一種用于檢測與食管癌相關miRNA基因的FISH探針組合物、試劑盒及其使用方法
【專利摘要】本發明公開了一種用于檢測與食管癌相關miRNA基因的FISH探針組合物，該探針組合物中包含有用于檢測與食管癌相關miRNA基因的FISH探針。本發明還提供了一種用于檢測與食管癌相關miRNA基因的FISH試劑盒，所述FISH試劑盒中包含如權利要求1-5中所述的FISH探針組合物。另外，本發明還公開了用于檢測與食管癌相關miRNA基因的FISH試劑盒的使用方法。本發明的技術方案，直接采用熒光原位雜交技術對唾液中多種與食管癌相關miRNA基因進行檢測，既可直接對樣品進行原位定量，又可實現無創早期食管癌的診斷與篩查。
【專利說明】—種用于檢測與食管癌相關m i RNA基因的FISH探針組合物、試劑盒及其使用方法
【技術領域】
[0001]本發明涉及分子生物學領域，具體涉及一種用于檢測與食管癌相關miRNA基因的FISH探針組合物、試劑盒及其使用方法。
【背景技術】
[0002]MicroRNAs (miRNAs)是近些年來發現的一類內源性的具有調控功能的非編碼小分子RNA，其大小長約20~25個核苷酸。miRNA基因在細胞核內由RNA聚合酶II轉錄后形成初級轉錄產物(pr1-RNAs)。Pr1-RNA經過一系列加工處理后成為19_25bp左右的成熟miRNA。成熟的miRNA在細胞中可以與蛋白質結合形成RNA誘導沉默復合物(RNA inducedsilencing complex, RISC)。RISC與祀mRNA基因不完全配對時,可以阻斷miRNA的翻譯過程，降低表達；RISC與靶mRNA完全配對時，則可以導致mRNA的降解。miRNA通過阻斷或者降解的mRNA表達來控制靶基因的表達，從而達到調控基因的分化、凋亡等一系列的過程【Hobert 0.Gene regulation by transcription factors and microRNAs[J].Science, 2008，319(5871): 1785-1786】。
[0003]腫瘤的發生發展與基因密不可分，環境因素以及遺傳等的因素都可以導致或者引起DNA的變化，從而激活原癌基因或引起腫瘤抑制基因的滅活，引起基因表達水平的異常，使靶細胞發生轉化。研究發現，超過50%的miRNA基因位于原癌基因或抑癌基因的染色體脆性位點(fragile sites)或相關遺傳區域【Calin等，Human microRNA genes arefrequently located at fragile sites and genomic regions involved in cancers[J].Proc Natl Acad Sci U S A, 2004, 101(9):2999-3004.】。miRNA 基因往往在腫瘤中發生異常表達，其在腫瘤的發生發展過程中能夠作為致癌因子或抑癌因子參與腫瘤的各個過程，對比腫瘤細胞與正常組織細胞間來源的miRNA發現，其表達譜具有明顯差異【Castilla等，Micro-RNA signature of the epithelial-mesenchymal transition in endometrialcarcinosarcoma [J].J Pathol, 20`11, 223(1):72-80.】。研究表明 miRNA 在細胞凋亡、增殖、分化、血管生成及腫瘤形成等方面均具有重要的調節作用，參與人體大約30%的基因調節，與心血管疾病、腫瘤、免疫紊亂及代謝紊亂等多種發病有關。已有研究發現若干miRNA的負調控作用與白血病、乳腺癌、肺癌、肝癌和結腸癌等高度相關。因此，miRNA在腫瘤診斷以及判斷預后等方面具有重要的參考價值。
[0004]食管癌是最常見的消化系統惡性腫瘤之一，是世界上發病率第八死亡率第六的癌癥，我國是食管癌的高發地區，每年因食管癌死亡人數約為15萬人，其死亡率占我國惡性腫瘤死亡率的第四位，近年來發病及死亡雖有下降趨勢，但目前仍然處于較高水平。如今新輔助化療的運用，抗腫瘤生物靶向藥物的出現，基因制劑的研制，食管內鏡等微創外科的開展都為食道癌患者帶來了福音。但是食道癌的發病率和死亡率仍較高。目前食道癌的存活率仍較低，僅有3%~5%的患者能夠存活5年。由于早期癥狀不明顯，大部分臨床食管癌患者已到中晚期，且半數以已上發生腫瘤遷移。因此，提高食道癌的早期診斷水平和治療是至關重要的。
