單核細胞增生性李斯特菌免疫pcr檢測試劑盒的制作方法
【專利摘要】本發明公開了一種用于檢測單核細胞增生性李斯特菌的經過特異性抗體包被的PCR反應管及免疫PCR檢測試劑盒。所述的PCR反應管上預包被了能特異性富集樣品中單核細胞增生性李斯特菌的單克隆抗體。本發明的檢測試劑盒能夠快速、準確、靈敏地從食品等樣品中檢測出單核細胞增生性李斯特菌，其靈敏度可達到103～104cfu/ml，比常規PCR靈敏度提高10～100倍。本發明將免疫學和分子生物學方法有機結合于一體，可在一個PCR管中實現樣品中單核細胞增生性李斯特菌的富集和檢測，操作簡便，成本低廉，檢測快速，結果準確。
【專利說明】單核細胞增生性李斯特菌免疫PCR檢測試劑盒
【技術領域】
[0001] 本發明屬于生物技術和免疫學領域，具體涉及一種檢測單核細胞增生性李斯特菌的免疫PCR檢測試劑盒。
【背景技術】
[0002]單核細胞增生李斯特菌(Listeria monocytogenes)是一種短小的革蘭氏陽性無芽胞兼性厭氧桿菌，是李斯特菌屬中致病力最強的細菌，也是唯一對人致病的、典型的胞內寄生菌，可以導致嚴重的人畜共患傳染病，如腦膜炎、敗血癥、流產和單核細胞增多等癥狀。1988年，世界衛生組織(World Health Organization, WHO)發表“食源性李斯特菌病勸告書”，指導全世界各國如何預防李斯特菌污染和中毒。自此，LM成為新的重要的食源性疾病病原菌，WHO將其與E.coli 0157、沙門氏菌以及金黃色葡萄球菌并列為20世紀90年代四大食源性致病菌。該菌主要污染牛奶及乳制品、乳酪制品、肉制品香腸、加工禽類、生肉、魚、蝦、煙熏魚、生蔬菜。目前單核細胞增生李斯特菌的檢測主要依賴于國標所規定的生化鑒定，其缺點是操作繁瑣、檢測周期較長，無法適應大量的樣品篩查。
[0003]免疫學檢測是近年來出現的最快速、準確、穩定的快速檢測手段，但是檢測產品全部依賴進口，我國目前尚無擁有完全自主知識產權，且可運用于檢測實踐的快速檢測產品，該專利以單核細胞增生李斯特菌為檢測靶標，所要求保護的技術涉及單核細胞增生性李斯特菌快速檢測產品。

【發明內容】

[0004]本發明的目的是提供一種用于檢測單核細胞增生性李斯特菌的PCR反應管。
[0005]本發明的另一個目的是提供一種用于檢測單核細胞增生性李斯特菌的免疫PCR檢測試劑盒。
[0006]本發明的第一方面是提供了一種用于檢測單核細胞增生性李斯特菌的PCR反應管，所述的PCR反應管包括:
[0007]免疫PCR管；和
[0008]包被于所述的免疫PCR管管體內壁的抗單核細胞增生性李斯特菌單克隆抗體，所述的抗單核細胞增生性李斯特菌單克隆抗體由小鼠雜交瘤細胞系6D4H7C8B6，CGMCCN0.8002 或 1B4E7A6C9, CGMCC N0.8765 產生。
[0009]本發明的第二方面是提供了一種檢測試劑盒，所述的試劑盒含有所述的PCR反應管。
[0010]在一優選例中，所述的試劑盒還含有容器a，所述的容器a中裝有所述的PCR反應管。
[0011 ] 在另一優選例中，所述的試劑盒還含有緩沖液、dNTP、TaqDNA聚合酶、ddH20、引物、陽性對照和陰性對照。
[0012]在另一優選例中，所述的引物包括正向引物和反向引物。[0013]在另一優選例中，所述的陽性對照為滅活的單核細胞增生性李斯特菌菌液，所述的陰性對照為滅菌的李氏增菌肉湯。
[0014]本發明各個方面的細節將在隨后的章節中得以詳盡描述。通過下文以及權利要求的描述，本發明的特點、目的和優勢將更為明顯。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0015]圖1是本發明的試劑盒的使用流程和原理圖。
