用于基于aflp的高通量多態性檢測的方法
【專利摘要】本發明涉及用于基于AFLP的高通量多態性檢測的方法，其用于高通量發現、檢測和基因分型一個或多個樣品中一個或多個遺傳標記的方法，其包括步驟：限制性內切核酸酶消化DNA、接頭-連接、任選的預擴增、選擇性擴增、混合集中擴增產物、測序具有足夠冗余度的所述文庫、聚簇分析，接著鑒定所述文庫內和/或文庫之間的遺傳標記，并確定所述遺傳標記的(共)顯性的基因分型。本發明提供方法或策略，其組合AFLP的功效和一般適用性與某些高通量測序技術以建立一般可適用的多態性評分系統。在該策略中，也解決了抽樣變異的問題，確保基因分型具有高精確度和最佳化數據集具有最少量的遺漏基因分型的概率。
【專利說明】用于基于AFLP的高通量多態性檢測的方法
[0001]本申請是申請號為200680051561.8，申請日為2006年12月20日，發明名稱為“用于基于AFLP的高通量多態性檢測的方法”的中國專利申請的分案申請。
【技術領域】
[0002]本發明涉及分子生物學和和遺傳學領域。本發明涉及快速發現、檢測和大規模基因分型核酸樣品中或樣品之間的多態性。鑒定的多態性可用作遺傳標記。
【背景技術】
[0003]科學的、特別是醫學的團體長期期望研究基因組DNA。基因組DNA在鑒定、診斷和治療疾病比如癌癥和阿爾茨海默病中起關鍵作用。除了疾病鑒定和治療之外，基因組DNA的研究可在植物和動物繁殖努力中提供重要的優點，其可提供世界上對食品和營養品問題的答案。
[0004]已知許多疾病與特定的遺傳組分、特別地與特定基因中的多態性相關。目前，大樣品比如基因組的多態性的鑒定是一項艱巨和耗時的工作。然而，這樣的鑒定對領域比如生物醫學研究、開發藥品、組織分型、基因分型和人口研究有很大的價值。
[0005]標記，即遺傳標記，已被用作遺傳分型方法很長時間，即將表型性狀同DNA(基因)的特定部分的存在、不存在或量相連接。最多用途的遺傳分型技術之一是AFLP，其已經使用了許多年，廣泛適用于任何生物體(對于綜述，參見Savelkoul 等，J.Clin.Microbiol, 1999, 37 (10), 3083-3091 ；Bensch 等，MolecularEcology, 2005，14，2899-2914)。
[0006]從AFLP技術在九十年代初期發明以來，已經發現AFLP技術(Zabeau&Vos，1993 ；Vos等人，1995)廣泛用于植物育種及其它領域。這應歸于AFLP的一些特征，其中最重要的是不需要現有序列信息以可重現的方式產生大量遺傳標記。而且，選擇性擴增(AFLP的基石)的原理保證了可以使擴增片段的數量符合檢測系統的分辨率，與基因組大小或來源無關。
[0007]AFLP片段的檢測通常通過在平板-凝膠上的電泳(Vos等人，1995)或毛細管電泳(van der Meulen等人,2002)進行。以這種方式評分的大多數AFLP標記表示(單一核苷酸)存在于用于AFLP模板制備的限制性內切酶識別位點或選擇性AFLP引物覆蓋的其旁側核苷酸(flanking nucleotides)的多態性。其余的AFLP標記為在限制性片段的內部序列中出現的插入/缺失多態性和在小的限制性片段(〈約IOObp)中出現的單核苷酸取代的非常小的部分，對于這些片段，其可引起在兩個等位基因之間可重現的遷移率變化；這些AFLP標記能被共顯性地(co-dominantly)評分而不用必須依賴于帶的強度。
[0008]因此，在典型的AFLP指紋圖譜中，所述AFLP標記占擴增片段的小部分(小于50百分比，但通常小于20百分比)，而其余的通常被稱為恒定的AFLP片段。然而，后者在凝膠評分過程中有用，因為它們起用于計算AFLP標記的片段遷移率和輔助定量用于共顯性評分的標記的定位點的作用。目前，AFLP標記的共顯性評分(純合性或雜合性評分)只限于采集分離種群指紋的范圍中。在沒有聯系的系的小組中，僅僅顯性評分是可能的。
[0009]盡管由于在擴增和檢測步驟中高倍增水平引起AFLP的通量非常高，速率限定步驟是電泳的分辨力。基于限制性內切酶組合(EC)、引物組合(PC)和遷移率，電泳允許獨特鑒定大多數擴增片段，但理想地，所述檢測系統應當能夠測定擴增片段的全部序列以獲得所有的多態性。
[0010]通過測序代替遷移率測定的檢測將增加通量，因為:
[0011]I)將在大多數(或所有的)擴增片段中檢測到位于內部序列的多態性；這將相當大地增加每個PC標記的數量。
[0012]2)由于AFLP標記和恒定的條帶的共遷移不會引起AFLP標記損失。
[0013]3)共顯性評分不依賴于定量帶強度，且與個體指紋圖譜的親緣關系無關。
[0014]迄今為止，通過測序檢測AFLP標記/序列還不是經濟可行的，因為，包括其它的限制，Sanger雙脫氧法測序技術及其它常規測序技術的費用限制。
[0015]因此，本發明的一個目標是提供基于測序來檢測AFLP標記物或其它的遺傳標記比如SNP標記的經濟可行的方法。
[0016]與經由用于基因分型(即診斷)目的的測序來檢測許多包含AFLP或SNP的片段進一步相關的重要問題是抽樣變異問題。特別地，這指當分析許多片段和沒有觀察到特定片段時，人們不得不確定 這不是由于沒有在檢測步驟中抽樣涉及的片段，盡管它們存在于所述片段混合物中，因為這將引起標記的假陰性評分。該限制不能應用到電泳檢測，因為在凝膠上位置信息是有用的。
[0017]因此，本發明的進一步的目標之一是提供解決抽樣變異問題或至少減少由抽樣變異引起的誤差至可接受的最少值的方法。

【發明內容】

[0018]本發明人已經發現在用于高通量測序的某些調整的步驟中借助于AFLP的測序可以檢測AFLP和SNP標記。因此，本發明提供方法或策略，其組合AFLP的功效和一般適用性與某些高通量測序技術以建立一般可適用的多態性評分系統。在該策略中，也解決了抽樣變異的問題，確保基因分型具有高精確度和最佳化數據集具有最少量的遺漏基因分型的概率。
[0019]定義
[0020]在下述說明書和實施例中，使用了許多術語。為了提供對包括這類術語給出的范圍的說明書和權利要求書清楚一致的理解，提供下述定義，除非本文另有定義，使用的所有技術和科學術語具有如本發明所屬領域技術人員通常理解的相同的含義。將所有出版物、專利申請、專利及其它參考文獻公開的內容以其全部引入本文作為參考。
