Hla-b*27等位基因檢測方法及其試劑盒的制作方法
【專利摘要】本發明涉及用于檢測人類白細胞HLA-B*27抗原基因的方法，包括提供待測樣品、核酸擴增體系和熒光檢測體系混合物；通過擴增反應循環擴增靶多核苷酸；使熒光發生基團與被擴增的靶多核苷酸序列間接結合；測定熒光發生基團產生的熒光量，確定靶多核苷酸的存在及其相對量；所述核酸擴增體系由耐熱DNA聚合酶、2’-脫氧核苷三磷酸、能夠與靶多核苷酸的第一、二條鏈結合的引物組成。本發明還公開了與其配套使用的試劑盒。本發明方法與試劑盒應用于人HLA-B*27等位基因檢測，可實現HLA-B*27等位基因的雜合型與純合型的定量區分，對于HLA-B*27等位基因強關聯性疾病的早期預警更具優勢。
【專利說明】HLA-B*27等位基因檢測方法及其試劑盒
【技術領域】
[0001 ] 本發明涉及一種采用實時熒光定量技術，檢測人類白細胞HLA-B*27抗原基因的檢測方法及其配套使用的試劑盒。
【背景技術】
[0002]HLA(human leukocyte antigen),即人類白細胞抗原是人體重要的免疫遺傳體系，也是目前所知人體最復雜的多態系統。HLA作為抗原刺激機體產生相應抗體的性質或分子結構，這是器官移植產生排異反應的主要原因，也是血清學和細胞學配型的基礎。HLA有
I類、II類、III類基因，HLA-B*是I類HLA基因的三個位點(HLA-A*、HLA_B*、HLA-C*)之一。而HLA-B27基因即人類HLA-1類分子B位點上的等位基因，位于第6號染色體短臂上，由8個外顯子和7個內含子組織，編碼分子質量為43KD的糖蛋白。該基因主要表達在機體所有的有核細胞表面，尤其是淋巴細胞表面有豐富的含量。[0003]強直性脊椎炎(Ankylosing Spondylitis AS)是以骶髂關節和脊柱附著點炎癥為主要癥狀的疾病。該病以脊柱為主要病變部位的慢性病，累及骶髂關節，引起脊柱強直和纖維化，造成不同程度眼、肺、肌肉、骨骼病變，屬自身免疫性疾病。據資料統計，我國約有400余萬強直性脊柱炎病人。它最為顯著的變化為關節的纖維化和骨性強直。若不及時診治，很容易導致患者關節畸形，終身痛苦，故有“不死的癌癥”之稱。上個世紀70年代Brewerlon等首先發現HLA-B*27抗原與強直性脊椎炎密切相關。此后，國內外對HLA與疾病的相關性研究層層遞進，不斷深入。研究結果不斷證實了 HLA-B*27抗原與強直性脊椎炎的強關聯性:90% -95%的強直性脊椎炎患者表達了 HLA-B*27基因，而普通人群中HLA_B*27的表達頻率僅為5% -10%。在強直性脊椎炎患者中已檢測到B*2701、2702、2703、2704、2705、2706、2707、2708、2710、2715相關亞型的表達，其中白種人強直性脊椎炎患者與B*2707、B*2705亞型相關，亞洲人強直性脊椎炎患者與B*2704、B*2705亞型相關，而與中國強直性脊椎炎患者相關的亞型主要是B*2702、B*2704和B*2705。強直性脊柱炎的診斷主要依據患者骨侵蝕、硬化等形態學變化，從治療角度講，此時已發病4-10年，失去最佳的治療時機，因此早期診斷成為爭取良好預后的關鍵。臨床上，對疑似病例或早期患者開展HLA-B27的檢測，可起到輔助診斷的效果，對于疑難病例的診斷、鑒別診斷及預后判斷，對患者親屬或子女患病風險的預測，尤其對于癥狀不明顯的早期患者的確診，均具有非常重要的參考價值。此外，還有許多疾病與HLA-B*27抗原的表達有著或多或少的關聯性，如Reiter S綜合癥的HLA-B*27陽性率為70-90%，銀屑病性關節炎的HLA_B*27陽性率為50-60 %，葡萄膜炎的HLA-B*27陽性率為40-50%等等。因此，HLA_B*27的檢測在這些疾病的診斷中是一個非常有價值的指標。
