一種小鼠腸道菌群失調eric-pcr指紋圖譜的制備方法
【專利摘要】本發明提供一種小鼠腸道菌群失調的ERIC-PCR指紋圖譜的制備方法。所述方法包括抗生素相關性腹瀉致小鼠腸道菌群失調造模、提取盲腸內容物DNA、清除盲腸內容物DNA中的腐殖酸、清除盲腸內容物DNA中的PCR抑制物、ERIC-PCR擴增及非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳（Native-PAGE），通過與常規菌群分析結果做比較，從而建立小鼠腸道菌群失調的ERIC-PCR指紋圖譜的制備方法。本發明是以純系小鼠為研究對象，解決傳統的細菌培養方法應用于微生物群落分析所帶來的不足。該方法可用于實驗小鼠腸道菌群失調的快速檢測，避免傳統的細菌分離培養的操作繁瑣、耗時長、工作量大等缺點，能夠準確、快速有效地檢測小鼠腸道菌群分布狀況。
【專利說明】—種小鼠腸道菌群失調ERIC-PCR指紋圖譜的制備方法
【技術領域】
[0001]本發明屬于細菌基因組指紋圖譜制備領域，特別涉及一種小鼠腸道菌群失調ERIC-PCR指紋圖譜的制備方法。
【背景技術】
[0002]菌群失調(dysbacteriosis)是基礎及臨床研究經常遇到的問題，它是外源性感染和內源性感染的起始因素，一旦發生很難控制。引起菌群失調的因素有很多，包括飲食因素、菌叢的變化因素、藥物的代謝因素、年齡因素及胃腸道免疫功能障礙因素。因此，對于機體腸道菌群結構多樣性及種群動態變化進行研究對治療菌群失調具有至關重要的意義。
[0003]最常見的、也是最被人們所熟悉的一種菌群失調，就是“腹瀉”癥狀。腹瀉是一種糞便稀薄、排便次數增加的表現，為多種類似癥狀的統稱。在臨床上一般將其分為感染性腹瀉和非感染腹瀉2種，其中感染性腹瀉約占80%。對于感染性腹瀉，人們習慣于使用抗生素進行治療，然后由于抗生素的大量盲目使用，使腸道中有益菌被抑制，使其數量急劇減少，腸道微生態平衡被打破，導致菌群失調，此時腸上皮細胞的代謝調節水平和生理功能發生紊亂，使腹灣進一步加重，即抗生素相關性腹灣(Antibiotic Associated Diarrhea, AAD)。其發生率視不同抗生素而異，約為15%~39%。凡能對抗細菌的藥物，幾乎均可引起AAD，多見于氯林可霉素、氨芐青霉素、阿莫西林、阿奇霉素、頭孢菌素等抗生素。為深入開展菌群失調研究，常需要建立抗生素相關性腹瀉動物模型。
[0004]檢測菌群失調一般采用傳統的細菌培養方法，雖然可行，但腸道內微生物多數都是厭氧菌，采用傳統的培養方法難以分析，并且傳統的細菌分離和培養方法操作繁瑣，耗時、費力，重復性差，易受操作方法等因素的影響。隨著分子生物學的發展，一些基于微生物遺傳物質的分子生物學方法，如PFGE、RAPD-PCR、REA、RFLP, ERIC-PCR等，可以克服傳統方法的缺陷，與傳統的培養方法相比優勢明顯，已應用于微生物群落分析研究中。其中，以腸桿菌基因間重復一致序列(enterobacterial repetitive intergenic consensussequences, ERIC)為基礎的ERIC-PCR指紋圖譜鑒定，具有靈敏度高、可重復性和可靠性好、省時省力，是目前應用最廣泛的方法之一。ERIC是存在于多種細菌基因組中的串聯重復序列，主要存在于腸道細菌基因組間，目前尚未在細菌噬菌體和質粒上發現有ERIC的存在。ERIC具有不完整的反向重復性和高度保守性，二級結構可以形成穩定的莖環結構，該序列長約44bp，在染色體上存在的位置和拷貝數隨物種的不同而有差異。由于不同的細菌基因組上的ERIC重復序列的數目和分布不同，可根據這一 ERIC核心序列設計反向引物進行PCR擴增，得到一系列有大小不同的片段組成的DNA指紋圖譜，即DNA遷移帶。在一定范圍內，DNA遷移帶的大小和多少代表著此重復序列間的距離和重復次數。因此，基因組DNA的差異可清晰顯示在指紋圖譜上，根據電泳條帶來區分菌株(型)。ERIC-PCR指紋圖譜具有高度的穩定性和良好的可重復性。
