一種l-天冬酰胺酶及其編碼基因與應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種L-天冬酰胺酶及其編碼基因與應(yīng)用。本發(fā)明公開的一種蛋白，為如下（1）或（2）所示：（1）SEQ?ID?No.2所示的蛋白；（2）將SEQ?ID?No.2所示的氨基酸序列經(jīng)過一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且功能相同的蛋白質(zhì)。本發(fā)明公開的L-天冬酰胺酶適合作為食品添加劑應(yīng)用于焙烤食品中，以降低產(chǎn)品中致癌物丙烯酰胺的生成量，同時(shí)也適合作為藥物應(yīng)用于白血病的輔助治療。
【專利說明】—種L-天冬酰胺酶及其編碼基因與應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種L-天冬酰胺酶及其編碼基因與應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]L-天冬酰胺酶(EC3.5.1.1, L-asparaginase)又稱L-天冬酰胺酰胺基水解酶,能夠特異性的水解天冬酰胺生成L-天冬氨酸和氨，可廣泛應(yīng)用于食品、醫(yī)藥等領(lǐng)域。在食品工業(yè)中，L-天冬酰胺酶可用作高效的食品添加劑，焙烤食品原料中含有的L-天冬酰胺與還原糖在高溫烘焙過程中能夠通過美拉德反應(yīng)生成致癌物質(zhì)丙烯酰胺，L-天冬酰胺酶添加到焙烤食品原料中后能夠?qū)⑵渲械腖-天冬酰胺水解，從而減少焙烤食品中丙烯酰胺的生成量，提高此類食品的安全性。在醫(yī)藥方面，L-天冬酰胺酶可用作治療癌癥的藥物，L-天冬酰胺是細(xì)胞增殖所需的一類營養(yǎng)物質(zhì)，正常細(xì)胞具有L-天冬酰胺合成能力，而癌癥細(xì)胞由于缺乏L-天冬酰胺合成機(jī)制而不能自身合成，因此如果在癌細(xì)胞的增殖過程中引入L-天冬酰胺酶將其L-天冬酰胺水解掉，就能使其缺乏L-天冬酰胺的營養(yǎng)供給而停止增殖直至死亡。L-天冬酰胺酶因其在食品加工和醫(yī)藥等領(lǐng)域的廣泛、成功應(yīng)用，目前已成為人們研究和產(chǎn)品開發(fā)的熱點(diǎn)之一。
[0003]L-天冬酰胺酶廣泛存在于植物、動(dòng)物和微生物體中。L-天冬酰胺酶最初受到研究者的重視是基于其醫(yī)藥療效。1953年，Kidd首次發(fā)現(xiàn)豚鼠血清具有抗癌作用，Broom于1961年進(jìn)一步證實(shí)了豚鼠血清中的抗腫瘤因子是L-天冬酰胺酶(Broome JD.1981.L-asparaginase: discovery and development as a tumor-1nhibitory agent.CancerTreat R印65: 111 - 114)。之后關(guān)于L-天冬酰胺酶的研究逐步深入，研究者成功采用微生物大腸桿菌(Escherichia coli )和歐文菌(Erwinia carotovora)等制備得到了 L-天冬酰胺酶，并將其應(yīng)用于兒童ALL、霍金森病、淋巴肉瘤、黑素肉瘤和胰腺癌等疾病的治療，取得較好的療效(Duval M, Suc`iu S, Ferster A, Rialland X, Nelken B, LutzP, Benoit Y, Robert A, Manel AM, Vilmer E, Otten J, Philippe N.2002.Comparison ofEscherichia col1-asparaginase with Erwinia-asparaginase in the treatment ofchildhood lymphoid malignancies:results of a randomized European Organisationfor Research and Treatment of Cancer-Children's Leukemia Group phase3trial.Blood99:2734 - 2739)。然而目前已報(bào)道的L-天冬酰胺酶還存在一些缺陷，如大腸桿菌來源的L-天冬酰胺酶作為白血病治療藥物時(shí)往往存在穩(wěn)定性差和致敏性強(qiáng)的缺點(diǎn)；L-天冬酰胺酶作為食品添加劑使用時(shí)則存在水解效率低和熱穩(wěn)定性差等缺點(diǎn)。迄今，國內(nèi)L-天冬酰胺酶的相關(guān)研究相對(duì)較少，且主要集中于細(xì)菌L-天冬酰胺酶的制備，如大腸桿菌(專利號(hào):CN101748094)和枯草芽孢桿菌(專利號(hào):CN102864163, CN103243063)。關(guān)于真菌來源L-天冬酰胺酶的酶學(xué)性質(zhì)及應(yīng)用的研究報(bào)道更少，僅見一個(gè)專利公開了黑曲霉(Aspergillus niger)來源的L-天冬酰胺酶基因序列和制備方式(專利號(hào):CN101663395和CN102869772)，仍然缺乏特性優(yōu)良的適合于食品工業(yè)和白血病治療應(yīng)用的L-天冬酰胺酶