[0004]近年來，隨著人們對HLA_B*27與疾病相關性研究的逐漸深入，HLA_B*27的檢測在臨床上日益受到重視。HLA-B*27的檢測技術也不斷發展，目前常見的HLA-B27檢測方法有流式細胞術(FCM)、微量淋巴細胞毒法(MLCT)、ELISA法、PCR-SSP法、實時熒光定量PCR等。在這些技術中，流式細胞術(FCM)、微量淋巴細胞毒法(MLCT)、ELISA法、PCR-SSP等方法或者硬件要求高，標本存放不易、或者操作復雜，檢測容量小、或者準確性不高、，已很難適應臨床檢驗的要求。而實時熒光定量PCR技術是近年在普通PCR基礎上發展起來的核酸檢測方法，它將熒光值的積累與PCR產物的擴增過程相結合，通過測量指數擴增期的熒光值來計算待測樣本中核酸的原始量。相較于傳統的HLA等位基因分型檢測方法，FQ-PCR除了具有靈敏度高、特異性強等特點外，還具有著操作簡便、耗時短、可定量等傳統方法無可比擬的優點。將FQ-PCR應用于HLA等位基因的檢測是PCR【技術領域】的一項創新。
[0005]Taqman PCR技術是FQ-PCR技術中更具技術優勢的一種,本發明即將TaqmanPCR技術應用于HLA_B*27等位基因的檢測，使Taqman PCR的技術優點(靈敏度高、特異性強、著操作簡便、耗時短、可定量)在HLA-B*27等位基因檢測中得到完美繼承。特別是本試劑盒利用設計了嚴謹的內對照體系，利用相對定量的原理對HLA-B*27等位基因的純合型和雜合型進行了鑒定。本發明涉及的試劑盒可廣泛應用于人HLA-B*27等位基因的檢測，可區分HLA-B*27等位基因的雜合型與純合型，其結果可量化，對于HLA-B*27等位基因強關聯性疾病的早期預警更具優勢。

【發明內容】

[0006]本發 明要解決的技術問題是提供一種HLA_B*27等位基因檢測方法及其試劑盒，以克服現有技術存在的上述缺陷。
[0007]本發明的一個目的是提供一種HLA_B*27等位基因檢測方法，該方法包括如下步驟:
[0008](I)提供包括待測樣品、核酸擴增體系和熒光檢測體系的混合物；
[0009](2)通過擴增反應循環擴增待測樣品中的靶多核苷酸；
[0010](3)使所述熒光檢測體系中的熒光發生基團與被擴增的靶多核苷酸序列間接結合；
[0011](4)測定熒光發生基團所產生的熒光量，從而確定靶多核苷酸的存在及其相對量。
[0012]所述核酸擴增體系由如下組分組成:耐熱DNA聚合酶、2’ -脫氧核苷三磷酸、能夠與靶多核苷酸的第一條鏈結合的正向引物a和能夠與靶多核苷酸的第二條鏈結合的反向引物a，能夠與靶多核苷酸的第一條鏈結合的正向引物b和能夠與靶多核苷酸的第二條鏈結合的反向引物b ；
[0013]所述熒光檢測體系是能夠與靶多核苷酸結合并且兩端分別結合有熒光發生基團和熒光淬滅基團的兩條寡核苷酸探針。
[0014]作為一種優選的技術方案，本發明所述核酸擴增體系和熒光檢測體系共I組，其中:
[0015]核酸擴增體系中用于靶多核苷酸擴增的正向引物a和反向引物a分別為引物I和引物2，用于靶多核苷酸擴增的正向引物b和反向引物b分別為引物3和引物4，并且熒光檢測體系中所使用的寡核苷酸探針為探針I和探針2 ；
[0016]其中，各引物和探針具體組成如下:
[0017]引物1: 5，-GCTGTTCGTGAGGTTCGACA-3 ’，
