使用單核苷酸多型性預(yù)測(cè)漢人白血球抗原基因型的試劑盒的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開(kāi)了一種使用單核苷酸多型性預(yù)測(cè)漢人白血球抗原基因型的試劑盒及其應(yīng)用。針對(duì)亞洲人種的人類白血球抗原基因型(HLA-A、HLA-B、HLA-C、HLA-DPB1、HLA-DQB1、及HLA-DRB1)預(yù)測(cè)模型，且預(yù)測(cè)結(jié)果已達(dá)到模型的優(yōu)化。本發(fā)明由單核苷酸多型性基因定型預(yù)測(cè)亞洲人種典型人類白血球抗原對(duì)偶基因型，準(zhǔn)確率范圍為80.37%(HLA-B)至95.79%(HLA-DQB1)，可達(dá)到高準(zhǔn)確率，此外，使用基因型預(yù)測(cè)白血球抗原對(duì)偶基因型的試劑盒可節(jié)省可觀的時(shí)間及花費(fèi)。
【專利說(shuō)明】使用單核苷酸多型性預(yù)測(cè)漢人白血球抗原基因型的試劑盒

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明是關(guān)于具有族群專一性的單核苷酸多型性可預(yù)測(cè)人類白血球抗原對(duì)偶基 因的試劑盒，特別的是，本發(fā)明是關(guān)于使用漢人的單核苷酸多型性來(lái)預(yù)測(cè)人類白血球抗原 基因型的試劑盒。

【背景技術(shù)】
[0002] 人類白血球組織抗原基因群位于第6對(duì)染色體上，分為主要組織兼容性復(fù) 合體第I類（HLA-A、HLA-B、及HLA-C)與主要組織兼容性復(fù)合體第II類（HLA-DR、 HLA-DQ、及HLA-DP)的對(duì)偶基因（alleles)，而個(gè)體單一基因的多種對(duì)偶基因的多形性 (polymorphism)型態(tài)，造成組織或器官移植時(shí)的移植物排斥（graft rejection)及移植物 排斥宿主疾病（graft-versus-host diseases)。人類白血球抗原對(duì)偶基因亦在群體遺傳 學(xué)及免疫相關(guān)疾病狀態(tài)（immune-related disease status)中扮演重要的角色。再者，先 前的比較研究顯示免疫系統(tǒng)通常有強(qiáng)的選擇性壓力（selective pressure),其可能由病 毒-宿主交互作用所造成。因?yàn)檫@些選擇性壓力，族群間的比較揭示人類白血球抗原對(duì)偶 基因的對(duì)偶基因分布的連鎖不平衡（linkage disequilibrium)及高可變形態(tài)（variable patterns)〇
[0003] 人類白血球組織抗原（human leukocyte antigen, HLA)的遺傳變異與免疫功能、 自體免疫疾病和某些癌癥有關(guān)。至今，大規(guī)模的研究由實(shí)驗(yàn)（經(jīng)由血清學(xué)或PCR)取得 人類白血球抗原基因的配型依然耗時(shí)與昂貴。因此，只需要較低價(jià)格的單核苷酸多型性 (single-nucleotide polymorphisms, SNPs)被廣泛使用于預(yù)測(cè)白血球抗原的基因型以節(jié) 省經(jīng)費(fèi)與實(shí)驗(yàn)時(shí)間。然而，大部分的人類白血球抗原基因型預(yù)測(cè)模型只有高加索人樣本，少 有研究報(bào)導(dǎo)包含非高加索人的樣本，而在不同的種族間其人類白血球組織抗原基因類別分 布相異。
[0004] Zheng等人于2011年BMC genetics期刊中強(qiáng)調(diào)，在建構(gòu)完預(yù)測(cè)白血球組織抗原預(yù) 測(cè)模型后，此模型不能使用于不同種族的白血球抗原基因型。因此，Ayele等人于2011年 于PL0S ONE期刊中，已經(jīng)針對(duì)非洲人建構(gòu)出其特有白血球組織抗原預(yù)測(cè)模型；然而，目前尚 未有亞洲人的人類白血球組織抗原預(yù)測(cè)模型。因此，建構(gòu)出種族獨(dú)特的白血球組織抗原預(yù) 測(cè)模型有其必要性，尤其是漢人的的白血球組織抗原預(yù)測(cè)模型更有其需求。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 緣此，本發(fā)明提供一種單核苷酸多型性在制備預(yù)測(cè)人類白血球抗原對(duì)偶基因試劑 盒中的應(yīng)用，其步驟包含：(a)提供一人類核酸樣本；(b)判別該人類核酸樣本的一單核苷 酸多型性集合的基因型，該單核苷酸多型性集合集合包含位于人類白血球抗原基因上的各 個(gè)不同的單核苷酸多型性；（ c)使用一預(yù)測(cè)模型分析步驟（b)中各單核苷酸多型性的基因 型以獲得一計(jì)算值，其中該預(yù)測(cè)模型是使用單核苷酸多型性基因型來(lái)預(yù)測(cè)人類白血球抗原 對(duì)偶基因；以及（d)依據(jù)步驟（c)所獲得的計(jì)算值預(yù)測(cè)該人類樣本的人類白血球抗原對(duì)偶 基因型；且其中該樣本為亞洲人族群，較佳為漢人族群。
[0006] 本發(fā)明的應(yīng)用中，該單核苷酸多型性集合所包含的各單核苷酸多型性來(lái)自（1) HLA-A、（2)HLA-B、（3)HLA-C、（4)HLA-DPB1、（5)HLA-DQB1、以及 ^)HLA-DRB1 基因，其中該來(lái) 自（l)HLA-A基因的是選自于一第1單核苷酸多型性集合、一第2單核苷酸多型性集合、一 第3單核苷酸多型性集合、及一第4單核苷酸多型性集合；
[0007] (i)該第1單核苷酸多型性集合是由rsl633085、rs2254071、rs407238、 rs9258881、rs2975046、rs2735096、rs417162、rs9260954、rs6917477、rs6457144、 rs9261394、及 rs2523990 所組成；
[0008] (ii)該第 2 單核苷酸多型性集合是由 rs4122198、rsl6895757、rsl632973、 rs9357086、rsll759549、rs3115628、rs3094165、rs2734925、rs2517755、rs2256919、 rsll756025、rs7382061、rs6457144、rs2517646、及 rs7744914 所組成；
