多工試片的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明提供一種適用于各種類型的檢測的多工試片。試片在不同的反應區(qū)可預先填充特殊配制的試劑，各反應在特別配制的試劑填充的不同反應區(qū)獨立地進行。
【專利說明】多工試片

【技術領域】
[0001]本發(fā)明是有關于一種試驗試片，且特別是有關于一種預先填充聚合酶鏈反應試劑的多工試片。

【背景技術】
[0002]在分子生物檢驗領域中，許多特定樣品需要進行多種不同的實驗或試驗方法檢測，有時需要針對一個樣品進行多種項目檢驗。例如，在DNA的檢測試驗中，通過聚合酶鏈反應(PCR)檢測測試，來檢驗一個樣品中數(shù)種單核苷酸多態(tài)性(SNP)的基因型，或是檢驗一個樣品中數(shù)個基因表現(xiàn)程度。實際診斷上會由幾個DNA檢驗(assay)組成一個檢驗套組(panel)，例如幾種PCR檢驗組成一個癌癥診斷的檢驗套組。PCR檢驗中每組檢驗試劑中至少包括兩個特定的DNA引子分子(某些PCR檢驗中還額外包括目標特定的報導探針(reporter probes))，這對引子(引子對)必須正確地與從要進行測試樣品(樣品)中所萃取的DNA模板混合，方能檢驗出樣品中特定DNA目標是否存在或存在的量是多少。
[0003]傳統(tǒng)上，引子對和樣品置放于相同的反應容器以進行PCR。一般的置放方式通常是通過吸量管將單瓶儲存的引子對、酶和dNTP混合物和緩沖液試劑以及樣品一一以手動方式以吸量管移液到反應容器中。最常見的承載容器是96孔盤。利用前述置放方式，PCR檢測至少需要兩回合(兩回)的吸量管移液操作，其中一回添加樣品到反應容器中而另一回添加引子對到反應容器中。例如，假設利用一個檢驗套組來檢查在一個樣品中的36個目標，則需要至少36回移液操作以添加各自引子對到36個不同的反應容器中，另外需要36回移液操作以添加樣品至上述各反應容器。此種操作方式不僅復雜容易出錯，而且須耗用大量的人力。
[0004]另一種方法，所謂的多工法(multiplexing approach),是在同一個反應區(qū)利用包括一個以上引子對的混合物來測試樣品。通常情況下，一個反應容器中加入2?4種引子對。例如，如果一個容器中使用4種引子對時，以測試樣品中的36個目標來計，將需要9個反應容器，添加引子對最少需要36回移液操作，加上需要9回移液操作來添加樣品，總共需進行45回移液操作。其人力操作已經(jīng)減少。但盡管多工法具便利性，同一容器內(nèi)同時進行許多反應可能會導致反應和/或信號檢測相互干擾，而使試驗的準確性變差。因此，此種多工法難以在一個反應容器中使用多于6種引子對。
[0005]另一種方法是在工廠對個別反應容器預填充引子對。實驗室使用者只需要添加樣品到已經(jīng)預先填充好的容器內(nèi)。以前述例子，測試一個樣品的36個目標，將只需要36回移液操作添加樣品至預先填充好的36個反應容器中。如果同時采用多工法技術，過程甚至可能被進一步降低至只需9回移液操作。
[0006]此外，另一種方法是降低滴定盤板的反應容器體積至約納升(nano-liter)的范圍內(nèi)，以節(jié)省試劑成本，其樣式為類似試片的微滴定板。在微滴定板的反應容器(也稱為微井或納米井孔)的尺寸和體積太小，無法手動填充所用的引子對或樣品而又能避免造成相鄰反應容器之間的交叉污染(即引子對從一井散逸至其他井)。
[0007]另一種方法是提供具有微流體通道的微流芯片，其可以協(xié)助遞送檢測試劑(主要是引子對)和樣品至各單獨的反應孔進行獨立反應。但是，微流芯片設計和制造不易且檢測成本相當高。
[0008]還有一種方法是預先提供引子對至各納米井并且固定引子于該納米井的表面。因此，用戶可以以單一移液操作或通過單一微流體通道來添加樣品到各孔中，而不擔心引子從一井散逸到其他井，使井與井之間的交叉污染降至最低。然而，引子固定后會限制其在反應容器內(nèi)的運動，進而大大降低了 PCR的效率。
[0009]總之，如果這些引子對或探針可以預先被放置在反應區(qū)，將可以大大簡化人為操作。但是，只要檢測反應涉及兩個或多個反應區(qū)，同樣的樣品就需要分發(fā)到該反應的不同的反應區(qū)域，但預先填充的引子必須不能產(chǎn)生區(qū)域之間的交叉污染。
