一個方面，本申請提供了由如本申請所述的任意方法獲得的經基因修飾的非人動物。[0491]在各種實施方式中，所述非人動物是哺乳動物。在一個實施方式中，所述哺乳動物是哨齒動物，例如小鼠、大鼠或倉鼠。[0492]在各種實施方式中，如本申請所述的經基因修飾的免疫球蛋白基因座存在于非人動物的種系基因組中，所述非人動物例如哺乳動物，例如嚙齒動物，例如小鼠、大鼠或倉鼠。[0493]附圖的簡要說明[0494]圖1A和1B顯示了由人源D基因區段⑶的三個閱讀框架（即終止、親水性和疏水性閱讀框架）編碼的氨基酸序列和由組氨酸取代的人源D基因區段（HD)的三個閱讀框架編碼的氨基酸序列。在親水性閱讀框架中引入組氨酸密碼子（以粗體表示）還將終止閱讀框架中的多個終止密碼子改變為Ser密碼子（以粗體表示）但是在疏水性閱讀框架中引入了極少的改變。符號表示終止密碼子，和在兩個SEQIDN0之間的逗號表示其為由終止密碼子分隔的兩條氨基酸序列。[0495]圖2顯示了將含有大觀霉素選擇性表達盒的pLMa0174靶向至MAID1116的5'末端的示意圖（步驟lBHR(Spec))。在步驟1中，將均位于hVH6-l上游的氯霉素選擇性表達盒、新霉素選擇性表達盒、loxP位點、兩個VH基因區段（hVHl-3和hVHl-2)、人源Adam6基因均從所述克隆中缺失并使用大觀霉素表達盒取代以產生VI433克隆。在步驟2(BHR(Hyg+SpeC))中，將翼側為FRT位點的含有潮霉素表達盒的pNTu0002靶向至含有人源免疫球蛋白D基因區段的區域。通過步驟2,將全部的人源D基因區段從VI433中缺失并使用潮霉素表達盒取代以產生MAID6011VI434(克隆1)。[0496]圖3顯示了通過順序連接來組裝組氨酸取代的人源D基因區段的示意圖。[0497]圖4顯示了通過酶介導的消化（PI-SceI和I-CeuI)和連接將含有新霉素表達盒的預組裝的組氨酸取代的人源D基因區段引入D-近端￥11基因區段（VH6-1)和D-近端JH基因區段（JH1)之間的區域。這一過程從MAID6011VI434中除去潮霉素表達盒并將預組裝的人源組氨酸取代的D基因區段引入該克隆。根據對新霉素和大觀霉素二者的抗性選擇包含成功靶向的克隆的細菌細胞。所得到的克隆（MAID6012VI469)從5'至3'包含（1)大觀霉素選擇性表達盒，（2)包含人源￥11基因區段（VH6-1)的50kb臂，（3)翼側為loxP位點的新霉素表達盒，（4)含有組氨酸取代的人源D基因區段（HD1.l-6.6(9586bp;SEQID勵：1)、邢1.7-6.13(9268匕？；5￡〇10勵：2)、邢1.14-6.19(944訃口；5￡〇10勵：3)和邢L20-6.25，1.26(11592bp;SEQIDN0:4))，（5)含有人源義基因區段的約25kb的基因組區域，（6)小鼠Ei序列（SEQID勵:5;在發育中的8細胞中促進￥11向〇1重排的內含子增強子）和⑵小鼠IgM恒定區核苷酸序列（mlgM外顯子1;SEQIDN0:7)。[0498]圖5顯示了通過在MAID6011VI434中使用潮霉素選擇性表達盒靶向來源于129品系的MAID1460het染色體從MAID1460雜合子ES細胞中缺失人源免疫球蛋白重鏈D基因區段的示意圖。[0499]圖6顯不了在鑒定MAID6011的篩選試驗中用于確定等位基因丟失（L0A)、等位基因獲得（G0A)或母本等位基因（母本）的引物和探針列表。[0500]圖7顯示了通過使用MAID6012VI469靶向MAID6011雜合子ES細胞來構建MAID6012het的示意圖。通過電穿孔使MAID6012VI469構建體進入MAID6011雜合子ES細胞產生MAID6012雜合子ES細胞，在所述ES細胞中129品系來源的染色體被修飾以使其從5'至3'方向含有FRT位點、人源￥11基因區段、含有adam6基因的小鼠基因組區、翼側為L〇XP(fl〇Xed)的新霉素選擇性表達盒、含有組氨酸取代的人源D基因區段（HDl.l-6.6(9586bp;SEQIDN0:1)、HD1.7-6.13(9268bp;SEQIDN0:2)、HD1.14-6.19(944訃口；5已01〇從)：3)和11〇1.20-6.25，1.26(11592匕口；5￡01〇勵：4))、人源1基因區段、小鼠Ei序列（SEQIDN0:5;在發育中的B細胞中促進￥11向0義重排的內含子增強子）和小鼠IgM恒定區核苷酸序列（mlgM外顯子1;SEQIDN0:7)。[0501]圖8顯不了在鑒定MAID6012的篩選試驗中用于確定等位基因丟失（LOA)、等位基因獲得（G0A)或母本等位基因（母本）的引物和探針列表。[0502]圖9顯示了用于從MAID6012雜合子ES細胞中除去新霉素表達盒的示意圖。通過電穿孔使Cre-表達質粒進入MAID6012ES細胞以重組和缺失翼側為LoxP(floxed)的新霉素表達盒，以產生MAID6013雜合子ES細胞。[0503]圖10A-10E顯示了帶有針對六個閱讀框架中各個框架的翻譯的人源D基因區段核苷酸序列，所述六個閱讀框架即三個閱讀框架為5'至3'方向和三個閱讀框架為相反方向(3'至5'方向符號表示終止密碼子和在兩個SEQIDN0之間的逗號表示其為由終止密碼子分隔的兩條氨基酸序列。[0504]圖11-13顯示了由6013R)雜合子小鼠表達的mRNA序列及其編碼的蛋白序列，所述序列在其129品系來源的染色體的免疫球蛋白重鏈基因座中包含組氨酸取代的人源D基因區段（HDl.l-6.6(9586bp;SEQIDN0:1)、HD1.7-6.13(9268bp;SEQIDN0:2)、HD1.14-6.19(9441bp;SEQIDN0:3)和HD1.20-6.25，L26(11592bp;SEQIDN0:4))。各圖中框中的序列表示在從包含組氨酸取代的人源D基因區段的經基因修飾的免疫球蛋白重鏈基因座中來源的CDR3序列中存在的組氨酸密碼子。FWR表示框架區和CDR表示互補性決定區。在比對中，點"表示與查詢序列相同的序列，連接線表示序列中的間隙。[0505]圖14顯示了在免疫球蛋白重鏈⑶R3序列中組氨酸的摻入頻率。X軸表示在各⑶R3序列中出現的組氨酸密碼子的數量，Y軸表示相應的讀取比例。"6013R)het"表示由含有組氨酸取代的D基因區段的6013雜合子小鼠表達的⑶R3序列。"VI3-Adam6"表示獲自對照小鼠的CDR3序列，所述對照小鼠含有人源VH、D和JH基因區段，不含如本申請所述的組氨酸修飾。"ASAP"表示獲自瑞恩澤（Regeneron)抗體數據庫的⑶R3序列，將其作為另一個對照。[0506]發明詳沭[0507]本發明不限于所述的特定方法和實驗條件，因為這種方法和條件可以改變。還應理解本申請使用的術語僅用于描述特定實施方式的目的，并不旨在限定，因為本發明的保護范圍是由權利要求定義的。[0508]除非另有定義，否則本申請使用的所有術語和短語包括所述術語和短語在本領域中所具有的含義，除非有相反的明確說明或根據使用所述術語或短語的上下文是顯而易見的。盡管在本發明的實施或檢測中可以使用與本申請所述的那些類似或等效的任意方法和材料，但是現在描述特定的方法和材料。所提及的全部出版物均通過引用并入本申請。[0509]定義[0510]本申請所使用的術語"互補性決定區"或"⑶R"包含由生物體免疫球蛋白基因的核酸序列編碼的氨基酸序列，所述免疫球蛋白基因通常（即在野生型動物中）出現在免疫球蛋白分子（例如抗體或T細胞受體）的輕鏈或重鏈可變區中的兩個框架區之間。CDR可以由例如種系序列或者重排的序列編碼，以及例如由初始（naive)B細胞或者成熟的B細胞或T細胞來編碼。