[0009] (iii)該第 3 單核苷酸多型性集合是由 rs3094165、rs9258883、rs3132714、 rsl611493、 rs2524005、 rs2860580、 rsl2665039、 rs6457109、 rs3869062、 rs3893464、 rs5009448、rs2571375、rs7758512、及 rs9261394 所組成；
[0010] (iv)該第 4 單核苷酸多型性集合是由 rs2523409、rsl611133、rs3115628、 rs2517859、 rsl611732、 rs2523998、 rs2860580、 rsl2202296、 rs2248153、 rs2975046、 rs6457109、rs5009448、rs9260932、及 rs6457144 所組成；
[0011] 該來(lái)自（2) HLA-B基因的單核苷酸多型性是選自于一第5單核苷酸多型性集合、一 第6單核苷酸多型性集合、一第7單核苷酸多型性集合、及一第8單核苷酸多型性集合，其 中
[0012] (i)該第 5 單核苷酸多型性集合是由 rs3130944、rs3130532、rs3130534、 rs3134762、 rsl6899207、 rs2524089、 rs9366778、 rs2524166、 rs9295984、 rs4394275、 rs9378249、rs2523534、rs9266406、rs2844558、rs5022119rs3099848、rs4081552、 rs2848716、rs2596454、及 rs2248462 所組成；
[0013] (ii)該第 6 單核苷酸多型性集合是由 rsll966319、rs2853948、rs6906846、 rs9378228、 rs2524051、 rs9366778、 rsl6867947、 rs4394274、 rs4394275、 rs2523591、 rs9501572、rs7761068、rs2523535、rs9266406、rs5006724、rsl3198903、rs9266669、 rs9266689、rs3099849、rs2442749、rsl051796、rs2596464、rs3099836、及 rs3131622 所組 成；
[0014] (iii)該第 7 單核苷酸多型性集合是由 rs9264868、rs9264942、rs3094691、 rs2156875、rs2523619、rs2442719、rs2596501、rs2523589、rs2523554、rs2844573、 rs9266395、rs9266440、rs9295986、rs2442749、rs2596560、rs3128982、rs2284178、及 rs7758090 所組成；
[0015] (iv)該第 8 單核苷酸多型性集合是由 rs3094691、rs7453967、rs4394274、 rs4394275、rs2596509、rs2596501、rsl058026、rs2523591、rs2523589、rs2523554、 rs2523545> rs9501572> rs2844575> rs9266395> rs9266406> rs5006725> rs9295986> rs6933050、 rs4959068、 rs5022119、 rsl3198903、 rs9266689、 rs2251396、 rsl051796、 rs3094584、rs9765960、及 rs3128982 所組成；
[0016] 該來(lái)自（3)HLA-C基因的單核苷酸多型性是選自于一第9單核苷酸多型性集合、一 第10單核苷酸多型性集合、一第11單核苷酸多型性集合、及一第12單核苷酸多型性集合， 其中
[0017] (i)該第 9 單核苷酸多型性集合是由 rs2073724、rs3130713、rs3130531、 rs3095250、 rs3130532、 rs3130534、 rs2844615、 rs6906846、 rs2524067、 rs7382297、 rs2394963、rs2524095、rsl6899203、rs9366778、rs9295970、及 rs2523534 所組成；
[0018] (ii)該第 10 單核苷酸多型性集合是由 rs3130712、rs28480108、rs3134762、 rsl9966319、 rs9264523、 rs3132488、 rs3134745、 rs3130693、 rs3132486、 rs2853948、 『86906846、^9378228、^6457372、^2394963、^2524057、^12191877、及^9366776 所組 成；
[0019] (iii)該第 11 單核苷酸多型性集合是由 rs2516049、rs2858870、rs660895、 rs532098、 rs3129763、 rsl063355、 rs9275141、 rs9275184、 rs7774434、 rs7775228、及 rs9275224 所組成；
[0020] (iv)該第 12 單核苷酸多型性集合是由 rs9263957、rs9263969、rs3134762、 rsll966319、rs2248880、rs9264532、rs2524099、rs2074488、rs2395471、rs5010528、 rsl3207315、rs3132488、rs3130693、rs9391714、rs4386816、rs2524057、rsl6899205、及 rs9295970 所組成；
[0021] 該來(lái)自（4)HLA-DPB1基因的單核苷酸多型性是選自于一第13單核苷酸多型性集 合、一第14單核苷酸多型性集合、一第15單核苷酸多型性集合、及一第16單核苷酸多型性 集合，其中
[0022] (i)該第 13 單核苷酸多型性集合是由 rs3128955、rs3130588、rs9277194、 rs9348904、 rs9296073、 rs2856816、 rs3135021、 rsl431403、 rs3128963、 rs3117229、 rs7763822、rs2295120、rs3117242、rs6937034、及 rsl003979 所組成；
[0023] (ii)該第 14 單核苷酸多型性集合是由 rs9296068、rs9277183、rs3135402、 rs9348904、 rs2856830、 rs9296073、 rs2071350、 rsl431402、 rsl431403、 rs9277550、 rs3128963、rs3117229、rs9277567、rs3128918、及 rs6937034 所組成；
[0024] (iii)該第 15 單核苷酸多型性集合是由 rs206769、rs6920606、rs375912、 rsl431399、rs987870、rs3135021、rs9277535、rs9277554、rsl0484569、rs2281390、 rs3128917、rs2281388、rs3130215、及 rs2269346 所組成；