[0021]多態性:多態性指在種群中存在核苷酸序列的兩種或多種變體。多態性可包括一個或多個堿基變化、插入、重復或缺失。多態性包括例如單一序列重復(SSR)和單一核苷酸多態性(SNP)，其為當單一核苷酸:腺嘌呤(A)、胸腺嘧啶(T)、胞嘧啶(C)或鳥嘌呤(G)被改變時出現的變異。變異通常必須出現在至少I %的種群中才被認為SNP。SNP構成例如90%的所有人類遺傳變異，且沿著人類基因組的每100至300個堿基出現。每三個SNP中兩個用胸腺嘧啶(T)取代了胞嘧啶(C)。在例如人類或植物的DNA序列中的變異可以影響它們怎樣處理疾病、細菌、病毒、化學品、藥物等。
[0022]核酸:根據本發明的核酸可包括任何嘧啶和嘌呤堿基的聚合物或低聚物，所述堿基分別優選胞嘧啶、胸腺嘧啶和尿嘧啶，和腺嘌呤及鳥嘌呤(參見，AlbertL.Lehninger, Principles of Biochemistry, at793-800 (Worth Pub.1982),將其全部內容引入本文作為參考用于所有目的)。本發明考慮了脫氧核糖核苷酸、核糖核苷酸或肽核苷酸組分，和其任何化學變體，比如這些堿基的甲基化的、羥甲基化的或糖基化的形式等。所述聚合物或低聚物在組成上可以是異源的或同源的，且可以是從天然存在的來源分離的或可以是人工或合成產生的。而且，所述核酸可以是DNA或RNA或其混合物，且其可以以單鏈或雙鏈形式永久或瞬間存在，所述雙鏈形式包括同源雙鏈、異源雙鏈和雜交體狀態。
[0023]復雜性降低:術語復雜性降低用于表示其中核酸樣品比如基因組DNA的復雜性通過產生樣品亞型而降低。該亞型可以是整體(即復合物)樣品的代表，且優選可重現的亞型。可重現的在本文中指當使用相同方法降低相同樣品的復雜性時，獲得相同的或至少可比較的亞型。用于復雜性降低的方法可以是本領域已知的用于復雜性降低的任何方法。用于復雜性降低的方法的優選的實例包括例如AFLP? (Keygene N.V.，荷蘭；參見例如EP0534858、US6045994)，Dong 公開的方法(參見例如 W003/012118、W000/24939)，索引的鏈接(indexed linking) (Unrau 等人,見下文)，接頭-PCR(Iinker-PCR) (W090/008821)和SALSA-PCR(W000/23620) Schouten等人)等。本發明使用的復雜性降低法具有它們是可重現的共同點。可重現的指當相同樣品以相同方式降低復雜性時，獲得樣品的相同亞型，與更隨機的復雜性降低比如顯微切割或使用mRNA(cDNA)相反，所述mRNA代表了在選擇的組織中轉錄的基因組部分，且其重現性取決于組織的選擇、分離時間等。[0024]AFLP =AFLP指用于選擇性擴增DNA的方法，其基于用一種或多種限制性內切酶消化核酸以提供限制性片段，連接接頭(adaptors)至限制性片段，并用至少一個引物擴增所述接頭-連接的限制性片段，所述引物與所述接頭(部分)互補，(部份)互補于限制性內切酶的剩余部分，且進一步包含至少一個從A、C、T或G(或U，視情況而定)中隨機選擇的核苷酸。AFLP不需要任何現有的序列信息，且可以在任何起始DNA上進行。通常，AFLP包括下述步驟:
[0025](a)用一種或多種特異性限制性內切酶消化核酸，特別是DNA或cDNA，以將DNA片段化成相應系列的限制性片段；
[0026](b)連接由此得到的限制性片段與雙鏈的合成寡核苷酸接頭，其中一個末端適合于限制性片段的一個或兩個末端，從而生成接頭-連接的、優選標記的、起始DNA的限制性片段；
[0027](c)在雜交條件下，將一個或多個在其3’ -末端包含選擇性核苷酸的寡核苷酸引物接觸接頭-連接的、優選標記的限制性片段；
[0028](d)通過PCR或類似的技術擴增與引物雜交的接頭-連接的、優選標記的限制性片段，以便進一步使雜交的引物沿著起始DNA的限制性片段與引物雜交的方向伸長；和
[0029](e)檢測、鑒定或回收由此獲得的擴增的或伸長的DNA片段。
[0030]因此，AFLP提供接頭-連接的片段的可重現的亞型。AFLP公開在EP534858、US6045994和在Vos等人文章中。參照這些出版物可進一步了解關于AFLP的細節。AFLP通常用作復雜性降低技術和DNA指紋圖譜技術。在AFLP作為指紋圖譜技術的用途的內容中，已經發展了 AFLP標記的概念。
[0031]AFLP標記:AFLP標記是擴增的接頭_連接的限制性片段，其在使用AFLP(指紋圖譜)、使用相同類的引物擴增的兩種樣品間不同。因而，可將存在或不存在該擴增的接頭-連接的限制性片段作為與性狀或表型相關的標記。在常規凝膠技術中，AFLP標記顯示為以一定的遷移率位于凝膠中的條帶。其它的電泳技術比如毛細管電泳可能不將此表示為條帶，但該概念仍相同，即具有一定長度和遷移率的核苷酸。存在或不存在條帶可以指示(或與其相關)存在或不存在表型。AFLP標記典型地包括在內切核苷酸酶限制位點中的SNP或選擇性核苷酸。有時，AFLP標記可包括在限制性片段中的indel。
[0032]SNP標記:SNP標記為基于在某一位點鑒定的單核苷酸多態性的標記。SNP標記可以位于與AFLP標記相同的位置，但是SNP標記也可以位于限制性片段本身中。因而，SNP標記屬包括AFLP標記種。
[0033]恒定的條帶:在AFLP技術中恒定的條帶為擴增的接頭-連接的限制性片段，其在樣品之間相對不變。因此，在AFLP技術中恒定的條帶將在樣品范圍內表現在凝膠中大約相同位置，即具有相同的長度/遷移率。在常規AFLP中，這些典型地用于固定相應于凝膠中樣品的泳道或用毛細管電泳檢測的多種AFLP樣品的電泳圖譜。典型地，恒定的條帶比AFLP標記提供的信息更少。然而，因為AFLP標記慣常包括在選擇核苷酸或限制性位點中的SNP，恒定的條帶可包括在限制性片段本身中的SNP，導致恒定的條帶成為與AFLP標記互補的遺傳信息的感興趣的另一個來源。
