H11亞型禽流感病毒rt-lamp可視化檢測(cè)試劑盒的制作方法
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明公開(kāi)了一種H11亞型禽流感病毒RT-LAMP可視化檢測(cè)試劑盒。本發(fā)明提供了檢測(cè)H11亞型禽流感病毒的環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增引物組，為由引物1、引物2、引物3、引物4、引物5和引物6組成的引物組A，或由所述引物1、所述引物2、所述引物3和所述引物4組成的引物組B；所述引物1、所述引物2、所述引物3、所述引物4、所述引物5和所述引物6的核苷酸序列分別為序列1、序列2、序列3、序列4、序列5和序列6。實(shí)驗(yàn)證明，本發(fā)明特異性強(qiáng)、靈敏度高、儀器設(shè)備及操作簡(jiǎn)單、結(jié)果便于觀察，尤其適合在基層獸醫(yī)站、養(yǎng)殖場(chǎng)及邊境口岸進(jìn)行H11亞型禽流感病毒的快速診斷和早期篩查。
【專(zhuān)利說(shuō)明】H11亞型禽流感病毒RT-LAMP可視化檢測(cè)試劑盒
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及Hll亞型禽流感病毒RT-LAMP可視化檢測(cè)試劑盒。
【背景技術(shù)】
[0002]禽流感病毒(Avian Influenza Virus，AIV)屬于正粘病毒科A型流感病毒屬，根據(jù)表面糖蛋白血凝素(Hemagglutinin,HA)和神經(jīng)氨酸酶(Neuraminidase,NA)的抗原性差異，AIV可進(jìn)一步分為不同的亞型，目前已鑒別出16種HA亞型(Hl~H16)和9種NA (NI~N9)亞型。AIV是一種有囊膜、單股負(fù)鏈、分節(jié)段的RNA病毒，基因組分為8個(gè)節(jié)段，分別編碼HA、NA、NP、NS、MP、PA、PBl和PB2蛋白。Hll亞型AIV為稀有亞型AIV，對(duì)該病的研究相對(duì)較少，為了更好地了解Hll亞型AIV這個(gè)病毒以及構(gòu)建種毒庫(kù)，目前，國(guó)內(nèi)外尚未見(jiàn)有該HA亞型AIV的檢測(cè)方法，因此，建立一種快速、簡(jiǎn)便和特異的檢測(cè)方法十分迫切，對(duì)該病的診斷具有重要意義。
[0003]目前，禽流感病毒常用的檢測(cè)方法包括病毒雞胚分離鑒定、普通RT-PCR法、實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR和酶聯(lián)免疫吸附法等。病毒雞胚分離鑒定是檢測(cè)的金標(biāo)準(zhǔn)，先接種雞胚增殖病毒，再用血凝試驗(yàn)和血凝抑制試驗(yàn)進(jìn)行鑒定，該法在實(shí)驗(yàn)室的檢測(cè)最為常見(jiàn)，但耗時(shí)太長(zhǎng)，常需要兩天到一周的時(shí)間；普通RT-PCR法和實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR法快速、靈敏，但儀器相對(duì)昂貴，并需技術(shù)人員進(jìn)行操作，不適合在基層推廣使用；酶聯(lián)免疫吸附法快速但需要特殊試劑；這些方法在實(shí)際應(yīng)用上存在一定的局限性。
[0004]環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增方法(loop-mediatedisothermal amplification, LAMP)最早由日本Notomi等報(bào)道，是一種新型核酸擴(kuò)增技術(shù)，與其它方法相比，LAMP具有更方便、更簡(jiǎn)捷、更靈敏和結(jié)果可視化等優(yōu)點(diǎn)，目前在一些病原微生物的檢測(cè)中被廣泛運(yùn)用。`
【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明的一個(gè)目的是提供一種檢測(cè)Hll亞型禽流感病毒的環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增引物組。