[0025] (iv)該第 16 單核苷酸多型性集合是由 rs2216264、rs423639、rs3097669、 rs987870、rsl431402、rsl431403、rs9277378、rs9277535、rs9277550、rs9277554、 rs9277565、rs2281390、rs2281388、rs3130215、rs6937034、rs6937061、及 rs2395357 所組 成；
[0026] 該來(lái)自（5) HLA-DQB1基因的單核苷酸多型性是選自于一第17單核苷酸多型性集 合、一第18單核苷酸多型性集合、一第19單核苷酸多型性集合、及一第20單核苷酸多型性 集合，其中
[0027] (i)該第 17 單核苷酸多型性集合是由 rs9269186、rs9270986、rs615672、 rs3129768、rs9272219、rs9272346、rs6908943、rs9275134、rs9469220、rs6457617、 rs2647046、rs2858308、及 rs9275418 所組成；
[0028] (ii)該第 18 單核苷酸多型性集合是由 rs2647073、rs502055、rs3129768、 rs9272535、rs9272723、rs34485459、rs3129716、rs7775228、rs6469219、rs5000634、 rs6457617、及 rs9275418 所組成；
[0029] (iii)該第 19 單核苷酸多型性集合是由 rs2516049、rs2858870、rs660895、 rs532098、 rs3129763、 rsl063355、 rs9275141、 rs9275184、 rs7774434、 rs7775228、及 rs9275224 所組成；
[0030] (iv)該第 20 單核苷酸多型性集合是由 rsl7533090、rs9272219、rsl7211510、 rs41269947、rs34485459、rsl063355、rs9275141、rs3129716、rs7774434、rs9405119、 rs9469219、rs9469220、及 rs9275224 所組成
[0031] 該來(lái)自（6) HLA-DRB1基因的單核苷酸多型性是選自于一第21單核苷酸多型性集 合、一第22單核苷酸多型性集合、一第23單核苷酸多型性集合、及一第24單核苷酸多型性 集合，其中
[0032] (i)該第 21 單核苷酸多型性集合是由 rs9268831、rs9268861、rs7747521、 rs9268877、rs9269186、rs2027852、rs615672、rs3129768、rs9272219、rs9272346、 rs9275134、rs7775228、rs9469220、rs6457617、rs2647046、及 rs2858308 所組成；
[0033] (ii)該第 22 單核苷酸多型性集合是由 rs9268877、rs4410767、rs7749092、 rsl7210980、rs2647073、rs615672、rs674343、rs502771、rs3997872、rs9271367、 rs9271720、rs2187668、rs34485459、rs3129716、及 rs9405119 所組成；
[0034] (iii)該第 23 單核苷酸多型性集合是由 rs9405098、rs3129871、rsl3209234、 rs9268832、rs6903608、rs602875、rs660895、rs9271366、rs3129769、rsl7211510、 rs2187668、rs9275141、rs9275184、rs9275383、rs2856717、rs2858305、rsl3192471、及 rs3104405 所組成；
[0035] (iv)該第 24 單核苷酸多型性集合是由 rs2395175、rs9405035、rs9268831、 rs6903608、 rs9268877、 rs9269186、 rs7749092、 rs2027852、 rsl7210980、 rs2516049、 rs615672、rs660895、rs674313、rs502771、rs3997872、rs9271366、rs2187668、rs34485459、 rs9275141、rs7755224、rs3129716、及 rs3104404 所組成。
[0036] 本發(fā)明的又一目的，是提供一種試劑盒（kit)，在各容器中可能包括有一個(gè)或多個(gè) 單核苷酸多型性，包含判別HLA-A基因、HLA-B基因、HLA-C基因、HLA-DPB1基因、HLA-DQB1 基因、以及HLA-DRB1基因的本發(fā)明表5的單核苷酸多型性。
[0037] 本發(fā)明的另一目的是提供一種預(yù)測(cè)人類白血球抗原對(duì)偶基因的裝置，是包含不超 過(guò)200個(gè)核苷酸探針，其中該探針可檢測(cè)上述單核苷酸多型性；而其中該探針是固定于該 裝置上。
[0038] 本發(fā)明建構(gòu)對(duì)亞洲人種具有族群專一性的人類白血球抗原基因型預(yù)測(cè)模型，包含 437個(gè)具有Affymetrix5. 0及Illumina550K單核苷酸多型性的漢人血液樣本，其中214個(gè) 樣本亦有在Affymetrix6. 0單核苷酸多型性的數(shù)據(jù)。所有個(gè)體均在6個(gè)人類白血球抗原基 因座（loci)上分型至一 4位數(shù)分辨率并且用于人類白血球抗原基因型預(yù)測(cè)模型中作為驗(yàn) 證（training)及測(cè)試（testing)集。本發(fā)明的結(jié)果顯示較大的樣本數(shù)與較高的單核苷酸 多型性密度通常會(huì)導(dǎo)致較準(zhǔn)確的預(yù)測(cè)。此外，與本發(fā)明亞洲人種中人類白血球抗原對(duì)偶基 因有關(guān)的的優(yōu)化的flanking區(qū)域（flanking region)通常較高加索人的flanking區(qū)域?yàn)?短。在最準(zhǔn)確的模型中，flanking區(qū)域?yàn)闄M跨不同芯片數(shù)據(jù)集的人類白血球抗原對(duì)偶基因 的20-200kb (中位數(shù)為70kb)。當(dāng)該人類白血球抗原對(duì)偶基因較短時(shí)，該flanking區(qū)域增 力口，而該人類白血球抗原對(duì)偶基因密度上升。本發(fā)明的最佳模型在亞洲人種中提供準(zhǔn)確的 預(yù)測(cè)。此外，本發(fā)明亦提供針對(duì)亞洲族群人類白血球抗原基因型預(yù)測(cè)模型的實(shí)際的建議，其 是關(guān)于對(duì)偶基因區(qū)域、芯片、及填補(bǔ)（Imputation)。本發(fā)明大約只需要20個(gè)單核甘酸多型 性就可正確的預(yù)測(cè)一個(gè)白血球抗原基因型，因此只需要1/10的價(jià)格就可以得到白血球抗 原基因型的信息。