[0034]選擇性堿基:位于引物的3’末端，其包含與接頭互補的部分，和與限制性位點的剩余部分互補的部分，所述選擇性堿基隨機選自A、C、T或G。通過用選擇性堿基延伸引物，隨后的擴增將僅獲得接頭-連接的限制性片段的可重現的亞型，即僅有可以使用含有所述選擇性堿基的引物擴增的片段。可以將數目在I至10之間改變的選擇性核苷酸加入到引物的3’末端。典型地，1-4足夠了。兩種引物均可包含可變數量的選擇性堿基。通過每一個加入的選擇性堿基，亞型以大約4的因子降低了亞型中擴增的接頭-連接的限制性片段的量。典型地，在AFLP中使用的選擇性堿基的數量由+N+M表示，其中一個引物載有N個選擇性核苷酸，而另一個引物載有M個選擇性核苷酸。因此，Eco/Mse+l/+2AFLP為如下的速記:用EcoRI和MseI消化起始DNA，連接適合的接頭，并用一個定向到載有一個選擇性堿基的EcoRI限制性位點的引物和另一個定向到載有2個選擇性核苷酸的MseI限制型位點的引物擴增。
[0035]聚簇分析:術語“聚簇分析”指基于同樣或類似核苷酸的短的或長的片段的存在比較兩種或多種核苷酸序列。用于比對核苷酸序列的幾種方法是本領域已知的，如下述進一步闡述的。有時，術語“裝配”或“比對”作為同義詞使用。
[0036]標記:可以加入到引物或包括在其序列或用作標記以提供獨特標識符的短序列。這樣的序列標識符可以是可變但確定長度的獨特堿基序列，其特別地用于鑒定特定的核酸樣品。例如，4bp標記允許4(4次方)= 256個不同的標記。典型的實例為ZIP序列,其為本領域已知的通常用于雜交的獨特檢測的標記(Iannone等，Cytometry39:131-140, 2000)。使用這樣的標記，可以通過進一步的加工確定PCR樣品的起點。在組合來源于不同核酸樣品的加工產物的情況中，通常使用不同的標記鑒定不同的核酸樣品。在本發明的情況下，加入獨特序列標記有助于鑒定序列擴增產物群中個體植物的配位。可以使用多個標記。[0037]標記:術語標記指將標記加入到核酸樣品中，以便能夠使其與第二個或進一步的核酸樣品區別。標記可以例如通過在復雜性降低期間加入序列標識符或通過本領域已知的任何其它方式進行。這樣的序列標識符可以例如是可變但確定長度的獨特堿基序列，其特別地用于鑒定特定的核酸樣品。其典型的實例是例如ZIP序列。使用這樣的標記，可以通過進一步的加工確定樣品的起點。在組合來源于不同核酸樣品的加工產物的情況中，應當使用不同的標記鑒定不同的核酸樣品。
[0038]標記的文庫:術語標記的文庫指標記的核酸的文庫。
[0039]測序:術語測序指測定核酸樣品例如DNA或RNA中核苷酸的順序(堿基順序)。
[0040]高通量篩選:高通量篩選通常縮寫為HTS，是用于科學實驗的方法，特別地與生物學和化學領域有關。通過組合現代機器人學及其它專門的實驗室硬件，其允許研究人員同時有效地篩選大量樣品。
[0041]限制性核酸內切酶:限制性核酸內切酶或限制酶為識別雙鏈DNA分子中特定的核苷酸序列(目標位點 )，并且將在每個目標位點切割DNA分子雙鏈的酶。
[0042]限制性片段:由限制性核酸內切酶消化產生的DNA分子被稱為限制性片段。任何給出的基因組(或核酸，不考慮其起源)都將被特定的限制性核酸內切酶消化成分離的限制性片段。由限制性核酸內切酶裂解得到的DNA片段可以進一步用于各種技術，并可以例如用凝膠電泳檢測。
[0043]凝膠電泳:為了檢測限制性片段，可能需要基于大小的分級雙鏈DNA分子的分析方法。用于獲得這樣的分級最通常使用的技術是(毛細管)凝膠電泳。DNA片段在這樣的凝膠中運動的速率取決于其分子量；因此，當片段長度增加時移動距離減少。如果包括在圖像中的片段的數量足夠少，可以通過染色步驟例如銀染色法或使用溴乙錠染色直接顯影由凝膠電泳分級的DNA片段。DNA片段的可選地進一步的處理包括片段中可檢測的標簽，比如熒光團或放射性標簽。
[0044]連接:由其中兩個雙鏈DNA分子共價結合在一起的連接酶催化的酶促反應被稱為連接。通常，兩個DNA鏈共價結合在一起，但也有可能通過化學或酶修飾所述鏈的一個末端阻止了兩個鏈中一個的連接。在那種情況下，共價結合將僅僅出現在兩個DNA鏈的一個中。
[0045]合成寡核苷酸:可以化學合成的、具有優選約10至約50個堿基的單鏈DNA分子被稱為合成寡核苷酸。通常，這些合成DNA分子被設計成具有獨特或期望的核苷酸序列，盡管有可能合成具有相關序列的分子家族，并且其在核苷酸序列內特定位置具有不同的核苷酸組分。術語合成寡核苷酸通常用來指具有設計的或期望的核苷酸序列的DNA分子。
[0046]接頭:具有有限堿基對的短雙鏈DNA分子，例如長度為約10至約30個堿基對，如此設計使其可以連接到限制性片段的末端。接頭通常由兩個具有彼此部分互補的核苷酸序列的合成寡核苷酸組成。當在適當條件下的溶液中混合所述兩個合成寡核苷酸時，它們將彼此退火形成雙鏈結構。在退火后，接頭分子的一個末端被設計成使其適合限制性片段的末端，且可以與其連接；接頭的另一個末端被設計成使其不能連接，但這不必是所述的情況(雙連接的接頭)。
[0047]接頭-連接的限制性片段:已經被接頭封端(capped)的限制性片段。
[0048]引物:通常術語引物指可以啟動DNA合成的DNA鏈。DNA聚合酶不能在沒有引物下新合成DNA:其只能延伸反應中的現有DNA鏈，其中互補鏈用作模板以指導要裝配的核苷酸順序。我們指在聚合酶鏈式反應(PCR)中作為引物的合成寡核苷酸分子。
[0049]DNA擴增:術語DNA擴增典型地用于表示使用PCR體外合成雙鏈DNA分子。請注意，存在其它擴增方法，它們可以用于本發明中而不背離其要旨。