[0010]最重要的考慮是，每個反應容器中必須填充預定量的樣品。然而，在樣品填充過程中，各反應容器中不同的測試檢測試劑不能相互交叉污染。傳統(tǒng)的方法是，用移液吸管或針狀分注器將樣品逐個添加到反應井中。隨著反應孔體積變小，井間的距離越接近，要將各孔中填充樣品卻不會產(chǎn)生交叉污染極具挑戰(zhàn)性。若需要設計特殊的機械機構的分注器或路徑，個別傳送至每個反應容器是復雜且耗時的。至于具微通道的微流體裝置，微流體裝置的設計和微管道配制則會顯著地增加生產(chǎn)成本。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0011]本發(fā)明提供了一種預先填充試劑的多工試片，以用于生物、生物化學或化學分析檢測；特別是，用于聚合酶鏈反應；且更具體地，應用于即時聚合酶鏈反應。使用釋放控制(release-control)的概念,運用特別配方設計的預充式試劑,在樣品溶液填充到反應容器中的過程中(樣品填充期間)，允許試劑延遲釋放。在樣品填充期間結束后且PCR開始前，預充的試劑隨后被釋放到樣品溶液中。因此，預先填充試劑的組成成分(如引子和相關聯(lián)特定的報導探針)將完全懸浮在混合物溶液中，故PCR的效率不會降低。但是，預充式試劑的組成成分在被釋放之前具有類似固定化的性質(zhì)，這將會使因樣品填充操作而導致交叉污染的可能性下降。當反應孔中預先填充釋放控制物質(zhì)(控釋物質(zhì))時，樣品可以通過溢流法(overflow)、浸泡法(immers1n)、毛細吸入現(xiàn)象(capillary suct1n)、真空吸引法(vacuum suct1n)、刷涂或刮涂法(squeegee)涂布在反應試片上，以單一回移液操作在很短的時間內(nèi)便能填充所有的反應孔/井。預裝試劑的配方也應使預充式試劑保存和/或運輸便利。
[0012]本發(fā)明提供了多工試片，其包括至少具有樣品裝載區(qū)域和多個反應容器的檢測區(qū)域的一試片。其中該些反應容器布置為陣列，每一個反應容器具開口部和比開口部窄的底部，每一個反應容器中包括預充式試劑的配方(formulat1n)和控釋物質(zhì)。
[0013]根據(jù)本發(fā)明實施例，每一個反應容器有一個傾斜的側壁連接開口部和底部。
[0014]根據(jù)本發(fā)明實施例，該預充式試劑的配方包括聚合酶鏈反應(PCR)的至少一對引子。此外，該預充式試劑的配方可包括報導探針(reporter probes)。
[0015]根據(jù)本發(fā)明實施例，該控釋物質(zhì)包括甘油。甘油的重量百分比為20%或以上，該預充式試劑的配方變得粘稠且重力滑動率(gravity sliding rate)小于5μηι/天。
[0016]根據(jù)本發(fā)明實施例，該控釋物質(zhì)包括聚(乙烯醇)(PVA)、聚(乙烯基吡咯烷酮)(PVP)、聚乙二醇/聚氧化乙烯(PEG/PEO)、藻酸、天然淀粉或人工淀粉。
[0017]根據(jù)本發(fā)明實施例，該控釋物質(zhì)包括聚氨酯、瓊脂糖(agarose)或聚丙烯酰胺。
[0018]根據(jù)本發(fā)明實施例，該控釋物質(zhì)包括活性炭的微米顆粒或活性炭的納米顆粒。
[0019]為讓本發(fā)明的上述特征和優(yōu)點能更明顯易懂，下文特舉實施例，并配合附圖作詳細說明如下。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0020]圖1A顯示根據(jù)本發(fā)明實施例的例示性檢測陣列板示意圖；
[0021]圖1B是根據(jù)本發(fā)明實施例的陣列板的反應容器的剖視示意圖；
[0022]圖2顯示出根據(jù)本發(fā)明實施例的預充式試劑分注模式示意圖；
[0023]圖3A-3E顯示出根據(jù)本發(fā)明實施例的檢測試驗的應用程序步驟示意圖；
[0024]圖4A顯示本發(fā)明反應容器中具有熒光染料和甘油的預充式試劑所發(fā)出的熒光信號不意圖；