[0039] 以下將配合圖式進(jìn)一步說(shuō)明本發(fā)明的實(shí)施方式，以下所列舉的實(shí)施例是用以闡明 本發(fā)明，并非用以限定本發(fā)明的范圍，任何熟習(xí)此技藝者，在不脫離本發(fā)明的精神和范圍 內(nèi)，當(dāng)可做些許更動(dòng)與潤(rùn)飾，因此本發(fā)明的保護(hù)范圍當(dāng)視后附的權(quán)利要求書所界定的為準(zhǔn)。

【專利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0040] 圖1是與不同flanking區(qū)域大小相關(guān)的測(cè)試準(zhǔn)確率；就各6個(gè)人類白血球抗原對(duì) 偶基因而言，測(cè)試準(zhǔn)確率顯示隨著flanking區(qū)域大小增加而提升；圖中Affy6. 0芯片的數(shù) 據(jù)是以未填補(bǔ)單核苷酸多型性表示。
[0041] 圖2是由各基因定型芯片產(chǎn)生的優(yōu)化模型的測(cè)試準(zhǔn)確率；圖中顯示6個(gè)人類白血 球抗原對(duì)偶基因的測(cè)試準(zhǔn)確率與判讀率（可信度門坎為0);圖中顯示各3個(gè)基因定型芯片 及該三個(gè)基因定型芯片的合并芯片的填補(bǔ)（A)與未填補(bǔ)（B)單核苷酸多型性。

【具體實(shí)施方式】
[0042] 定義
[0043] 本說(shuō)明書中使用的用語(yǔ)是指在該領(lǐng)域中的一般涵義。下列在本說(shuō)明書中所討論到 的用語(yǔ)，為了方便起見(jiàn)，某些用語(yǔ)會(huì)以特別的字體格式標(biāo)示，例如使用斜體及/或括號(hào)。這 些字體格式的使用并不影響到其范圍及該用語(yǔ)本身的涵義。無(wú)論是否以特別的字體格式標(biāo) 示，其范圍及用語(yǔ)本身的涵義是相同的。因此，任何等效用語(yǔ)或同義詞的使用，并非用以改 變其本身的涵義。使用其中一或多種同義詞，并非排除其他同義詞的使用。在本發(fā)明實(shí)施 例中所使用的任何用語(yǔ)僅為說(shuō)明，并非用以限制其范圍及涵義。相同地，本發(fā)明的范圍亦不 僅受限于所出現(xiàn)的實(shí)施例。
[0044] 除非有特別予以定義，所有在此出現(xiàn)的技術(shù)及科學(xué)用語(yǔ)，具有在本領(lǐng)域具有通常 知識(shí)者所認(rèn)知的通常涵義。
[0045] 本發(fā)明中所使用的「大約」、「約」等用語(yǔ)，是指在20%的范圍內(nèi)，較佳地是指在10% 的范圍內(nèi)，更佳地是指在5%的范圍內(nèi)。在此提供的數(shù)字是為近似值，若未明確表達(dá)時(shí)，即是 暗示具有大約或大致的意思。
[0046] 實(shí)施例
[0047] 本發(fā)明所提供的所有單核苷酸多型性（SNPs)的rsID，其序列及所含單核苷 酸變異的位置及其變異的堿基是于本發(fā)明申請(qǐng)前已公開(kāi)于美國(guó)國(guó)家生物技術(shù)信息中心 (National Center for Biotechnology Information，NCBI)的單核苷酸多型性數(shù)據(jù)庫(kù)（SNP database, dbSNP)。
[0048] 依據(jù)下列所述本發(fā)明實(shí)施例的儀器、裝置、方法及其相關(guān)結(jié)果等，僅為說(shuō)明之用， 并非用以限制本發(fā)明的范圍。在實(shí)施例中的名稱或其次名稱僅為方便閱讀，并非用以限制 本發(fā)明的范圍。進(jìn)一步地，在此所揭露的理論，無(wú)論其是否有誤，只要實(shí)施例可據(jù)以實(shí)施，皆 不應(yīng)限制本發(fā)明的范圍。
[0049] 研究設(shè)計(jì)
[0050] 利用估計(jì)等式方法（estimating equation approach)，以建立混淆基因型 (unphased genotype)的人類白血球抗原基因型預(yù)測(cè)模型。就各對(duì)偶基因而言，該人類白血 球抗原基因型預(yù)測(cè)方法是以二個(gè)階段進(jìn)行。第一階段為建構(gòu)一預(yù)測(cè)的模型，而第二階段則 是驗(yàn)證由該第一階段所產(chǎn)生的模型。在該第一階段中，選擇一套混淆基因型來(lái)建立一預(yù)測(cè) 模型。該選擇是使用一目標(biāo)函數(shù)（objective function)來(lái)評(píng)估，其為人類白血球抗原對(duì)偶 基因特定的混淆基因型（基于Akaike Information Criterion)的負(fù)對(duì)數(shù)近似值（negative log-likelihood)。接著，基因型的選擇是以前進(jìn)選擇（forward-selection)及后退淘汰 (backward-elimination)的方法進(jìn)行。以與一人類白血球抗原對(duì)偶基因相關(guān)的基因型為 起始并逐次地增加一個(gè)基因型。該第二階段是使用一套獨(dú)立的樣本來(lái)驗(yàn)證第一階段的預(yù)測(cè) 模型。提供混淆基因型（unphased genotype)及非混淆人類白血球抗原對(duì)偶基因 （phased HLA alleles)作為該些獨(dú)立的樣本。依照最簡(jiǎn)化規(guī)則（parsimonious rule),最佳的預(yù)測(cè) 模型需使用最小可能性的flanking區(qū)域與最少可能性的單核苷酸多型性以產(chǎn)生最精準(zhǔn)的 預(yù)測(cè)。本發(fā)明所使用的樣本，是由臺(tái)灣地區(qū)華人細(xì)胞株及基因數(shù)據(jù)庫(kù)（Taiwan Han Chinese Cell and Genome Bank)取得的437個(gè)居住于臺(tái)灣地區(qū)漢人的血液樣本。
[0051] 基因型分析法