[0018]引物2:5，-TCCGCAGGTCCTCTCGGTCA-3，，
[0019]引物3:5 ’ -GGTGAAGGTCGGAGTCAACG-3，，[0020]引物4:5 ’ -ACCATGTAGTTGAGGTCAATGAAGG-3 ’，
[0021]探針1:5’ -GCGGGGAGCCCCGCTTCATCACCGT-3’，
[0022]探針2:5’ -CGCCTGGTCACCAGGGCTGC-3’。
[0023]其中，引物1、2來源于人HLA-B位點的基因序列，引物I位于165-184位，含20個堿基，引物2位于291 -310位，含20個堿基，擴增片段長度為146bp ;引物3、4來自源人GAPDH基因序列的HBB基因第9外顯子的序列，引物3含20個堿基，引物4含25個堿基，擴增片段長度為123bp。探針I來源于HLA-B位點基因序列的122-145位，其長度為24bp ;探針2來源于人GAPDH基因第9外顯子的一段序列，其長度為20bp。[0024]可使用DNA合成裝置合成所需的寡核苷酸引物，用分子篩和快速液相層析法(FPLC)純化后進行氨解處理。同樣合成所需的探針序列，氨解處理后分別在其5’端標記作為熒光發生基團(報告基團)的FAM或HEX，并在其3’端標記借助活性連接臂偶聯的作為熒光淬滅基團的TAMRA或BHQ。以FPLC層析法純化熒光標記的探針，然后使用變性條件下的聚丙烯酰胺凝膠(20%)電泳法和分光光度法物理鑒定所合成的引物和探針的純度。
[0025]所述擴增反應循環是重復30-35次的聚合酶鏈反應循環。
[0026]所述待測樣品是指需要檢測其中是否含有HLA_B*27基因型的臨床血液樣本。
[0027]所述靶多核苷酸來自人血液全基因組DNA。
[0028]作為本發明的一個優選實施方案，步驟(4)中，先確定樣品中的靶多核苷酸經擴增后所產生的熒光達到基線以上的固定閾值時所需的閾循環數；然后將上述測定的閾循環數與標準溶液中的靶多核苷酸的閾循環數相比較，以確定樣品中靶多核苷酸的相對量，從而判斷樣品包含靶多核苷酸基因的純合型與雜合型。
[0029]使用磁珠法或DNA柱回收法(可購買市售DNA提取試劑盒)從得自受試者的血液樣本中提取基因組DNA，然后將提取合格的DNA產物用于后續的PCR擴增。
[0030]在含有引物1、2和引物3、4，探針1、2，DNA模板(PCR擴增靶序列)，dNTPs(10mM)，耐熱DNA聚合酶，Mg2+，PCR緩沖液和水的反應體系中使用ABI7500、Roche LightCycler480,Mx3000P等其它結構類似的自動熒光檢測熱循環儀上對如上得到的DNA序列進行PCR擴增。所使用的反應條件是:95°C預變性3分鐘，95°C 30秒一62°C 30秒，共進行35個循環；最后25°C下至少30秒。
[0031]1.無效結果判定:與存在于擴增體系中的寡核苷酸熒光探針2相關的擴增曲線不呈現“S”型或Ct值空白又或Ct值> 30的樣本，報告為無效；
[0032]2.陽性結果判定:滿足與體系中的寡核苷酸探針I和探針4相關的擴增曲線呈現“S”型且同體系中探針I和探針4的CT值< 30的樣本，報告為陽性；
[0033]3.陰性結果判定:屬于無效結果判定和陽性結果判定以外的情況則報告為陰性；