[0006]本發(fā)明所提供的檢測(cè)Hll亞型禽流感病毒的環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增引物組，具體為如下引物組A或引物組B:
[0007]所述引物組A由引物1、引物2、引物3、引物4、引物5和引物6組成；所述引物組B由所述引物1、所述引物2、所述引物3和所述引物4組成。
[0008]所述引物I (內(nèi)引物FIP-H11)、所述引物2 (內(nèi)引物BIP-H11)、所述引物3 (外引物F3-H11)、所述引物4 (外引物B3-H11)、所述引物5 (環(huán)引物L(fēng)F-HlI)和所述引物6 (環(huán)引物L(fēng)B-H11)的核苷酸序列分別為序列表中的序列1、序列2、序列3、序列4、序列5和序列6。
[0009]所述引物組A中，所述引物1、所述引物2、所述引物3、所述引物4、所述引物5和所述引物6的摩爾比具體可為8:8:1:1:4:4 ;所述引物組B中，所述引物1、所述引物2、所述引物3和所述引物4的摩爾比具體可為8:8:1:1。[0010]在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例中，所述引物I (內(nèi)引物FIP-HlI)和所述引物2 (內(nèi)引物BIP-HlI)在環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)體系中的終濃度均為1.6 μ M，所述弓丨物3 (外引物F3-H11)和所述引物4 (外引物Β3-Η11)在環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)體系中的終濃度均為0.2 μ Μ，、所述引物5 (環(huán)引物L(fēng)F-HlI)和所述引物6 (環(huán)引物L(fēng)B-HlI)在環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)體系中的終濃度均為0.8 μ Mo
[0011]序列I由42個(gè)核苷酸組成，序列2由41個(gè)核苷酸組成，序列3由20個(gè)核苷酸組成，序列4由22個(gè)核苷酸組成，序列5由20個(gè)核苷酸組成，序列6由19個(gè)核苷酸組成。
[0012]本發(fā)明的第二個(gè)目的是提供一種檢測(cè)Hll亞型禽流感病毒的逆轉(zhuǎn)錄環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增試劑。
[0013]本發(fā)明所提供的檢測(cè)Hll亞型禽流感病毒的逆轉(zhuǎn)錄環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增試劑，包括鏈置換型DNA聚合酶、甜菜堿、dNTPs、Mg2+ (如MgS04)、反轉(zhuǎn)錄酶和如上所述的引物組。
[0014]當(dāng)所述引物組為所述引物組A時(shí)，所述引物1、所述引物2、所述引物3、所述引物4、所述引物5、所述引物6、所述dNTPs、所述Mg2+、所述鏈置換型DNA聚合酶、所述反轉(zhuǎn)錄酶和所述甜菜堿在所述擴(kuò)增試劑中的配比為40pmol:40pmol:5pmol:5pmol:20pmol:20pmol:35nmol: 125nmol:8U:5U:20umol。
[0015]當(dāng)所述引物組為所述引物組B時(shí)，所述引物1、所述引物2、所述引物3、所述引物
4、所述dNTPs、所述Mg2+、所述鏈置換型DNA聚合酶、所述反轉(zhuǎn)錄酶和所述甜菜堿在所述擴(kuò)增試劑中的配比為 40pmol:40pmol:5pmol:5pmol:35nmol: 125nmol:8U:5U:20 μ mo I。
[0016]在本發(fā)明中，所述鏈置換型DNA聚合酶具體可為Bst DNA聚合酶大片段或BstDNA
聚合酶。
[0017]在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例中，所述Bst DNA聚合酶大片段具體為New EnglandBiolabs公司產(chǎn)品，產(chǎn)品目錄號(hào)為M0275。
[0018]在本發(fā)明中，所述反轉(zhuǎn)錄酶具體可為AMV反轉(zhuǎn)錄酶。