[0050]選擇性雜交:涉及在嚴格的雜交條件下的雜交，在所述雜交條件下，核酸序列雜交至特定核苷酸目標序列比其雜交至非目標核苷酸序列到可檢測的更大程度(例如，至少是背景的2倍)并到基本排除非目標核酸序列的程度。術語“嚴格條件”或“嚴格的雜交條件”包括提到的在其中將探針雜交至其目標序列比雜交至其它序列的可檢測的程度更大(例如，是背景的至少2倍)的條件。嚴格條件是依賴序列的，其在不同的環境中不同。通過控制雜交和/或洗滌條件的嚴格性，可以識別與探針100%互補(同源探測)的目標序列。可選地，可以調節嚴格條件以允許序列中的某些錯配以便檢測到較低的相似度(異源探測)。通常，探針小于約100個核苷酸長度，任選地僅僅50或25個核苷酸長度。典型地，嚴格條件為其中鹽濃度為在PH7.0至8.3下小于約1.5M Na離子，典型地約0.01至1.0MNa離子濃度(或其它鹽)，和對于短探針(例如10至50個核苷酸)溫度為至少約30°C，和對于長探針(例如大于50個核苷酸)溫度為至少約60°C的那些。嚴格條件也可以通過加入不穩定劑(destabilising agent)比如甲酰胺獲得。示例性的低嚴格條件包括在37°C的30至35%甲酰胺、IM NaCl、I %的SDS (十二烷基硫酸鈉)的緩沖溶液中雜交和在50至55°C的I*至2*SSC(20*SSC = 3.0M NaCl/0.3M檸檬酸鈉)洗滌。示例性的中等嚴格條件包括在37°C的40至45%甲酰胺、IM NaClU % SDS中雜交和在55至60°C的0.5*至1*SSC中洗滌。示例性的高嚴格條件包括在37°C的50%甲酰胺、IM NaCl U % SDS中雜交和在60至65°C的0.1*SSC中洗滌。特異性是典型地雜交后洗滌的功能，關鍵因素是后期洗滌溶液的離子強度和溫度。對于DNA-DNA雜交體，Tm可以近似來自Meinkoth和+Wahl, Anal.Biochem.，138:267-284(1984)的等式:Tm = 81.5°C+16.6(log Μ) +0.41(% GC) -0.61(% 甲 酰胺)_500/L ;其中M為一價陽離子的摩爾濃度，％ GC為鳥苷和胞嘧啶核苷酸在DNA中的百分數，％甲酰胺為甲酰胺在雜交溶液中的百分數，和L為堿基對中雜種的長度。Tm為其中50%的互補目標序列雜交至完全匹配的探針的溫度(在確定的離子強度和pH下)。對于1%的錯配，Tm降低了約1°C;因此，可以調節Tm、雜交和/或洗滌條件以雜交到具有期望同一性的序列。例如，如果尋求具有>90%同一性的序列，Tm可以降低10°C。通常，對于特定的序列及其補鏈，在確定的離子強度和PH下，選擇嚴格條件為比熱熔點(Tm)低約5°C。然而，非常嚴格條件可以利用比熱熔點(Tm)低1、2、3或4°C的雜交和/或洗滌；中等嚴格條件可以利用比熱熔點(Tm)低6、7、8、9或10°C的雜交和/或洗滌；低嚴格條件可以利用比熱熔點(Tm)低11、12、13、14、15或20°C的雜交和/或洗滌。使用該等式、雜交和洗滌組合物和期望的Tm，普通技術人員將理解雜交和/或洗滌溶液的嚴格性方面的變化是固有描述的。如果期望的錯配度引起小于45°C (水溶液)或32°C (甲酰胺溶液)的Tm，則優選增加SSC濃度以便可以使用較高的溫度。核酸雜交的廣泛指導可在Ti jssen, LaboratoryTechniques in Biochemistry and Molecular Biology-Hybridisation with NucleicAcid Probes，PartI，2 章“Overview of principles of hybridisation and thestrategy of nucleic acid probe assays"，Elsevier，N.Y.(1993)； 和 CurrentProtocols in Molecular Biology，Chapter2，Ausubel，等，編，Greene Publishing andWiley-1ntersciencej New York(1995)中找到。【專利附圖】

【附圖說明】
[0051] 圖1A:顯示了根據本發明的退火到珠粒(‘454珠粒’)上的片段和用于預擴增兩個胡椒系的引物的序列。‘DNA片段’表示在用限制性核酸內切酶消化后得到的片段，‘主基因接頭’表示為用于產生文庫的(磷酸化的)寡核苷酸引物提供退火位點的接頭，‘KRS’表示標識符序列(標記)，‘454SEQ接頭’表示測序接頭，和‘454PCR接頭’表示允許乳劑擴增(emulsion amplification)DNA片段的接頭。所述PCR接頭允許退火至珠粒和擴增,其可包含3’ -T突出。
[0052]其中，用于預擴增PSP-1l的引物組I
[0053]EOILKRSI 5，-CGTCAGACTGCGTACCAATTCA-3，[SEQ IDl]
[0054]M15KKRS1 5，-TGGTGATGAGTCCTGAGTAACA-3，[SEQ ID2]
[0055]用于預擴增PI201234的引物組II
[0056]E01LKRS2 5， ~CAAGAGACTGCGTACCAATTCA~3， [SEQ ID3]
[0057]M15KKRS2 5，-AGCCGATGAGTCCTGAGTAACA-3，[SEQ ID4]
[0058]圖1B:顯示了用在復雜性降低步驟中的引物示意圖。這樣的引物通常包括如(2)指示的識別位點區域、如(I)指示的可包括標記區的恒定區和如⑶指示的在其3’ -末端的選擇性區域中的一個或多個選擇性核苷酸。
[0059]圖2A和圖2B:顯示了在I %瓊脂糖凝膠上的DNA質量控制。其中，圖2A為短的凝膠電泳；圖2B為長的凝膠電泳。其中，1:1kb梯度；2:樣品1，表示PSPll ；3:樣品2，表示PI201234 ；4:50ng DNA,5:1OOng DNA、6:250ng DNA和 7:500ng DNA分別表示用于評價樣品I 和樣品 2 的 DNA 數量的 50ng、100ng、250ng 和 500ng。
[0060]圖2C和圖2D:顯示了使用Nanodrop分光光度法的DNA濃度測定。其中圖2C是樣品I濃度；圖2D是樣品2濃度。
[0061]圖3A和圖3B:顯示了實施例3的中間體在I %瓊脂糖凝膠上的DNA質量控制。圖3A是短的凝膠電泳，圖中數字表示:Nr.1-4:樣品1、Nr.5-8:樣品2、10: lkb、11:50ng、12:100ng、13:250ng。圖3B是長的凝膠電泳，圖中數字表示:Nr.1-4:樣品1、Nr.5-8:樣品2、10:lkb ；ll:50ng ；12:1OOng ;13:250ng。