[0005]miRNA與食管癌的發生發展關系非常密切，通過檢測食管癌組織miRNA的表達譜，發現其在正常組織與腫瘤組織中的表達水平具有明顯的差異【Hanahan等，Thehallmarks of cancer[J].cell, 2000，100(I):57-70.】。Guo 等【Guo 等，DistinctivemicroRNA profiles relating to patient survival in esophageal squamous cellcarcinoma [J].Cancer research, 2008, 68 (I): 26-33.】最早米用基因芯片的方法檢測了食管癌組織中的miRNA表達，發現在食管癌組織中有46種miRNA的表達明顯區別于癌旁正常組織，并找到了 7種miRNA可以區分惡性病變和正常食管癌組織。Ye等【Ye等，Genetic variations in microRNA-related genes are novel susceptibility loci foresophageal cancer risk [J].Cancer Prevention Research, 2008，I (6): 460-469.】通過對346例食管癌進行研究發現，7個miRNA相關基因的單核苷酸多態性和食管癌的發病風險有關，其中位于pre-miR423區的單核苷酸多態性rs6505162位點可能與降低食管癌的風險有關，表明miRNA基因組水平的改變和食管癌的發生有關，這些miRNA可作為食管癌診斷的分子標志物。Kan 等【Kan 等,The miR-106b-25Polycistron, Activated by GenomicAmplification, Functions as an Oncogene by Suppressing p21and Bim[J].Gastroenterology, 2009, 136(5): 1689-1700.】用微陣列芯片法研究發現，食管癌組織mir-106b_25有異常表達，并用實時熒光定量聚合酶鏈反應(RT-PCR)證實其存在。Komatsu等【Komatsu等，Circulating microRNAs in plasma of patients with oesophageal squamous cellcarcinoma [J].British journal of cancer, 2011，105 (I): 104-111.】對食管鱗狀細胞癌患者血漿中循miRNAs進行了相關研究，發現血漿中miRNA-21表達水平明顯高于正常人，提出高水平表達的RNA-21容易侵襲血管，產生血行轉移，并與腫瘤的發有著密切的關系，從而發現miRNAs可能成為檢測和診斷食道癌新的腫瘤基因標志物。通過研究這些不正常的miRNA，將有助于進一步闡明食管癌的發病機制，并將有助于食管癌癌變組織的檢測、診斷、治療以及預后的判斷。
[0006]多種miRNAs已被發現在食管癌患者的組織和血漿內表達失調，并對食管癌具有檢測診斷作用【Komatsu 等，Circulating microRNAs in plasma ofpatients with oesophageal squamous cell carcinoma[J].British journal ofcancer, 2011, 105 (I): 104-111.】。由于唾液腺血運豐富，被認為是血循環的末端產物，幾乎所有的在血液中存在的分子物質也見于唾液中，如蛋白、RNA、DNA、病毒顆粒等【Lee等，Saliva:an emerging biofluid for early detection of diseases[J].American journalof dentistry, 2009, 22(4):241.】。近年來也有研究報道組織、血漿和唾液三者具有相似的miRNA表達譜，即若干個同種miRNA在患者的癌組織、血液和唾液中的表達同時發生了顯著的變化[Wiklund等，MicroRNA alterations and associated aberrant DNA methylationpatterns across multiple sample types in oral squamous cell carcinoma[J].PLoSOne，2011，6 (I I): e27840.】。我們的前期研究【吳偉東等，唾液中miRNA-144可作為早期診斷食道癌的基因標志物[J].南方醫科大學學報，2013(12).】表明食道癌患者唾液中miRNA-144存在高表達，可作為早期診斷食道癌的基因標志物，因此開展唾液中miRNA_144基因及其他在食道癌中表達差異顯 著的miRNA的FISH (熒光原位雜交技術，fluorescentin situ hybridization)檢測將有助于食道癌的早期篩查與診斷。[0007]國內外對食管癌組織miRNA分析的方法很多，如基因芯片篩選食管癌miRNA，RT-PCR定量分析等。基因芯片可以直接測定一份標本的多種miRNA，但是此方法背景和雜信號干擾大，重復性差，不能區分差異小的miRNA，因此被用于食管癌miRNA的篩選。RT-PCR技術通過實時監測目標miRNA轉錄基因的擴增產物來推算目標基因的量，靈敏度高，精確度高，但是多了轉錄步驟，程序略復雜。此外，由于實驗條件的差異，會影響實驗效果，例如:
(I)標本離體時間、保存條件不同，影響組織樣本中可能的RNA的降解；(2)總RNA提取方法不同、試劑不同，影響核酸回收率，并最終影響定量；(3)因儀器、試劑不同，cDNA合成效率不同。由于以上實驗條件沒有統一的標準，會使結果的重復性較差，有的甚至出現截然相反的結論，嚴重阻礙著食管癌組織miRNA檢測的發展和應用。再者，食管癌組織miRNA檢測需要采集較多的新鮮組織(20~80mg)，不宜作為術前篩查，也阻礙著食管癌組織miRNA檢測。
[0008]綜上所述，本領域中尚無采用FISH技術檢測唾液中食道癌的基因標志物miRNA基因，因此可開發該技術應用于食道癌早期篩查工作中。

【發明內容】

[0009]為了克服現有技術的缺陷，一方面，本發明所解決的技術問題在于提供一種用于檢測與食管癌相關miRNA基因的FISH探針組合物。
[0010]本發明的用于檢測與食管癌相關miRNA基因的FISH探針組合物，其特征在于，該探針組合物中包含有用于檢測與食管癌相關miRNA基因的FISH探針。
[0011]優選地，所述與食管癌相關miRNA基因至少包含以下基因中的一種:
[0012]hsa-miR-144 基因、hsa-miR-1180 基因、hsa_miR-196b 基因、hsa-miR-149 基因、hsa-miR-1825 基因、hsa-miR-760 基因、hsa_miR-135b 基因、hsa-miR-139 基因、hsa-miR-1539 基因、hsa-miR-1281 基因、hsa-miR-129 基因、hsa-miR-1267 基因、hsa-miR-362 基因、hsa-miR-766 基因、hsa-miR-933 基因。
[0013]其中，所述hsa-miR-144 基因、hsa-miR-1180 基因、hsa_miR-196b 基因、hsa-miR-149 基因、hsa-miR-1825 基因、hsa-miR-760 基因、hsa_miR-135b 基因、hsa-miR-139 基因、hsa-miR-1539 基因為上調基因，所述 hsa-miR-1281 基因、hsa-miR-129基因、hsa-miR-1267 基因、hsa-miR-362 基因、hsa-miR-766 基因、hsa-miR-933 基因為下調基因。
[0014]優選地，所述FISH探針為以下核酸探針中的至少一種:
[0015](I)針對hsa-miR-144基因的核苷酸序列如SEQ ID N0.1所示的核酸探針:5’ -CTTACAGTATATGATGATATCC-3’ ；
[0016](2)針對hsa-miR-1180基因的核苷酸序列如SEQ ID N0.2所示的核酸探針:5’ -TATTCCCGGCCGGGTGGGTCC-3’ ；
[0017](3)針對hsa-miR_196b基因的核苷酸序列如SEQ ID N0.3所示的核酸探針:5’ -CCCAACAACAGGAAACTACCTA-3’ ；
[0018](4)針對hsa-miR-149基因的核苷酸序列如SEQ ID N0.4所示的核酸探針:5， -GGGAGTGAAGACACGGAGCCAGA-3，；
[0019](5)針對hsa-miR-1825基因的核苷酸序列如SEQ ID N0.5所示的核酸探針:5， -GGAGAGGAGGGCACTGGA-3，；
[0020](6 )針對hsa-miR-760基因的核苷酸序列如SEQ ID N0.6所示的核酸探針:5， -TCCCCACAGACCCAGAGCCG-3，；
[0021](7)針對hsa-miR_135b基因的核苷酸序列如SEQ ID N0.7所示的核酸探針:5， -TCACATAGGAATGAAAAGCCATA-3，；
[0022](8)針對hsa-miR-139基因的核苷酸序列如SEQ ID N0.8所示的核酸探針:5’ -ACTCCAACAGGGCCGCGTCTCCA-3’ ；
[0023](9)針對hsa-miR-1539基因的核苷酸序列如SEQ ID N0.9所示的核酸探針:5’ -GGCATCTGGGACGCGCAGGA-3’ ；[0024](10)針對hsa-miR-1281基因的核苷酸序列如SEQ ID N0.10所示的核酸探針:5， -GGGAGAGGAGGAGGCGA-3，；
[0025](11)針對hsa-miR-129基因的核苷酸序列如SEQ ID N0.11所示的核酸探針:5， -GCAAGCCCAGACCGCAAAAAG-3，；
[0026](12)針對hsa-miR-1267基因的核苷酸序列如SEQ ID N0.12所示的核酸探針:5， -TGGGGATTACACTTCAACAGG-3，；