[0052] 本發(fā)明使用三種商用芯片：l)Affymetrix Genome-Wide Human SNP Array5. 0 芯 片（Affy5. 0) ;2)Affymetrix Genome-Wide Human SNP Array6. 0 芯片（Affy6. 0);及 3) Illumina' s HumanHap550Genotyping BeadChip 芯片（Illumina 550),其中使用 Affy5. 0 與Illumina550芯片對(duì)437個(gè)白血球DNA樣本進(jìn)行基因型分析，而437個(gè)樣本中的214 個(gè)樣本亦使用Affy6. 0芯片進(jìn)行基因定型。位于第6對(duì)染色體短臂上的人類主要組織 兼容性復(fù)合體（MHC)又稱為人類白血球抗原（HLA)基因群區(qū)域中，該Affy5.0芯片具 有1，406個(gè)單核苷酸多型性（3即 8);該4€€76.0芯片具有2,203個(gè)單核苷酸多型性； 該Illumina550K芯片具有1，939個(gè)單核苷酸多型性（如表1所示），而intra-MHC區(qū) 域是以位于著絲點(diǎn)端（centromeric end)的HLA-A對(duì)偶基因（6號(hào)染色體上的位置： 30, 018, 310 - 30, 021，632;NCBI build36. 3)與位于端粒端（telomeric end)的HLA-DPB1 對(duì) 偶基因（6號(hào)染色體上的位置：33, 151，738 - 33, 162, 954)為界。此區(qū)域包括第I類基因座 (HLA-A, HLA-B, HLA-C)及第 II 類基因座（HLA-DRB1, HLA-DQB1)。對(duì)于 HLA-A、-B、-C、-DQB1 及-DRB1 的對(duì)偶基因，是利用 Dynal RELI SS0 typing 套組（Dynal Biotech Ltd.，英國(guó)）進(jìn) 行基因定型；對(duì)于HLA-DPB1的對(duì)偶基因，是利用Gold SSP HLA-DPBIHigh Resolution套組 (Invitrogen公司，美國(guó)加州）進(jìn)行基因定型。所有的基因定型皆由中央研究院國(guó)家基因體 醫(yī)學(xué)研究中心執(zhí)行，該些單核苷酸多型性的判讀率（call rate)皆大于98%。
[0053] 對(duì)于全基因體相關(guān)研究法（genome-wide association studies，GWASs)，本發(fā)明 以基因型填補(bǔ)（Genotype imputation)評(píng)估在建構(gòu)人類白血球抗原基因型預(yù)測(cè)模型的實(shí)用 性。為了數(shù)據(jù)的連貫性及最佳填補(bǔ)表現(xiàn)，本發(fā)明使用MaCH軟件及漢人北京（CHB)與日本東 京（JPT)的數(shù)據(jù)組作為參考，此是用來(lái)填補(bǔ)本發(fā)明單核苷酸多型性之外來(lái)自國(guó)際人類基因 組單體型圖計(jì)劃（HapMap Project)的基因型。本發(fā)明檢視所有在MHC區(qū)域中的單核苷酸 多型性，而通常在基因型填補(bǔ)前，采用quality-control評(píng)估并篩選單核苷酸多型性以控 制其質(zhì)量，當(dāng)嚴(yán)重違反Hardy-Weinberg equilibrium(ρ〈1(Γ4)時(shí)，該些單核苷酸多型性判讀 率（callrate)〈0.95,少數(shù)對(duì)偶基因頻率（minor-allele frequency)〈0.01，則排除該些單 核苷酸多型性。再者，本發(fā)明的填補(bǔ)的單核苷酸多型性各自具有一由MaCH軟件分析結(jié)果 之貝氏定理事后機(jī)率（posterior probability) >0. 8、判讀率>0. 95、且少數(shù)對(duì)偶基因頻率 >0. 01。
[0054] 另一方面，為了測(cè)試該些芯片間單核苷酸多型性的重復(fù)性以及一致性，本發(fā)明比 較了各兩個(gè)芯片重迭的單核苷酸多型性數(shù)據(jù)。判斷基因型數(shù)據(jù)的一致性是以Cohen' s kappa coefficient來(lái)計(jì)算，而Kappa值大于0. 9通常表示兩個(gè)芯片的數(shù)據(jù)具有高一致 性。本發(fā)明亦比較各兩個(gè)芯片在建構(gòu)人類白血球抗原基因型預(yù)測(cè)模型過(guò)程中所選基因 型間的差異，以此判定所選的基因型是否對(duì)芯片具有專一性即獨(dú)特性。該差異定義為 其中啊及pi叫是兩個(gè)不同的芯片；u (啊利 是兩個(gè)不同芯片的單核苷酸多型性的聯(lián)集（union);而Π (plakplatp是兩個(gè)不同芯片的 單核苷酸多型性的交集（intersection)。不同族群間人類白血球抗原對(duì)偶基因頻率分布及 flanking區(qū)域大小差異
[0055] 不同族群間，人類白血球抗原對(duì)偶基因及其對(duì)偶分布有實(shí)質(zhì)上的差異，其是反應(yīng) 族群近代的演化歷史。再者，人類白血球抗原對(duì)偶基因分布于第6對(duì)染色體上不同的區(qū)域， 包括數(shù)個(gè)單核苷酸多型性。本發(fā)明探討國(guó)際人類基因組單體型圖計(jì)劃（HapMap Project) 中亞洲人樣本及高加索人樣本的對(duì)偶基因頻率分布。對(duì)于各人類白血球抗原對(duì)偶基因，本 發(fā)明使用卡方分布（chi-square)及費(fèi)雪精確性檢定（Fisher' s exact test)來(lái)決定人類 白血球抗原對(duì)偶基因在這兩個(gè)族群中是否有所差異。本發(fā)明以延伸±l〇kb至±400kb的 flanking區(qū)域來(lái)建構(gòu)該人類白血球抗原基因型預(yù)測(cè)模型。在漢人種中，各人類白血球抗原 對(duì)偶基因最適合的flanking區(qū)域是由上述最簡(jiǎn)化規(guī)則來(lái)決定。此外，本發(fā)明亦比較亞洲人 的flanking區(qū)域大小（Affy5. 0芯片）與已知高加索人的flanking區(qū)域大小。
[0056] 交叉驗(yàn)證（Corss-validation)