女口
廣叩ο
【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明的目的是提供一種L-天冬酰胺酶及其編碼基因與應(yīng)用。
[0005]本發(fā)明提供的一種蛋白，為如下(I)或(2)所示:
[0006](I) SEQ ID N0.2 所示的蛋白；
[0007](2)將SEQ ID N0.2所示的氨基酸序列經(jīng)過一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且功能相同的蛋白質(zhì)。
[0008]上述蛋白的編碼基因也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。
[0009]上述編碼基因中:所述編碼基因?yàn)槿缦轮兄辽僖环N:
[0010]I) SEQ ID N0.1中自5’末端起第38位至第2086位核苷酸所示的DNA分子；
[0011]2) SEQ ID N0.1 所示的 DNA 分子；
[0012]3)在嚴(yán)格條件下與I)或2)限定的DNA分子雜交且編碼所述蛋白質(zhì)的DNA分子；
[0013]4)與I)或2)或3)限定的DNA分子具有90%以上的同一性且編碼所述蛋白質(zhì)的DNA分子。
[0014]含有上述任一所述編碼基因的重組載體、表達(dá)盒、轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系或重組菌也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。
[0015]一種制備L-天冬酰胺酶的方法也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍，該方法是將所述重組菌進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)得到。
`[0016]所述重組菌的具體制備方法如下:將含有上述任一所述編碼基因的重組表達(dá)載體導(dǎo)入 E.coli BL21 (DE3)中即得。
[0017]所述重組表達(dá)載體具體是將SEQ ID N0.1中自5’末端起第38位至第2086位核苷酸所示的DNA分子插入pET-28a ( + )的多克隆位點(diǎn)得到。
[0018]上述蛋白在制備清除食品中致癌物的產(chǎn)品中的應(yīng)用或在降低食品中致癌物含量中的應(yīng)用也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。
[0019]上述應(yīng)用中，所述致癌物為丙烯酰胺。
[0020]所述食品為面食，具體如面包、餅干。
[0021 ] 上述蛋白在制備預(yù)防和/或治療白血病和/或淋巴瘤的產(chǎn)品中的應(yīng)用也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。
[0022]上述蛋白在制備抑制白血病細(xì)胞和/或淋巴瘤細(xì)胞的增殖的產(chǎn)品中的應(yīng)用也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。
[0023]所述白血病細(xì)胞具體為人慢性髓系細(xì)胞性白血病細(xì)胞K562或人外周血白血病細(xì)胞 Jurkat ；
[0024]所述淋巴瘤細(xì)胞具體為人組織淋巴瘤細(xì)胞U937。
[0025]上述蛋白在制備具有L-天冬酰胺酶作用的產(chǎn)品中的應(yīng)用也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。
[0026]本發(fā)明通過RACE法從米黑根毛霉(Rhizomucor miehei)中克隆得到一個(gè)L-天冬酰胺酶全長基因，并成功在大腸桿菌基因工程菌中進(jìn)行了表達(dá)，該酶比活力高達(dá)約1980U/mg,具有嚴(yán)格的底物特異性，幾乎沒有L-谷氨酰胺酶活性。最適pH為7.0，在pH4.0-9.0范圍內(nèi)穩(wěn)定；最適溫度為45°C，且在45°C以內(nèi)穩(wěn)定，在45°C保溫30min酶活幾乎不變，表現(xiàn)出較好的熱穩(wěn)定性。本發(fā)明提供的L-天冬酰胺酶適合作為食品添加劑應(yīng)用于焙烤食品中，以降低產(chǎn)品中致癌物丙烯酰胺的生成量，同時(shí)也適合作為藥物應(yīng)用于白血病的輔助治療。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0027]圖1為米黑根毛霉L-天冬酰胺酶(RmAsnase)基因PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳圖。