CDR可以是體細胞突變的（例如不同于在動物種系中編碼的序列）、人源化的和/或使用氨基酸取代、加入或缺失修飾的。在一些情況下（例如針對CDR3)，CDR可由兩條或更多條序列（例如種系序列）編碼，所述序列（例如在未經重排的核酸序列中）不是鄰近的，但是在B細胞核酸序列中是鄰近的，例如作為所述序列剪接或連接的結果（例如V-D-J重組以形成重鏈CDR3)。[0511]在本申請中使用的術語"解離半衰期"或"t1/2"指由下述公式計算的值：[0512]t1/2(min)=(ln2/kd)/60,其中kd表示解離速率常數。[0513]涉及免疫球蛋白核酸序列的術語"種系"包含能夠傳遞給后代的核酸序列。[0514]短語"重鏈"或"免疫球蛋白重鏈"包括免疫球蛋白重鏈序列，其包括來自任意生物體的免疫球蛋白重鏈恒定區序列。除非另有明示，重鏈可變結構域包含三個重鏈⑶R和四個FR區。重鏈的片段包含CDR、CDR和FR及其組合。典型的重鏈具有下述可變結構域（從N-末端到C-末端）：CH1結構域、鉸鏈、CH2結構域和(^3結構域。重鏈的功能性片段包含能夠特異性識別表位（例如以在微摩、納摩或皮摩范圍內的KD識別所述表位）、能夠由細胞表達和分泌并且包含至少一個CDR的片段。重鏈可變結構域由可變區核苷酸序列編碼，所述序列通常包含來源于在種系中存在的VH、DH和JH區段庫的VH、DH和JH區段。各種生物體V、D和J重鏈區段的序列、位置和命名可見于MGT數據庫，可以通過在URL"imgt.org."登錄萬維網（WWW)對其進行訪問。[0515]短語"輕鏈"包括來自任何生物體的免疫球蛋白輕鏈，并且除了另有明示包括人源k和A輕鏈和VpreB，以及替代輕鏈。除非另有明示，輕鏈可變結構域通常包括三個輕鏈CDR和四個框架（FR)區。在通常情況下，全長的輕鏈從氨基末端到羧基末端包含含有FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4的可變結構域和輕鏈恒定區氨基酸序列。輕鏈可變結構域由輕鏈可變區核苷酸序列編碼，所述輕鏈可變區核苷酸序列通常包含來源于種系中存在的輕鏈V和J基因區段庫的輕鏈'和輕鏈1基因區段。各種生物體輕鏈V和J基因區段的序列、位置和命名可見于MGT數據庫，可以通過在URL"imgt.org."登錄萬維網（www)對其進行訪問。輕鏈包含例如不選擇性結合第一或第二表位的那些，所述第一或第二表位與在包含該輕鏈的表位結合蛋白選擇性結合。輕鏈還包含結合和識別或者輔助重鏈結合和識別一個或多個表位的那些，所述表位與包含該輕鏈的表位結合蛋白選擇性結合。[0516]短語"可操作地連接"指某種關系，其中所述組件以預期的方式與可操作地連接功能。在一個例子中，編碼蛋白的核酸序列可以與調節序列（例如啟動子、增強子、沉默子序列等）可操作地連接，以保持適宜的轉錄調節。在一個例子中，免疫球蛋白可變區（或V(D)J區段）核酸序列可以與免疫球蛋白恒定區的核酸序列可操作地連接，以使得在所述序列之間適宜的重組形成免疫球蛋白重鏈或輕鏈序列。[0517]在本申請中使用的短語"體細胞突變的"包含涉及來自已經過類別轉換的B細胞的核酸序列，其中在經過類別轉換的B細胞中的免疫球蛋白可變區例如重鏈可變區的核酸序列（例如重鏈可變結構域或包含重鏈⑶R或FR序列）不同于類別轉換前在B細胞中的核酸序列，例如未經過類別轉換的B細胞與已經過類別轉換的B細胞之間在CDR或框架核酸序列中存在差異。短語"體細胞突變的"包含涉及來自親和性成熟的B細胞的核酸序列，所述序列不同于在未經過親和性成熟的B細胞中相應的免疫球蛋白可變區序列（即，在種系細胞基因組中的序列）。短語"體細胞成熟的"還包含涉及將B細胞與目標表位接觸后來自B細胞的免疫球蛋白可變區核酸序列，其中所述核酸序列不同于在將所述B細胞與目標表位接觸前相應的核酸序列。短語"體細胞突變的"還涉及來自抗體的序列，所述抗體在具有人源免疫球蛋白可變區核酸序列的動物例如小鼠中針對免疫原攻擊生成并且由在這種動物中固有的選擇過程產生。[0518]表達包含組氨酸殘基的免疫球蛋白重鏈可變結構域的非人動物[0519]所述的發明提供了經基因修飾的非人動物，所述非人動物能夠產生具有pH依賴性抗原結合性質的抗原結合蛋白。在各種實施方式中，由如本申請所述的經基因修飾的非人動物產生的抗原結合蛋白顯示出增加的pH依賴的再循環效能和/或增加的血清半衰期。特別地，所述的發明在免疫球蛋白重鏈基因座中使用基因修飾以便將組氨酸密碼子引入人源重鏈可變區核苷酸序列，并且任選地在編碼CH2和/或CH3結構域的恒定區核苷酸序列中引入一個或多個突變，其增加抗體恒定區與FcRn受體的結合，這促進了抗原結合蛋白的再循環。由于質子化的組氨酸殘基位于抗原結合位點中，所以與細胞外環境中或在細胞表面上（即在生理pH下，例如pH范圍約7.0至約7.4)相比，含有所述修飾的抗原結合蛋白在酸性細胞內隔室中（例如在pH范圍是約5.5至約6.0的核內體中）可以更加松散地結合其靶點。因此，在靶點介導的內吞作用之后，與不包含這種基因修飾的野生型抗原結合蛋白相比，包含如本申請所述的基因修飾的抗原結合蛋白能夠更加迅速或有效地再循環。而且，由于經修飾的組氨酸殘基僅在酸性環境中而不是中性pH中質子化，因而預計這種修飾將不會影響抗原結合蛋白與目標抗原在生理pH下的結合親和性和/或特異性。[0520]在各種方面，本申請提供了包含免疫球蛋白重鏈基因座的非人動物，所述基因座包含未經重排的人源重鏈可變區核苷酸序列，其中所述未經重排的人源重鏈可變區核苷酸序列包含加入至少一個組氨酸密碼子或使用組氨酸密碼子取代至少一個內源性非組氨酸密碼子。[0521]在各種方面，本申請還提供了制備和使用非人動物的方法。當使用目標抗原免疫時，所述經基因修飾的非人動物能夠產生B細胞群，所述B細胞群產生包含具有組氨酸殘基的重鏈可變結構域的抗原結合蛋白，其中所述抗原結合蛋白顯示出增加的pH依賴的再循環性和/或增加的血清半衰期。在各種實施方式中，所述非人動物產生B細胞群，所述B細胞群表達人源重鏈可變結構域以及同源的人源輕鏈可變結構域。在各種實施方式中，所述經基因修飾的免疫球蛋白重鏈基因座存在于非人動物的種系基因組中。[0522]在各種實施方式中，所述經基因修飾的免疫球蛋白重鏈基因座包含修飾，所述修飾使得全部或基本上全部的內源性VH、D和義基因區段缺失或不具有功能；并且所述經基因修飾的基因座包含未經重排的重鏈可變區核苷酸序列，所述核苷酸序列包含具有一個或多個組氨酸密碼子的一個或多個人源VH、D和/或JH基因區段，其中所述未經重排的重鏈可變區核苷酸序列存在于內源性位置（即所述核苷酸序列位于野生型非人動物中）或存在于異位（即在與其基因組的內源性免疫球蛋白鏈基因座不同的基因座，或在其內源性基因座中，例如在免疫球蛋白可變基因座中，其中所述內源性基因座位于或移至基因組中的不同位置）。在一個實施方式中，例如約80%或更多的、約85%或更多的、約90%或更多的、約95%或更多的、約96%或更多的、約97%或更多的、約98%或更多的或者約99%或更多的全部內源性重鏈V、D或J基因區段缺失或使其不具有功能。在一個實施方式中，例如至少95%、96%、97%、98%或99%的內源性具有功能的重鏈V、D或J基因區段缺失或使其不具有功能。[0523]在一個實施方式中，所述非人動物是哺乳動物。盡管在本申請中廣泛討論了將組氨酸密碼子引入小鼠中未經重排的人源重鏈可變基因序列的實施方式，但是本申請還提供了其他非人動物，所述非人動物包含經基因修飾的免疫球蛋白基因座，所述基因座含有未經重排的人源重鏈可變區核苷酸序列，所述核苷酸序列含有加入至少一個組氨酸密碼子或使用組氨酸密碼子取代至少一個內源性非組氨酸密碼子。