[0025]圖4B顯示出添加樣品溶液到已經(jīng)有具有熒光染料和甘油的預充式試劑的反應容器后所發(fā)出的熒光信號示意圖；
[0026]圖4C顯示出添加樣品溶液到已經(jīng)有具有熒光染料但不含甘油的預充式試劑的反應容器后所發(fā)出的熒光信號示意圖；
[0027]圖4D顯示出經(jīng)PCR40次熱循環(huán)后，從裝有樣品溶液與具熒光染料和控釋物質(zhì)的預充式試劑的反應容器中所發(fā)出的熒光信號示意圖；
[0028]圖4E顯示出經(jīng)PCR40次熱循環(huán)后，從裝有樣品溶液與具熒光染料但不含控釋物質(zhì)的預充式試劑的反應容器中所發(fā)出的熒光信號示意圖。
[0029]附圖標記說明:
[0030]10,20,30:檢測陣列板；
[0031]32、100:檢測區(qū)域；
[0032]102:反應容器；
[0033]102a:開口部；
[0034]102b:底部；
[0035]34、104:樣品裝載區(qū)域；
[0036]160a ?160f:納井；
[0037]22A、22B、22C:分注器；
[0038]20A、20B、20C:反應室；
[0039]320:反應井；
[0040]K:刮板；
[0041]R:預充式試劑；
[0042]S:樣品。

【具體實施方式】
[0043]本發(fā)明提供多工試片或多工檢測陣列板，可以廣泛地應用于不同類型的反應檢驗。本發(fā)明提供一種預先填充可測試多種反應的試劑的檢驗試片，可以是玻璃微孔板或塑料微孔板。生產(chǎn)的檢驗試片板可以在不同的反應區(qū)中包括預充式檢測試劑，而在填充有特殊配制試劑的反應區(qū)所獨立進行的反應可以是相同的或不同的。本發(fā)明還提供了一種試劑的控釋配方。根據(jù)本發(fā)明所配制的檢驗試劑的配方制劑可改善所用試劑長期保存，使所用試劑的運輸和分配更容易。
[0044]下面的一些名詞特提供說明。
[0045]“試劑”可指用于一個特定測試/檢驗的數(shù)種成分的配方或制劑。例如，在采用聚合酶鏈反應的試驗中，檢測試劑包括一對引子、酶、dNTPs、熒光報導物與鹽類等。在應用程序中，不同的引子對和熒光報導物可能先被添加到反應容器中，再其次是樣品與酶、dNTP和其它添加劑混合再加到反應容器中。
[0046]“樣品”一般是指被測試的物品。例如，樣品可以是農(nóng)業(yè)標本、病理切片、土壤試樣或從上述樣品中提取的核酸片段(包括DNA或RNA等)。
[0047]“分析”或“試驗”可指對同一樣品進行的一或多個實驗或測試項目。例如，使用PCR來針對核酸樣品檢測300單核苷酸多態(tài)性(300SNP)基因型，該檢測包括數(shù)種PCR檢測項目，通過檢查每個單核苷酸態(tài)性(SNP)的每個基因型(A、T、C、G)。例如，使用即時熒光定量PCR確定一個特定序列的核酸量。“樣品溶液”或“樣品混合物”指的是樣品溶液與反應區(qū)中試劑的前述部分混合的混合物或混合溶液。
[0048]“反應容器”可指管盤的各個管、各反應管、微滴定板的孔或井，或測試試片或陣列板的凹坑/孔。如本文所述，“試片”、“試片板”、“檢測陣列板”或“檢測板”均可指容納前述反應容器的同一襯底或襯板。
[0049]當在容器中的液體體積減小到一定程度時，在容器中的液體流動主要是由表面的附著力而非重力所控制。如果容器中的液體體積只有幾納升，該液體具有較高的表面粘附性會粘著到容器(納井)上，也就是說，此時液體可以被視為粘接劑般穩(wěn)定附著至容器底部或容器壁上。
[0050]較佳的，反應容器可以是試驗試片或檢測陣列板的單個反應孔或井。正如前面所討論的，優(yōu)選乃是使用更小的體積的反應容器，其尺寸例如從幾納升到幾百納升不等。
