棉蚜棉酚誘導型cyp6j1啟動子及活性分析的制作方法
【專利摘要】棉蚜棉酚誘導型CYP6J1啟動子及活性分析屬生物工程【技術領域】，本發明提供了一種獲得的棉蚜棉酚誘導型CYP6J1啟動子序列，所述啟動子序列如SEQIDNO:1所示，其中SEQIDNO：1的-1bp至-848bp區為棉蚜棉酚誘導型CYP6J1啟動子的DNA序列，SEQIDNO:1的+1bp至+297bp區為棉蚜P450基因CYP6J1的5’非翻譯區的DNA序列；本發明可用于真核基因的高效表達，用于獲得低豐度基因研究，使其獲得高水平、穩定表達，對于目的功能研究具有積極意義。
【專利說明】棉蚜棉酚誘導型0丫?6」1啟動子及活性分析
【技術領域】
[0001]本發明屬生物工程【技術領域】，涉及一段0嫩序列，它可以作為啟動子調控基因的表達。具體涉及一種來源于棉蚜？450基因^？6了1并在細胞中高度表達的誘導型啟動子序列。
【背景技術】
[0002]棉蚜(細1118 808871)11)是一種重要的世界性農業害蟲，通過取食和病毒傳播來危害農作物。棉酚是棉屬植物特有的萜烯類化合物，也是在棉花體內發現最早、抗蚜效果最明顯的一類次生物質。前期研究結果表明，棉蚜細胞色素？450基因0^611表達量能被高劑量棉酚誘導。這可能是棉蚜利用棉酚作為化學感應信號來啟動其防御機制進而應對棉酚脅迫的重要生理機能。這也顯示出棉蚜^？6了1基因啟動子極可能具有較高誘導活性，迄今為止，未有從棉蚜中分離的高活性啟動子。目前能應用于真核表達研究的棉蚜啟動子還未有。因此，對于新的高活性的桃蚜相關啟動子的克隆、順式作用元件具體序列的確定、各元件之間的相互作用，以及與這些元件互作的轉錄因子的研究具有重要意義，對深入研究害蟲植物次生物質耐受性機制及新型抗蟲新品種的研制奠定基礎。`

【發明內容】

[0003]本發明的一個目的是提供一種棉酚誘導型^？6了1啟動子序列，該啟動子序列能夠誘導目的基因高水平表達，而且該啟動子來源于棉蚜？450基因
[0004]本發明的第二個目的是提供一種用于真核細胞轉染的^？6了1啟動子真核表達載體，該載體指導高水平表達目的基因^？6了1的啟動子序列和5’非翻譯區。
[0005]本發明的第三個目的是提供一種所述真核細胞表達載體的表達，該載體的表達能反映啟動子活性的高低。
[0006]為實現上述目的，本發明克隆了棉蚜？450基因(^^11的啟動子區，并構建了真核表達載體，所述載體包含帶有^？6了1基因的5’非翻譯區的上述啟動子。隨后利用所述載體在對9細胞中表達，并檢測到該啟動子的高水平活性。
[0007]本發明提供一種獲得的棉蚜棉酚誘導型^？6了1啟動子序列，所述啟動子序列如820 10勵:1所示，其中3即10勵:1的-1恥至-8481^區(見序列表)為棉蚜棉酚誘導型0^611啟動子的0嫩序列，在真核細胞中本發明所述的啟動子的具有高水平活性。
[0008]獲得的棉酚誘導型啟動子序列源自棉蚜？450基因(^^了匕
[0009]820 10
的5’非翻譯區的0嫩序列，本發明所述的棉蚜基因的5’非翻譯區能在細胞中通過增強目標外源基因的翻譯效力，而誘導目標基因的高水平表達。
[0010]為實現另一個目的，本發明提供一種用于細胞系轉染的真核細胞表達載體，所述真核細胞表達載體包含棉蚜棉酚誘導型?^？6了1啟動子序列。
[0011]上述用于對9細胞轉染的真核表達載體是指能夠在細胞中瞬時、高水平表達外源基因的載體，例如PGL3載體、pGL4載體。
[0012]一種用真核細胞表達載體的表達，所述真核細胞表達包含棉蚜棉酚誘導型CYP6J1啟動子序列。
[0013]關于本發明所述的用于真核細胞的表達載體(pGL3)，所述的棉蚜CYP6J1基因的啟動子和5’非翻譯區在表達載體中位于外源基因(Luc+)的前面。本發明提供通過插入本發明所述的棉蚜CYP6J1基因的啟動子和5’非翻譯區至含有Luc+報告基因的載體中而構建的pGL3-CYP6Jl (-848/+297)。但是，所述Luc+報告基因是外源基因，并預期可以用任意其它有用的外源基因來代替。
[0014]本發明提供來自棉蚜CYP6J1基因的啟動子和5’非翻譯區，根據本發明的啟動子和5’非翻譯區使得能夠在真核細胞中進行高水平的表達。
[0015]本發明的有益效果在于:可用于真核基因的高效表達，應用于獲得低豐度基因研究，使其獲得聞水平、穩定表達，對于目的功能研究具有積極意義。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0016]圖1為桃蚜基因組電泳圖
[0017]圖2 為 Genomewal kerPCR 電泳圖
[0018]圖3為CYP6J1連T載酶切鑒定電泳圖
[0019]圖4為CYP6Jl連pGL3PCR鑒定電泳圖
[0020]圖5為CYP6J1連pGL3酶切鑒定電泳圖