[0034]可利用已知為HLA_B*27純合型和雜合型等位基因的樣本與待檢樣本(DNA濃度為20ng/ μ I)同批次進行PCR擴增反應，在獲得相應的CT值后，利用雙Λ Ct法，將標準品(HLA-B*27純合型和雜合型樣本)擴增體系中與探針1、探針2相關的擴增曲線的CT值，與待檢樣本(根據擴增試驗結果已確定為HLA-B*27等位基因型)擴增體系中探針1、探針2相關的擴增曲線的CT值進行比較分析，從而判斷出待檢樣本(根據擴增試驗結果已確定為HLA-B*27等位基因型)HLA-B*27等位基因的純合型或雜合型。也就是說，為了基于上述的擴增反應結果推斷出待檢樣本HLA-B*27等位基因的純合型或雜合型。[0035]本發明的另一個目的是提供一種用于上述HLA_B*27等位基因檢測的試劑盒，該試劑盒包括:(I)分別裝有反應液、EZ Taq酶混合液、標準液1、標準液2的多個密封離心管，(2)分隔并集中包裝這些離心管的試劑盒；其中:
[0036]反應液由如下組分組成:由PCR反應緩沖液、2’ -脫氧核苷三磷酸、用于靶多核苷酸擴增的引物I和引物2，寡核苷酸探針為探針I ;用于靶多核苷酸擴增的引物3和引物4，寡核苷酸探針為探針2 ；
[0037]EZ Taq混合液:主要成份為熱啟動Taq酶；
[0038]標準液1:純合型HLA_B*27基因組DNA ；
[0039]標準液2:雜合型HLA_B*27基因組DNA。
[0040]與基于擴增反應完成后進行單一終點檢測的傳統PCR方法不同，實時熒光定量聚合酶鏈反應方法可以在擴增反應進行的過程中隨時監測擴增產物的產生，從而極大的提高了定量檢測的準確性和精密度。實時熒光定量PCR (Taqman探針法)在PCR的擴增中，同時加入了引物和在5’末端和3’末端分別標記有熒光發生基團和熒光淬滅基團的特異性寡核苷酸探針 。如果探針沒有與靶序列互補結合，探針序列保持完整，熒光發生基團發射的熒光信號被淬滅基團吸收，故沒有熒光信號的產生，而當探針與靶序列能夠互補結合時，在PCR擴增進行的過程中，DNA聚合酶在引導DNA序列復制的同時其5’ -3’端外切酶活性將切斷熒光探針，導致熒光發生基團與熒光淬滅基團的分離，從而熒光檢測系統可以接收并記錄熒光信號。每擴增一條DNA鏈即有一個熒光信號的產生，熒光信號的積累與PCR產物的形成完全同步，故可以實時地監測整個PCR反應過程，并可借助標準曲線或表達量恒定的內對照產物對未知的靶多核苷酸進行絕對或相對的定量分析。
[0041]如上所述,為了檢測出臨床血液樣本中HLA (human leukocyte antigen)的基因型為HLA-B*27等位基因型，特別是能夠準確區分與HLA-B*27等位基因有著較高相似度DNA序列的其他等位基因型，設計并制備實現這些目的的寡核苷酸引物和探針是一個非常重要的技術環節。為此，我們在使用適當的核酸分析軟件(如DNA Star)對HLA-B*的核苷酸序列進行分析，進一步使用適當的引物設計軟件(如Primer primer5.0)選擇并設計具有特定核苷酸序列的寡核苷酸引物；選擇并設計具有特定核苷酸序列的寡核苷酸探針。
[0042]如上所述,為了檢測出臨床血液樣本中HLA (human leukocyte antigen)的基因型為HLA-B*27等位基因型，特別是能夠準確區分與HLA-B*27等位基因有著較高相似度DNA序列的其他等位基因型，本發明將HLA-B*27等位基因型的DNA序列與其它與之有著高度同源性的等位基因型的DNA序列進行了同源性比較和分析，特別設計適用本發明檢測試劑盒的寡核苷酸引物和探針。使用這些引物和探針完成的HLA-B*27等位基因實時定量檢測，極大的簡化了 HLA-B*27等位基因檢測的操作步驟，縮短了檢測時間，提高了檢測靈敏度，降低了模板使用量。實驗證明，本發明對HLA-B*27等位基因型檢測的準確度在99%以上。