這種非人動物包含能夠被基因修飾以表達如本申請所公開的含有組氨酸重鏈可變結構域的那些非人動物中的任意一個，包含例如小鼠、大鼠、家兔、豬、牛（例如奶牛、公牛、水牛）、鹿、綿羊、山羊、雞、貓、犬、雪紹、靈長類（例如狨猴、恒河猴）等。例如，對于那些適宜的可基因修飾的ES細胞不易獲得的非人動物而言，使用其他方法制備包含所述基因修飾的非人動物。此類方法包括例如修飾非ES細胞基因組（例如成纖維細胞或誘導性多能干細胞）并且使用體細胞核轉移（SCNT)將經基因修飾的基因組轉移至適宜細胞，例如將卵母細胞去核，并在適宜條件下在非人動物中妊娠所述經修飾的細胞（例如所述經修飾的卵母細胞）以形成胚胎。用于修飾非人動物基因組（例如豬、奶牛、哨齒動物、雞等基因組）的方法包括例如使用鋅指核酸酶（ZFN)或轉錄激活因子樣效應器核酸酶（TALEN)修飾基因組以包含編碼的核苷酸序列。[0524]在一個實施方式中，所述非人動物是小型哺乳動物，例如跳鼠總科（Dipodoidea)或鼠總科（Muroidea)。在一個實施方式中，所述經基因修飾的動物是嚙齒動物。在一個實施方式中，所述哨齒動物選自小鼠、大鼠和倉鼠。在一個實施方式中，所述哨齒動物選自鼠總科。在一個實施方式中，所述經基因修飾的動物來自選自下組的科：麗倉鼠科（Calomyscidae)(例如小鼠樣倉鼠）、倉鼠科（Cricetidae)(例如倉鼠、新世界大鼠和小鼠、田鼠）、鼠科（Muridae)(真小鼠和大鼠、沙鼠、非洲刺毛鼠、帚尾倉鼠）、馬島鼠科（Nesomyidae)(攀鼠、巖鼠、白尾大鼠、馬達加斯加大鼠和小鼠）、刺山鼠科(Platacanthomyidae)(例如多刺睡鼠（spinydormouse))和廳形鼠科（Spalacidae)(例如鼴鼠、竹鼠和鼢鼠）。在一個特定的實施方式中，所述經基因修飾的嚙齒動物選自真小鼠或大鼠（鼠科）、沙鼠、非洲刺毛鼠和帚尾倉鼠。在一個實施方式中，所述經基因修飾的小鼠來自鼠科成員。在一個實施方式中，所述動物是哨齒動物。在一個特定的實施方式中，所述哨齒動物選自小鼠和大鼠。在一個實施方式中，所述非人動物是小鼠。[0525]在一個實施方式中，所述非人動物是嚙齒動物，所述嚙齒動物是選自下組的C57BL品系的小鼠：C57BL/A、C57BL/An、C57BL/GrFa、C57BL/KaLwN、C57BL/6、C57BL/6J、C57BL/6ByJ、C57BL/6N、C57BL/6NJ、C57BL/10、C57BL/10ScSn、C57BL/10Cr和C57BL/Ola。在另一個實施方式中，所述小鼠是129品系。在一個實施方式中，所述129品系選自下組：129P1、129P2、129P3、129X1、129S1(例如129Sl/SV、129Sl/SvIm)、129S2、129S4、129S5、129S9/SvEvH、129S6(129/SvEvTac)、129S7、129S8、129T1、129T2(參見例如Festing等，（1999)Revisednomenclatureforstrain129mice(129小鼠品系經修訂的命名法），MammalianGenome10:836,亦參見Auerbach等，（2000)EstablishmentandChimeraAnalysisof129/SvEv-andC57BL/6_DerivedMouseEmbryonicStemCellLines(129/SvEv-和C57BL/6-來源的小鼠胚胎干細胞系的建立和嵌合體分析））。在一個實施方式中，所述經基因修飾的小鼠是前述129品系和前述C57BL品系（例如C57BL/6品系）的混合。在另一個實施方式中，所述小鼠是前述129品系的混合，或前述C57BL/6品系的混合。在一個實施方式中，所述129品系的混合是129S6(129/SvEvTac)品系。在另一個實施方式中，所述小鼠是129/SvEv-和C57BL/6-來源的品系的混合。在一個特定的實施方式中，所述小鼠是在如Auerbach等2000BioTechniques29:1024-1032中所述的129/SvEv-和C57BL/6-來源的品系的混合。在另個實施方式中，所述小鼠是BALB品系，例如BALB/c品系。在另一個實施方式中，所述小鼠是BALB品系（例如BALB/c品系）和另一種如述品系的混合。[0526]在一個實施方式中，所述非人動物是大鼠。在一個實施方式中，所述大鼠選自Wistar大鼠、LEA品系、SpragueDawley大鼠、Fischer品系、F344、F6和DarkAgouti。在一個實施方式中，所述大鼠品系是兩種或更多種選自下組的品系的混合:Wistar、LEA、SpragueDawley、Fischer、F344、F6和DarkAgouti〇[0527]在一個實施方式中，所述非人動物是小鼠。在一個實施方式中，所述小鼠是VELOCIMMUNE?人源化小鼠。[0528]VELOCIMMUNE?人源化小鼠（參見例如US6,596,541、US7,105,348和US20120322108A1，其通過引用整體并入本申請）含有在內源性小鼠基因座使用人源免疫球蛋白可變區對小鼠免疫球蛋白可變區的精確取代，所述小鼠在B細胞發育方面顯示出與野生型小鼠令人吃驚的和顯著的相似性。VELOCIMMUNE?人源化小鼠對免疫顯示出基本正常的野生型應答，僅在一個重要方面與野生型小鼠不同--其免疫應答產生的可變區是全人源的。[0529]VELOCIMMUNE?.人源化小鼠含有使用相應的人源免疫球蛋白可變區核苷酸序列在內源性基因座對小鼠免疫球蛋白重鏈（IgH)和免疫球蛋白輕鏈（例如k輕鏈，Igi〇的種系可變區核苷酸序列的精確的、大規模的取代（參見例如US6,596,541、US7，105,348、US20120322108A1，其通過引用整體并入本申請）。總體而言，約6百萬堿基的小鼠基因座被約1.5百萬堿基的人源基因組序列取代。該精確的取代得到具有雜交的免疫球蛋白基因座的小鼠，所述小鼠制備具有人源可變區和小鼠恒定區的重鏈和輕鏈。小鼠VH-D-義和Vk-Jk區段的精確取代在雜交的免疫球蛋白基因組中保留了被翼側包圍的小鼠序列的完整性和功能。所述小鼠體液免疫系統的功能與野生型小鼠類似。B細胞發育在任何重要的方面都沒有阻礙，并且在抗原攻擊后在小鼠中產生了豐富多樣的人源可變區。[0530]VELOCIMMUNE?人源化小鼠是可能的，因為在人和小鼠中用于重鏈和k輕鏈重排的免疫球蛋白基因區段具有相似性，這并不是說其基因座是相同的或甚至幾乎如此--顯然它們不是。然而，所述基因座足夠相似，可以通過使用基本上覆蓋人源免疫球蛋白基因座的等效序列的、約1百萬個堿基的相鄰的人源基因組序列來取代含有全部VH、D和JH基因區段的約3百萬個堿基對的相鄰的小鼠序列，從而實現所述重鏈可變基因座的人源化。[0531]在一些實施方式中，使用人源恒定區核苷酸序列對某些小鼠恒定區核苷酸序列的進一步取代（例如使用人源重鏈CH1核苷酸序列取代小鼠重鏈CH1核苷酸序列，和使用人源輕鏈恒定區核苷酸序列取代小鼠輕鏈恒定區核苷酸序列）得到具有雜交的免疫球蛋白基因座的小鼠，所述小鼠制備具有人源可變區和部分人源恒定區的抗體，其適于例如制備全人源抗體片段，例如全人源Fab。具有雜交的免疫球蛋白基因座的小鼠顯示出正常的可變基因區段重排、正常的體細胞高突變頻率和正常的類別轉換。這些小鼠顯示出與野生型小鼠沒有區別的體液免疫系統，并且在B細胞發育的所有階段均顯示出正常的細胞群和正常的淋巴器官結構--即使是缺乏人源可變區核苷酸區段的完整的庫的小鼠。免疫這些小鼠導致了強大的體液應答，所述體液應答顯示出廣泛多樣的可變基因區段的使用。[0532]對小鼠種系可變區核苷酸序列的精確取代使得制備得到具有部分人源免疫球蛋白基因座的小鼠。