[0016]圖2是單核細胞增生性李斯特菌直接PCR梯度稀釋檢測限研究結果。
[0017]其中，M:1OOObp DNA ladder ；N:陰性對照；1-8號泳道對應的細菌濃度為:I, 17 X IO8 ~1，17 X 10cfu/mL。 [0018]圖3是單核細胞增生性李斯特菌免疫PCR檢測試劑盒檢測單核細胞增生性李斯特菌梯度稀釋檢測限研究結果。
[0019]其中，M:1OOObp DNA ladder ；N:陰性對照；1-8號泳道對應的細菌濃度為:
I,17 X IO8 ~1，17 X 10cfu/mL。
[0020]圖4是檢測試劑盒特異性的結果。
[0021]其中，M =1000bp DNA ladder ;N:陰性對照；1_12號泳道為:單核細胞增生性李斯特菌ATCC43251，單核細胞增生性李斯特菌ATCC82346，金黃色葡萄球菌ATCC27660，鼠氏傷寒沙門氏菌ATCC22956，腸炎沙門氏菌ATCC13076，副溶血弧菌ATCC17802，小腸結腸炎耶爾森氏菌ATCC23715，福氏志賀氏菌ATCC12022，宋內氏志賀氏菌ATCC25931，痢疾志賀氏菌ATCC51329,乙型溶血性鏈球菌ATCC10373，阪崎腸桿菌ATCC29004。
[0022]圖5是模擬帶菌牛奶樣品免疫PCR試劑盒檢測限研究結果。
[0023]A(I)模擬帶菌牛奶樣品直接PCR檢測限研究結果；
[0024]A(2)模擬帶菌牛奶樣品免疫捕獲PCR檢測試劑盒檢測限研究結果；
[0025]其中，M:1OOObp DNA ladder ；N:陰性對照；I號泳道為牛奶樣品(不加菌液)；2_8號泳道對應的細菌濃度為:1，17 X IO2~I, 17X 108cfu/mL。
[0026]圖6是模擬帶菌酸奶樣品免疫PCR試劑盒檢測限研究結果。
[0027]B⑴模擬帶菌酸奶樣品直接PCR檢測限研究結果；
[0028]B (2)模擬帶菌酸奶樣品免疫捕獲PCR檢測試劑盒檢測限研究結果；
[0029]其中，M:1OOObp DNA ladder ；N:陰性對照；I號泳道為酸奶樣品(不加菌液)；2_8號泳道對應的細菌濃度為:1，17 X IO2~I, 17X 108cfu/mL。
[0030]圖7是模擬帶菌香腸樣品免疫PCR試劑盒檢測限研究結果；
[0031]C⑴模擬帶菌香腸樣品直接PCR檢測限研究結果；
[0032]C(2)模擬帶菌香腸樣品免疫捕獲PCR檢測試劑盒檢測限研究結果；
[0033]其中，M:1OOObp DNA ladder ；N:陰性對照；I號泳道為香腸樣品(不加菌液)；2_8號泳道對應的細菌濃度為:1，17 X IO2~I, 17X 108cfu/mL。
[0034]圖8是模擬帶菌蛋糕樣品免疫PCR試劑盒檢測限研究結果。
[0035]D(I)模擬帶菌蛋糕樣品直接PCR檢測限研究結果；
[0036]D (2)模擬帶菌蛋糕樣品免疫捕獲PCR檢測試劑盒檢測限研究結果；
[0037]其中，M:1OOObp DNA ladder ；N:陰性對照；I號泳道為蛋糕樣品(不加菌液)；2_8號泳道對應的細菌濃度為:1，17 X IO2~I, 17X 108cfu/mL。
[0038]圖9是模擬帶菌果汁樣品免疫PCR試劑盒檢測限研究結果。
[0039]E⑴模擬帶菌果汁樣品直接PCR檢測限研究結果；
[0040]E (2)模擬帶菌果汁樣品免疫捕獲PCR檢測試劑盒檢測限研究結果；
[0041]其中，M:1OOObp DNA ladder ；N:陰性對照；I號泳道為果汁樣品(不加菌液);2_8號泳道對應的細菌濃度為:1，17 X IO2~I, 17X 108cfu/mL。