[0057] 在開(kāi)始人類白血球抗原預(yù)測(cè)分析之前，本發(fā)明將數(shù)據(jù)分成多組進(jìn)行交叉驗(yàn)證 (cross-validation, CV)。以十折（10-fold)交叉驗(yàn)證為例，該數(shù)據(jù)是分為一驗(yàn)證集 (training data set)(數(shù)據(jù)的 9/10)及一測(cè)試集（testing data set)(數(shù)據(jù)的 1/10)。就各 交叉驗(yàn)證子集（subset)而言，計(jì)算該測(cè)試集的準(zhǔn)確率且定義為f，其中Tv是正確預(yù)測(cè)測(cè) 試集中樣本的數(shù)量，而Νν是測(cè)試集中樣本的總數(shù)。平均測(cè)試準(zhǔn)確度是10個(gè)交叉驗(yàn)證子集 的平均值，表示所建構(gòu)的模型在預(yù)測(cè)人類白血球抗原對(duì)偶基因上的表現(xiàn)。人類白血球抗原 的預(yù)測(cè)可不經(jīng)由交叉驗(yàn)證，然而執(zhí)行交叉驗(yàn)證可避免預(yù)測(cè)模型的過(guò)適（ over-fitting)且可 節(jié)省獲得一獨(dú)立樣本組用于評(píng)估的時(shí)間與成本。本發(fā)明是建構(gòu)人類白血球抗原基因型預(yù)測(cè) 模型，故，使用十折交叉驗(yàn)證。
[0058] 可信度門坎（Confidence threshold)
[0059] 就在測(cè)試集中的各樣本而言，其P值（probability value)是被分配給特定單型 的每個(gè)可能的人類白血球抗原對(duì)偶基因?qū)Α＿@些數(shù)值是基于所提供的混淆基因型及非混淆 的人類白血球抗原對(duì)偶基因?qū)Α８怕史峙浜螅粼摳怕食^(guò)一預(yù)先指定的可信度門坎，則選 擇具有最大概率的人類白血球抗原對(duì)偶基因?qū)ΑＭǔ?lái)說(shuō)，可信度門坎設(shè)為0,表示判讀率 (call rate)為100%(即所有樣本均會(huì)被預(yù)測(cè)）。若可信度門坎設(shè)為0. 5 (或任何大于0的 值），則僅會(huì)使用最大預(yù)測(cè)概率超過(guò)可信度門坎的樣本。本發(fā)明將可信度門坎設(shè)為〇、〇. 5、 或0. 9來(lái)評(píng)估可信度門坎對(duì)建構(gòu)人類白血球抗原基因型預(yù)測(cè)模型的影響。
[0060] 結(jié)果
[0061] 本發(fā)明使用214個(gè)樣本由三個(gè)不同芯片（Affy5. 0、Affy6. 0、及Illumina550K芯 片）基因定型的樣本來(lái)計(jì)算6個(gè)典型人類白血球抗原（HLA-A，HLA-B，HLA-C，HLA-DRB1，HL A-DQB1，HLA-DPB1)對(duì)偶基因的頻率分布。本發(fā)明亦分析180個(gè)從國(guó)際人類基因組單體型 圖計(jì)劃取得的高加索人樣本，然而無(wú)該些樣本的HLA-DPB1數(shù)據(jù)。人類白血球抗原基因座最 多是為HLA-B。在漢人種中觀察到44個(gè)對(duì)偶基因橫跨HLA-B區(qū)域，而在國(guó)際人類基因組單 體型圖計(jì)劃中的高加索人種中觀察到32個(gè)對(duì)偶基因橫跨HLA-B區(qū)域。如卡方分布及費(fèi)雪 精確性檢定所示，在高加索人和漢人間，HLA-A、-B、-C、-DQB1、及-DRB1對(duì)偶基因的對(duì)偶基 因頻率分布具有顯著的差異（所有P值〈〇. 〇〇〇1 ;HLA-A、-B、-C、-DQB1、及-DRB1的自由度 (degree of freedom)分別為29、62、23、16、及35)，由此可見(jiàn)，人類白血球抗原對(duì)偶基因頻 率分布在不同人種間有很大的差異，也就是說(shuō)，由一族群的人類白血球抗原對(duì)偶基因所建 構(gòu)的人類白血球抗原基因型預(yù)測(cè)模型，在預(yù)測(cè)不同族群人種時(shí)會(huì)產(chǎn)生不良的預(yù)測(cè)。
[0062] 未填補(bǔ)的不同的芯片
[0063] 僅使用單一的基因定型技術(shù)可能使得人類白血球抗原對(duì)偶基因的預(yù)測(cè)存在偏見(jiàn)。 為了克服此問(wèn)題，本發(fā)明的臺(tái)灣地區(qū)214個(gè)漢人樣本是以三個(gè)芯片來(lái)基因定型（Affy5.0、 Affy6.0、及Illumina550K)。各芯片的結(jié)果及這三個(gè)芯片的合并芯片（Union)的結(jié)果是被 用來(lái)建構(gòu)人類白血球抗原預(yù)測(cè)的模型。最后，本發(fā)明評(píng)估由這三個(gè)數(shù)據(jù)集所衍生的預(yù)測(cè)模 型是否產(chǎn)出具有比較性的預(yù)測(cè)。
[0064] 各芯片對(duì)之間少有數(shù)據(jù)的重迭（如表1所示）。Affy6. 0有最多在人類MHC區(qū)域 中的單核苷酸多型性，而Affy5.0則為最少（如表1所示）。表2則顯示，芯片對(duì)之間關(guān)于 所觀察基因型的一致性系數(shù)。比較兩個(gè)Affymetrix數(shù)組，同時(shí)存在于兩個(gè)數(shù)組的基因型的 一致性系數(shù)高達(dá)0. 9926,此高程度的一致性表示高質(zhì)量的基因定型，其更由比較不同芯片 間的基因型獲得支持。
[0065] 表1、國(guó)際人類基因組單體型圖計(jì)劃及三個(gè)基因定型芯片間在延伸的MHC區(qū)域中 重迭的單核苷酸多型性 1
[0066]

【權(quán)利要求】
1. 一種單核苷酸多型性在制備預(yù)測(cè)人類白血球抗原基因型試劑盒中的應(yīng)用，其步驟包 含： (a) 提供人類核酸樣本； (b) 判別該人類核酸樣本的單核苷酸多型性集合的基因型，該單核苷酸多型性集合包 含位于人類白血球抗原基因上的各個(gè)不同的單核苷酸多型性； (c) 使用預(yù)測(cè)模型分析步驟（b)中各單核苷酸多型性的基因型以獲得計(jì)算值，其中該 預(yù)測(cè)模型是使用單核苷酸多型性基因型來(lái)預(yù)測(cè)人類白血球抗原對(duì)偶基因；以及 (d) 依據(jù)步驟（c)所獲得的計(jì)算值預(yù)測(cè)該人類核酸樣本的人類白血球抗原對(duì)偶基因 型。
2. 如權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其中該單核苷酸多型性集合所包含的各單核苷酸多型性 是來(lái)自 (1) HLA-A 基因、 (2) HLA-B 基因、 (3) HLA-C 基因、 (4) HLA-DPB1 基因、 (5) HLA-DQB1基因、以及 (6) HLA-DRB1 基因。