由于部分人源免疫球蛋白基因座正常地重排、高突變和類別轉換，因而所述部分人源免疫球蛋白基因座在小鼠中產生包含人源可變區的抗體。編碼所述可變區的核苷酸序列能夠被鑒定和克隆，然后與所選擇的任意序列例如適用于特定用途的任意免疫球蛋白同種型融合（例如在體外系統中），結果得到全部來源于人源序列的抗體或抗原結合蛋白。[0533]在各種實施方式中，至少一個組氨酸密碼子存在于編碼N-末端區、環4區、⑶R1、⑶R2、⑶R3或其組合的未經重排的重鏈可變區核苷酸序列中。[0534]在各種實施方式中，至少一個組氨酸密碼子存在于編碼選自下組的框架區（FR)的未經重排的重鏈可變區核苷酸序列中：FR1、FR2、FR3和FR4。[0535]在各種方面，所述經基因修飾的免疫球蛋白基因座包含其中至少一個密碼子被組氨酸密碼子取代的核苷酸序列。[0536]在各種方面，所述經基因修飾的免疫球蛋白基因座包含未經重排的人源重鏈可變區核苷酸序列，所述核苷酸序列包含使用組氨酸密碼子取代至少一個內源性非組氨酸密碼子。[0537]在一個實施方式中，使用組氨酸密碼子取代2個或更多個、3個或更多個、4個或更多個、5個或更多個、6個或更多個、7個或更多個、8個或更多個、9個或更多個、10個或更多個、11個或更多個、12個或更多個、13個或更多個、14個或更多個、15個或更多個、16個或更多個、17個或更多個、18個或更多個、19個或更多個、20個或更多個、21個或更多個、22個或更多個、23個或更多個、24個或更多個、25個或更多個、26個或更多個、27個或更多個、28個或更多個、29個或更多個、30個或更多個、31個或更多個、32個或更多個、33個或更多個、34個或更多個、35個或更多個、36個或更多個、37個或更多個、38個或更多個、39個或更多個、40個或更多個、41個或更多個、42個或更多個、43個或更多個、44個或更多個、45個或更多個、46個或更多個、47個或更多個、48個或更多個、49個或更多個、50個或更多個、51個或更多個、52個或更多個、53個或更多個、54個或更多個、55個或更多個、56個或更多個、57個或更多個、58個或更多個、59個或更多個、60個或更多個或者61個或更多個內源性非組氨酸密碼子。[0538]此前對人源免疫球蛋白D基因區段的閱讀框架使用情況的研究顯示在三個閱讀框架（例如終止、疏水性和親水性閱讀框架）中，終止框架的使用非常不頻繁。顯然，一些終止框架被損壞（chewedback)并導致表達。然而，終止閱讀框架的使用頻率非常低，使得在用于工程改造組氨酸密碼子的目的時不使用終止閱讀框架是更有效的。在親水性和疏水性閱讀框架之間，親水性閱讀框架似乎是優選的。因而，在一個實施方式中，對人源D基因區段的親水性閱讀框架進行工程改造以使其含有一個或多個組氨酸密碼子（與終止框架或疏水性框架相比）。[0539]在體外引入突變的方法例如位點定向誘變是本領域熟知的。在所述發明的一些實施方式中，通過計算機模擬（insilico)設計組氨酸取代的人源D基因區段（例如將Y、D和N密碼子突變為H密碼子，例如CAT、CAC)來富集組氨酸密碼子，這是使用用于將其再連接在一起的（獨特）限制性酶位點合成（例如化學合成）。使用上游和下游適宜的重組信號序列（RSS)制備所合成的D基因區段。在一個實施方式中，當彼此連接時，所合成的組氨酸取代的D基因區段包含在各人源D基因區段之間出現的基因間序列。[0540]應理解編碼所述一個或多個組氨酸的密碼子在重排和/或體細胞高突變后可以改變，以使得一個或多個組氨酸變成其他氨基酸。然而，這可能不發生在非人動物中的每次重排中的每個編碼組氨酸的密碼子上。如果發生這種改變，則所述改變可能發生在一些但不是全部的B細胞上或在一些但不是全部的重鏈可變序列上。[0541]在各種方面，所述經基因修飾的免疫球蛋白基因座包含人源重鏈V、D和J基因區段，其中至少一個所述人源D基因區段相對于相應的野生型序列已從5'至3'反轉，并且其中反轉的人源D基因區段的至少一個閱讀框架包含組氨酸密碼子。[0542]在各種實施方式中，所述核苷酸序列包含1個或更多個、2個或更多個、3個或更多個、4個或更多個、5個或更多個、6個或更多個、7個或更多個、8個或更多個、9個或更多個、10個或更多個、11個或更多個、12個或更多個、13個或更多個、14個或更多個、15個或更多個、16個或更多個、17個或更多個、18個或更多個、19個或更多個、20個或更多個、21個或更多個、22個或更多個、23個或更多個、24個或更多個或者25個或更多個組氨酸密碼子。[0543]在6個家族、每個家族有3-5個成員（1個家族一D7家族一具有一個成員）中，有25個具有功能的人源D基因區段。人源D基因區段的直接重組比反向的頻率高得多，盡管反轉閱讀框架顯示有更多的組氨酸密碼子。某些D基因區段和閱讀框架比其他的使用地更加頻繁。針對所有具有功能的D基因區段的全部三個正向閱讀框架和全部三個反轉閱讀框架見圖10A-10E。如圖10A-10E所示，與正向閱讀框架相比，在反轉閱讀框架中具有更多的組氨酸密碼子。更具體地，在反轉閱讀框架中有34個組氨酸，在正向閱讀框架中僅有4個。此外，在正向閱讀框架的4個組氨酸中，有3個組氨酸由假基因編碼或存在于替代等位基因中。因此，種系人源D基因區段僅有一個正向閱讀框架含有組氨酸密碼子，更多的組氨酸密碼子可能出現在替代等位基因中（可能在人群子集中）。[0544]反轉的D重排極為罕見。Tuaillon等（J.Immunol.，154(12):5453-6465,其通過引用整體并入本申請）發現反轉閱讀框架的使用非常罕見（通過有限稀釋PCT測定），即在大多數情況下正向與反向重排的比例為100至1000。就正向與反向重排的比例較低的問題而言，其僅在顯示出極低使用情況的那些D區段中觀察到。還發現與J1相鄰（遠離其他D家族成員）的D基因區段家族7在胎兒中使用最多，但是在成人中顯示出較低的使用情況(Schroeder等，Immunology30,2006,119-135,其通過引用整體并入本申請）。因此，在一個實施方式中，D家族7序列不是5'至3'反轉的。[0545]在一個實施方式中，至少2個、至少3個、至少4個、至少5個、至少6個、至少7個、至少8個、至少9個、至少10個、至少11個、至少12個、至少13個、至少14個、至少15個、至少16個、至少17個、至少18個、至少19個、至少20個、至少21個、至少22個、至少23個、至少24個或者全部或基本上全部的人源具有功能的D基因序列相對于相應的野生型序列是5'至3'反轉的。[0546]在一個實施方式中，包含至少一個非天然存在的組氨酸殘基的所述人源免疫球蛋白重鏈可變結構域顯示出pH依賴的抗原結合特性。例如，包含所述經修飾的免疫球蛋白重鏈可變結構域的抗體在約中性pH下（例如pH約7.0至約7.4)以充足的親和性與靶點結合，而在酸性pH下（例如pH約5.5至約6.0)與相同的靶點不結合或結合減弱。在一個實施方式中，所述酸性pH選自約5.5、約5.6、約5.7、約5.8、約5.9和約6.0。在一個實施方式中，所述中性pH選自約7.0、約7.1、約7.2、約7.3和約7.4。[0547]在一個實施方式中，由如本申請所述的經基因修飾的免疫球蛋白重鏈基因座表達的、含有重鏈可變結構域的抗原結合蛋白在25°C在酸性pH下（例如pH約5.5至約6.0)具有的解離半衰期（t1/2)少于2min。在一個實施方式中，由如本申請所述的經基因修飾的免疫球蛋白重鏈基因座表達的、含有重鏈可變結構域的抗原結合蛋白在37°C在酸性pH下（例如pH約5.5至約6.0)具有的解離半衰期（t1/2)少于2min。