[0021]圖6為pGL3-CYP6Jl (-848/+297)轉染Sf9細胞后啟動子活性檢測示意圖 圖7為pGL3-CYP6Jl (-848/+297)表達載體示意圖
【具體實施方式】
[0022]下面結合附圖介紹具體實施步驟，將能夠使本領域技術人員更清楚地理解如何實施本發明。盡管已經結合本發明的優選的【具體實施方式】來對本發明進行了描述，但是以下描述的目的是示例性的，而不是限制本發明的范圍。
[0023]實施例1:棉蚜CYP6J1啟動子的克隆
[0024]依據棉蚜CYP6JlmRNA序列(GenbankN0.JN989967)設計染色體步移引物GSPl (5-TCATCAAATACTATTCCACGGTTGGGA-3)和 GSP2 (5-GCTTTTGAAACTGATAGAAACCGACGAAC-3)。提取桃蚜基因組DNA (圖1 )，并用平切酶Afe1、EcoRV-HF、PvuI1、Sma1、Pme1、StuI進行消化，純化DNA并連接接頭引物。按照設計的特異性引物進行PCR擴增,并按照Genome walker(Clontech) PCR方法進行擴增。擴增得到目的片段，經1%瓊脂糖凝膠電泳分析，擴增出長度為1202bp的條帶(圖2)，并進行回收。回收片段與pGEM-T載體連接得到重組質粒，提取質粒并進行酶切驗證(圖3)，并測序。
[0025]棉蚜CYP6J1啟動子(啟動子序列如SEQIDN0:1所示，其中SEQIDN0:1的-1bp至-848bp區為棉蚜棉酚誘導型CYP6J1啟動子的DNA核苷酸序列)，在棉蚜CYP6J1基因的5’區序列中得到鑒定。
[0026]在本文件的啟動子序列表中,轉錄起始位點的堿基用+1示出,ATG用紅色標注。并用啟動子分析網站分析了啟動子的核心元件。[0027]啟動子分析網站
[0028]http://www.gene-regulation.com/pub/programs/alibaba2/index, html
[0029]實施例2:棉蚜CYP6J1啟動子表達載體pGL3_CYP6Jl (-848/+297)的構建
[0030]將在實施例1中所克隆的棉蚜CYP6J1啟動子和5’非翻譯區(見序列表)插入到PGL3 載體中，從而構建 pGL3-CYP6Jl (-848/+297)載體。
[0031 ]更具體地說，利用引物(5-ACGCGTGACTTCTGCCTCAAAGAAG-3，5-CTCGAGTTTAGTTACCTCCTTAGTAT-3)擴增并將該啟動子序列克隆到pGL3載體MluI和XhoI位點上，構建成pGL3-CYP6Jl (-848/+297)，用于驅動Luc+的表達，經PCR鑒定(圖4)和酶切鑒定(圖5)獲得啟動子與載體的重組質粒。
[0032]實施例3:鑒定本發明所述的棉蚜CYP6J1啟動子的活性
[0033]Sf9 細胞接種于 24 孔板中(4X 105cells/孔)，用 CellfectinII 試劑(Invitrogen ；
2μ L/每孔)瞬時共轉染pGL3-CYP6CY3(-2230/+71)建體(2μ g/孔)和對照報告基因質粒phRL-TK (Promega; 0.2 μ g/孔)，。48小時后，收獲細胞，將所得裂解物用于測量螢光素酶活性(Promega)。如圖6所示，pGL3_CYP6Jl (-848/+297)所轉染細胞具有很高熒光素酶活性。
[0034]實用性
[0035]如上所述， 本發明提供棉蚜CYP6J1基因啟動子和5’非翻譯區。
[0036]本發明提供分別將棉蚜CYP6J1基因啟動子和5’非翻譯區插入至pGL3而獲得的真核細胞表達載體。
[0037]經使用所述的真核細胞表達載體進行鑒定，本發明所述的棉蚜CYP6J1基因啟動子和5’非翻譯區能夠啟動下游基因的表達。因此，本發明可用于提高真核基因的高效表達，應用于獲得低豐度基因研究使其獲得聞水平、穩定表達。
[0038]
【權利要求】
1.一種獲得的棉蚜棉酚誘導型^？6了1啟動子序列，其特征在于所述啟動子序列如82010^0: 1所示，其中3即10勵:1的-1恥至-8481^區為棉蚜棉酚誘導型口？6了1啟動子的0嫩序列，3即10勵:1的+11^至+297恥區為棉蚜？450基因?^？6了1的5’非翻譯區的0嫩序列。
2.一種用于細胞系轉染的真核細胞表達載體，其特征在于所述真核細胞表達載體包含權利要求1所述的棉蚜棉酚誘導型^？6了1啟動子序列。
3.一種用真核細胞表達載體的表達，其特征在于所述真核細胞表達包含權利要求1所述的棉蚜棉酚誘導型?^？6了1啟動子序列。
【文檔編號】C12N15/113GK103834658SQ201410020524
【公開日】2014年6月4日 申請日期:2014年1月17日 優先權日:2014年1月17日
【發明者】尚慶利, 潘怡歐, 楊晨, 席景會, 楊巽, 畢銳, 辛雪成 申請人:吉林大學