[0028]圖2為發(fā)酵粗酶液和N1-1DA親和柱純化產(chǎn)物的SDS-PAGE圖譜。
[0029]圖3為RmAsnase蛋白作為L-天冬酰胺酶的最適作用pH。
[0030]圖4為RmAsnase蛋白作為L-天冬酰胺酶的pH穩(wěn)定性。
[0031]圖5為RmAsnase蛋白作為L-天冬酰胺酶的最適作用溫度。
[0032]圖6為RmAsnase蛋白作為L-天冬酰胺酶的溫度穩(wěn)定性。
[0033]圖7為RmAsnase蛋白作為L-天冬酰胺酶減少餅干中丙烯酰胺的含量圖。
[0034]圖8為RmAsnase蛋白作為L-天冬酰胺酶減少面包中丙烯酰胺的含量圖。
[0035]圖9為RmAsnase蛋白作為L-天冬酰胺酶抑制癌細(xì)胞體外增殖效果圖。
【具體實(shí)施方式】
[0036]下述實(shí)施例中所使用的實(shí)驗(yàn)方法如無特殊說明，均為常規(guī)方法。
[0037]下述實(shí)施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。
`[0038]下述實(shí)施例中L-天冬酰胺酶酶活力的定義及測(cè)定方法如下:
[0039]L-天冬酰胺酶活力測(cè)定參照Wade等(Wade HE, Phillips BP.1971.Automated determination of bacterial asparaginase and glutaminase.AnalBiochem44:189-199)的方法:100 μ L0.04mol/L L-天冬酰胺溶液中分別加入 50 μ L0.05Μ磷酸鹽(ρΗ7.0)緩沖液和IOOyL待測(cè)酶液，45 °C反應(yīng)10min后加50yL三氯乙酸溶液(1.5mol/L)終止反應(yīng),離心取上清加入0.71111^水和20(^ L Nessler試劑顯色,最后在450nm測(cè)定吸光值A(chǔ)。
[0040]標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作:以不同濃度的NH4C1水溶液代替上述反應(yīng)體系中的L-天冬酰胺溶液進(jìn)行酶活測(cè)定，以銨離子濃度為橫坐標(biāo)，450nm處吸光值為縱坐標(biāo)制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到標(biāo)準(zhǔn)曲線公式。
[0041]酶活力單位(U)定義:在上述條件下每分鐘催化L-天冬酰胺水解生成I μ mo I銨離子所需要的酶量。
[0042]將待測(cè)酶液的吸光值A(chǔ)帶入標(biāo)準(zhǔn)曲線公式，得到銨離子的量，進(jìn)而根據(jù)上述酶活力單位(U)定義計(jì)算得到該待測(cè)酶液的酶活。
[0043]米黑根毛霉(Rhizomucormiehei ) CAU432 在文獻(xiàn) “Katrolia, P.，Jia, H.，Yan, Q., Song, S., Jiang, Z., Xu, H., 2012.Characterization of a protease-resistantalpha-galactosidase from the thermophilic fungus Rhizomucor miehei and itsapplication in removal of raffinose family oligosaccharides.Bioresour.Technol.110, 578 - 586.”中公開過，公眾可從中國農(nóng)業(yè)大學(xué)獲得。
[0044]SMART RACE cDNA Amplification Kit 購自美國 Clontech 公司，產(chǎn)品目錄號(hào)為634914。[0045]瓊脂糖N1-1DA親和柱購自美國GE公司，產(chǎn)品目錄號(hào)為17_0575_01。
[0046]人慢性髓系細(xì)胞性白血病細(xì)胞系K562、人組織淋巴瘤細(xì)胞系U937和人外周血白血病細(xì)胞系Jurkat均購自中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所細(xì)胞中心。
[0047]實(shí)施例1、L-天冬酰胺酶基因的獲得
[0048]一、L-天冬酰胺酶基因保守區(qū)片斷的PCR擴(kuò)增