[0019]根據(jù)需要，所述檢測(cè)Hll亞型禽流感病毒的逆轉(zhuǎn)錄環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增試劑還包括熒光顯色劑。
[0020]所述熒光顯色劑可為含有鈣黃綠素和MnCl2的水溶液；所述熒光顯色劑中，所述鈣黃綠素和所述MnCl2的配比可為50μπιΟ1 =Immol0在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例中，所述熒光顯色劑具體為含有625 μ mo I/L的鈣黃綠素和12.5mmol/L的MnCl2的水溶液。
[0021]進(jìn)一步，在所述檢測(cè)Hll亞型禽流感病毒的逆轉(zhuǎn)錄環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增試劑中，所述鈣黃綠素和所述引物I的配比為625pmol:40pmolo
[0022]所述檢測(cè)Hll亞型禽流感病毒的逆轉(zhuǎn)錄環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增試劑中，還包括IOXBstbuffer。
[0023]所述IOXBst buffer的溶劑為水，溶質(zhì)及其濃度如下:200mM Tris-HClUOOmMKCl、IOOmM(MM)2SO4、20mM MgS04、1%(體積分?jǐn)?shù))Triton X-100，各濃度均為相應(yīng)組分在 IOX
等溫反應(yīng)緩存液中的終濃度。
[0024]在本發(fā)明中，所述檢測(cè)Hll亞型禽流感病毒的逆轉(zhuǎn)錄環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增試劑(每管20 μ L)，組成如下:終濃度均為2.0 μ M的所述引物I和所述引物2、終濃度均為0.25 μ M的所述引物3和所述引物4、終濃度均為1.0 μ M的所述引物5和所述引物6、終濃度為0.4U/μ L的所述Bst DNA聚合酶大片段、終濃度為0.25U/ μ L的所述AMV反轉(zhuǎn)錄酶、終濃度為1.75mM的所述dNTPs、終濃度為6.25mM的MgSO4、終濃度為1.0M的所述甜菜堿、終濃度為31.25 μ M的所述鈣黃綠素、終濃度為0.625mM的所述MnCl2,以及2.5 μ L所述IOXBstbuffer,余量為水。
[0025]更加具體的，在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例中，所述檢測(cè)Hll亞型禽流感病毒的逆轉(zhuǎn)錄環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增試劑(每管20 μ L)，組成如下:引物組A預(yù)混液I μ L (使所述引物I濃度為40 μ Μ、所述引物2濃度為40 μ Μ、所述引物3濃度為5 μ Μ、所述引物4濃度為5 μ M溶液、所述引物5濃度為20 μ Μ、所述引物6濃度為20μΜ)、2.5μ L所述10 X Bstbuffer、l.0 μ L濃度為8U/ μ L的所述Bst DNA聚合酶大片段溶液、LOyL濃度為5U/ μ L的所述AMV反轉(zhuǎn)錄酶溶液、3.5 μ L濃度為IOmM的所述dNTPs溶液、5.0yL濃度為25mM的MgSO4溶液、4 μ L濃度為5Μ的所述甜菜堿溶液、I μ L濃度為625 μ M的所述鈣黃綠素溶液，以及I μ L濃度為12.5mM的MnCl2溶液。各溶液的溶劑均為水。
[0026]本發(fā)明的第三個(gè)目的是提供一種檢測(cè)Hll亞型禽流感病毒的逆轉(zhuǎn)錄環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增試劑盒。
[0027]本發(fā)明所提供的檢測(cè)Hll亞型禽流感病毒的逆轉(zhuǎn)錄環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增試劑盒含有如上所述的引物組，或如上所述的試劑。
[0028]進(jìn)一步，所述檢測(cè)Hll亞型禽流感病毒的逆轉(zhuǎn)錄環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增試劑盒還可包括陽(yáng)性對(duì)照和陰性對(duì)照。其中，陽(yáng)性對(duì)照可為Hll亞型禽流感病毒RNA ;陰性對(duì)照可為滅菌超純水。