在一個實施方式中，由如本申請所述的經基因修飾的免疫球蛋白重鏈基因座表達的、含有重鏈可變結構域的抗原結合蛋白在25°C在酸性pH下（例如pH約5.5至約6.0)具有的解離半衰期（t1/2)少于lmin。在一個實施方式中，由如本申請所述的經基因修飾的免疫球蛋白重鏈基因座表達的、含有重鏈可變結構域的抗原結合蛋白在37°C在酸性pH下（例如pH約5.5至約6.0)具有的解離半衰期（t1/2)少于lmin。在一個實施方式中，由如本申請所述的經基因修飾的免疫球蛋白基因座表達的、含有重鏈可變結構域的抗原結合蛋白在酸性pH下（例如pH約5.5至約6.0)的解離半衰期（t1/2)比所述抗原結合蛋白在中性pH下（例如pH約7.0至約7.4)的解離半衰期（t1/2)降低至少約2倍、至少約3倍、至少約4倍、至少約5倍、至少約10倍、至少約15倍、至少約20倍、至少約25倍或至少約30倍。[0548]在一個實施方式中，包含經基因修飾的人源免疫球蛋白重鏈可變結構域的抗原結合蛋白能夠在中性或生理pH下（pH約7.0至約7.4)以低于10_6、10_7、10_8、10_9或10_1(1、KTn、l(r12的親和性（KD)與目標抗原特異性結合。[0549]在酸性pH下（例如pH約5.5至約6.0)所述免疫球蛋白重鏈可變結構域改變的結合性質將在一些情況下允許抗體更迅速的周轉（turnover)，因為與細胞表面上的靶點結合的治療性抗體將被內化進入核內體，并且在核內體中更容易或更迅速地從靶點上解離，以使得治療劑能被再循環以結合在另一個細胞上存在的另一個靶分子。這將導致能夠以較低的劑量給予治療性抗體，或者以較少的頻率給予治療抗體。這對于不希望頻繁給予治療性抗體或者給藥超過一定劑量會導致安全性或毒性問題的情況是特別有用的。[0550]在各種實施方式中，如本申請所述的人源免疫球蛋白重鏈可變區核苷酸序列與人源或非人源重鏈恒定區核苷酸序列（例如編碼選自IgM、IgD、IgG、IgE和IgA的免疫球蛋白同種型的重鏈恒定區核苷酸序列）可操作地連接。在各種實施方式中，所述人源或非人源重鏈恒定區核苷酸序列選自下組：CH1、鉸鏈、CH2、CH3及其組合。在一個實施方式中，所述恒定區核苷酸序列包含CH1、鉸鏈、CH2和CH3(例如CH1-鉸鏈-CH2-CH3)。[0551]在各種實施方式中，所述重鏈恒定區核苷酸序列存在于內源性基因座（即所述核苷酸序列位于野生型非人動物中）存在于異位（例如，在與其基因組的內源性免疫球蛋白鏈基因座不同的基因座，或在其內源性基因座中，例如在免疫球蛋白可變基因座中，其中所述內源性基因座位于或移至基因組中的不同位置）。[0552]在一個實施方式中，所述重鏈恒定區核苷酸序列包含在CH2或CH3中的修飾，其中所述修飾增加在酸性環境中（例如在pH范圍是約5.5至約6.0的核內體中）所述重鏈恒定區氨基酸序列核內體與FcRn的親和性。[0553]針對IgG的新生兒Fc受體（FcRn)已在由母體通過胎盤和近端小腸向其胎兒轉移的被動體液免疫中被很好地表征（Roopenian，D.和Akilesh，S.，Nat.Rev.Immun.，2007,7:715-725,其通過引用整體并入本申請）。FcRn與IgG的Fc部分結合的位點不同于啟動補體活化經典通路中的經典FcYR或補體Clq組分的結合位點。更具體地，顯示了FcRn結合IgG抗體的CH2-CH3鉸鏈區--多功能的Fc區，所述Fc區還與金黃色葡萄球菌（Staphylococcal)蛋白A、鏈球菌（Streptococcal)蛋白G和類風濕因子結合。然而，與其他Fc結合蛋白不同，FcRn以嚴格的pH依賴性方式與IgG的Fc區結合；在生理條件下的pH7.4時，FcRn不結合IgG，而在核內體的酸性pH下（例如pH范圍約5.5至約6.0)，FcRn針對IgG的Fc區顯示出較低的微摩至納摩的親和性。已發現這種pH依賴性相互作用由在IgG的CH2-CH3區中組氨酸殘基的滴度及其隨后與FcRn表面上的酸性殘基的相互作用所介導（Roopenian,D?和Akilesh,S.，Nat.Rev.Immun.，2007,7:715-725,其通過引用整體并入本申請）。[0554]在IgG的CH2_CH3區中能夠增加在酸性pH下Fc區與FcRn的親和性的多種突變是本領域所公知的。這些包括但不限于在位置250的修飾（例如E或Q);在250和428的修飾（例如L或F);在252的修飾（例如L/Y/F/W或T)、在254的修飾（例如S或T)和在256的修飾（例如S/R/Q/E/D或T);或在位置428和/或433的修飾（例如L/R/S/P/Q或K)和/或434的修飾（例如H/F或Y);或在位置250和/或428的修飾；或在位置307或308的修飾（例如308F、V308F)和434的修飾。在另一個實施例中，所述修飾可以包含428L(例如M428L)和434S(例如N434S)修飾；428L、259I(例如V259I)和308F(例如V308F)修飾；433K(例如H433K)和434(例如434Y)修飾；252、254和256(例如252Y、254T和256E)修飾；250Q和428L修飾或其組合。[0555]在一個實施方式中，所述重鏈恒定區核苷酸序列編碼人源CH2氨基酸序列，所述人源CH2氨基酸序列包含在位置252和257的氨基酸殘基之間的至少一個修飾，其中所述修飾在酸性環境中（例如在pH范圍是約5.5至約6.0的核內體中）增加所述人源CH2氨基酸序列對FcRn的親和性。[0556]在一個實施方式中，所述重鏈恒定區核苷酸序列編碼人源CH2氨基酸序列，所述人源CH2氨基酸序列包含在位置307和311的氨基酸殘基之間的至少一個修飾，其中所述修飾在酸性環境中（例如在pH范圍是約5.5至約6.0的核內體中）增加所述CH2氨基酸序列對FcRn的親和性。[0557]在一個實施方式中，所述重鏈恒定區核苷酸序列編碼人源CH3氨基酸序列，所述人源CH3氨基酸序列包含在位置433和436的氨基酸殘基之間的至少一個修飾，其中所述修飾在酸性環境中（例如在pH范圍是約5.5至約6.0的核內體中）增加所述CH3氨基酸序列對FcRn的親和性。[0558]在一個實施方式中，由如本申請所述的重鏈恒定區核苷酸序列編碼的所述人源恒定區氨基酸序列包含選自下組的突變：M428UN434S及其組合。在一個實施方式中，所述人源恒定區氨基酸序列包含選自下組的突變：M428L、V259I、V308F及其組合。在一個實施方式中，所述人源恒定區氨基酸序列包含N434A突變。在一個實施方式中，所述人源恒定區氨基酸序列包含選自下組的突變：M252Y、S254T、T256E及其組合。在一個實施方式中，所述人源恒定區氨基酸序列包含選自下組的突變：T250Q、M248L或這兩者。在一個實施方式中，所述人源恒定區氨基酸序列包含選自下組的突變：H433K、N434Y或這兩者。[0559]在一個實施方式中，所述重鏈恒定區氨基酸序列是非人源恒定區氨基酸序列，并且所述重鏈恒定區氨基酸序列包含上文所述任意類型的修飾中的一種或多種。[0560]在一個實施方式中，所述重鏈恒定區核苷酸序列是人源重鏈恒定區氨基酸序列，并且所述人源重鏈恒定區氨基酸序列包含上文所述任意類型的修飾中的一種或多種。實施例[0561]本發明提供下述實施例是為了向本領域的普通技術人員提供如何制備和使用本發明的完整的公開和描述，而不是旨在限定發明人所認為的發明的范圍，也不旨在表示下面的實驗是完成的所有的實驗或僅有的實驗。盡力確保所使用的數量（例如量、溫度等）的準確度，但是應考慮一些實驗誤差和偏差。除非另有明示，份數以重量份計，分子量以平均分子量表示，溫度以攝氏度表示，以及壓力為處于或接近大氣壓。