[0051]圖1A顯示根據(jù)本發(fā)明實施例的例示性檢測陣列板示意圖。如圖1A所示，檢測陣列板(或試片)10例如是:由聚碳酸酯(PC)或聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)制成的試片且外形尺寸為36毫米X36毫米Xl毫米。該檢測陣列板10具有一個檢測區(qū)域100，其包含10,000個反應容器(納井nanowells) 102，該些反應容器102排列為100X100陣列而占據(jù)覆蓋面積為22.5毫米X 22.5毫米。陣列板10并具有樣品裝載區(qū)域104。從陣列板10的剖視圖(圖1A的右側部分)來看，納井102具有較寬的開口部102a和較窄的底部102b。例如，每個矩形納井102具深度100微米(dl)，其開口部102a的尺寸:200微米(LI) X 185微米(Wl)與底部102b的尺寸:106.74微米(L2) X 91.74微米(W2)。納井102之間的距離或間距(Pl)可能范圍為25?40微米，納井102的傾斜側壁的角度Θ例如大于90度，優(yōu)選在100至135度之間，更優(yōu)選在110至120度之間。每個納井102可以容納例如2.1納升的樣品溶液。
[0052]圖1B是根據(jù)本發(fā)明實施例的陣列板的反應容器的剖視示意圖。在圖1B中，陣列板10的反應容器可以設計具有不同的形狀或配置方式。例如，納井160a?160b乃是在檢測陣列板10內(nèi)形成的凹槽但沒有貫通檢測陣列板10。納井160b/160d/160f具有傾斜側壁。納井160c?160f貫穿檢測陣列板10而在檢測陣列板10的頂面和底面上有兩個開口端。由于毛細作用，樣品液體能穩(wěn)滯于納井160c?160d中。納井160d穿透檢測陣列板10且在檢測陣列板10的頂面和底面上具有兩個開口端，并有傾斜的側壁連接的兩個開口端。
[0053]納井的形狀，大小或數(shù)量并不限定于該實施例所示。納井的橫截面形狀可以是例如圓形，方形或多邊形。
[0054]一般情況下，引子是溶于水性溶劑或溶液，本發(fā)明的試驗試片可能設計為反應區(qū)域(井)的內(nèi)壁和底表面是親水性的，而在各反應區(qū)域(井)之間是疏水性的。預先填充的試劑或探針將只附著至親水性區(qū)域，也就是說，只附著到反應區(qū)域(井)的內(nèi)壁和底部表面。每個反應容器或井的尺寸可以是小于I毫米。以此尺寸大小規(guī)模，少量的樣品液體可以在10秒內(nèi)溢流填充大量的反應容器，顯著提高了樣品裝載效率。
[0055]預充式試劑可以通過移液操作(pipetting)或通過任何可能的液體或凝膠分裝器而添加到反應容器或反應井中。圖2顯示出根據(jù)本發(fā)明實施例的預充式試劑分注模式示意圖。預充式試劑乃是制備包括一或多個與控釋配方混合的檢驗試劑。如圖2所示，預充式試劑為液態(tài)溶液，分別通過不同的分注器22A、22B、22C滴落或分裝到檢測陣列板20的三個反應室20A、20B、20C。然后檢測陣列板20就準備好要存放或裝運。如圖2所示，在反應室20A、20B和20C中，不同的試劑乃以不同的配給模式(配給圖案)來添加，因不同配給模式可能會影響到控制其釋放速率或各成分釋放比率。
[0056]樣品可以通過溢流法(overflow)、浸泡法(immers1n)、毛細吸入現(xiàn)象(capillary suct1n)、真空吸引法(vacuum suct1n)、刷涂或刮涂法(squeegee)涂布在反應試片上。溢流法是使樣品溢出或淹浸反應區(qū)而使樣品填滿反應區(qū)的方法。浸潰法是將具反應容器或井的試驗試片浸泡到樣品溶液中，而充填反應容器或井。至于毛細吸入法或真空吸引法，樣品可通過毛細作用反應或真空抽吸填充到反應區(qū)或容器中。刷涂法或刮涂法是指通過毛刷或刮板同時驅動或推動樣品至反應井中。
[0057]圖3A-3E顯示出根據(jù)本發(fā)明實施例的檢測試驗的應用程序步驟示意圖。如圖3A所示，檢測陣列板30上設置有具有多個反應井320的檢測區(qū)域32和樣品裝載區(qū)域34。如圖3B所示，預充式試劑R由分注器36分裝添加到反應井320。如圖3C所示，利用樣品裝載裝置38將樣品S添加到樣品裝載區(qū)域34。在圖3D-3E中，刮板K推動樣品S而涂布至陣列板30的檢測區(qū)域32，而使樣品S填充至反應井320中。在樣品S與預充式試劑R接觸后，預充式試劑R開始溶解，并釋放特定的引子、熒光報導物或試劑到樣品溶液中。然后檢測反應在檢測反應的優(yōu)選條件下啟動。
[0058]一些試劑可以預先填充至相同的反應井以進行多個反應。