[0062]圖4A和圖4B:其中，圖4A顯示了序列數據加工流水線的流程圖，即自測序數據產生到推定的SNP、SSR和indel的鑒定的步驟，經由在整理&標記中除去已知序列信息的步驟，通過該步驟得到整理的序列數據在聚簇分析和裝配所述數據以得到重疊群和單元素(重疊群中不能裝配的片段)后鑒定和評價推定的多態性。圖4B進一步詳述了采集(mining)多態性的方法，包括多態性采集和質量分配過程。
[0063]圖5:顯示了包含推定的單核苷酸多態性(SNP)的胡椒AFLP片段序列的多重對比“10037_CL989contig2”。請注意，SNP (用黑箭頭表示)由存在于樣品I (PSPll)的兩個閱讀(read)中的A等位基因和樣品2 (PI201234)中存在的G等位基因定義，樣品I由名為頂端兩個閱讀的MSl標記的存在表示，樣品2由名為底端兩個閱讀的MS2標記的存在表示。閱讀名稱顯示在左面。該多重對比的共有序列為(5，-3’ ):
[0064]TAACACGACTTTGAACAAACCCAAACTCCCCCAATCGATTTCAAACCTA GAACA[A/G]TGTTGGTTTTGGTGCTAACTTCAACCCCACTACTGTTTTGCTCT ATTTTTG。[0065]圖6:顯示了基于觀察到的每個基因座的閱讀的數量的454基因型正確分類概率的圖示。
【具體實施方式】
[0066]在第一個方面，本發明涉及用于高通量發現、檢測和大規模基因分型一個或多個樣品中一種或多種遺傳標記的方法，其包括下述步驟:
[0067](a)提供來自一種或多種樣品的DNA ；
[0068](b)用至少一種限制性內切酶限制DNA以產生限制性片段；
[0069](c)連接接頭與限制性片段，產生接頭-連接的限制性片段；
[0070](d)任選地，用至少與接頭互補的引物對擴增接頭-連接的限制性片段，產生預擴增的接頭-連接的限制性片段；
[0071](e)用引物對擴增(任選地預擴增的)接頭-連接的限制性片段，其中至少一個引物包含在引物5’端的標識符標記，以為每個樣品產生接頭-連接的限制性片段的標記擴增亞型文庫；[0072](f)任選地，集中來源于多個樣品的文庫；
[0073](g)使用高通量測序技術測序該文庫；
[0074](h)使用標識符標記聚簇分析每個文庫的序列；
[0075](i)通過比較文庫內和/或文庫之間聚簇分析的序列鑒定遺傳標記。
[0076](j)測定一個或多個文庫中遺傳標記的(共)顯性的基因型，優選地對于所有的樣品和對于所有鑒定的標記。
[0077]所述方法涉及發現、檢測和基因分型一個或多個樣品中的一個或多個遺傳標記。在某些實施方案中，所述方法涉及目標遺傳標記的有/沒有評分。在某些實施方案中，所述方法涉及測定一個或多個樣品的(共)顯性的基因型的一個或多個遺傳標記。這可能需要標準化觀察到的樣品之間標記-或標記等位基因序列的數量。
[0078]在所述方法的第一個步驟(a)中，提供DNA。這可通過本領域本身已知的方法完成。通常使用本領域常見的方法獲得DNA的分離，所述方法比如從種群成員收集組織、DNA萃取(例如使用Q-Biogene快速DNA試劑盒)、定量和標準化以獲得每種試樣等量的DNA。所述DNA可以來自各種來源(基因組、RNA、cDNA、BAc、YAC等)和生物體(人類、哺乳動物、植物、微生物等)。可以混合集中分離的DNA。
[0079]所述DNA在步驟(b)中使用至少一種限制性核酸內切酶限制。根據情況，即基因組的大小，可以使用更多的核酸內切酶。在某些實施方案中，可以使用兩種或多種核酸內切酶。對于大多數基因組，2種核酸內切酶足夠了，因此，2種是最優選的。在某些實施方案中，特別是對于大的或復雜的基因組，可以使用更多核酸內切酶。優選地，核酸內切酶提供約為250-500bp的相對短的限制性片段，但這不是必需的。典型地，至少一種常見切割核酸內切酶是優選的，即具有4或5個堿基對識別序列的核酸內切酶是優選的。一種這樣的酶是Msel，但大量其他的是市售可獲得的，且可以使用。可以使用切割其識別序列外部的酶(Hs類型)，或者提供平末端限制性片段的酶。優選的組合使用一種少見的出個和更多個堿基對識別序列，例如EcoRI)和一種常見的切割酶。
[0080]在限制所述混合集中的DNA后或者與其同時，將接頭連接至所述限制性片段以提供接頭-連接的限制性片段。可以使用一個或多個不同的接頭，例如兩個接頭，一個正向接頭，一個反向接頭。可選地，對于所有的片段可以使用一個接頭，或者可以使用一組接頭，其在所述接頭的突出端包含核苷酸變換以便提供索引接頭(indexing linkers),其可允許用于預選擇步驟(Unrau等,Gene, 1994,145,163-169)。可選地,在平末端限制片段的情況下，可以使用平末端接頭。接頭-連接是本領域所熟知的，且尤其公開在EP534858中。AFLP技術的一個有用的變體使用非選擇性核苷酸(即+0/+0引物)，其有時稱為接頭PCR。如同Salsa PCR—樣，通過利用限制性內切酶提供選擇步驟，不同的限制性內切酶獲得不同的亞型。這有時也表示為預擴增，其中使用至少與所述接頭互補且任選地也與所述限制性核酸內切酶的識別序列剩余部分互補的引物。預擴增可有助于(進一步)標準化來自各個樣品的DNA的量，或增加DNA的總量以允許多種分析(即分開樣品)和增加信噪比。預擴增也可用于引入允許在選擇性擴增之前混合集中的標記。通過在引物的5’末端引入核苷酸標記(例如4bp)，可以標記用于不同樣品的限制性片段，并且在該過程結束時可以通過使用標記來檢索。
[0081]在任選的預擴增之后，在本發明方法的步驟(d)中用一對引物擴增接頭-連接的限制性片段。引物之一與所述接頭的至少部分互補，且可進一步與所述核酸內切酶的識別序列剩余的部分互補，和可進一步包含在其3’末端的(隨機選擇的)選擇性核苷酸，與在EP534858中公開的類似 。優選地，所述引物能夠在嚴格雜交條件下選擇性雜交。與上述類似，所述選擇性擴增也可以用載有5’標記的引物進行，以鑒別所述樣品的來源。結果是擴增的接頭-連接的限制性片段的(標記的)亞型的文庫。