[0029]另外，所述試劑盒中還包括說(shuō)明書(shū)；所述說(shuō)明書(shū)中記載:向每管20 μ L的所述試劑中加入1-5 μ L的模板RNA，其余以滅菌超純水補(bǔ)足25 μ L，形成RT-LAMP反應(yīng)體系。
[0030]在上述檢測(cè)Hll亞型禽流感病毒的環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增引物組或上述檢測(cè)Hll亞型禽流感病毒的逆轉(zhuǎn)錄環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增試劑或檢測(cè)Hll亞型禽流感病毒的逆轉(zhuǎn)錄環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增試劑盒中，各引物可分別單獨(dú)包裝或按照所述比例混合后共同包裝。
`[0031]如下a)或b)的應(yīng)用也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍:
[0032]a)如上所述的引物組在制備所述試劑或所述試劑盒中的應(yīng)用；
[0033]b)所述引物組，或所述試劑，或所述試劑盒在制備檢測(cè)或輔助檢測(cè)待測(cè)樣品中是否含有Hll亞型禽流感病毒的產(chǎn)品中的應(yīng)用。
[0034]應(yīng)用所述引物組，或所述試劑，或所述試劑盒檢測(cè)或輔助檢測(cè)待測(cè)樣品中是否含有Hll亞型禽流感病毒的方法，包括如下步驟:用所述引物組，或所述試劑，或所述試劑盒在63°C條件下對(duì)所述待測(cè)樣品進(jìn)行時(shí)長(zhǎng)Ih的逆轉(zhuǎn)錄環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)，之后在80°C 5min終止反應(yīng)。反應(yīng)結(jié)束后，直接肉眼觀察反應(yīng)液顏色判定結(jié)果，陽(yáng)性反應(yīng)液肉眼可見(jiàn)顏色變綠，陰性仍為淺桔色，實(shí)現(xiàn)了 RT-LAMP反應(yīng)結(jié)果的可視化觀察同時(shí)也避免了打開(kāi)反應(yīng)管蓋后引起環(huán)境污染而造成下次實(shí)驗(yàn)的假陽(yáng)性結(jié)果。反應(yīng)開(kāi)始之前鈣黃綠素(Calcein)與熒光淬滅劑錳離子結(jié)合而不發(fā)熒光，反應(yīng)液為淺桔色。隨著反應(yīng)的擴(kuò)增，產(chǎn)生大量的焦磷酸根離子，而焦磷酸根離子更易與錳離子結(jié)合從而釋放了鈣黃綠素。游離的鈣黃綠素就可自發(fā)熒光，鎂離子還可以加強(qiáng)這種熒光效果。只需一個(gè)可控溫的水浴鍋即可完成全部反應(yīng)，反應(yīng)結(jié)束后，通過(guò)肉眼觀察反應(yīng)液顏色，直接判定結(jié)果。
[0035]在本發(fā)明中，以上所有的所述Hll亞型禽流感病毒均可為H11N3型禽流感病毒。在本發(fā)明是一個(gè)實(shí)施例中，所述Hll型禽流感病毒具體為禽流感病毒毒株A/Chicken/Guangxi/43C/09 ;所述Hl 1N3型禽流感病毒具體為禽流感病毒毒株A/duck/HK/661/79(H11N3)。
[0036]實(shí)驗(yàn)證明，本發(fā)明提供的檢測(cè)Hll亞型禽流感病毒的環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增引物組、試劑和試劑盒可特異性地檢測(cè)Hll亞型禽流感病毒，而對(duì)其它亞型禽流感病毒、呼吸道病原體無(wú)交叉反應(yīng)，針對(duì)Hll亞型禽流感病毒HA基因的RT-LAMP方法最少可以檢測(cè)到IO2拷貝/μ L的Hll亞型禽流感病毒。本發(fā)明特異性強(qiáng)、靈敏度高、儀器設(shè)備及操作簡(jiǎn)單、結(jié)果便于觀察，尤其適合在基層獸醫(yī)站和養(yǎng)殖場(chǎng)進(jìn)行快速檢測(cè)，具有非常廣闊的應(yīng)用前景。