[0027](13)針對hsa-miR-362基因的核苷酸序列如SEQ ID N0.13所示的核酸探針:5’ -TGAATCCTTGAATAGGTGTGTT-3’ ；
[0028](14)針對hsa-miR-766基因的核苷酸序列如SEQ ID N0.14所示的核酸探針:5， -AAGACCAGCACCAATTCCTCCT-3，；
[0029](15)針對hsa-miR-933基因的核苷酸序列如SEQ ID N0.15所示的核酸探針:5’ -GGGAGAGGTCTCCCTGCGCACA-3’。
[0030]作為本發明的優選方案，在本發明的優選實施例中，所述FISH探針為核苷酸序列如SEQ ID N0.1~SEQ ID N0.1所示的核酸探針的組合。
[0031]另一方面，本發明所解決的技術問題還在于提供一種用于檢測與食管癌相關miRNA基因的FISH試劑盒，所述FISH試劑盒中包含上述方案中所公開的FISH探針組合物。
[0032]優選地，本發明的FISH試劑盒中所用的FISH探針組合物制成溶液，該溶液是通過將FISH探針溶解在2x SSC緩沖液中得到，探針濃度為5ng/μ 1，所述2 X SSC緩沖液是以氯化鈉8.8g，檸檬酸鈉4.4g，去離子水400ml配制而成。
[0033]優選地，本發明的FISH試劑盒中還包括4’，6_ 二脒基_2_苯基吲哚復染液。
[0034]再則，本發明所解決的技術問題還在于提供了一種用于檢測與食管癌相關miRNA基因的FISH試劑盒的使用方法，其特征在于，包括如下步驟:
[0035](I)將待檢測唾液樣品固定在防脫落載玻片上，對玻片上的唾液樣品進行預處理；
[0036](2)分別將FISH探針滴加于載玻片圓孔中的樣品處，每個探針加2個復孔，使探針待測樣品進行變性雜交；
[0037](3)雜交后，對玻片進行洗滌；
[0038](4)使用復染液對玻片上的雜交區域進行復染；
[0039](5)使用熒光顯微鏡觀察玻片的雜交區域。
[0040]優選地，該FISH試劑盒的使用方法的相應步驟中包含如下(I) - (4)項中的任意一項或者多項的具體操作方式:
[0041](I)步驟(1)中將待檢測唾液樣品固定和預處理具體為:
[0042]①將新鮮收集到的唾液1500rpm離心8min ；
[0043]②去上清，加入5ml0.075M kcl低滲液，混勻，后放入37°C水浴30min ；
[0044]③加入2ml固定液預固定,混合均勻后1500rpm離心8min ;該固定液甲醇:冰乙酸=3:1混合溶液
[0045]④去上清,加入5ml固定液固定,混合均勻后1500rpm離心8min,去上清,加入5ml固定液，混勻后于_20°C保存備用；
[0046]⑤取出預固定好的唾液標本，1500rpm離心8min,去上清,加適量固定液；
[0047]⑥吹打混勻后吸取少量細胞固定液滴片于防脫落載玻片上，自然晾干，56°C烤片30min,防止掉片，滴片前一定要將細胞吹打散開，滴片時保證細胞均勻散開，防止細胞太密集，也要保證有足夠計數的細胞；
[0048]⑦將上步所得玻片置于37°C預熱的2XSSC溶液中浸泡lOmin，洗滌玻片，增加細胞核的通透性；
[0049]⑧蛋白酶K于55°C消化5-10min ;
[0050]⑨玻片于2 X SSC溶液中漂洗2次，每次5min ；
[0051]⑩將玻片一次置于70%、95%乙醇溶液中各2min，進行梯度脫水，自然晾干玻片；
[0052](2)步驟(2)將待探針與玻片上的待測樣品進行變性雜交具體為:①分別取15種探針試劑I μ 1，2 X SSC緩沖液9 μ 1，混合得到15種不同的探針混合液將上述15種探針混合液分別滴加于樣品處，每個探針加樣2個復孔，蓋上蓋玻片，于雜交儀上73°C變性5min，37°C雜交過夜；
[0053](3)步驟(3)玻片洗滌具體為:①去掉封片膠和蓋玻片，于46-48°C水浴2X SSC溶液中2次，每次5min;②將玻片置于46°C 0.1%ΝΡ_40/2XSSC中，晃動l_3S，5min后取出；
③70%、95%乙醇中脫水各2min，甩干，自然干燥；
[0054](4)步驟(3)復染具體為:向雜交區加入15 μ 1DAPI，蓋上大蓋玻片，蓋上蓋玻片，暗處放置10-20min。
[0055]相比于現有檢測方法，本發明的技術方案至少具有以下優勢:
[0056]現有技術中，常采用PCR或Q-PCR對血液樣品中mir_144等基因進行檢測，在該過程中涉及到核酸抽提、逆轉錄及PCR等繁瑣步驟，且采集血液會對病患造成創傷性；本試劑盒直接采用熒光原位雜交技術對唾液中多種與食管癌相關miRNA基因進行檢測，既可直接對樣品進行原位定量，又可達到無創早期食管癌的診斷與篩查。由于食道癌患者唾液中多種miRNA存在高表達，可作為早期診斷食道癌的基因標志物，因此采用本發明的技術方案通過唾液對與食管癌相關miRNA基因表達的檢測可達到易采集、無創傷性、快速檢測等優點。另外，采用本發明的方案能夠同時對多種(最多15種)與食管癌相關miRNA基因的表達情況進行檢測，技術實踐中，如何使多種探針的組合物在熒光原位雜交反應中表現出良好的有效性和特異性是一項好大的選擇過程，而本發明的探針組合物中包含的多種探針能夠高效、特異性明顯地與各自針對的目的基因進行特異性雜交，并高效、快捷地通過顯示出正確的檢測結果，大大提高檢測效率，為相應的與食管癌相關miRNA基因的表達情況的檢測以及食管癌的檢測提供了一種有效途徑。【專利附圖】

【附圖說明】
[0057]圖1是本發明實施例3中FISH檢測食道癌患者唾液樣品中與食管癌相關miRNA基因表達陽性的實驗結果圖。其中，A為hsa-miR-144基因表達陽性、B為hsa-miR-1180基因表達陽性、C為hsa-miR-196b基因表達陽性、D為hsa-miR-149基因表達陽性、E為hsa-miR-1825基因表達陽性、F為hsa-miR-760基因表達陽性、G為hsa_miR-135b基因表達陽性、H為hsa-miR-139基因表達陽性、I為hsa-miR-1539基因表達陽性、J為hsa-miR-1281基因表達陽性、K為hsa-miR-129基因表達陽性、L為hsa-miR-1267基因表達陽性、M為hsa-miR-362基因表達陽性、N為hsa-miR-766基因表達陽性、O為hsa-miR-933基因表達陽性。其中 hsa-miR-144 基因、hsa-miR-1180 基因、hsa_miR-196b 基因、hsa-miR-149基因、hsa-miR-1825 基因、hsa-miR-760 基因、hsa_miR-135b 基因、hsa-miR-139 基因、hsa-miR-1539 基因為上調基因。hsa-miR-1281 基因、hsa-miR-129 基因、hsa-miR-1267 基因、hsa-miR-362 基因、hsa-miR-766 基因、hsa-miR-933 基因為下調基因。
[0058]圖2是本發明實施例3中FISH檢測正常組唾液樣品中與食管癌相關miRNA基因表達陽性的實驗結果圖。
[0059]圖3是本發明實施例3中陰性樣品中與食管癌相關miRNA基因表達陽性的實驗結果圖。
【具體實施方式】
[0060]為使本發明更加容易理解，下面結合具體實施例，進一步闡述本發明。應理解，這些實施例僅用于說明本發明而不用于限制本發明的范圍。
[0061]實施例1:探針 的設計與合成。
[0062]通過在線數據庫miRBase (http://www.mirbase.0rg/)對15種與食管癌相關miRNA基因進行分析，設計18-25bp的熒光素標記探針待檢測基因及其探針序列如下所示:
[0063](I)針對 hsa-miR-144 基因的探針:5’ -CTTACAGTATATGATGATATCC-3 (SEQ IDN0.1)；
[0064](2)針對 hsa-miR-1180 基因的探針:5’ -TATTCCCGGCCGGGTGGGTCC-3 (SEQ IDN0.2)；
[0065](3)針對 hsa-miR-196b 基因的探針:5’ -CCCAACAACAGGAAACTACCTA-3’ (SEQ IDN0.3)；
[0066](4)針對 hsa-miR-149 基因的探針:5’ -GGAGTGAAGACACGGAGCCAGA-3’ (SEQ IDN0.4)；
[0067](5)針對 hsa-miR-1825 基因的探針:5’-GGAGAGGAGGGCACTGGA-3’ (SEQ ID N0.5)；
[0068](6)針對hsa-miR-760基因的探針:5’-TCCCCACAGACCCAGAGCCG-3’(SEQ ID N0.6)；
[0069](7)針對 hsa-miR-135b 基因的探針:5’-TCACATAGGAATGAAAAGCCATA-3’ (SEQ IDN0.7)；
[0070](8)針對 hsa-miR-139 基因的探針:5’ -ACTCCAACAGGGCCGCGTCTCCA-3’ (SEQ IDN0.8)；
[0071](9)針對 hsa-miR-1539 基因的探針:5’ -GGCATCTGGGACGCGCAGGA-3’ (SEQ IDN0.9)；
[0072](10)針對hsa-miR-1281 基因的探針:5’-GGGAGAGGAGGAGGCGA-3’(SEQ ID N0.10)；
[0073](11)針對 hsa-miR-129 基因的探針:5 ’ -GCAAGCCCAGACCGCAAAAAG-3 ’ (SEQ IDN0.11)；
[0074](12)針對 hsa-miR-1267 基因的探針:5’ -TGGGGATTACACTTCAACAGG-3’ ；(SEQ IDN0.12)；