[0042]圖10是模擬帶菌雞蛋樣品免疫PCR試劑盒檢測限研究結果。
[0043]F(I)模擬帶菌雞蛋樣品直接PCR檢測限研究結果；
[0044]F(2)模擬帶菌雞蛋樣品免疫捕獲PCR檢測試劑盒檢測限研究結果；
[0045]其中，M:1000bp DNA ladder ；N:陰性對照；I號泳道為雞蛋樣品(不加菌液)；2_8號泳道對應的細菌濃度為:1，17 X IO2~I, 17X 108cfu/mL。
【具體實施方式】
[0046]本發明人的研究表明，以單核細胞增生性李斯特菌作為免疫原，免疫Balb/c小鼠，分離純化得到抗單核細胞增生性李斯特菌單克隆抗體6D4H7C8B6和1B4E7A6C9，其抗體效價可達到1:100000，其能夠特異性、高效地與單核細胞增生性李斯特菌結合，檢測靈敏度達到105cfu/ml。與出血性大腸桿菌0157:H7、豬霍亂沙門、鼠傷寒沙門、腸炎沙門、福氏志賀、宋內氏志賀、鮑氏志賀、副溶血弧菌、阪崎腸桿菌、小腸耶爾森氏菌、肺炎鏈球菌、蠟樣芽孢桿菌等共計68種病原細菌均無交叉反應。
[0047]在此基礎上，本發明人進而將致病菌免疫富集技術和基因水平檢測技術有效結合，即先用本發明的抗單核細胞增生性李斯特菌單克隆抗體將待測樣品中的病原菌特異性免疫富集，然后再進行PCR擴增，從而提供了一種可快速、高效檢測食源性單核細胞增生性李斯特菌的檢測試劑盒。
[0048]抗體
[0049]本發明的抗單核細胞增生性李斯特菌單克隆抗體可以利用小鼠雜交瘤細胞系6D4H7C8B6 (CGMCC N0.8002)或 1B4E7A6C9 (CGMCC N0.8765)分泌產生。本發明包括具有抗單核細胞增生性李斯特菌單克隆抗體6D4H7C8B6或1B4E7A6C9的相應氨基酸序列的單克隆抗體，以及具有這些鏈的其他蛋白質或蛋白質偶聯物及融合表達產物。具體地，本發明包括具有含超變區(互補決定區，CDR)的輕鏈和重鏈的任何蛋白質或蛋白質偶聯物及融合表達產物(即免疫偶聯物及融合表達產物)，只要該超變區與本發明的輕鏈和重鏈的超變區相同或至少90%同源性，較佳地至少95%同源性。如本領域技術人員所知，免疫偶聯物及融合表達產物包括:藥物、毒素、細胞因子(cytokine)、放射性核素、酶和其他診斷或治療分子與抗單核細胞增生性李斯特菌單克隆抗體或其片段結合的而形成的偶聯物。本發明還包括與抗單核細胞增生性李斯特菌單克隆抗體或其片段結合的細胞表面標記物或抗原。
[0050]對于本發明的抗單核細胞增生性李斯特菌單克隆抗體重鏈和輕鏈序列，可以用常規方法測定。抗單核細胞增生性李斯特菌單克隆抗體V鏈的超變區或互補決定區(complementarity determining region, Q)R)特別令人感興趣，因為它們中至少部分涉及結合抗原。因此，本發明包括那些具有帶CDR的免疫球蛋白輕鏈和重鏈可變鏈的分子，只要其⑶R與抗單核細胞增生性李斯特菌單克隆抗體⑶R具有90%以上(較佳地95%以上)的同源性。本發明不僅包括完整的單克隆抗體，還包括具有免疫活性的抗體片段，如Fab或(Fab ‘)2片段；抗體重鏈；抗體輕鏈。
[0051]本發明還提供了上述免疫球蛋白或其片段的DNA分子。這些DNA分子的序列可以用常規技術，利用雜交瘤細胞系 6D4H7C8B6(CGMCC N0.8002)或 1B4E7A6C9 (CGMCC N0.8765)獲得。此外，還可將輕鏈和重鏈的編碼序列融合在一起，形成單鏈抗體。
[0052]一旦獲得了有關的序列，就可以用重組法來大批量地獲得有關序列。這通常是將其克隆入載體，再轉入細胞，然后通過常規方法從增殖后的宿主細胞中分離得到有關序列。