[0562]實施例1:包含組氨酸取代的D基因區段的人源化免疫球蛋白重鏈基因座的構建[0563]通過使用細菌人工染色體（BAC)DNA，在細菌細胞（BHR)中進行一系列同源重組反應來構建含有組氨酸取代的人源D基因區段的免疫球蛋白重鏈基因座。使用VELOCIGENE??因工程技術生成用于形成基因工程小鼠的若干靶向構建體，所述基因工程小鼠表達含有一個或多個組氨酸殘基的重鏈可變結構域（參見例如美國專利號6,586,251和Valenzuela,D.M.等（2003)，High-throughputengineeringofthemousegenomecoupledwithhigh-resolutionexpressionanalysis(與高分辨表達分析偶聯的小鼠基因組的高通量工程改造），NatureBiotechnology21(6):652-659,其通過引用整體并入本申請）。[0564]首先，在計算機模擬中以四個片段（4個重復）的形式合成人源D基因區段，其中在親水性框架中編碼酪氨酸（Y)、天冬酰胺（N)、絲氨酸（S)和天冬氨酸（D)的密碼子被組氨酸密碼子取代（在下文中"組氨酸取代的人源D基因區段"，即HD1.1-6.6(9586bp;SEQ10吣：1)、邢1.7-6.13(9268匕口；5￡〇10吣：2)、邢1.14-6.19(944訃口；5￡〇10吣：3)和HD1.20-6.25,1.26(11592bp;SEQIDN0:4)(圖3)。所述四個重復還在末端含有用于將其重新連接在一起的獨特的限制性酶位點。在各人源D基因區段中的組氨酸取代的特定位置（以粗體標記）如圖1A和1B中標記為"親水性"的一欄所示。如圖1所示，所述修飾在親水性閱讀框架中引入組氨酸密碼子的同時，還將"終止"閱讀框架中的一些終止密碼子變為絲氨酸密碼子。然而，所述修飾幾乎沒有改變"疏水性"閱讀框架。將四個合成的D區段重復連接的詳細步驟如圖3中所示（順序連接）。所得到的克隆從5'至3'含有5'小鼠同源臂、翼側為loxP位點（floxed)的新霉素表達盒、含有組氨酸取代的人源D基因區段（即HDl.l-6.6(9586bp;SEQIDN0:1)、HD1.7-6.13(9268bp;SEQIDN0:2)、HD1.14-6.19(9441bp;SEQIDN0:3)和HD1.20-6.25，L26(11592bp;SEQIDN0:4))、氯霉素選擇性表達和3'同源臂。[0565]進行下述六個基因修飾以便使用上文所述的組氨酸取代的人源D基因區段在VELOCIMMUNE?人源化小鼠中取代內源性人源D基因區段。[0566]首先，將含有大觀霉素選擇性表達盒和AsiSI限制性位點的pLMa0174靶向至MAID1116克隆的5'末端（步驟lBHR(Spec);圖2)。在步驟1中，將全部位于hVH6-l的5'上游的氯霉素選擇性表達盒、新霉素選擇性表達盒、loxP位點、兩個％基因區段（hVHl-3和hVHl-2)和人源Adam6p基因均從MAID1116克隆中缺失并使用大觀霉素表達盒取代以產生VI433克隆。[0567]其次，在步驟2中（BHR(Hyg+SpeC);圖2)，將含有翼側為FRT位點的潮霉素表達盒的pNTu0002靶向至含有人源免疫球蛋白DH基因區段的區域。在步驟2中，將全部的人源重鏈D基因區段從VI433中缺失并使用潮霉素表達盒取代以產生MAID6011VI434(克隆1)。所述修飾還在潮霉素表達盒的5'和3'末端引入PI-SceI和I-CeuI限制性位點。[0568]第三，通過限制性消化和連接將含有組氨酸取代的人源D基因區段(HD1.1-6.6(9586bp；SEQIDN0:1),HD1.7-6.13(9268bp；SEQIDN0:2),HD1.14-6.19(9441bp;SEQIDN0:3)和HDL20-6.25，1.26(11592bp;SEQIDN0:4))的基因組區域引入在MAID6011VI434的PI-SceI和I-CeuI位點之間的區域（PI-SceI/I-CeuI連接修飾的1116(Kan+Spec);圖4)。這產生了MAID6012VI469,所述MAID6012VI469從5'至3'含有大觀霉素表達盒、含有VH6-1的約50kb的基因組區域、翼側為loxP位點的新霉素表達盒、約40kb的組氨酸取代的人源D基因區段（HD1.l-6.6(9586bp;SEQID勵：1)、邢1.7-6.13(9268匕？；5￡〇10勵：2)、邢1.14-6.19(944訃口；5￡〇10勵：3)和邢1.20-6.25,1.26(11592bp;SEQIDN0:4))和含有人源JH基因區段的約25kb的基因組區域，后接小鼠EiOnlgH內含子增強子；SEQIDN0:5)、小鼠轉換區（SEQIDN0:6)和小鼠IgM恒定區核苷酸序列（mlgM外顯子1;SEQIDNO:7)。基于卡那霉素和大觀霉素的選擇性來選擇含有所述修飾的細菌細胞。[0569]第四，如圖5中所示，通過電穿孔將MAID6011VI434靶向至MAID1460雜合子小鼠ES細胞以便從MAID1460克隆中除去全部內源性人源D基因區段。這產生了MAID6011雜合子小鼠ES細胞，所述ES細胞在其免疫球蛋白重鏈基因座中（在129品系來源的染色體上）從5'至3'含有FRT位點、人源VH基因區段、包含adam6a/b基因的小鼠基因組區域、翼側為FRT位點的潮霉素表達盒和人源JH區段，后接小鼠Ei序列和IgM恒定區核苷酸序列。通過使用如圖6所示的探針和引物確證了MAID6011的基因修飾（等位基因喪失、等位基因獲得和存在母本等位基因）。[0570]第五，使用MAID6012VI469電穿孔MAID6011雜合子小鼠ES細胞，以便將組氨酸取代的人源D基因區段（即HDl.l-6.6(9586bp;SEQIDN0:1)、HD1.7-6.13(9268bp;SEQIDN0:2)、HD1.14-6.19(9441bp;SEQIDN0:3)和HD1.20-6.25，L26(11592bp;SEQIDN0:4))引入MAID6011。所述靶向步驟從MAID6011中除去翼側為loxP位點的潮霉素選擇性表達盒并且使用組氨酸取代的人源D基因區段取代所述序列。這產生了MAID6012雜合子ES細胞，所述ES細胞含有野生型C57BL/6品系來源的染色體和經基因修飾的129品系來源的染色體，所述染色體含有人源野生型￥11和義基因區段和本申請所述的組氨酸取代的人源D基因區段。此外，所述ES細胞包含在VH和D區段之間含有adam6a/b基因和翼側為loxP位點的新霉素表達盒的小鼠基因組區域（圖7)。通過使用如圖8所示的探針和引物確證了MAID6012的基因修飾（等位基因喪失、等位基因獲得和存在母本等位基因）。[0571]最后，使用表達Cre重組酶的質粒電穿孔MAID6012ES細胞以便從MAID6012ES細胞中除去新霉素選擇性表達盒，結果得到MAID6013雜合子ES細胞（圖9)。最終的MAID6013雜合子（"MAID6013het"）ES細胞含有野生型C57BL/6品系來源的染色體和經基因修飾的129品系來源的染色體，所述經基因修飾的129品系來源的染色體在其免疫球蛋白重鏈基因座中從5'至3'含有：（1)FRT位點；（2)人源VH基因區段；（3)包含adam6a/b基因的小鼠基因組區域；（4)翼側為FRT位點的新霉素選擇性表達盒；（5)組氨酸取代的人源D基因區段（HDl.l-6.6(9586bp;SEQIDN0:1)、HD1.7-6.13(9268bp;SEQIDN0:2)、HD1.14-6.19(9441bp;SEQIDN0:3)和HD1.20-6.25，1.26(11592bp;SEQIDN0:4));(6)人源義基因區段；后接⑵小鼠Ei序列（mlgH內含子增強子；SEQIDN0:5)，（8)轉換區（SEQIDN0:6);和（9)小鼠IgM恒定區核苷酸序列（mlgM外顯子1;SEQIDN0:7)，如圖9所示。