[0075](13)針對 hsa-miR-362 基因的探針:5’ -TGAATCCTTGAATAGGTGTGTT-3’ (SEQ IDN0.13)；
[0076](14)針對 hsa-miR-766 基因的探針:5’ -AAGACCAGCACCAATTCCTCCT-3’ (SEQ IDN0.14)；
[0077](15)針對 hsa-miR-933 基因的探針:5’ -GGGAGAGGTCTCCCTGCGCACA-3’ (SEQ IDN0.15)。
[0078]需要說明的是hsa-miR-144 基因、hsa-miR-1180 基因、hsa_miR-196b 基因、hsa-miR-149 基因、hsa-miR-1825 基因、hsa-miR-760 基因、hsa_miR-135b 基因、hsa-miR-139 基因、hsa-miR-1539 基因為上調基因，所述 hsa-miR-1281 基因、hsa-miR-129基因、hsa-miR-1267 基因、hsa-miR-362 基因、hsa-miR-766 基因、hsa-miR-933 基因為下調基因。
[0079]用上述設計好的探針序列合成熒光素標記探針，本實施中通過 申請人:自行合成而得到該批熒光探針(生產批次`為B10SEEN20131217PR0BE)，當然熒光探針也可以在設計好相應序列后委托其他商業生物公司合成。
[0080]實施例2:反應試劑的制備。
[0081]FISH試劑盒中所用的FISH探針組合物制成溶液，該溶液是通過將FISH探針溶解在2x SSC緩沖液中得到，探針濃度為5ng/ μ 1，所述2 X SSC緩沖液是以氯化鈉8.8g，檸檬酸鈉4.4g，去離子水400ml配制而成。
[0082]另外，FISH試劑盒中還包括5mg/ml的4’，6_ 二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)復染液300 μ I。
[0083]實施例3 =FISH檢測食道癌患者唾液樣品中與食管癌相關miRNA基因表達陽性的實驗。
[0084]按照如下步驟進行試驗:
[0085]包括如下步驟:
[0086]1、將待檢測唾液樣品固定在防脫落載玻片上，對玻片上的唾液樣品進行預處理。具體操作如下:
[0087]1.1、將新鮮收集到的唾液1500rpm離心8min。
[0088]1.2、去上清，加入5ml0.075M kcl低滲液。混勻，后放入37°C水浴30min。(作用:利用滲透壓差使細胞膜破裂，細胞核吸水膨脹。利于探針的雜交。)
[0089]1.3、加入2ml固定液預固定，(甲醇:冰乙酸=3:1)，混合均勻后1500rpm離心Smin0 (固定液中主要利用冰乙酸和甲醇的小分子性，有極強的細胞穿透能力，在瞬間殺死細胞，使細胞固定在低滲后的膨脹狀態，保證細胞中需要檢測的物質不被破壞。)
[0090]1.4、去上清,加入5ml固定液固定,混合均勻后1500rpm離心8min。去上清,加入5ml固定液，混勻后于_20°C保存備用。
[0091]1.5、取出預固定好的唾液標本，1500rpm離心8min。去上清,加適量固定液(IOml的唾液樣本，根據細胞的多少，一般留IML左右的固定液)。
[0092]1.6、吹打混勻后吸取少量細胞固定液滴片(滴片前一定要將細胞吹打散開，滴片時保證細胞均勻散開，不要太密集，也要保證有足夠計數的細胞)于3張12圓孔防脫落載玻片上。自然晾干，56°C烤片30min。(防止掉片)
[0093]1.7、將上步所得玻片置于37°〇預熱的2\55(:溶液中浸泡101^11。(洗滌玻片，增加細胞核的通透性。
[0094]1.8、蛋白酶1(于551:消化5-101^11。(每片組織是10 μ I左右)
[0095]1.9、玻片于2 X SSC溶液中漂洗2次，每次5min ；
[0096]1.10、將玻片一次置于70%、95%乙醇溶液中各2min，進行梯度脫水，自然晾干玻片。
[0097]2、分別將FISH探針滴加于載玻片圓孔中的樣品處，每個探針加2個復孔，使探針待測樣品進行變性雜交。具體操作如下:
[0098]2.1、2X SSC溶液中漂洗2次，每次5min ；
[0099]2.2、梯度脫水:將玻片一次置于70%、95%乙醇中各2min，自然晾干玻片。
[0100]2.3、分別將15種探針滴加于載玻片圓孔中的樣品處，每個樣品孔加10 μ I探針，每個探針加2個復孔，使探針待測樣品進行變性雜交，加蓋蓋玻片，封片。
[0101]2.4、雜交儀上73°C變性5min，37°C雜交過夜。
`[0102]3、雜交后，對玻片進行洗滌。具體操作如下:
[0103]3.1、去掉封片膠和蓋玻片，于46°C(46-48°C)水浴2XSSC溶液中2次，每次5min;