[0082]此時，可以任選地混合集中由多個樣品制備的文庫中的選擇性擴增的片段。這可能對尋求對某些組的樣品特異性的標記有用，比如共享某些表型特征的那些。篩選混合集中的樣品通常稱為分組分析法(BSA ；Michelmore, Paran和Kesseli, 1991)。在某些實施方案中，還可以在采樣階段的DNA提取之前進行混合集中，減少DNA制品的數量。在PCR擴增之前，DNA的混合集中進一步有助于標準化DNA，以提供在用于測序文庫中更平等的表示法(representation)。
[0083]現在，使用高通量測序技術測序選擇性擴增的接頭-連接的限制性片段的，任選混合集中的文庫。
[0084]測序可以基本上通過本領域已知的任何方法進行，所述方法比如雙脫氧鏈終止法(Sanger測序)。然而，優選和更有利地是使用高通量測序方法進行測序，比如在 W003/004690, W003/054142、W02004/069849, W02004/070005, W02004/070007 和W02005/003375(所有的名稱都為 454Life Sciences)、Seo 等，(2004) Proc.Natl.Acad.Sc1.USAlOl: 5488-93中公開的方法和Helios, Solexa,美國基因組學的技術等，將其引入本文作為參考。最優選的是使用在W003/004690、W003/054142、W02004/069849、W02004/070005, W02004/070007 和 W02005/003375 (所有的名稱都為 454Life Sciences)中公開的裝置和/或方法進行，將其引入本文作為參考。目前公開的技術允許在單次運行中測序至多4千萬個堿基，其比基于Sanger測序和使用現用的毛細管電泳儀器比如MegaBACE (GE Healthcare)或 ABI3700(xl) (Applied Biosystems)的競爭性技術快 100 倍和更加便宜。這將隨著每次反應的閱讀長度增加和/或平行反應次數增加而增加。所述測序技術大致包括下述5個步驟:1)片段化DNA和連接特定的接頭，以建立單鏈DNA(ssDNA)的文庫；2)退火ssDNA至珠粒，在油包水型微型反應器中乳化該珠粒，并進行乳劑PCR以擴增在珠粒上的單個ssDNA分子；3)選擇/富集包含在其表面的擴增的ssDNA分子的珠粒；4)在PicoThcfPhm中沉積載有DNA的珠粒；和5)通過產生焦磷酸鹽光信號同時在100，000個池中測序。
[0085]在優選的實施方案中，所述測序包括下述步驟:
[0086](I)退火測序-接頭-連接的片段至珠粒，用單個片段退火每個珠粒；
[0087](2)在油包水型微反應器中乳化所述珠粒，每個油包水型微反應器包括單個珠粒;
[0088](3)進行乳劑PCR以擴增在珠粒表面上的接頭-連接的片段；
[0089](4)選擇/富集包含擴增的接頭-連接的片段的珠粒；
[0090](5)將所述珠粒裝填在池中，每個池包括單個珠粒；和
[0091](6)產生焦磷酸鹽信號。
[0092]在第一個步驟(1)中，將存在于所述接頭連接的限制性片段中的接頭退火到珠粒。如本文上述公開的，測序接頭包括至少用于退火至珠粒的“關鍵”區域、測序引物區域和PCR引物區域。特別地，現在，擴增的接頭-連接的限制性片段在其一個末端包含下述序列:5’ -序列引物結合位點一標記一PCR引物序列_3’，而在其另一個末端存在可以是如下的片段:5’ -珠粒 退火序列一標記一接頭特定的序列一限制性位點-特定的序列(任選的)一(隨機)選擇性序列(任選的)_3’。清楚地，序列引物結合位點和珠粒退火序列可以互換。現在，可以使用該珠粒退火序列退火片段至珠粒，該珠粒在該末端載有核苷酸序列。
[0093]因此，將修改的片段退火至珠粒，用單個修改的片段退火每個珠粒。向修改的片段的池中加入過量的珠粒以確保對于大多數珠粒而言每個珠粒有單個修改的片段退火(泊松分布)。.[0094]在優選的實施方案中，為了進一步增加篩選的效率，將PCR產物直接擴增到用于測序的珠粒上是有益的。這可以用接頭-加尾的PCR引物進行PCR來實現，所述PCR引物中在MseI (或其它限制性內切酶)側的接頭的一個鏈與結合至所述序列珠粒的寡核苷酸互補。
[0095]在下一步中，在油包水型微型反應器中乳化所述珠粒，每個油包水型微型反應器包括單個珠粒。PCR試劑存在于油包水型微型反應器中，使得PCR反應在微型反應器內發生。接著，破壞所述微型反應器，并富集包括DNA的珠粒(DNA陽性珠粒)。
[0096]在下一步中，將所述珠粒裝填到池中，每個池包括單個珠粒。所述池優選地為PiC0TiterTMPlate的一部分，其允許同時測序大量的片段。
[0097]在加入載有酶的珠粒后，使用焦磷酸測序確定所述片段的序列。在連續步驟中，在存在常規測序劑下，使PicoTiter? Plate和所述珠粒以及其中的酶珠粒接受不同的脫氧核糖核苷酸，和在加入脫氧核糖核苷酸時，產生被記錄的光信號。加入正確的核苷酸將產生可以檢測到的焦磷酸測序信號。
[0098]焦磷酸測序本身是本領域已知的，且特別地公開在www.biotagebi0.com ；www.pyrosequencing.com/section technology 中。所述技術進一步應用在如 W003/004690、W003/054142、W02004/069849, W02004/070005, W02004/070007 和 TO2005/003375 (所有的名稱都為454Life Sciences)中，將其引入本文作為參考。
[0099]在測序后，可以整理從所述測序步驟中直接獲得的片段的序列，優選電子的，以除去任何珠粒退火序列、測序引物、接頭或引物-相關的序列信息。
[0100]典型地，在已經為任何加入的接頭/引物序列進行整理的序列數據上進行比對或聚簇分析，即，僅僅使用來源于所述核酸樣品的片段的序列數據和任選的標識符標記。