[0005]采用ERIC-PCR方法對正常小鼠和抗生素相關性腹瀉小鼠進行腸道菌群基因組DNA擴增，快速檢測并獲得菌群分布狀況。與傳統方法比較，可以得出較為準確的菌群定性結果。這對于相關基礎及臨床研究，尤其是流行性腸道疾病快速診斷會有很大的用途。

【發明內容】

[0006]本發明的目的是提供一種以小鼠為研究對象，解決傳統的細菌培養方法應用于微生物群落分析所帶來的不足，而建立的一種小鼠腸道菌群失調的ERIC-PCR指紋圖譜的制備方法。為實現上述目的，本發明的具體步驟為:建立抗生素相關性腹瀉致小鼠腸道菌群失調動物模型、提取盲腸內容物DNA、清除盲腸內容物DNA腐殖酸、清除盲腸內容物DNA中的PCR抑制物、ERIC-PCR擴增、非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳(Native-PAGE)。
[0007]本發明的制備方法如下:
[0008](I)采用糞便DNAout試劑盒，從盲腸內容物標本中提取基因組DNA，方法如下:
[0009]a、65°C預熱溶液A，待其沉淀溶化后，充分混勻，然后取0.5mL加入到1.5mL塑料離心管中并放置于65°C待用。最好使用螺旋蓋離心管；
[0010]b、取0.1-0.3g的新鮮或冷凍的盲腸內容物，加入到含預熱溶液A的離心管中，振蕩器上劇烈振蕩使菌體樣品裂解，再加B液處理并抽提、乙醇沉淀和洗滌，所得DNA沉淀溶解于TE或無菌水，_20°C保存備用。
[0011](2)所提取的盲腸內容物DNA用柱式腐殖酸清除劑清除腐殖酸得到純化的DNA溶液，去除DNA溶液中小鼠腸道細菌蛋白質、腐殖酸。
[0012](3)ERIC-PCR擴增:采用合成引物ERICIR、ERIC2對盲腸內容物DNA進行PCR擴增。取盲腸內容物DNA作為PCR模板，將PCR抑制物清除劑加入到PCR反應體系中，PCR抑制物清除劑加入量與PCR總反應體系`總量的體積比1:10，進行PCR擴增，然后取擴增產物，用于非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳上樣，膠濃度為10%，設定電泳條件:室溫，150V，90min，電泳緩沖液為1XTBE，電泳結束后凝膠采用Syber-Green I染色30min，并立即進行紫外拍照，SP得小鼠腸道菌群失調的ERIC-PCR指紋圖譜。
[0013]PCR抑制物清除劑用于去除PCR抑制物。
[0014]ERIC-PCR引物，序列如下:
[0015]ERIClR:5’ -ATGTAAGCTCCTGGGGATTCAC-3’，
[0016]ERIC2:5’ -AGTAAGTGACTGGGGTGAGCG-3’ ；
[0017]引物粉末短暫離心后，加入滅菌ddH20配制成IOOii M儲備液，經1:10稀釋成IOii M工作液。
[0018]所述非變性聚丙烯酰胺凝膠以30%聚丙烯酰胺、5XTBE為原料，10%APS作為促凝劑，TEMED作為催化促凝劑。
[0019]所述ERIC-PCR擴增，擴增程序:95°C預變性7min，94°C變性lmin，52°C退火lmin，65°C延伸 8min，循環 35 次，65°C延伸 16min。
[0020]糞便DNAout試劑盒、柱式腐殖酸清除劑、PCR抑制物清除劑均購于北京天恩澤基因科技有限公司。
[0021]本發明將ERIC-PCR技術用于小鼠腸道菌群的快速鑒別，可以避免傳統的分離培養方法的耗時長、工作繁重，操作繁瑣等缺點，常規菌群分析方法有較大的局限性:一是分離培養細菌操作繁瑣，用時至少2~3天，后續的菌落計數工作量也較大；二是檢測菌群種類有限，無法獲得更多的腸道菌群分布狀況。同時由于傳統方法無法對所有微生物進行分離培養，可能造成原始菌群缺失，無法獲取實時和全面的菌群信息，而采用ERIC-PCR可以檢測到相對含量極低的菌群，而且操作簡便對于實驗室設備條件沒有過高要求，用時I天左右，能夠準確、快速有效地檢測兩組小鼠的腸道菌群分布狀況。