[0104]3.2、將玻片置于 46°C 0.1%ΝΡ_40/2X SSC 中，晃動 l_3S，5min 后取出;
[0105]3.3、70%、95%乙醇中脫水各2min，甩干，自然干燥。
[0106]4、使用復染液對玻片上的雜交區域進行復染。向雜交區加入151110么?1，蓋上大蓋玻片，蓋上蓋玻片，暗處放置10-20min。
[0107]5、使用熒光顯微鏡觀察玻片的雜交區域，試驗結果如圖1-3所示。
[0108]結果分析:結果分析:從圖1和圖2可見，在圖1A-圖10的實驗結果顯示，與食管癌相關miRNA基因主要表達于細胞質。相對于正常組別而言，與食管癌相關miRNA基因在食道癌患者唾液樣品中高表達，而陰性對照實驗中，未檢測出綠色熒光。說明本發明的上調基因探針可用于檢測唾液樣品中與食管癌相關miRNA基因的表達情況。同時用經生物信息學分析獲得的在食管癌中下調的microRNA基因探針對樣品進行熒光原位雜交分析，結果與預測的相符合，這些基因在食管癌樣品中表達量低。因此采用上調基因探針與下調基因探針相結合對樣品進行原位雜交分析更為準確、可靠；同時使用與食管癌相關miRNA基因熒光探針進行唾液樣品的FISH實驗可達到食道癌的篩查與初診效果。另外，通過測序和業界其他常用于檢測與食管癌相關miRNA基因表達情況的方法驗證發現，上述實驗結果均為準確，足見本發明試劑盒在檢測與食管癌相關miRNA基因以及食道癌的篩查中的準確性。
[0109]最后所應當說明的是，以上實施例僅用以說明本發明的技術方案而非對本發明保護范圍的限制，盡管參照較佳實施例對本發明作了詳細說明，本領域的普通技術人員應當理解，可以對本發明的技術方案進行修改或者等同替換，而不脫離本發明技術方案的實質和范圍。
【權利要求】
1.一種用于檢測與食管癌相關miRNA基因的FISH探針組合物，其特征在于，該探針組合物中包含有用于檢測與食管癌相關miRNA基因的FISH探針。
2.根據權利要求1所述的FISH探針組合物，其特征在于，所述與食管癌相關miRNA基因至少包含以下基因中的一種: hsa-miR-144 基因、hsa-miR-1180 基因、hsa_miR-196b 基因、hsa-miR-149 基因、hsa-miR-1825 基因、hsa-miR-760 基因、hsa_miR-135b 基因、hsa-miR-139 基因、hsa-miR-1539 基因、hsa-miR-1281 基因、hsa-miR-129 基因、hsa-miR-1267 基因、hsa-miR-362 基因、hsa-miR-766 基因、hsa-miR-933 基因。
3.根據權利要求2所述的FISH探針組合物，其特征在于，所述hsa-miR-144基因、hsa-miR-1180 基因、hsa_miR-196b 基因、hsa-miR-149 基因、hsa-miR-1825 基因、hsa-miR-760 基因、hsa_miR-135b 基因、hsa-miR-139 基因、hsa-miR-1539 基因為上調基因，所述 hsa-miR-1281 基因、hsa-miR-129 基因、hsa-miR-1267 基因、hsa-miR-362 基因、hsa-miR-766基因、hsa-miR-933基因為下調基因。
4.根據權利要求2所述的FISH探針組合物，其特征在于，所述FISH探針為以下核酸探針中的至少一種: (1)針對hsa-miR-144基因的核苷酸序列如SEQID N0.1所示的核酸探針:，5’ -CTTACAGTATATGATGATATCC-3’ ； (2)針對hsa-miR-1180基因的核苷酸序列如SEQID N0.2所示的核酸探針:，5’ -TATTCCCGGCCGGGTGGGTCC-3’ ； (3)針對hsa-miR-196b基因的核苷酸序列如SEQID N0.3所示的核酸探針:，5’ -CCCAACAACAGGAAACTACCTA-3’ ； (4)針對hsa-miR-149基因的核苷酸序列如SEQID N0.4所示的核酸探針:，5， -GGGAGTGAAGACACGGAGCCAGA-3，； (5)針對hsa-miR-1825基因的核苷酸序列如SEQID N0.5所示的核酸探針:，5， -GGAGAGGAGGGCACTGGA-3，； (6)針對hsa-miR-760基因的核苷酸序列如SEQID N0.6所示的核酸探針:，5， -TCCCCACAGACCCAGAGCCG-3，； (7)針對hsa-miR-135b基因的核苷酸序列如SEQID N0.7所示的核酸探針:，5， -TCACATAGGAATGAAAAGCCATA-3，； (8)針對hsa-miR-139基因的核苷酸序列如SEQID N0.8所示的核酸探針:，5’ -ACTCCAACAGGGCCGCGTCTCCA-3’ ； (9)針對hsa-miR-1539基因的核苷酸序列如SEQID