[0043]值得特別說明的是，我們使用了已知為HLA_B*27等位基因純合型和雜合型的基因組DNA參考品，作為檢測體系中的陽性對照。此外，參考品的存在，使完成HLA-B*27等位基因型檢測的同時，進一步提高了待檢樣本HLA-B*27等位基因純合型或雜合型判斷的準確度。
[0044]本發明即將Taqman PCR技術應用于HLA_B*27等位基因的檢測，使TaqmanPCR的技術優點(靈敏度高、特異性強、著操作簡便、耗時短、可定量)在HLA-B*27等位基因檢測中得到完美繼承的同時對HLA-B*27等位基因的純合型和雜合型進行了鑒定。本發明涉及的試劑盒可廣泛應用于人HLA-B*27等位基因的檢測，為強直性脊椎炎、Reiter S綜合癥、銀屑病性關節炎、葡萄膜炎的早期預警提供了便捷的診斷工具。
【具體實施方式】
[0045]下面給出本發明較佳實施例，以詳細說明本發明的技術方案。
[0046]實施例1:
[0047]HLA_B*27等位基因檢測試劑盒(SSP-PCR熒光探針法)及其使用。
[0048](I)制備包括下列組成成份的試劑盒:反應液(900 μ I/管)I管、EZ Taq酶混合液(100 μ I/管)I管、標準液I (30 μ I/管)、標準液2 (30 μ I/管)。
[0049](2)樣本采集、運送和保存:用一次性真空采血器，無菌操作，取待檢個體血液樣本，做好標示后將獲取的血液樣本置于低溫冰箱(_70°C或_20°C)中冷凍保存。如集中檢驗，標本需在0°C以下環境中運送并于24小時內送達實驗室。
[0050](3)檢驗步驟和結果分析:
[0051]將待檢測血樣取300 μ 1，用柱回收法提取血液樣本中的DNA，用分光光度計或類似的儀器確認提取的DNA的質量(0D260/280在1.8-2.0之間)，將提取的每份待檢樣本DNA和標準品DNA分別置于I個PCR反應管或PCR板的I個孔中，每孔2 μ I。然后,在加入DNA樣本的孔中加入PCR反應液16 μ 1，再在每個孔中加入2 μ I的酶混合液。混勻離心后,將PCR反應體系置于自動突光檢測熱循環儀上，選擇FAM通道(Reporter:FAM, Quencher:none)收集特異擴增信號；選擇HEX或VIC通道(Reporter:HEX/VIC, Quencher:none)檢測內標；參比突光(Passive Reference)設置為none ;設置Sample Volume為20。按照儀器操作說明做好相應設置后開始試驗。本試劑盒的所使用的反應條件是:95°C預變性3分鐘，95°C 30秒一620C 30秒，共進行35個循環；最后25°C下至少30秒。
[0052]反應結束后保存檢測數據文件，點選儀器的數據分析選項后可查看各個PCR反應體系的結果，如PCR擴增曲線，待檢樣本和標準樣本的CT值等，具體PCR擴增反應條件、標準品和樣品的檢測結果見表1~表3。
[0053]表1PCR擴增反應條件
【權利要求】
1.一種HLA-B*27等位基因檢測方法，其特征在于，包括如下步驟: (1)提供包括待測樣品、核酸擴增體系和熒光檢測體系的混合物； (2)通過擴增反應循環擴增待測樣品中的靶多核苷酸； (3)使所述熒光檢測體系中的熒光發生基團與被擴增的靶多核苷酸序列間接結合； (4)測定熒光發生基團所產生的熒光量，從而確定靶多核苷酸的存在及其相對量； 所述核酸擴增體系由如下組分組成:耐熱DNA聚合酶、2’ -脫氧核苷三磷酸、能夠與靶多核苷酸的第一條鏈結合的正向引物a和能夠與靶多核苷酸的第二條鏈結合的反向引物a，能夠與靶多核苷酸的第一條鏈結合的正向引物b和能夠與靶多核苷酸的第二條鏈結合的反向引物b ;所述熒光檢測體系是能夠與靶多核苷酸結合并且兩端分別結合有熒光發生基團和熒光淬滅基團的兩條寡核苷酸探針。