[0572]使用上文所述的靶向的ES細胞（MAID6013)作為供體ES細胞并且通過VELOCIMOUSE?方法將其引入8細胞階段的小鼠胚胎（參見例如US7,576,259、US7,659,442、US7,294,754、US2008-0078000A1，其均通過引用整體并入本申請）。通過使用圖8中所示引物和探針的基因分型對攜帶經基因修飾的免疫球蛋白重鏈基因座的小鼠進行鑒定，所述基因座含有本申請所述的組氨酸取代的人源重鏈D基因區段。將所得到的經基因修飾的小鼠與野生型小鼠交配以獲得F1后代。對F1幼仔進行基因分型，并且選擇針對含有組氨酸取代的人源重鏈D基因區段的經基因修飾的免疫球蛋白基因座是雜合子的F1幼仔進行進一步鑒定。[0573]實施例2:重排的重鏈可變區核苷酸序列的分析[0574]接下來，檢查含有本申請所述組氨酸取代的人源D基因區段的所述經基因修飾的小鼠（即6013R)雜合子小鼠）是否能夠表達含有來源于經基因修飾的免疫球蛋白重鏈基因座的一個或多個組氨酸密碼子的重排的重鏈V(D)J序列，所述6013R)雜合子小鼠在其種系中含有129品系來源的染色體，所述染色體含有人源￥11、義基因區段和組氨酸取代的人源D基因區段（HDl.l-6.6(9586bp;SEQIDN0:1)、HD1.7-6.13(9268bp;SEQIDN0:2)、HD1.14-6.19(9441bp;SEQIDN0:3)和HD1.20-6.25，1.26(11592bp;SEQIDN0:4))。[0575]為了這個目的，通過高通量測序針對來源于組氨酸取代的人源D基因區段的IgMCDR3序列的存在情況分析了編碼IgM重鏈可變區的mRNA序列。簡言之，收集脾臟并使用玻片在lxPBS(Gibco)中勻漿。在離心機中將細胞離心沉淀（500xg，5分鐘），并且在ACK裂解緩沖液（Gibco)中裂解紅細胞3分鐘。使用lxPBS洗滌細胞并使用0.7ym的細胞篩過濾。使用針對CD19的MACS磁性陽性選擇從脾細胞中分離B-細胞（美天旎生物公司(MiltenyiBiotec))。使用RNeasyPlus試劑盒（凱杰公司（Qiagen))從沉淀的B細胞中分離總RNA。使用Oligotcx?DirectmRNA微量試劑盒（凱杰公司（Qiagen))從總RNA中分離PolyA+mRNA。[0576]使用SMARTer?PicocDNA合成試劑盒（克隆達公司（Clontech))通過5'RACE從脾臟B細胞中制備雙鏈cDNA。使用英杰公司（Invitrogen)的SuperscriptII和dNTP代替克隆達公司的逆轉錄酶和dNTP。使用IgM恒定區特異性引物和SMARTer?5'RACE引物(表1)從cDNA擴增重鏈可變區（VH)抗體庫。使用QIAquick?PCR純化試劑盒（凱杰公司(Qiagen))純化PCR產物。使用相同的5'RACE引物和嵌套的對IgM恒定區具有特異性的3'引物進行第二輪PCR(表2)。使用SizeSelect?E-gd_3i:系統（英杰公司（Invitrogen))純化第二輪的PCR產物。使用加入454個適體（adapter)和條形碼（barcode)的引物進行第三輪PCR。使用Agcncourt?AMPure?XP小珠純化第三輪PCR產物。使用KAPA實驗室定量試劑盒（KAPA生物系統公司（KAPABiosystems))通過SYBR?-qPCR對純化的PCR產物進行定量。根據生產廠商的方案，使用454GS小型鈦系列Lib-AemPCR試劑盒（羅氏診斷公司（RocheDiagnostics))對混合文庫進行乳液PCR(emPCR)并且使用Roche454GS小型儀器進行雙向測序。[0577]表1[0578][0579]生物信息分析【權利要求】1.一種非人動物，所述動物在其種系中含有經基因修飾的免疫球蛋白重鏈基因座，所述基因座含有未經重排的人源免疫球蛋白重鏈可變區核苷酸序列，其中所述未經重排的重鏈可變區核苷酸序列包含加入至少一個組氨酸密碼子或使用組氨酸密碼子取代至少一個內源性非組氨酸密碼子。2.根據權利要求1所述的非人動物，其中所述非人動物是哺乳動物。3.根據權利要求2所述的非人動物，其中所述哺乳動物是選自下組的嚙齒動物：小鼠、大鼠和倉鼠。4.根據權利要求1所述的非人動物，其中所述加入或取代的組氨酸密碼子存在于選自人源VH基因區段、人源D基因區段、人源JH基因區段及其組合的人源免疫球蛋白重鏈基因區段中。5.根據權利要求4所述的非人動物，其中所述人源免疫球蛋白重鏈基因區段選自人源種系VH基因區段、人源種系D基因區段、人源種系JH基因區段及其組合。6.根據權利要求5所述的非人動物，其中所述加入或取代的組氨酸密碼子存在于所述人源免疫球蛋白重鏈基因區段的至少一個閱讀框架中，所述閱讀框架編碼選自N-末端區、環4區、互補性決定區1(⑶R1)、互補性決定區2(⑶R2)、互補性決定區3(⑶R3)及其組合的重鏈可變結構域。7.根據權利要求1所述的非人動物，其中被所述組氨酸密碼子取代的所述內源性非組氨酸密碼子編碼選自下組的氨基酸：Y、N、D、Q、S、W和R。8.根據權利要求1所述的非人動物，其中所述加入或取代的組氨酸密碼子存在于人源D基因區段的至少一個閱讀框架中。9.根據權利要求8所述的非人動物，其中所述閱讀框架是所述人源D基因區段的親水性框架，并且所述親水性框架包含編碼選自下組的氨基酸序列的核苷酸序列：SEQIDN0:46、SEQIDN0:48、SEQIDN0:50、SEQIDN0:52、SEQIDN0:54、SEQIDN0:56、SEQIDN0:58、SEQIDN0:60、SEQIDN0:62、SEQIDN0:64、SEQIDN0:66、SEQIDN0:68、SEQIDN0:70、SEQIDN0:72、SEQIDN0:74、SEQIDN0:76、SEQIDN0:78、SEQIDN0:80、SEQIDN0:82、SEQIDN0:84、SEQIDN0:86及其組合。10.根據權利要求1所述的非人動物，其中所述未經重排的重鏈可變區核苷酸序列與人源或非人源重鏈恒定區核苷酸序列可操作地連接。11.根據權利要求10所述的非人動物，其中所述未經重排的重鏈可變區核苷酸序列與選自下組的內源性非人源重鏈恒定區核苷酸序列可操作地連接：CH1、鉸鏈、CH2、CH3及其組合。12.根據權利要求10所述的非人動物，其中所述人源重鏈恒定區核苷酸序列包含在pH約5.5至約6.0的范圍內增加重鏈恒定區氨基酸序列對新生兒Fc受體（FcRn)親和性的修飾，其中所述修飾是選自下組的突變：M428L、N434S、M428L、V259I、V308F、N434A、M252Y、S254T、T256ET250Q、M248L、H433K、N434Y及其組合。13.根據權利要求1所述的非人動物，其中所述非人動物是針對種系中的經基因修飾的免疫球蛋白重鏈基因座的純合子。14.根據權利要求1所述的非人動物，其中所述非人動物還包含未經重排的人源免疫球蛋白輕鏈V基因區段和未經重排的人源免疫球蛋白輕鏈J基因區段。15.根據權利要求1所述的非人動物，其中所述非人動物包含富集的B細胞群，所述B細胞群能夠產生含有重鏈可變結構域的抗原結合蛋白，所述重鏈可變結構域具有至少一個組氨酸殘基。16.根據權利要求15所述的非人動物，其中所述B細胞群已被抗原活化，并且所述抗原結合蛋白經歷通過體細胞高突變（SHM)的親和性成熟。17.根據權利要求15所述的非人動物，其中由所述B細胞群產生的所述抗原結合蛋白在約5.5至約6.0的pH范圍與在約7.0至約7.4的中性pH范圍相比，顯示出降低的抗原結合親和性。