【專(zhuān)利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0037]圖1為Hll亞型禽流感病毒的RT-LAMP試劑盒的特異性分析結(jié)果。1_13依次為Hl 1Ν3、Hl 1、HlNl、Η3Ν2、Η4、Η5Ν2、Η6Ν8、Η7Ν2、Η9Ν2、NDV、IBV、ILTV 和陰性對(duì)照。
[0038]圖2為Hll亞型禽流感病毒的RT-LAMP試劑盒的靈敏度分析結(jié)果。其中，1_7依次為IO6拷貝/ μ L、IO5拷貝/ μ L、IO4拷貝/ μ L、IO3拷貝/ μ L、IO2拷貝/ μ L、10拷貝/ μ L的Hll亞型禽流感病毒HA基因靶片段的質(zhì)粒H11HA-PMD18-T，以及陰性對(duì)照。
【具體實(shí)施方式】
[0039]下述實(shí)施例中所使用的實(shí)驗(yàn)方法如無(wú)特殊說(shuō)明，均為常規(guī)方法。
[0040]下述實(shí)施例中所用的材料、試劑等，如無(wú)特殊說(shuō)明，均可從商業(yè)途徑得到。
[0041]MiniBEST Viral RNA/DNA Extraction Kit Ver.4.0 抽提試劑盒、AMV 反轉(zhuǎn)錄酶、dNTPs和pMD18-T載體購(gòu)自大連寶生物公司；膠回收試劑盒購(gòu)自北京全氏金公司；Bst DNA聚合酶(大片段)購(gòu)自New En`gland Biolabs公司舊8304和甜菜堿(Betaine)購(gòu)自Sigma公司。
[0042]禽流感病毒毒株A/duck/HK/661/79(HllN3):記載在 “Xie Z，Pang Y S，Liu J, et al.A multiplex RT-PCR for detection of type a influenza virus anddifferentiation of avian H5, H7and H9hemagglutinin subtypes[J].Mol Cell Probes,2006，20 (3-4):245-249” 一文中，公眾可從廣西壯族自治區(qū)獸醫(yī)研究所獲得。
[0043]禽流感病毒毒株A/Chicken/Guangxi/43C/09 (HI I)、A/Duck/Guangx i/03OD/2009 (HlNl)、A/Duck/Guangxi/N42/2009 (H3N2)、A/Duck/Guangxi/027D/2009 (H4)、A/Turkey/GA/209092/02 (H5N2)、A/Turkey/0ntario/63 (H6N8)、A/Chicken/NY/273874/03 (H7N2), A/Duck/Guangxi/RX/09 (H9N2),以及新城疫病毒 Newcastle disease virus (NDV)、傳染性支氣管炎病毒 Infectious bronchitisvirus (IBV)和傳染性喉氣管炎病毒 Infectious Laryngotracheitis virus (ILTV):均記載在 “Yi Peng, et al.Visual detection of H3subtype avian influenza viruses byreverse transcription loop-mediated isothermal amplification assay.VirologyJournal2011，8:337” 一文中，公眾可從廣西壯族自治區(qū)獸醫(yī)研究所獲得。
[0044]實(shí)施例1、檢測(cè)Hll亞型禽流感病毒的環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增試劑盒的制備及使用方法
[0045]一、檢測(cè)Hll亞型禽流感病毒的環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增引物組的制備
[0046]本實(shí)施例的檢測(cè)Hll亞型禽流感病毒的環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增引物組，由內(nèi)引物FIP-H11、內(nèi)引物BIP-Hl1、外引物F3-H11、外引物B3-H11、環(huán)引物L(fēng)F-H11和環(huán)引物L(fēng)B-H11組成。這六條引物是本發(fā)明的發(fā)明人通過(guò)比較分析大量的Hll亞型禽流感病毒的HA基因序列后設(shè)計(jì)得到的，它們的核苷酸序列分別為序列表中的序列1、序列2、序列3、序列4、序列5和序列6 (表1)。