N0.9所示的核酸探針:，5’ -GGCATCTGGGACGCGCAGGA-3’ ； (10)針對hsa-miR-1281基因的核苷酸序列如SEQID N0.10所示的核酸探針:，5， -GGGAGAGGAGGAGGCGA-3，； (11)針對hsa-miR-129基因 的核苷酸序列如SEQID N0.11所示的核酸探針:，5， -GCAAGCCCAGACCGCAAAAAG-3，； (12)針對hsa-miR-1267基因的核苷酸序列如SEQID N0.12所示的核酸探針:，5， -TGGGGATTACACTTCAACAGG-3，；(13)針對hsa-miR-362基因的核苷酸序列如SEQID N0.13所示的核酸探針:5’ -TGAATCCTTGAATAGGTGTGTT-3’ ； (14)針對hsa-miR-766基因的核苷酸序列如SEQID N0.14所示的核酸探針:5， -AAGACCAGCACCAATTCCTCCT-3，； (15)針對hsa-miR-933基因的核苷酸序列如SEQID N0.15所示的核酸探針:5’ -GGGAGAGGTCTCCCTGCGCACA-3’。
5.根據權利要求4所述的FISH探針組合物，其特征在于，所述FISH探針為核苷酸序列如SEQ ID N0.1~SEQ ID N0.1所示的核酸探針的組合。
6.一種用于檢測與食管癌相關miRNA基因的FISH試劑盒，其特征在于，所述FISH試劑盒中包含如權利要求1-5中所述的FISH探針組合物。
7.根據權利要求6所述的FISH試劑盒，其特征在于，所述FISH探針組合物制成溶液，該溶液是通過將FISH探針溶解在2x SSC緩沖液中得到，探針濃度為5叩/^1，所述2父55〇緩沖液是以氯化鈉8.8g，檸檬酸鈉4.4g，去離子水400ml配制而成。
8.根據權利要求6所述的FISH試劑盒，其特征在于，還包括4’，6-二脒基-2-苯基吲哚復染液。
9.一種如權利要求6-8所述的用于檢測與食管癌相關miRNA基因的FISH試劑盒的使用方法，其特征在于，包括如下步驟: (1)將待檢測唾液樣品固定在防脫落載玻片上，對玻片上的唾液樣品進行預處理； (2)分別將FISH探針滴加于載玻片圓孔中的樣品處，每個探針加2個復孔，使探針待測樣品進行變性雜交； (3)雜交后，對玻片進行洗滌； (4)使用復染液對玻片上的雜交區域進行復染； (5)使用熒光顯微鏡觀察玻片的雜交區域。
10.根據根據權利要求9所述的FISH試劑盒的使用方法，其特征在于，該FISH試劑盒的使用方法的相應步驟中包含如下(I) - (4)項中的任意一項或者多項的具體操作方式: (I)步驟(1)中將待檢測唾液樣品固定和預處理具體為: ①將新鮮收集到的唾液1500rpm離心8min； ②去上清，加入5ml0.075M kcl低滲液，混勻，后放入37°C水浴30min ； ③加入2ml固定液預固定,混合均勻后1500rpm離心8min;該固定液甲醇:冰乙酸=3:1混合溶液 ④去上清，加入5ml固定液固定,混合均勻后1500rpm離心8min,去上清,加入5ml固定液，混勻后于_20°C保存備用； ⑤取出預固定好的唾液標本，1500rpm離心8min,去上清,加適量固定液； ⑥吹打混勻后吸取少量細胞固定液滴片于防脫落載玻片上，自然晾干，56°C烤片30min，防止掉片，滴片前一定要將細胞吹打散開，滴片時保證細胞均勻散開，防止細胞太密集，也要保證有足夠計數的細胞； ⑦將上步所得玻片置于37°C預熱的2XSSC溶液中浸泡lOmin，洗滌玻片，增加細胞核的通透性； ⑧蛋白酶K于55°C消化5-10min；⑨玻片于2X SSC溶液中漂洗2次，每次5min ； ⑩將玻片一次置于70%、95%乙醇溶液中各2min，進行梯度脫水，自然晾干玻片； (2)步驟(2)將待探針與玻片上的待測樣品進行變性雜交具體為:①分別取15種探針試劑Iy 1，2XSSC緩沖液9μ 1，混合得到15種不同的探針混合液將上述15種探針混合液分別滴加于樣品處，每個探針加樣2個復孔，蓋上蓋玻片，于雜交儀上73°C變性5min，`37 °C雜交過夜； (3)步驟(3)玻片洗滌具體為:①去掉封片膠和蓋玻片，于46-48°C水浴2X SSC溶液中2次，每次5min ;②將玻片置于46°C 0.1%ΝΡ_40/2 X SSC中，晃動1_3S，5min后取出；@70%、`95%乙醇中脫水各2min,甩干，自然干燥； (4)步驟(3)復染具體為:向雜交區加入15μ IDAPI，蓋上大蓋玻片，蓋上蓋玻片，暗處放置 10-20min。`
【文檔編號】C12N15/11GK103866040SQ201410136226
【公開日】2014年6月18日 申請日期:2014年4月4日 優先權日:2014年4月4日
【發明者】吳偉東, 王曉香, 周劍, 董先輝, 劉雪媚 申請人:廣州伯信生物科技有限公司