3. 如權(quán)利要求2所述的應(yīng)用，其中該來(lái)自（l)HLA-A基因的單核苷酸多型性是選自于 第1單核苷酸多型性集合、第2單核苷酸多型性集合、第3單核苷酸多型性集合、及第4單 核苷酸多型性集合所組成的群組，其中 (i) 該第 1 單核苷酸多型性集合是由 rsl633085、rs2254071、rs407238、rs9258881、 rs2975046、rs2735096、rs417162、rs9260954、rs6917477、rs6457144、rs9261394、及 rs2523990 所組成； (ii) 該第 2 單核苷酸多型性集合是由 rs4122198、rsl6895757、rsl632973、rs9357086、 rsll759549、 rs3115628、 rs3094165、 rs2734925、 rs2517755、 rs2256919、 rsll756025、 rs7382061、rs6457144、rs2517646、及 rs7744914 所組成； (iii) 該第 3 單核苷酸多型性集合是由 rs3094165、rs9258883、rs3132714、rsl611493、 rs2524005> rs2860580> rsl2665039> rs6457109> rs3869062> rs3893464> rs5009448> rs2571375、rs7758512、及 rs9261394 所組成； (iv) 該第 4 單核苷酸多型性集合是由 rs2523409、rsl611133、rs3115628、rs2517859、 rsl611732、rs2523998、rs2860580、rsl2202296、rs2248153、rs2975046、rs6457109、 rs5009448、rs9260932、及 rs6457144 所組成。
4. 如權(quán)利要求2所述的應(yīng)用，該來(lái)自（2) HLA-B基因的單核苷酸多型性是選自于第5單 核苷酸多型性集合、第6單核苷酸多型性集合、第7單核苷酸多型性集合、及第8單核苷酸 多型性集合所組成的群組，其中 (i)該第 5 單核苷酸多型性集合是由 rs3130944、rs3130532、rs3130534、rs3134762、 rsl6899207、rs2524089、rs9366778、rs2524166、rs9295984、rs4394275、rs9378249、 rs2523534、rs9266406、rs2844558、rs5022119rs3099848、rs4081552、rs2848716、 rs2596454、及 rs2248462 所組成； (ii) 該第 6 單核苷酸多型性集合是由 rsll966319、rs2853948、rs6906846、rs9378228、 rs2524051、rs9366778、rsl6867947、rs4394274、rs4394275、rs2523591、rs9501572、 rs7761068> rs2523535> rs9266406> rs5006724> rsl3198903> rs9266669> rs9266689> rs3099849、rs2442749、rsl051796、rs2596464、rs3099836、及 rs3131622 所組成； (iii) 該第 7 單核苷酸多型性集合是由 rs9264868、rs9264942、rs3094691、rs2156875、 rs2523619、rs2442719、rs2596501、rs2523589、rs2523554、rs2844573、rs9266395、 rs9266440、rs9295986、rs2442749、rs2596560、rs3128982、rs2284178、及 rs7758090 所組 成； (iv) 該第 8 單核苷酸多型性集合是由 rs3094691、rs7453967、rs4394274、rs4394275、 rs2596509, rs2596501, rsl058026, rs2523591, rs2523589, rs2523554, rs2523545, rs9501572> rs2844575> rs9266395> rs9266406> rs5006725> rs9295986> rs6933050> rs4959068、 rs5022119、 rsl3198903、 rs9266689、 rs2251396、 rsl051796、 rs3094584、 rs9765960、及 rs3128982 所組成。
5. 如權(quán)利要求2所述的應(yīng)用，該來(lái)自（3)HLA-C基因的單核苷酸多型性是選自于第9單 核苷酸多型性集合、第10單核苷酸多型性集合、第11單核苷酸多型性集合、及第12單核苷 酸多型性集合所組成的群組，其中 (i) 該第 9 單核苷酸多型性集合是由 rs2073724、rs3130713、rs3130531、rs3095250、 rs3130532、 rs3130534、 rs2844615、 rs6906846、 rs2524067、 rs7382297、 rs2394963、 rs2524095、rsl6899203、rs9366778、rs9295970、及 rs2523534 所組成； (ii) 該第10單核苷酸多型性集合是由rs3130712、rs28480108、rs3134762、 rsl9966319、 rs9264523、 rs3132488、 rs3134745、 rs3130693、 rs3132486、 rs2853948、 『86906846、^9378228、^6457372、^2394963、^2524057、^12191877、及189366776 所組 成； (iii) 該第 11 單核苷酸多型性集合是由 rs2516049、rs2858870、rs660895、rs532098、 rs3129763、rsl063355、rs9275141、rs9275184、rs7774434、rs7775228、及 rs9275224 所組 成； (iv) 該第12單核苷酸多型性集合是由rs9263957、rs9263969、rs3134762、 rsll966319、rs2248880、rs9264532、rs2524099、rs2074488、rs2395471、rs5010528、 rsl3207315、rs3132488、rs3130693、rs9391714、rs4386816、rs2524057、rsl6899205、及 rs9295970 所組成。