2.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，所述核酸擴增體系和熒光檢測體系為:核酸擴增體系中用于靶多核苷酸擴增的正向引物a和反向引物a分別為引物I和引物2，用于靶多核苷酸擴增的正向引物b和反向引物b分別為引物3和引物4，并且熒光檢測體系中所使用的寡核苷酸探針為探針I和探針2 ； 各引物和探針具體組成如下:
引物 1:5’ -GCTGTTCGTGAGGTTCGACA-3’，
引物 2:5’ -TCCGCAGGTCCTCTCGGTCA-3’，
引物 3:5’ -GGTGAAGGTCGGAGTCAACG-3’，
引物 4:5’ -ACCATGTAGTTGAGGTCAATGAAGG-3’，
探針 1:5’ -GCGGGGAGCCCCGCTTCATCACCGT-3’，
探針 2:5’ -CGCCTGGTCACCAGGGCTGC-3’。
3.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，所述擴增反應循環是重復30-35次的聚合酶鏈反應循環。
4.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，所述步驟(4)中，先確定樣品中靶多核苷酸的含量，然后確定靶多核苷酸經擴增后所產生的熒光達到基線以上的固定閾值時所需的閾循環數；然后將上述測定的閾循環數與標準溶液中的靶多核苷酸的閾循環數相比較，以確定樣品中靶多核苷酸的相對量，從而判斷樣品包含靶多核苷酸基因的純合型與雜合型。
5.一種用于HLA-B*27等位基因檢測的試劑盒，其特征在于，該試劑盒包括:(1)分別裝有反應液、EZ Taq混合液、標準液1、標準液2的多個密封離心管， (2)分隔并集中包裝這些離心管的試劑盒；其中: 反應液I由如下組分組成:由PCR反應緩沖液、2’ -脫氧核苷三磷酸、用于靶多核苷酸擴增的引物I和引物2，寡核苷酸探針為探針I ;用于靶多核苷酸擴增的引物3和引物4，寡核苷酸探針為探針2 ;反應液由如下組分組成:由PCR反應緩沖液、2’-脫氧核苷三磷酸、用于靶多核苷酸擴增的引物I和引物2，寡核苷酸探針為探針1 ;用于靶多核苷酸擴增的引物3和引物4，寡核苷酸 探針為探針2 ； EZ Taq混合液:主要成份為熱啟動Taq酶； 標準液1:純合型HLA-B*27基因組DNA ； 標準液2:雜合型HLA-B*27基因組DNA ； 各引物和探針具體組成如下:引物 1:5’ -GCTGTTCGTGAGGTTCGACA-3’，引物 2:5’ -TCCGCAGGTCCTCTCGGTCA-3’，引物 3:5’ -GGTGAAGGTCGGAGTCAACG-3’，引物 4:5’ -ACCATGTAGTTGAGGTCAATGAAGG-3’，探針 1:5’ -GCGGGGAGCCCCGCTTCATCACCGT-3’，探針2:5’ -CGCCTGGTCACCAGGGCTGC-3’。
【文檔編號】C12Q1/68GK103923981SQ201410105779
【公開日】2014年7月16日 申請日期:2014年3月20日 優先權日:2014年3月20日
【發明者】闕秋華, 肖偉明, 劉志文, 孫祖勇 申請人:上海吉盈醫療器械有限公司