[0053]此外，還可用人工合成的方法來合成有關序列，尤其是片段長度較短時。通常，通過先合成多個小片段，然后再進行連接可獲得序列很長的片段。
[0054]目前，已經可以完全通過化學合成來得到編碼本發明蛋白(或其片段，或其衍生物)的DNA序列。然后可將該DNA序列引入本領域中己知的各種現有的DNA分子(或如載體)和細胞中。此外，還可通過化學合成將突變引入本發明蛋白序列中。[0055]本發明還涉及包含上述的適當DNA序列以及適當啟動子或者控制序列的載體。這些載體可以用于轉化適當的宿主細胞，以使其能夠表達蛋白質。
[0056]宿主細胞可以是原核細胞，如細菌細胞；或是低等真核細胞，如酵母細胞；或是高等真核細胞，如哺乳動物細胞。
[0057]用重組DNA轉化宿主細胞可用本領域技術人員熟知的常規技術進行。當宿主為原核生物如出血性大腸桿菌時，能吸收DNA的感受態細胞可在指數生長期后收獲，用CaClJi處理，所用的步驟在本領域眾所周知。另一種方法是使用MgCl2。如果需要，轉化也可用電穿孔的方法進行。當宿主是真核生物，可運用如下的DNA轉染方法:磷酸鈣共沉淀法，常規機械方法如顯微注射、電穿孔，脂質體包裝等。
[0058]獲得的轉化子可以用常規方法培養，表達本發明的基因所編碼的多肽。根據所用的宿主細胞，培養中所用的培養基可選自各種常規培養基。在適于宿主細胞生長的條件下進行培養。當宿主細胞生長到適當的細胞密度后，用合適的方法(如溫度轉換或化學誘導)誘導選擇的啟動子，將細胞再培養一段時間。
[0059]在上面的方法中的重組多肽可在細胞內、或在細胞膜上表達、或分泌到細胞外。如果需要，可利用其物理的、化學的和其它特性通過各種分離方法分離和純化重組的蛋白。這些方法是本領域技術人員所熟知的。這些方法的例子包括但并不限于:常規的復性處理、用蛋白沉淀劑處理(鹽析方法)、離心、滲透破菌、超聲處理、超離心、分子篩層析(凝膠過濾)、吸附層析、離子交換層析、高效液相層析(HPLC)和其它各種液相層析技術及這些方法的結合。
[0060]本發明的抗單核細胞增生性李斯特菌單克隆抗體6D4H7C8B6和1B4E7A6C9，其效價高(可以達到1:100000)，能夠特異性地、高效地檢測單核細胞增生性李斯特菌，與出血性大腸桿菌015 7: H 7、豬霍亂沙門、鼠傷寒沙門、腸炎沙門、福氏志賀、宋內氏志賀、鮑氏志賀、副溶血弧菌、阪崎腸桿菌、小腸耶爾森氏菌、肺炎鏈球菌、蠟樣芽孢桿菌等共計68種病原細菌均無交叉反應，此為本發明的最大創新點。
[0061]檢測試劑盒
[0062]本發明人根據免疫PCR的原理，制備了一種可用于檢測樣品中單核細胞增生性李斯特菌的試劑盒，即先用本發明的抗單核細胞增生性李斯特菌單克隆抗體6D4H7C8B6或1B4E7A6C9將待測樣品中的病原菌特異性地免疫富集，然后再進行PCR擴增，以提高檢測的靈敏度和特異性。
[0063] 具體而言，本發明首先是提供了一種用于檢測單核細胞增生性李斯特菌的PCR反應管，它包括免疫PCR管和包被于所述免疫PCR管管體內壁的抗單核細胞增生性李斯特菌單克隆抗體6D4H7C8B6或1B4E7A6C9，所述的抗單核細胞增生性李斯特菌單克隆抗體6D4H7C8B6和1B4E7A6C9分別由小鼠雜交瘤細胞系6D4H7C8B6，CGMCC N0.8002或1B4E7A6C9, CGMCC N0.8765 分泌產生。
[0064]在此基礎上，本發明進而提供了一種單核細胞增生性李斯特菌免疫PCR檢測試劑盒，它含有上述用于檢測單核細胞增生性李斯特菌的PCR反應管；