[0059]在樣品添加過程中，樣品可能會覆蓋所有的反應區(qū)，并在短期(所謂浸沒期)內(nèi)，樣品可能淹沒貫通幾個反應區(qū)。釋放控制是指以可控制的方式釋放特定成分的機制。例如，特定成分被包圍、溶解或吸附在粘性載體、固體或液體之上或之中，以便于在一個特定的時刻釋放特定成分。預充引子對的配方設計為在浸沒期間或直至浸沒期已經(jīng)結束都不溶解(或只稍微溶解)。釋放控制機制可能會通過溫度、超音波或光解反應觸發(fā)，或通過長時間溶解包覆或包埋填充配方。
[0060]通過調(diào)整本發(fā)明的的試劑或引子的稀釋劑配方，試劑或引子可包括至少一種揮發(fā)性成分、至少一種低揮發(fā)性的成分和至少一種粘性成分。在裝填試劑或引子至反應區(qū)中之前，高含量的揮發(fā)性成分是必需的，以提供足夠的流動性，或者通過直接接觸或非直接接觸型機制，容許試劑或引子分裝，并允許液體傳送到所欲的反應區(qū)中。一旦試劑或引子添加到反應區(qū)中，因其揮發(fā)性成分揮發(fā)減少，從而降低試劑液體的流動性和移動性，而呈現(xiàn)一粘性固硬化狀態(tài)。預充式檢測試劑的水或揮發(fā)性溶劑可能會部分或完全去除以便利運輸。但是，因為試劑含有非揮發(fā)性或低揮發(fā)性成分，所述試劑液體無法被完全干燥，進而防止由于過度干燥剝離或剝落。
[0061]在不攪拌或加熱的情況下，當暴露于樣品液體，因其通過有限的質(zhì)量傳輸表面，類似凝膠的試劑或引子探針的溶出率是有限且相當慢的。然而，樣品涂布上或填充可能在幾秒鐘內(nèi)就完成，故得以避免反應區(qū)而不同引子的交叉污染。
[0062]釋放控制配方
[0063]在本發(fā)明中使用的非揮發(fā)性或低揮發(fā)性的成分可以是高水溶性、高粘度和低揮發(fā)性的物質(zhì)，例如糖、碳水化合物、甘油、寡醣、多醣或醇類等。在試劑或弓I子預填在反應區(qū)中之后，配方中揮發(fā)性成分例如水逐漸蒸發(fā)，而使非揮發(fā)性或低揮發(fā)性成分的含量逐漸增加。這樣的現(xiàn)象會強化生化反應抑制，故有益于試片保存。如果甘油作為非揮發(fā)性成分，在易揮發(fā)的揮發(fā)性成分蒸發(fā)后，例如甘油的重量百分比可能會增加至20%或更多。此種濃度甘油能抑制生化反應更利于長期保存。
[0064]為了實現(xiàn)控制釋放的效果，加入控釋物質(zhì)于預填充試劑的配方中，此配方可以被稱為作為釋放控制預充式試劑的配方。控釋物質(zhì)包括長鏈的高分子化合物、(能夠)形成膠體的成分、(能夠)形成多孔結構的成分、(能夠)吸附試劑緩慢釋放的成分、(能夠)與試劑鍵合緩慢釋放的成分或其組合。
[0065]形成膠體的成分可能是聚(乙烯醇)(PVA)、聚(乙烯基吡咯烷酮)(PVP)或聚乙二醇/聚氧化乙烯(PEG/PE0)，以形成聚合物凝膠。干燥后，在與水接觸時需要一定的時間方能完全溶解。藻酸(alginic acid)也被稱為褐藻膠(algin)或藻酸鹽(alginate),是陰離子多醣，在適當?shù)臈l件下可以用來形成凝膠。此外，自然或人工的淀粉可以被用來作為形成膠體的成分或控釋物質(zhì)。。
[0066]形成多孔結構的成分填充到反應容器后能夠形成多孔結構，該成分可以是例如聚氨基甲酸乙酯、瓊脂糖和聚丙烯酰胺。該物質(zhì)可形成微孔結構填補于反應容器中。
[0067]吸附試劑緩慢釋放的成分可以是脂質(zhì)體，微米顆粒或納米顆粒如活性炭顆粒。
[0068]與試劑鍵合緩慢釋放的成分是，能夠與反應容器的的全部或部分表面反應，使其表面對于需要慢慢被釋放出來的試劑具有高親和力的化合物。也就是說，該成分可以修飾反應容器的表面，是容器表面對于需要緩釋的試劑有很高的親和力或吸附力而得到控釋效果。樣品進入之后，可以顛倒或改變親和力或吸附效果而釋放出試劑參與反應。通過改變在反應容器中液體的PH值、鹽度、溫度、酶反應、化學反應或光化學反應，可以顛倒或減少其親和力或吸附效果。
[0069]具預充式試劑的檢測陣列板的制備