[0022]應使用試劑盒提取小鼠盲腸內容物DNA，并清除腐殖酸和PCR抑制物，使盲腸內容物DNA在成分極其復雜的糞便中被簡易有效地提取和純化，繼而方便后續的ERIC-PCR反應，省時省力。
[0023]采用ERIC-PCR，樣品在設定的電泳條件下，用PAGE膠進行條帶分離，基因組DNA差異可清晰顯示在圖譜上，圖譜具有高度穩定性和可重復性，能夠得出較為準確的菌群定性結果，從而建立腸道菌群快速檢測平臺。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0024]圖1為正常小鼠及腸道菌群失調小鼠盲腸內容物DNA ERIC-PCR產物2%瓊脂糖凝膠電泳結果；
[0025]圖2為正常小鼠及腸道菌群失調小鼠盲腸內容物DNA ERIC-PCR產物10%Native-PAGE 凝膠電泳結果，M:DNA Marker DL2000 ；S1 ~S4:正常組小鼠；K2 ~K5:模
型組小鼠。
【具體實施方式】
[0026]以下實施例子進一步解釋本發明的內容，但并不用以限制本發明。
[0027]實施例1小鼠腸道菌群失調造模
[0028]將24只純系Balb/`c小鼠適應性飼養7天后隨機分為2組，每組12只，均為雄性，體質量在20±2g，分別為正常(生理鹽水，NS)組和模型組。正常組小鼠用NS灌胃0.35mL/只/次，每天灌胃2次，作為對照組。模型組小鼠每天每只給藥量分別為硫酸慶大霉素28mg和頭孢拉定70mg，按用藥量配成混合抗生素溶液后給藥0.35mL/只/次，每天灌胃2次，造成小鼠腸道菌群失調。混合抗生素溶液是由硫酸慶大霉素(80mg/2mL/支)40支和頭孢拉定(Ig/瓶)8瓶混勻而成。正常組和模型組均連續處理7d。
[0029]實施例2樣品采集與處理
[0030]將兩組實驗小鼠頸椎脫臼處死后，在75%酒精中浸泡片刻，解剖小鼠腹部，用無菌小勺取少量小鼠盲腸內容物，使盲腸內容物重量在0.15g，4°C保存或直接用于后續基因組提取操作，另取少量盲腸內容物(0.01~0.1Og)用于常規菌群分析(作為ERIC-PCR鑒定方法的參照)。
[0031]實施例3常規菌群分析
[0032]用NS將盲腸內容物做連續10倍稀釋，即從KT1至10_7，常規方法分離培養細菌，EMB、EC平板于37°C正置培養18h，LBS、BS平板于37°C正置厭氧培養48h，選擇菌落生長密度為10-100個的平板進行菌落計數，計算每克盲腸內容物中腸桿菌、腸球菌、乳桿菌和雙歧桿菌的菌落數(CFU/g),以LglOn/g表示,各組數據結果用mean土SE表示,統計學分析采用兩樣本均數t檢驗。正常組中，腸桿菌3.68 ±0.28CFU/g，腸球菌3.65 ±0.34CFU/g，乳桿菌 6.16±0.11 CFU/g,雙歧桿菌 6.58±0.08CFU/g ;模型組中，腸桿菌 5.29±0.21CFU/g，腸球菌 5.14±0.21 CFU/g,乳桿菌 4.83±0.21 CFU/g,雙歧桿菌 4.89±0.21 CFU/g ? 腸桿菌 P=0.001 < 0.01，腸球菌 P=0.003 < 0.01,乳桿菌 P=0.000 < 0.01，雙歧桿菌 P=0.000
< 0.01，四種菌群兩組間比較均有顯著的統計學意義。常規菌群分析結果表明四種優勢菌群在數量上出現明顯的變化，證實造模成功。
[0033]實施例4小鼠盲腸內容物基因組DNA的提取
[0034]采用糞便DNAout試劑盒(北京天恩澤基因科技有限公司，CAT#:70601)從盲腸內容物標本中提取基因組DNA。