[0047]表1RT-LAMP引物序列
[0048]
【權(quán)利要求】
1.檢測(cè)Hll亞型禽流感病毒的環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增引物組，為引物組A或引物組B;所述引物組A由引物1、引物2、引物3、引物4、引物5和引物6組成；所述引物組B由所述引物1、所述引物2、所述引物3和所述引物4組成； 所述引物1、所述引物2、所述引物3、所述引物4、所述引物5和所述引物6的核苷酸序列分別為序列表中的序列1、序列2、序列3、序列4、序列5和序列6。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的引物組，其特征在于:所述引物組A中所述引物1、所述引物2、所述引物3、所述引物4、所述引物5和所述引物6的摩爾比為8:8:1:1:4:4 ;所述引物組B中所述引物1、所述引物2、所述引物3和所述引物4的摩爾比為8:8:1:1。
3.檢測(cè)Hll亞型禽流感病毒的逆轉(zhuǎn)錄環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增試劑，包括鏈置換型DNA聚合酶、甜菜堿、dNTPs、Mg2+、反轉(zhuǎn)錄酶和權(quán)利要求1或2所述的引物組。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的試劑，其特征在于:所述引物1、所述引物2、所述引物3、所述引物4、所述引物5、所述引物6、所述dNTPs、所述Mg2+、所述鏈置換型DNA聚合酶、所述反轉(zhuǎn)錄酶和所述甜菜堿在所述擴(kuò)增試劑中的配比為40pmol:40pmol:5pmol:5pmol:20pmol:20pmol:35nmol: 125nmol:8U:5U:20 μ moI ;或 所述引物1、所述引物2、所述引物3、所述引物4、所述dNTPs、所述Mg2+、所述鏈置換型DNA聚合酶、所述反轉(zhuǎn)錄酶和所述甜菜堿在所述擴(kuò)增試劑中的配比為40pmol:40pmol:5pmol:5pmol:35nmol: 125nmol:8U:5U:20umol。
5.根據(jù)權(quán)利要求3或4所述的試劑，其特征在于:所述鏈置換型DNA聚合酶為BstDNA聚合酶大片段或Bst DNA聚合酶?！?br> 6.根據(jù)權(quán)利要求3-5中任一所述的試劑，其特征在于:所述反轉(zhuǎn)錄酶為AMV反轉(zhuǎn)錄酶。
7.根據(jù)權(quán)利要求3-6中任一所述的試劑，其特征在于:所述試劑還包括熒光顯色劑。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的試劑，其特征在于:所述熒光顯色劑為含有鈣黃綠素和MnCl2的水溶液； 所述突光顯色劑中，所述鈣黃綠素和所述MnCl2的配比為50μηιο1: Immol0
9.檢測(cè)Hll亞型禽流感病毒的逆轉(zhuǎn)錄環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增試劑盒，其特征在于:所述試劑盒含有權(quán)利要求1或2所述引物組，或權(quán)利要求3-8中任一所述的試劑。
10.如下a)或b)的應(yīng)用: a)權(quán)利要求1或2所述的引物組在制備權(quán)利要求3-8中任一所述試劑或權(quán)利要求9所述試劑盒中的應(yīng)用； b)權(quán)利要求1或2所述的引物組，或權(quán)利要求3-8中任一所述的試劑，或權(quán)利要求9所述的試劑盒在制備檢測(cè)或輔助檢測(cè)待測(cè)樣品中是否含有Hll亞型禽流感病毒的產(chǎn)品中的應(yīng)用。
【文檔編號(hào)】C12R1/93GK103820576SQ201410065912
【公開(kāi)日】2014年5月28日 申請(qǐng)日期:2014年2月26日 優(yōu)先權(quán)日:2014年2月26日
【發(fā)明者】謝芝勛, 羅思思, 劉加波, 龐耀珊, 鄧顯文, 謝志勤, 謝麗基, 范晴 申請(qǐng)人:廣西壯族自治區(qū)獸醫(yī)研究所