[0070]為了實現(xiàn)控制釋放的配方，試劑也可以利用水或揮發(fā)性溶劑來與控釋物質(zhì)混合，預先填充到反應井(反應容器)。除去水或揮發(fā)性成分后，將混合物變成固體或半固體或凝膠形式。試劑如PCR引子分散在在半固體或凝膠態(tài)的控釋物質(zhì)(作為基體)中。當樣品被施加到該反應井后，由于基體填充物質(zhì)緩慢溶解，試劑會緩慢釋放出來。
[0071]或者，液體狀態(tài)試劑預先填充到反應井(反應容器)，然后填充控釋物質(zhì)到反應井。除去揮發(fā)成分或水后，該混合物變成固體或半固體或凝膠樣的形式，適合于保存。
[0072]或者，液體狀態(tài)控釋物質(zhì)預先填充到反應井(反應容器)中，然后填充試劑到反應井。除去揮發(fā)性成分或水后，將混合物變成固體或半固體或凝膠形式。
[0073]又或者，試劑預先填充到反應井(反應容器)中并干燥。然后，控釋物質(zhì)通過噴霧法、注入法或涂層法填充到反應井中，以覆蓋干燥的試劑。除去水或揮發(fā)性成分從控釋物質(zhì)后，該混合物變成固體或半固體或凝膠樣的形式。
[0074]此外，液體狀態(tài)試劑預填充到反應井(反應容器)中，然后控釋物質(zhì)的干燥粉末噴入反應井覆蓋試劑，以形成控制釋放膜。
[0075]實例一:(1)配制20?200 μ M的各個檢驗用的引子DNA水溶液；(2)將各引子DNA水溶液分別定量配送到預定位址的微反應井中；(3)將填好引子DNA的檢驗芯片置于60°C烘箱I?24小時；(4)配制1%?20%水溶性高分子聚合物溶液(如PVA、PEG、聚酯、瓊脂糖、明膠)；(5)取出烘干的檢驗芯片，將水溶性高分子聚合物溶液以刮板填入微反應井中；以及
(6)以60°C烘箱烘干填有水溶性高分子聚合物溶液的檢驗芯片。干掉的高分子溶液于引子DNA表面形成一層水溶性的薄膜，當反應液及樣品DNA溶液導入時，高分子薄膜會緩緩溶解以釋出引子DNA，因而防止引子DNA立即溶解所造成的交叉污染。
[0076]實例二:(1)配制20?200 μ M的各個檢驗用的引子DNA水溶液；(2)將各引子DNA水溶液分別定量配送到預定位址的微反應井中；(3)將填好引子DNA的檢驗芯片置于60°C烘箱I?24小時；(4)配制溶于己燒的石臘溶液(paraffin wax solut1n in n-hexane)；(5)取出烘干的檢驗芯片，將石蠟溶液以刮板填入微反應井中；以及(6)于抽氣烘箱中將溶劑加溫抽離。石蠟附著于引子DNA表面形成一層薄膜，當反應液及樣品DNA溶液于室溫導入時，石蠟薄膜暫時阻擋引子DNA釋出，因而防止引子DNA立即溶解所造成的交叉污染。待反應開始加熱時，溶解的石蠟將浮出于水溶液的表面，使反應液及引子DNA互溶并開始反應。
[0077]實例三:(1)配制20?200 μ M的各個檢驗用的引子DNA水溶液；(2)將各引子DNA水溶液分別定量配送到預定位址的微反應井中；(3)將填好引子DNA的檢驗芯片置于60°C烘箱I?24小時；(4)配制水溶性高分子聚合物溶液(如PVA、PEG、聚酯、瓊脂糖、明膠)；
(5)取出烘干的檢驗芯片，將水溶性高分子溶液以超音波震蕩或造霧器形成高分子溶液的微珠，均勻撒入微反應井中；以及(6)將填有水溶性高分子聚合物溶液的檢驗芯片以烘箱烘干或真空抽干。反應芯片抽干或烘干水分后，引子DNA表層即附上一層可溶性高分子薄膜，當反應液及樣品DNA溶液導入時，高分子薄膜會緩緩溶解以釋出引子DNA，因而防止引子DNA立即溶解所造成的交叉污染。
[0078]實例四:(1)配制20?200 μ M的各個檢驗用的引子DNA水溶液；(2)將各引子DNA水溶液分別定量配送到預定位址的微反應井中；(3)將填好引子DNA的檢驗芯片置于60°C烘箱I?24小時；(4)配制水溶性高分子聚合物溶液(如PVA、PEG、聚酯、瓊脂糖、明膠)；以及(5)取出烘干的檢驗芯片放置于加熱板上，再將水溶性高分子溶液形成高分子溶液的微珠，均勻撒向微反應井中。當微珠接近加熱板時，微珠中液體蒸干成為高分子的微粒而撒入微反應井中，引子DNA表層即附上一層可溶性高分子微粒，當反應液及樣品DNA溶液導入時，可溶性的高分子微粒會阻擋并延緩引子DNA的溶解釋出，因而防止引子DNA立即溶解所造成的交叉污染。