[0035](1)65°C預熱溶液A，待其沉淀溶化后，充分混勻，然后取0.5mL加入到1.5mL塑料離心管中并放置于65°C待用。最好使用螺旋蓋離心管。
[0036](2)取0.1-0.3g的新鮮或冷凍的盲腸內容物，加入到含預熱溶液A的離心管中，振蕩器上劇烈振蕩5-10min。注意:一定要讓管底的樣品充分振蕩起來。
[0037](3)將離心管置于65°C水浴中保溫至少5min。
[0038](4) 13000-15000g室溫離心3min，將上清轉移到一新的1.5mL塑料離心管中。
[0039](5)在上清液中加入等體積的溶液B，上下顛倒30s使之充分混勻，溶液將呈白色或淡黃色混濁狀。
[0040](6)將離心管冰浴至少5min。
[0041](7) 13000-15000g室溫離心3min，轉移上清到新的1.5mL塑料離心管中。
[0042](8)加入0.2mL的氯仿(自備)，振蕩器上充分振蕩30s混勻。注意:一定要讓管底的溶液振蕩起來。
[0043](9) 13000-15000g室溫離心3min,小心轉移上清到新的1.5mL塑料離心管中。
[0044](10)重復第8步和第9步各一次。
[0045](11)將上清轉移到新的1.5mL離心管時，不要超過0.5mL,否則沒有空間加兩倍體積的乙醇。如果有多余的可以棄之不用。
[0046](12)加入2倍體積的乙醇(自備),上下顛倒30s混勻，15000g離心5_10min,棄上
清，管底將有微小DNA沉淀。注意:最好不要用異丙醇代替乙醇，否則不容易去除帶色素的雜質。
[0047](13)加入lmL75%乙醇(自備)，振蕩數秒，13000-15000g室溫離心3min，棄上清。
[0048](14)重復上步清洗一次。注意:75%乙醇洗兩次有助于去除PCR抑制物。短暫離心，吸棄殘留的75%乙醇(約50y L)，室溫晾干。注意:一定要去除殘留的75%乙醇，否則會影響后續反應和電泳上樣(樣品會飄走)。
[0049](15)加入30 ii L TE緩沖液溶解沉淀。注意:不知道樣品DNA產率前最好不要加過多TE。如果DNA濃度偏高，可以再加TE稀釋。
[0050]實施例5腐殖酸的清除
[0051](I)采用柱式腐殖酸清除劑(北京天恩澤基因科技有限公司，CAT#:60801)，將
0.3mL專用上柱液與50 ii L或50 ii L以下的含腐殖酸的DNA溶液輕柔混勻。如果DNA溶液體積超過50iiL，專用上柱液的體積需按1:6 (DNA溶液:專用上柱液)的比例相應增加。不要劇烈振蕩，否則DNA容易斷裂。
[0052](2)將離心管中的溶液轉移到離心吸附柱中，套上收集管，放于離心管架上，靜置3-5min, 12000-15000g離心Imin并倒掉收集管中的液體。若一次加不完,可分兩次加入并離心。[0053](3)加入0.5mL通用洗柱液于離心柱中，12000-15000g離心lmin，倒棄收集管中的廢液。
[0054](4)重復第3步操作I次。
[0055](5) 12000-15000g離心Imin以去除離心柱中的殘留液體。
[0056](6)將離心柱置于一新的干凈的離心管(自備)中，加入50 ii L通用洗脫液，靜置3_5min, 12000_15000g 離心 lmin。
[0057](7)離心管底部所得溶液即為純化的DNA溶液。4°C保存或用于后續實驗。
[0058]實施例6ERIC-PCR
[0059](I)由寶生物工程(大連)有限公司合成ERIC-PCR引物。
[0060]ERIClR:5，-ATGTAAGCTCCTGGGGATTCAC-3，；
[0061]ERIC2:5 ’ -AGTAAGTGACTGGGGTGAGCG-3，。
[0062]引物粉末短暫離心后，加入滅菌ddH20配制成IOOii M儲備液，經1:10稀釋成IOii M工作液。