[0065]作為本發明的優選方式，所述的試劑盒中還裝載有容器a，所述的容器a可以是自封袋或者其他形式的容器，其中裝有本發明的包被有抗單核細胞增生性李斯特菌單克隆抗體 6D4H7C8B6 或 1B4E7A6C9 的 PCR 反應管。
[0066]此外，為了使本發明的試劑盒在檢測時更方便，所述的本發明的試劑盒中優選地還包含其它一些輔助試劑，所述的輔助試劑是免疫PCR檢測試劑盒中常規使用的一些試劑，這些試劑的特性以及它們的配制方法均是本領域技術人員所熟知的。所述的試劑例如(但不限于):緩沖液(10XPCR Buffer)、dNTP、TaqDNA聚合酶、ddH20(滅菌雙蒸水)、引物等常規PCR反應試劑。10XPCR Buffer、dNTP、TaqDNA聚合酶、ddH20與常規的免疫PCR檢測試劑盒中的所用的試劑相同。同時，為了消除假陽性和假陰性，還可在PCR檢測過程中設置質控(對照)，即在本發明的試劑盒中還包含有陰性對照和陽性對照等。較佳地，所述的陽性對照溶液為滅活的單核細胞增生性李斯特菌菌液，陰性對照溶液為滅菌的李氏增菌肉湯。如本領域技術人員所熟知，上述試劑和溶液可分別裝載于EP管或試劑瓶中。
[0067]此外，在所述試劑盒中還可包含使用說明書，用于說明其中裝載的試劑的使用方法。
[0068]本發明的有益效果:本發明的單核細胞增生性李斯特菌免疫PCR檢測試劑盒集病原菌濃縮、特異性抗體識別以及PCR擴增為一體，具有檢測結果準確性高、特異性強、靈敏度高以及檢測快速、使用方便等優點，彌補了現有食源性致病菌檢測技術費時耗力、靈敏度低的不足。
[0069]本發明的單核細胞增生性李斯特菌免疫PCR檢測試劑盒適用于菌株快速鑒定、食品中食源性致病菌檢測等諸多領域，尤其適用于樣品中微量病原體的快速檢測。可供質監部門、進出口檢疫部門等用于檢測食樣中的單核細胞增生性李斯特菌。
[0070]下面結合具體實施例，進一步闡述本發明。應理解，這些實施例僅用于說明本發明而不用于限制本發明的范圍。下列實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規條件如 Sambrook 等人,分子克隆:實驗室指南(New York:Cold Spring Harbor LaboratoryPress, 1989)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。除非另外說明，否則百分比和份數按重量計算。
[0071]除非另行定義，文中所使用的所有專業與科學用語與本領域熟練人員所熟悉的意義相同。此外，任何與所記載內容相似或均等的方法及材料皆可應用于本發明中。文中所述的較佳實施方法與材料僅作示范之用。
[0072]實施例1.抗單核細胞增生性李斯特菌單克隆抗體6D4H7C8B6和1B4E7A6C9的制備
[0073]一、免疫原和陽性標準品的準備
[0074]單核細胞增生性李斯特菌(ATCC N0.43251)接種于李氏增菌肉湯37°C、150r/min振蕩培養17h，計數，加入0.3%甲醛溶液室溫滅活I天。用生理鹽水調整單核細胞增生性李斯特菌(ATCC N0.43251)濃度至5 X 109cfu/ml作為免疫原；用生理鹽水調整濃度為IO8Cfu/ml單核細胞增生性李斯特菌菌液作為陽性對照標準品，李氏增菌肉湯為陰性對照標準品。
[0075]二、單克隆抗體的制備
[0076]I)實驗動物:選3只8周齡，體重20g左右、雌性Balb/c小鼠為實驗動物。
[0077]2)免疫方法:每只小鼠腹腔注射0.2ml免疫原，每間隔2周用同樣劑量加強注射
一次。
[0078]3)米血:3次加強免疫后從尾部靜脈米血,米用間接非競爭酶聯免疫法測定抗血清效價。待效價不再上升，腹腔注射同樣量免疫原，3天后按照常規方法進行細胞融合。