[0079]實例五:(1)配制20?200 μ M的各個檢驗用的引子DNA水溶液；(2)將各引子DNA水溶液分別定量配送到預定位址的微反應井中；以及(3)將填有引子DNA的檢驗芯片與石蠟塊一同置于反應室中，加熱石蠟塊使其溶解并產(chǎn)生石蠟蒸氣。石蠟蒸氣均勻滲入于微反應井中，附于引子DNA表面形成一層薄膜，當反應液及樣品DNA溶液于室溫導入時，石蠟薄膜暫時阻擋引子DNA釋出，因而防止引子DNA于樣品DNA和反應液導入時造成的交叉污染。待反應開始加熱時，溶解的石蠟將浮出于水溶液的表面，使反應液及引子DNA互溶并開始反應。
[0080]實例六:(I)配制1%?20%水溶性高分子聚合物溶液(如PVA、PEG、聚酯、瓊脂糖、明膠)，以刮板將高分子水溶液均勻填入空白芯片的微反應井中；(2)配制20?200 μ M的各個檢驗用的引子DNA水溶液；(3)將各引子DNA水溶液分別定量配送到已填有高分子水溶液的預定位址的微反應井；(4)將填好引子DNA的檢驗芯片置于60°C烘箱I?24小時；以及(5)取出烘干的檢驗芯片。干掉的高分子溶液于引子DNA表面形成一層水溶性的薄膜，當反應液及樣品DNA溶液導入時，高分子薄膜會緩緩溶解以釋出引子DNA，因而防止引子DNA立即溶解所造成的交叉污染。
[0081]實例七:(I于含有1%?20%緩釋配方的水溶液中(緩釋劑如PEG、PVA或甘油)配制20?200 μ M的引子DNA溶液；(2)將含緩釋配方的引子DNA溶液分別定量配送到預定位址的微反應井中；(3)將填好含緩釋配方的引子DNA的檢驗芯片置于60°C烘箱I?24小時。導入反應液及樣品DNA溶液時，烘干的引子DNA會延遲溶解釋出至少10秒以上，因而防止引子DNA立即溶解所造成的交叉污染。
[0082]圖4A顯示本發(fā)明反應容器中具有熒光染料和甘油的預充式試劑所發(fā)出的熒光信號示意圖。圖4B顯示出添加樣品溶液到已經(jīng)有具有熒光染料和甘油的預充式試劑的反應容器后所發(fā)出的熒光信號示意圖。圖4C顯示出添加樣品溶液到已經(jīng)有具有熒光染料但不含甘油的預充式試劑的反應容器后所發(fā)出的熒光信號示意圖。圖4D顯示出經(jīng)PCR40次熱循環(huán)后，從裝有樣品溶液與具熒光染料和控釋物質(zhì)的預充式試劑的反應容器中所發(fā)出的熒光信號示意圖。圖4E顯示出經(jīng)PCR40次熱循環(huán)后，從裝有樣品溶液與具熒光染料但不含控釋物質(zhì)的預充式試劑的反應容器中所發(fā)出的熒光信號示意圖。
[0083]實驗如圖4A和4B所示，預充式試劑水溶液含有15% (重量百分比)甘油(作為控釋物質(zhì))以及熒光染料Alexa Fluor 488 (8 μ Μ)以檢查樣品裝載期間的交叉污染狀況。如圖4Α所示，預充式試劑溶液分裝至9個納井(3X3)中。預充式試劑溶液的液滴位于井底表面上，而揮發(fā)性成分(水)蒸發(fā)后，甘油的重量百分比可增至20%或更多。水蒸發(fā)后，液滴變粘而其重力滑動率小于5 μ m/天，粘附至井的底部或側壁。在30天的觀察期后這些液滴(圖4A中顯示為圓點)仍然固定在納井中。樣品溶液涂抹檢測預先裝載的檢測陣列板的整個表面，以引入樣品。樣品溶液可能包含標準的PCR反應混合物，包括dNTPs、氯化鎂和TaqDNA聚合酶等。正如圖4B中所示，在90?92 °C之間簡短加熱I分鐘后，于納井中均勻分布的熒光(即熒光染料)表示預充式試劑完全溶解至樣品溶液中。例如，預充式試劑的溶出速率在低于90°C時一分鐘內(nèi)為90%或以上，在室溫下的溶解率為每秒1%或更小。
[0084]在相鄰的納井間，沒有觀察到可檢測的熒光信號差異。既然該些納井觀察到控制釋放的控制效果，在樣品溶液的加載過程中應無交叉污染發(fā)生。
[0085]與此相反，在圖4C的實驗中，不含甘油的預充式試劑溶液被存入納井不久后完全干涸。如圖4C所示，九個三列納井分裝入無甘油但含熒光染料的預充式試劑溶液，樣品溶液以從左至右涂抹越過納井陣列的方式載入。加載樣品溶液后，立即在三列納井的左側第一列可檢測到熒光信號。納井檢測的熒光強度從左欄右列逐漸減少。由于沒有觀察到控釋控制效果，避免交叉污染是不可能的。這個實驗說明預充式試劑中使用控釋配方作為解決方案的重要性。