[0063](2) ERIC-PCR反應液的配制
`[0064]取I ii L純化的盲腸內容物DNA作為模板，利用ERIC1R、ERIC2進行ERIC-PCR擴增。ERIC-PCR反應體系(總體積25 ii L):Premix Ex Taql2.5 y L，盲腸內容物DNA溶液I y L,ERIC1R0.5uL, ERIC20.5 u L, ddH2010.5 u L, PCR抑制物清除劑(北京天恩澤基因科技有限公司，CAT#:60804) 2.5 u L0 PCR 擴增程序:95°C預變性 7min，35 個循環(94°C變性 lmin,52°C退火lmin,65°C延伸8min),65°C延伸16min ;進行2%瓊脂糖凝膠電泳并拍照(圖1)。
[0065]實施例7非變性聚丙烯酰胺凝膠
[0066]取PCR產物10 ii L上樣。配制10%非變性聚丙烯酰胺凝膠:4mL ddH20、
2.6mL5 X TBE, 100 u L10%APS 和 4 y L TEMED 加 A 到 3.3mL30% 聚丙烯酰胺溶液中，待 Ih凝膠后即可使用。采用北京市六一儀器廠的水平電泳儀(DYY-6C型)進行電泳，設定電泳條件:室溫，150V，90min，電泳緩沖液為1XTBE。電泳結束后，采用凝膠1:10000的Syber-Green I溶液染色30min,并立即進行紫外拍照(見圖2)。
[0067]結果表明，8只小鼠腸道菌群基因組DNA經ERIC-PCR擴增及Native_PAGE，得到大小分布于0~2000bp的特異性條帶。正常組小鼠ERIC-PCR特異性條帶呈現多樣性，模型組小鼠ERIC-PCR特異性條帶漸成單一化，模型組小鼠較正常組腸道菌群明顯減少。
[0068]正常組小鼠腸道菌群種類豐富，ERIC-PCR特異性條帶呈現多樣性；而模型組小鼠由于腸道菌群失調導致以厭氧菌為主的正常優勢菌群數量急劇下降，因此ERIC-PCR特異性條帶漸成單一化。
【權利要求】
1.一種小鼠腸道菌群失調ERIC-PCR指紋圖譜的制備方法，其特征在于: (1)從盲腸內容物標本中提取基因組DNA; (2)所提取的盲腸內容物DNA須用柱式腐殖酸清除劑清除腐殖酸，從而得到純化的DNA溶液； (3)采用合成引物ERIC1R、ERIC2，取純化的DNA溶液作為PCR模板，PCR抑制物清除劑加入到PCR反應體系中，進行PCR擴增；取擴增產物用于非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳上樣，電泳結束后凝膠采用Syber-Green I染色，并立即進行紫外拍照，即得小鼠腸道菌群失調ERIC-PCR指紋圖譜；所述ERIClR引物的序列為5’ -ATGTAAGCTCCTGGGGATTCAC-3’，所述ERIC2引物的序列為5’ -AGTAAGTGACTGGGGTGAGCG-3’;所述PCR抑制物清除劑加入量與PCR總反應體系總量的體積比1:10。
2.如權利要求1所述小鼠腸道菌群失調ERIC-PCR指紋圖譜的制備方法，其特征在于:所述非變性聚丙烯酰胺凝膠為以30%聚丙烯酰胺、5XTBE為原料，10%APS作為促凝劑，TEMED作為催化促凝劑。
3.如權利要求1所述小鼠腸道菌群失調ERIC-PCR指紋圖譜的制備方法，其特征在于:所述PCR擴增，擴增程序為:95°C預變性7min，94°C變性lmin，52°C退火lmin，65°C延伸8min,循環 35 次，65°C延伸 16min。
4.權利要求1所述小鼠腸道菌群失調ERIC-PCR指紋圖譜的制備方法在小鼠腸道菌群失調快速鑒別的應用。
【文檔編號】C12Q1/04GK103773887SQ201410055356
【公開日】2014年5月7日 申請日期:2014年2月19日 優先權日:2014年2月19日
【發明者】倫永志, 孫麗妲 申請人:大連大學