6. 如權(quán)利要求2所述的應(yīng)用，該來(lái)自（4) HLA-DPB1基因的單核苷酸多型性是選自于第 13單核苷酸多型性集合、第14單核苷酸多型性集合、第15單核苷酸多型性集合、及第16單 核苷酸多型性集合所組成的群組，其中 (i) 該第 13 單核苷酸多型性集合是由 rs3128955、rs3130588、rs9277194、rs9348904、 rs9296073、 rs2856816、 rs3135021、 rsl431403、 rs3128963、 rs3117229、 rs7763822、 rs2295120、rs3117242、rs6937034、及 rsl003979 所組成； (ii) 該第 14 單核苷酸多型性集合是由 rs9296068、rs9277183、rs3135402、rs9348904、 rs2856830、 rs9296073、 rs2071350、 rsl431402、 rsl431403、 rs9277550、 rs3128963、 rs3117229、rs9277567、rs3128918、及 rs6937034 所組成； (iii) 該第 15 單核苷酸多型性集合是由 rs206769、rs6920606、rs375912、rsl431399、 rs987870、 rs3135021、 rs9277535、 rs9277554、 rsl0484569、 rs2281390、 rs3128917、 rs2281388、rs3130215、及 rs2269346 所組成； (iv) 該第 16 單核苷酸多型性集合是由 rs2216264、rs423639、rs3097669、rs987870、 rsl431402、rsl431403、rs9277378、rs9277535、rs9277550、rs9277554、rs9277565、 rs2281390、rs2281388、rs3130215、rs6937034、rs6937061、及 rs2395357 所組成。
7. 如權(quán)利要求2所述的應(yīng)用，該來(lái)自（5) HLA-DQB1基因的單核苷酸多型性是選自于第 17單核苷酸多型性集合、第18單核苷酸多型性集合、第19單核苷酸多型性集合、及第20單 核苷酸多型性集合所組成的群組，其中 (i) 該第 17 單核苷酸多型性集合是由 rs9269186、rs9270986、rs615672、rs3129768、 rs9272219、rs9272346、rs6908943、rs9275134、rs9469220、rs6457617、rs2647046、 rs2858308、及 rs9275418 所組成； (ii) 該第 18 單核苷酸多型性集合是由 rs2647073、rs502055、rs3129768、rs9272535、 rs9272723、rs34485459、rs3129716、rs7775228、rs6469219、rs5000634、rs6457617、及 rs9275418 所組成； (iii) 該第 19 單核苷酸多型性集合是由 rs2516049、rs2858870、rs660895、rs532098、 rs3129763、rsl063355、rs9275141、rs9275184、rs7774434、rs7775228、及 rs9275224 所組 成； (iv) 該第20單核苷酸多型性集合是由rsl7533090、rs9272219、rsl7211510、 rs41269947、rs34485459、rsl063355、rs9275141、rs3129716、rs7774434、rs9405119、 rs9469219、rs9469220、及 rs9275224 所組成。
8. 如權(quán)利要求2所述的應(yīng)用，該來(lái)自（6) HLA-DRB1基因的單核苷酸多型性是選自于第 21單核苷酸多型性集合、第22單核苷酸多型性集合、第23單核苷酸多型性集合、及第24單 核苷酸多型性集合所組成的群組；其中 (i) 該第 21 單核苷酸多型性集合是由 rs9268831、rs9268861、rs7747521、rs9268877、 rs9269186、rs2027852、rs615672、rs3129768、rs9272219、rs9272346、rs9275134、 rs7775228、rs9469220、rs6457617、rs2647046、及 rs2858308 所組成； (ii) 該第22單核苷酸多型性集合是由rs9268877、rs4410767、rs7749092、 rsl7210980、rs2647073、rs615672、rs674343、rs502771、rs3997872、rs9271367、 rs9271720、rs2187668、rs34485459、rs3129716、及 rs9405119 所組成； (iii) 該第23單核苷酸多型性集合是由rs9405098、rs3129871、rsl3209234、 rs9268832、rs6903608、rs602875、rs660895、rs9271366、rs3129769、rsl7211510、 rs2187668、rs9275141、rs9275184、rs9275383、rs2856717、rs2858305、rsl3192471、及 rs3104405 所組成； (iv) 該第 24 單核苷酸多型性集合是由 rs2395175、rs9405035、rs9268831、rs6903608、 rs9268877、 rs9269186、 rs7749092、 rs2027852、 rsl7210980、 rs2516049、 rs615672、 rs660895、rs674313、rs502771、rs3997872、rs9271366、rs2187668、rs34485459、 rs9275141、rs7755224、rs3129716、及 rs3104404 所組成。
9. 如權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其中該人類核酸樣本是為亞洲人族群。
10. 如權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其中該人類核酸樣本是為漢人族群。
11. 一種預(yù)測(cè)人類白血球抗原對(duì)偶基因的裝置，是包含不超過(guò)200個(gè)核苷酸探針，其中 該探針可檢測(cè)如權(quán)利要求2所述的單核苷酸多型性。
12. 如權(quán)利要求1所述的裝置，其中該探針是固定于該裝置上。
【文檔編號(hào)】C12Q1/68GK104109710SQ201410154791
【公開(kāi)日】2014年10月22日 申請(qǐng)日期:2014年4月17日 優(yōu)先權(quán)日:2013年4月17日
【發(fā)明者】范盛娟, 張?zhí)焘x, 楊偉勛, 陳沛隆, 謝璦如, 陳垣崇, 朱正中 申請(qǐng)人:中央研究院