[0079]4)細胞融合:取免疫小鼠脾臟細胞與SP2/0骨髓瘤細胞在50%PEG作用下常規融合，分別接種于96孔培養板，置于37°C、5% CO2培養箱培養。
[0080]5)雜交瘤細胞篩選:采用間接非競爭酶聯免疫法，篩選強陽性孔的雜交瘤細胞，將其轉移至24孔培養板。
[0081]6)克隆培養及抗體制備:用有限稀釋法進行克隆化培養。當細胞生長至鋪滿孔底1/10時，再用同樣方法檢測，將強陽性孔再克隆，如此反復3 — 4次，直至陽性率達到100 %。將雜交瘤細胞擴大培養，注射于經石蠟油預處理的Balb/c小鼠腹腔，每只2 X IO6個雜交瘤細胞，7~10天小鼠腹部隆起，活體穿刺抽取腹水。用辛酸-硫酸銨法從小鼠腹水
中純化抗體。Listeria monocytogenes單核細胞增生性李斯特菌-國標:GB4789.30一
2010
[0082]李氏增菌肉湯
[0083]成分:胰胨5.0g,多價胨5.0g,酵母膏5.0g,氯化鈉20.0g,磷酸二氫鉀1.4g，磷酸氫二鈉12.0g，七葉苷1.0g，蒸餾水1000mL ；
[0084]制法:將上述成分加熱溶解，調節pH7.2~7.4，分裝，1211:高壓滅菌151^11，備用。
[0085]單克隆抗體效價測定方法:
[0086](I)將飽和培養細菌抗原連同培養基在對應的孔中加入100μ 1，4°C過夜(約包板36h)。
[0087](2)倒空液體并拍干殘留液體，用250 μ I洗滌液清洗3次。
[0088](3)每個孔中加 100 μ 11% BSA，37°C封閉 Ih0
[0089](4)倒空液體并拍干殘留液體，用250 μ I洗滌液清洗3次。
[0090](5)每個孔中加100 μ I血清，37°C孵育lh。
[0091](6)倒空液體并拍干殘留液體，每個孔中加250 μ IPBST洗滌液洗滌3次。
[0092](7)每個孔中50 μ I的HRP標記的二抗(sigma)，室溫孵育lh。
[0093](8)用洗滌液浸泡5min，倒空液體并拍干殘留液體，每個孔中加250 μ IPBST洗滌液洗滌3次。
[0094](9)每個孔中加100 μ I底物，顯色30min，加終止液100 μ I并立即在OD450讀數。
[0095]表1.兩株單克隆抗體效價測定結果(OD45tl)
【權利要求】
1.一種用于檢測單核細胞增生性李斯特菌的PCR反應管，其特征在于，所述的PCR反應管包括: 免疫PCR管；和 包被于所述的免疫PCR管管體內壁的抗單核細胞增生性李斯特菌單克隆抗體，所述的抗單核細胞增生性李斯特菌單克隆抗體由小鼠雜交瘤細胞系6D4H7C8B6，CGMCC N0.8002或1B4E7A6C9, CGMCC N0.8765 產生。
2.一種檢測試劑盒，其特征在于，所述的試劑盒含有如權利要求1所述的PCR反應管。
3.如權利要求2所述的試劑盒，其特征在于，所述的試劑盒還含有容器a，所述的容器a中裝有如權利要求1所述的PCR反應管。
4.如權利要求2所述的試劑盒，其特征在于，所述的試劑盒還含有緩沖液、dNTP、TaqDNA聚合酶、ddH20、引物、陽性對照和陰性對照。
5.如權利要求4所述的試劑盒，其特征在于，所述的引物包括正向引物和反向引物。
6.如權利要求4所述的試劑盒，其特征在于，所述的陽性對照為滅活的單核細胞增生性李斯特菌菌液，所述的陰性對照為滅菌的李氏增菌肉湯。
【文檔編號】C12Q1/68GK103937898SQ201410177007
【公開日】2014年7月23日 申請日期:2014年4月29日 優先權日:2014年4月29日
【發明者】劉箐, 宋春美, 吳嫚 申請人:上海理工大學