[0049](一)根據(jù)GenBank中已報(bào)道的L-天冬酰胺酶氨基酸序列，利用在線軟件BlockMaker (http://blocks.fhcrc.0rg/blocks/blockmkr/make_blocks.html)搜索保守區(qū)，再利用在線引物設(shè)計(jì)軟件 CODEHOP (http://blocks, fhcrc.0rg/codehop.html)設(shè)計(jì)簡(jiǎn)并引物 AsnDF (正向引物):5’-TCGTCCTGCACGGACNGAYACNATG-3’，AsnDR (反向引物):5’-CGTTGCCGGCGCCAAANGTYTC-3’ 。
[0050](二)以米黑根毛霉CAU432基因組DNA為模板，以AsnDF和AsnDR為引物，使用ExTaq DNA聚合酶擴(kuò)增，得到PCR擴(kuò)增產(chǎn)物。
[0051]PCR 反應(yīng)條件:94°C 5min ;94°C 30s，60°C-55°C (每個(gè)循環(huán)降低 0.5 °C ) 30s，72°C lmin,共 10 個(gè)循環(huán)；94°C 30s, 55°C 30s, 72°C lmin,共 20 個(gè)循環(huán)；72°C，IOmin0
[0052]PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，結(jié)果顯示在622bp附近有特異條帶，將該條帶回收，并連接PMD18-T載體，得到重組質(zhì)粒，將其熱激轉(zhuǎn)化E.coli DH5a和菌落PCR鑒定重組子后測(cè)序，測(cè)序結(jié)果經(jīng)NCBI BLAST搜索比對(duì)，表明該基因與其它微生物來源的L-天冬酰胺酶基因有較高同源性。
[0053]二、L-天冬酰胺酶基因全長cDNA擴(kuò)增
[0054](一)根據(jù)克隆得到的DNA片段及閱讀框分析，分別設(shè)計(jì)5’RACE和3’ RACE引物。引物序列如表1所示。
[0055]表1引物序列
[0056]
【權(quán)利要求】
1.一種蛋白，為如下(I)或(2)所示: Cl) SEQ ID N0.2所示的蛋白； (2)將SEQ ID N0.2所示的氨基酸序列經(jīng)過一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且功能相同的蛋白質(zhì)。
2.權(quán)利要求1所述蛋白的編碼基因。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的編碼基因，其特征在于:所述編碼基因?yàn)槿缦轮兄辽僖环N: O SEQ ID N0.1中自5’末端起第38位至第2086位核苷酸所示的DNA分子； 2)SEQ ID N0.1所示的DNA分子； 3)在嚴(yán)格條件下與I)或2)限定的DNA分子雜交且編碼權(quán)利要求1所述蛋白質(zhì)的DNA分子; 4)與I)或2)或3)限定的DNA分子具有90%以上的同一性且編碼權(quán)利要求1所述蛋白質(zhì)的DNA分子。
4.含有權(quán)利要求2或3所述編碼基因的重組載體、表達(dá)盒、轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系或重組菌。
5.一種制備L-天冬酰胺酶的方法， 該方法是將權(quán)利要求4所述的重組菌進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)得到。
6.權(quán)利要求1所述的蛋白在制備清除食品中致癌物的產(chǎn)品中的應(yīng)用或在降低食品中致癌物含量中的應(yīng)用。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的應(yīng)用，其特征在于:所述致癌物為丙烯酰胺。
8.權(quán)利要求1所述的蛋白在制備預(yù)防和/或治療白血病和/或淋巴瘤的產(chǎn)品中的應(yīng)用。
9.權(quán)利要求1所述的蛋白在制備抑制白血病細(xì)胞和/或淋巴瘤細(xì)胞的增殖的產(chǎn)品中的應(yīng)用。
10.權(quán)利要求1所述的蛋白在制備具有L-天冬酰胺酶作用的產(chǎn)品中的應(yīng)用。
【文檔編號(hào)】C12R1/645GK103773750SQ201410040397
【公開日】2014年5月7日 申請(qǐng)日期:2014年1月27日 優(yōu)先權(quán)日:2014年1月27日
【發(fā)明者】閆巧娟, 黃林華, 江正強(qiáng), 楊紹青, 劉昱 申請(qǐng)人:中國農(nóng)業(yè)大學(xué)