18.根據權利要求1所述的非人動物，其中所述非人動物是針對種系中的經基因修飾的免疫球蛋白重鏈基因座的雜合子，并且所述非人動物包含B細胞群，所述B細胞群能夠產生含有重鏈可變結構域的抗原結合蛋白，所述重鏈可變結構域具有至少一個組氨酸殘基。19.根據權利要求1所述的非人動物，其中所述非人動物含有Adam6a基因、Adam6b基因或者這兩者。20.-種在非人動物種系中的經基因修飾的免疫球蛋白重鏈基因座，所述基因座含有未經重排的人源重鏈可變區核苷酸序列，其中所述未經重排的人源重鏈可變區核苷酸序列包含加入至少一個組氨酸密碼子或者使用組氨酸密碼子取代至少一個內源性非組氨酸密碼子。21.根據權利要求20所述的經基因修飾的免疫球蛋白重鏈基因座，其中所述加入或取代的組氨酸密碼子存在于選自人源VH基因區段、人源D基因區段、人源JH基因區段及其組合的免疫球蛋白重鏈基因區段中。22.根據權利要求21所述的經基因修飾的免疫球蛋白重鏈基因座，其中所述人源免疫球蛋白重鏈基因區段選自人源種系％基因區段、人源種系D基因區段、人源種系JH基因區段及其組合。23.根據權利要求20所述的經基因修飾的免疫球蛋白重鏈基因座，其中所述加入或取代的組氨酸密碼子存在于至少一個閱讀框架中，所述閱讀框架編碼選自N-末端區、環4區、互補性決定區1(⑶R1)、互補性決定區2(⑶R2)、互補性決定區3(⑶R3)及其組合的重鏈可變結構域。24.根據權利要求20所述的經基因修飾的免疫球蛋白重鏈基因座，其中被所述組氨酸密碼子取代的所述內源性非組氨酸密碼子編碼選自下組的氨基酸：Y、N、D、Q、S、W和R。25.根據權利要求20所述的經基因修飾的免疫球蛋白重鏈基因座，其中所述加入或取代的組氨酸密碼子存在于人源D基因區段的至少一個閱讀框架中。26.根據權利要求25所述的經基因修飾的免疫球蛋白重鏈基因座，其中所述閱讀框架是所述人源D基因區段的親水性框架，并且所述親水性框架包含編碼選自下組的氨基酸序列的核苷酸序列：SEQIDN0:46、SEQIDN0:48、SEQIDN0:50、SEQIDNO:52、SEQIDNO:54、SEQIDNO:56、SEQIDNO:58、SEQIDN0:60、SEQIDNO:62、SEQIDN0:64、SEQIDNO:66、SEQIDNO:68、SEQIDNO:70、SEQIDNO:72、SEQIDNO:74、SEQIDNO:76、SEQIDNO:78、SEQIDNO:80、SEQIDNO:82、SEQIDNO:84、SEQIDNO:86及其組合。27.根據權利要求20所述的經基因修飾的免疫球蛋白重鏈基因座，其中所述未經重排的重鏈可變區核苷酸序列與選自CH1、鉸鏈、CH2、CH3及其組合的人源或非人源重鏈恒定區核苷酸序列可操作地連接。28.根據權利要求27所述的經基因修飾的免疫球蛋白重鏈基因座，其中所述未經重排的重鏈可變區核苷酸序列與選自CH1、鉸鏈、CH2、CH3及其組合的內源性非人源重鏈恒定區核苷酸序列可操作地連接。29.根據權利要求27所述的經基因修飾的免疫球蛋白基因座，其中所述人源重鏈恒定區核苷酸序列包含在pH約5.5至約6.0的范圍內增加重鏈恒定區氨基酸序列對新生兒Fc受體（FcRn)親和性的修飾，其中所述修飾是選自下組的突變：M428L、N434S、M428L、V259I、V308F、N434A、M252Y、S254T、T256ET250Q、M248L、H433K、N434Y及其組合。30.-種制備非人動物的方法，所述非人動物在其種系基因組中包含經基因修飾的免疫球蛋白重鏈基因座，所述方法包括：(a)修飾非人動物的基因組以便在免疫球蛋白重鏈基因座中使內源性免疫球蛋白重鏈V、D和J基因區段缺失或使得內源性免疫球蛋白重鏈V、D和J基因區段不具有功能；并且(b)在所述基因組中放置未經重排的人源重鏈可變區核苷酸序列，所述序列含有加入至少一個組氨酸密碼子或使用組氨酸密碼子取代至少一個內源性非組氨酸密碼子。31.根據權利要求30所述的方法，其中所述加入或取代的組氨酸密碼子存在于選自人源％基因區段、人源D基因區段、人源義基因區段及其組合的免疫球蛋白重鏈基因區段中。32.根據權利要求31所述的方法，其中所述人源免疫球蛋白重鏈基因區段選自人源種系VH基因區段、人源種系D基因區段、人源種系JH基因區段及其組合。33.根據權利要求30所述的方法，其中所述加入或取代的組氨酸密碼子存在于至少一個閱讀框架中，所述閱讀框架編碼選自N-末端區、環4區、互補性決定區1(CDR1)、互補性決定區2(⑶R2)、互補性決定區3(⑶R3)及其組合的重鏈可變結構域。34.根據權利要求30所述的方法，其中被所述組氨酸密碼子取代的所述內源性非組氨酸密碼子編碼選自下組的氨基酸：Y、N、D、Q、S、W和R。35.根據權利要求30所述的方法，其中所述加入或取代的組氨酸密碼子存在于人源D基因區段的一個或多個閱讀框架中。36.根據權利要求35所述的方法，其中所述閱讀框架是所述人源D基因區段的親水性框架，并且所述親水性框架包含編碼選自下組的氨基酸序列的核苷酸序列：SEQIDN0:46、SEQIDN0:48、SEQIDN0:50、SEQIDNO:52、SEQIDNO:54、SEQIDNO:56、SEQIDNO:58、SEQIDN0:60、SEQIDNO:62、SEQIDN0:64、SEQIDNO:66、SEQIDNO:68、SEQIDN0:70、SEQIDNO:72,SEQIDNO:74,SEQIDNO:76,SEQIDNO:78,SEQIDNO:80,SEQIDNO:82,SEQIDN0:84、SEQIDN0:86及其組合。37.根據權利要求30所述的方法，其中所述未經重排的重鏈可變區核苷酸序列與選自CH1、鉸鏈、CH2、CH3及其組合的人源或非人源重鏈恒定區核苷酸序列可操作地連接。38.根據權利要求37所述的方法，其中所述未經重排的重鏈可變區核苷酸序列與選自CH1、鉸鏈、CH2、CH3及其組合的內源性非人源重鏈恒定區核苷酸序列可操作地連接。39.根據權利要求38所述的方法，其中所述人源重鏈恒定區核苷酸序列包含在pH約5.5至約6.0的范圍內增加重鏈恒定區氨基酸序列對新生兒Fc受體（FcRn)親和性的修飾，其中所述修飾是選自下組的突變：M428L、N434S、M428L、V259I、V308F、N434A、M252Y、S254T、T256ET250Q、M248L、H433K、N434Y及其組合。40.根據權利要求30所述的方法，其中所述非人動物是針對種系基因組中的經基因修飾的免疫球蛋白重鏈基因座的純合子。41.根據權利要求30所述的方法，其中含有所述經基因修飾的免疫球蛋白重鏈基因座的所述非人動物包含B細胞群，所述B細胞群能夠產生含有重鏈可變結構域的抗原結合蛋白，所述重鏈可變結構域具有至少一個組氨酸殘基。42.根據權利要求41所述的方法，其中所述B細胞群已被抗原活化，并且所述抗原結合蛋白經歷通過體細胞高突變（SHM)的親和性成熟。43.根據權利要求41所述的方法，其中由所述B細胞群產生的所述抗原結合蛋白在約5.5至約6.0的pH范圍與在約7.0至約7.4的中性pH范圍相比，顯示出降低的抗原結合親和性。44.根據權利要求29所述的方法，其中所述非人動物包含Adam6a基因、Adam6b基因或者這兩者。45.根據權利要求29所述的方法，其中所述方法生成經基因修飾的動物，所述動物包含富含對目標抗原顯示出pH依賴性結合的抗體的B細胞群。【文檔編號】C12N15/85GK104302170SQ201380025685【公開日】2015年1月21日申請日期:2013年3月15日優先權日:2012年3月16日【發明者】J·麥克沃克,L·麥克唐納,A·J·莫菲申請人:瑞澤恩制藥公司