[0086]同樣地，相對于如圖4D所示明亮清晰的熒光圖案(清晰的圓點陣列、線條或安排為字母的排列圖案)，如圖4E所示，在不同熒光圖案的周圍觀察到模糊糊化的熒光信號，這表示具有預充試劑但無控釋物質(zhì)的反應容器于引入樣品時發(fā)生交叉污染。
[0087]綜上所述，本發(fā)明利用一個特定配方的預充式試劑，使預先放置試劑探針有足夠的粘性，能附著至反應區(qū)的內(nèi)壁表面或底表面，流動性小且不易剝落，便于運輸或長期儲存。特別配制的試劑的釋放可被控制，以便于樣品填充過程中將不會釋放預充式引子探針。在樣品填充過程中，樣品可能覆蓋所有的反應區(qū)，而在此很短的時間內(nèi)樣品乃連通全部或一些反應區(qū)(即所有或幾個反應區(qū)實際上是相互連通的)。本發(fā)明通過特定配方的預充式試齊U，因反應在不同的反應區(qū)獨立地進行，反應區(qū)之間的引子探針不會發(fā)生交叉污染。
[0088]本案的樣品也可以直接將試驗試片浸潰到樣品溶液中來快速大量弓I入樣品，使樣品自動和迅速地填充到每個反應區(qū)。然后，從樣品溶液將試驗試片取出。引入樣品過程期間中，由于預充式試劑的控釋效果，確保每個反應區(qū)的反應獨立性。
[0089]最后應說明的是:以上各實施例僅用以說明本發(fā)明的技術方案，而非對其限制；盡管參照前述各實施例對本發(fā)明進行了詳細的說明，本領域的普通技術人員應當理解:其依然可以對前述各實施例所記載的技術方案進行修改，或者對其中部分或者全部技術特征進行等同替換；而這些修改或者替換，并不使相應技術方案的本質(zhì)脫離本發(fā)明各實施例技術方案的范圍。
【權利要求】
1.一種多工試片，其特征在于，包括: 至少一試片，具有多個反應容器，其中該些反應容器布置為陣列，每一個反應容器具開口部和底部，每一個反應容器中包括預充式試劑配方和控釋物質(zhì)。
2.根據(jù)權利要求1所述的多工試片，其特征在于，所述預充式試劑配方包括聚合酶鏈反應的至少一對引子。
3.根據(jù)權利要求2所述的多工試片，其特征在于，所述預充式試劑配方包括報導探針。
4.根據(jù)權利要求1所述的多工試片，其特征在于，所述控釋物質(zhì)包括甘油。
5.根據(jù)權利要求4所述的多工試片，其特征在于，甘油的重量百分比為20%或以上，所述預充式試劑配方變得粘稠且其重力滑動率小于5 μ m/天。
6.根據(jù)權利要求1所述的多工試片，其特征在于，所述控釋物質(zhì)包括聚乙烯醇、聚乙烯基吡咯烷酮、聚乙二醇/聚氧化乙烯、藻酸、天然淀粉或人工淀粉。
7.根據(jù)權利要求1所述的多工試片，其特征在于，所述控釋物質(zhì)包括聚氨酯、瓊脂糖或聚丙烯酰胺。
8.根據(jù)權利要求1所述的多工試片，其特征在于，所述控釋物質(zhì)包括活性炭的微米顆粒或活性炭的納米顆粒。
9.根據(jù)權利要求1所述的多工試片，其特征在于，所述至少一試片由聚碳酸酯或聚甲基丙烯酸甲酯所制成。
10.根據(jù)權利要求1所述的多工試片，其特征在于，所述每一個反應容器具有一傾斜側壁連結所述該開口部與所述底部，所述傾斜側壁的角度Θ大于90度。
11.根據(jù)權利要求10所述的多工試片，其特征在于，所述傾斜側壁的角度Θ在100至135度之間。
12.根據(jù)權利要求10所述的多工試片，其特征在于，所述傾斜側壁的角度Θ在110至120度之間。
13.根據(jù)權利要求1所述的多工試片，其特征在于，所述至少一試片包括樣品裝載區(qū)域。
14.根據(jù)權利要求1所述的多工試片，其特征在于，所述至少一試片包括蓋板覆蓋于所述至少一試片上而在所述至少一試片和所述蓋板之間以形成一個封閉的空間。
15.根據(jù)權利要求1所述的多工試片，其特征在于，所述每一個反應容器具有兩個開口端。
16.根據(jù)權利要求1所述的多工試片，其特征在于，所述每一個反應容器具有兩個開口端和一個傾斜側壁連接所述兩個開口端。
【文檔編號】C12M1/00GK104250612SQ201410048563
【公開日】2014年12月31日 申請日期:2014年2月12日 優(yōu)先權日:2013年6月27日
【發(fā)明者】邱創(chuàng)泛, 潘詔智, 味正唯, 張鈺 申請人:奎克生技光電股份有限公司