[0101]用于比較目的的比對序列的方法是本領域熟知的。各種程序和比對算法公開在:Smith and Waterman (1981) Adv.Appl.Math.2:482 ；Needleman and Wunsch (1970)J.Mo 1.Biol.48: 443 ; Pear son and Lipman (1988) Proc.Natl.Acad.Sc1.USA85: 2444 ；Higgins and Sharp(1988)Gene73:237-244 ；Higgins and Sharp (1989)CAB10S5:151-153 ；Corpet 等,(1988) Nucl.Acids Res.16:10881-90 ;Huang 等,(1992) Computer Appl.1n theBiosc1.8:155-65 ;和 Pearson 等，(1994)Meth.Mol.Biol.24:307-31，將其引入本文作為參考。Altschul等，(1994)Nature Genet.6:119-29 (引入本文作為參考)給出了序列比對方法和同源性計算的詳細說明。
[0102]NCBI 基本局部比對搜索工具(Basic Local Alignment Search Tool)(BLAST) (Altschul等人，1990)可以從幾個來源獲得，包括國家生物信息中心(NCBI, Bethesda, Md.)和因特網，用于與序列分析程序 blastp、blastn、blastx、tblastn 和tblastx相聯系。其可以從<http://www.ncb1.nlm.nih.gov/BLAST/>進入。如何使用該程序測定序列同一性的說明在
[0103]<http://www.ncb1.nlm.nih.gov/BLAST/blast_help.html> 可獲得。所述數據庫優選地包括EST序列，目標種類的基因組序列和/或GenBank的非冗余序列數據庫或類似的序列數據庫。
[0104]可以如Shendure 等，Science, Vol309, Issue5741,1728-1732 公開的使用高通量測序方法。其實例為微電泳測序、雜交測序/通過雜交測序(SBH)、對擴增分子的環狀陣列測序、對單分子的環狀-陣列測序，非環狀、單分子、實時方法，比如聚合酶測序、核酸外切酶測序、納米通道(nanopore)測序。
[0105]現在可以確定遺傳標記和/或對于遺傳標記的樣品的基因分型在所述文庫中的存在。
[0106]本發明的方法可用于鑒定、檢測基因型測定AFLP標記以及用于鑒定、檢測和基因分型包含在恒定的條帶中的SNP標記。
[0107]為了提供解決抽樣差異問題的方法，該問題影響通過測序包含在多個片段文庫中的等位(標記)片段來基因分型遺傳標記的準確度，本發明人已發現優選地用足夠的冗余度(深度)經由測序進行檢測AFLP標記以采樣所有擴增的片段至少一次，并通過統計學方式完成，其糾正了與所謂的基因分型的準確度有關的抽樣變異的問題。而且，正如AFLP評分一樣，在分離群體的內容中，在一個實驗中同時評分母體個體將有助于測定統計學閾值，因為樣品中所有可能的等位基因將以母體I或母體2評分。值得注意的是提出了抽樣母體個體比分離群體的個體具有更高的冗余度。
[0108]因此，在某些實施方案中，所述標記的擴增的接頭-連接的限制性片段的冗余度為至少6，優選至少7，更優選至少8和最優選至少9。在某些實施方案中，測定每個接頭-連接的限制性片段的序列至少6倍，優選至少7倍，更優選至少8倍和最優選至少9倍(fold)。在某些實施方案中，如此選擇冗余度，假定正確鑒定所述基因座恰是純合的為50/50的全部概率，則正確識別所述基因座的概率大于95%、96 %、97%、98 %、99 %、99.5%。
[0109]在某些實施方案中，樣品的數量可以在I至100000間改變，這也主要取決于要分析的基因組的大小和選擇性擴增片段的數量。通常，采用的測序技術的容量提供了在這方面最主要的限制因素。
[0110]實施例
[0111]如下例證所述方法:
[0112]I)根據Vos等人修改的試驗設計制備AFLP模板，所述試驗設計包括在限制和連接步驟之間在80°C熱變性20分鐘的步驟。在80°C孵育20分鐘后，將限制性內切酶消化物冷卻至室溫，加入DNA連接酶。所述變性步驟引起限制性片段的互補鏈分離成至多120bp，以使沒有接頭連接至末端。結果，小于120bp的片段不會被擴增，因而實現了尺寸選擇。
[0113]2)如果適用，如在常規AFLP中一樣進行預擴增反應。
[0114]3)使用具有獨特標識符標記的AFLP引物對在種群/實驗中的每個樣品進行最后的(選擇性)擴增步驟，(使用獨特4bp標識符序列:KIS)。所述KIS位于選擇性AFLP引物的5’末端。與在用電泳的常規AFLP檢測中所用的選擇性堿基的數量相比較，使用一種額外的選擇性核苷酸，例如在胡椒中，EcoRI/Msel的指紋圖譜為+4/+3 (凝膠檢測+3/+3)和在玉米中，EcoRI/Msel的指紋圖譜為+4/+4(凝膠檢測+4/+3)。需要用經驗確定采用的選擇性核苷酸的數量；因此，可以使用與用于凝膠檢測的選擇性核苷酸相同數量的選擇性核苷酸。該數量進一步取決于包括在實驗中的樣品的數量，因為按測序技術的當前現狀，序列跡線的數量假定為固定在 200，000，但這可以和可能增加。優選的起始點將獲得每種試樣文庫的AFLP片段的10倍采樣。
[0115]4)使根據步驟1-4制備的樣品的集合進行經由454Life Sciences技術的測序。這是指個體AFLP片段在珠粒上克隆、PCR擴增和測序。預期產出200，000個IOObp長度的序列。對于100個樣品的集合，這等于平均2000個序列跡線/樣品，可經由5’標記追蹤樣pin nr ο
[0116]5)假定當與凝膠檢測使用的數目相比使用I個額外的選擇性核苷酸時，每個PC擴增100個AFLP片段，其中百分之九十是恒定的條帶，以每個片段20倍平均冗余度采樣AFLP片段。然而，因為測序是不定向的且大多數條帶為>200bp，對于各個片段末端，測序冗余度將稍高于10倍。
[0117]6)使用KRS標記聚簇分析每個試樣的所有序列。給出10倍過量的抽樣，這是指對于每種試樣預期200個不同的序列跡線,代表200x100bp = 20kb序列/樣品。當這些序列的百分之十來源于AFLP標記(即擴增I個等位基因，另一種在PCR反應中不存在)時，百分之九十(18kb)的序列來源于恒定的條帶。
[0118]7)評分兩個類型的遺傳標記:
[0119]A)AFLP標記:這些是在一些樣品中觀察到，但在其他樣品中不存在的序列。
[0120]對樣品集合中序列頻率的檢查將揭示出該種類。根據在每個樣品中存在/不存在這些序列的觀察進行顯性的評分。AFLP標記的可靠評分需要設定用其在試驗中觀察其它AFLP序列的頻率的統計學閾值。即，如果在樣品中觀察到AFLP標記序列，則可以評分AFLP標記存在(顯性基因)，但不存在評分的可靠性取決于(恒定的)AFLP片段的(平均)頻率。需要統計學閾值水平，以便進行存在/不存在評分，其具有優選至少99.5%的準確度，取決于特定應用需要的可接受的水平。如果分析分離的種群及其母體，也可以通過定義所述標記序列的頻率種類來共顯性評分這些標記。后者可能實際上受到樣品之間不同的AFLP標記的抽樣變異的影響而變得復雜。
[0121]B)在恒定的AFLP片段中的(SN)多態性
[0122]這是最感興趣的(和大量的)遺傳標記的種類。主要的是將包含在恒定的AFLP片段內部序列中的SNP標記作為共顯性SNP標記評分。再次，這優選地需要應用用于精確地點出存在或不存在等位基因的統計學閾水平。預期所述片段文庫的10倍序列冗余度是足夠的，但依賴于觀察到的各個等位基因序列數量，需要統計分析法來確定SNP標記基因型的準確度。其基本原理 是，當恒定的條帶包含SNP且觀察到一種等位基因例如5次，同時沒有觀察到(所述序列包含)其它等位基因時，高度可能的是所述樣品對觀察的等位基因是純合的。因此，當觀察到兩個等位基因時，該樣品被評分為對于SNP標記是雜合的，與其頻率無關。
[0123]8)結果將是基因分型表，其包含(共)顯性評分的AFLP標記和共顯性評分的SNP的基因型，和用于校正所有標記的基因型的概率。可選地，產生數據集，其包含超過設定的統計學閾水平的基因型。
[0124]所述方法假定每種試樣10倍過量的AFLP片段采樣，獲得18kb的恒定序列/樣品和2kb的AFLP標記序列。
[0125]觀察到的遺傳標記的數量取決于研究的種質中的SNP比率。下面，以不同種質的SNP比率提供當采樣20kb序列時，估計的遺傳標記數量。AFLP標記/片段的平均長度假定為 200bp:
[0126]表1、通過使用454Life sciences技術測序AFLP片段評分的遺傳標記的期望數目，假定10倍過量的采樣量、200000個序列跡線、百分之九十恒定的條帶/百分之十AFLP標記，在各種SNP比率。
[0127]
【權利要求】
1.高通量發現、檢測和基因分型一個或多個樣品中一種或多種遺傳標記的方法，包括下述步驟: a)提供來自一種或多種樣品的DNA； b)用至少一種限制性內切酶限制DNA以產生限制性片段； c)連接接頭與限制性片段，產生接頭-連接的限制性片段； d)任選地，用與接頭互補的引物對擴增接頭-連接的限制性片段，產生預擴增的接頭_連接的限制性片段； e)用引物對擴增，任選地預擴增的，接頭-連接的限制性片段，其中至少一個引物包含在引物5’端的標識符標記，產生針對每個樣品的接頭連接的限制性片段的標記的擴增亞型的文庫； f)任選地，混合集中該文庫； g)使用高通量測序技術測序該文庫； h)使用標識符標記聚簇分析每個文庫的序列； i)鑒定文庫內和/或文庫之間的遺傳標記； j)測定一個或多個文庫中遺傳標記的顯性基因分型和/或共顯性基因分型。
2.根據權利要求1所述的方法，其中遺傳標記為AFLP標記或SNP標記。
3.根據權利要求1或2所述的方法，其中測序基于合成的測序，優選焦磷酸測序。
4.根據權利要求1-3所述的方法，其中測序在固體載體如珠粒上進行的。
5.根據權利要求1-4所述的方法，其中測序包括下述步驟: -退火擴增的接頭-連接的限制性片段至珠粒，每個珠粒同單個接頭-連接的片段退火； -在油包水型微型反應器中乳化珠粒；每個油包水型微型反應器包括單個珠粒； -進行乳劑PCR以在珠粒表面上擴增接頭-連接的限制性片段； -將珠粒裝填在池中，每個池包括單個珠粒；和 -產生焦磷酸鹽信號。
6.根據權利要求1-4所述的方法，其中標記的擴增的接頭-連接的限制性片段的平均冗余度為至少6，優選至少7，更優選至少8和最優選至少9。
7.根據權利要求1-5所述的方法，其中測定每個接頭-連接的限制性片段的序列至少6倍，優選至少7倍，更優選至少8倍和最優選至少9倍。
8.根據權利要求1-6所述的方法，其中在內切核苷酸酶限制和接頭連接之間，通過變性步驟進行大小選擇。
9.根據權利要求1-8所述的方法，其中0嫩選自基因組0嫩、1?應、00嫩、8408、￥408、整體基因組擴增的DNA或PCR產物。
10.根據權利要求1-9所述的方法，其中接頭為雙鏈的合成寡核苷酸接頭，其具有一個適合于限制性片段的一個末端或兩個末端的末端。
11.根據權利要求1-10所述的方法，其中DNA被兩個、優選三個或更多個限制性內切酶限制。
12.根據權利要求1-11所述的方法，其中DNA被兩個限制性內切酶限制。
13.根據權利要求1-2所 述的方法，其中至少一個限制性內切酶是稀有的切割酶。
14.根據權利要求1-13所述的方法，其中至少一個限制性內切酶為常見切割酶。
15.根據權利要求1-14所述的方法，其中引物包含I至10個，優選隨機地選自A、C、T或G，選擇性核苷酸，更優選I至5個核苷酸。
16.根據前述權利要求任一項所述的方法，其中使用三個或更多個限制性內切酶的組合限制DNA。
17.如上述權利要求任一項所定義的方法用于AFLP和/或SNP標記序列的共顯性評分的用途。
18.高通量測序方法的用途，其用于檢測如在上述方法權利要求任一項中定義的方法中的多態性、基因分型目的包括遺傳作圖、QTL定位、精細定位基因/特性、連鎖不平衡作圖、標記輔助的反交、遺傳距離分析、發現與特性或表型有關的標記、診斷患者樣品的基因分型等。
【文檔編號】C12Q1/68GK103937899SQ201410177894
【公開日】2014年7月23日 申請日期:2006年12月20日 優先權日:2005年12月22日
【發明者】M·J·T·范艾克, A·P·索倫森, M·G·M·范施里克 申請人:凱津公司