用于刺參腐皮綜合癥早期診斷的分子標記物及其擴增引物和應用的制作方法
【專利摘要】本發明公開了用于刺參腐皮綜合癥早期診斷的分子標記物及其擴增引物和應用，特點是分子標記物miR-137的核苷酸序列為SEQIDNO.1所示，分子標記物miR-2008的核苷酸序列為SEQIDNO.2所示，擴增miR-137基因片段的正向引物的核苷酸序列為：SEQIDNO.3所示，擴增miR-2008基因片段的正向引物的核苷酸序列為SEQIDNO.5所示，擴增RNU6B內參基因的正向引物的核苷酸序列為SEQIDNO.6所示，診斷刺參發病的方法為總RNA的提取、cDNA合成、PCR擴增和鑒定，優點是為刺參腐皮綜合癥的治療提供指導，實現刺參腐皮綜合癥的早診斷、早治療。
【專利說明】用于刺參腐皮綜合癥早期診斷的分子標記物及其擴增引物和應用
【技術領域】
[0001]本發明涉及生物檢測領域，尤其是涉及用于刺參腐皮綜合癥早期診斷的分子標記物及其擴增引物和應用。
【背景技術】
[0002]刺參(SiicAjaponicus Selenka)隸屬于棘皮動物門，刺參綱,楣手目，俗稱海老鼠和海黃瓜。主要分布在我國大連、北戴河、山東半島、江蘇連云港及平山島等沿海。伴隨著刺參養殖產業的發展，以腐皮綜合癥為代表的病害問題逐漸成為制約產業發展的重要瓶頸。據不完全統計，2004-2013年由于病害造成的刺參產業經濟損失每年30-40億元。因此，構建以新型疾病響應分子標記物為核心的疾病預警系統是提高刺參產業經濟效益的前題，是開展分子診療的基礎。
[0003]microRNA (miRNA)是一類高度保守的，長約22nt的非編碼小分子RNA，這類小分子廣泛存在于動植物中并參與了包括細胞增殖、分化、凋亡以及免疫調節等在內的多種生物學過程。miRNA可通過在轉錄或轉錄后水平上調控基因的表達來實現其相應的生物學功能，在多種疾病的發生和發展過程中扮演了極其重要的角色，因此，miRNA不但可以成為預測某些疾病發生的分子標記物而且還有可能成為治療某些疾病的分子靶點。越來越多的研究證明，miRNA作為一種調控因子其表達水平的改變和多種疾病過程相關，目前以miRNA作為分子標記物的檢測手段已被廣泛應用于肺癌、乳腺癌以及糖尿病等疾病的早期診斷中。
[0004]刺參腐皮綜合癥由于其發病率高、傳染快速、死亡率高且病原復雜等特征，使其難以得到快速的診斷和治療，因此通過方便快捷的現代生物學技術檢測來診斷刺參腐皮綜合癥具有重要意義。目前，國內外還沒有公開任何關于利用miRNA分子作為刺參腐皮綜合癥發病早期預測或診斷的分子標記物來診斷刺參腐皮綜合癥的相關研究報道。

【發明內容】

[0005]本發明所要解決的技術問題是提供一種利用miRNA分子作為刺參腐皮綜合癥發病早期診斷的分子標記物，并提供用于刺參腐皮綜合癥發病早期診斷的分子標記物擴增引物。本發明還提供了利用該分子標記快速預警刺參腐皮綜合癥發生的方法。
[0006]本發明解決上述技術問題所采用的技術方案為:一種用于刺參腐皮綜合癥早期診斷的分子標記物，所述的分子標記物的基因片段如下:分子標記物miR-137基因片段的核苷酸序列為5’ -UAUUGCUUGAGAAUACACGUAG-3’，分子標記物miR-2008基因片段的核苷酸序列為 5’ -AUCAGCCUCGCUGUCAAUACG-3’。
[0007]擴增權利要求1所述的miR-137基因片段的正向引物的核苷酸序列為:5’ -TATTGCTTGAGAATACACGTAG-3’，擴增權利要求1所述的miR-2008基因片段的正向引物的核苷酸序列為:5’ -ATCAGCCTCGCTGTCAATACG-3，擴增RNU6B內參基因的正向引物的核苷酸序列為:5’ -CGTGAAGCGTTCCATATTTTAA-3’。[0008]一種用于刺參腐皮綜合癥早期診斷的試劑盒，包括權利要求2所述的擴增miR-137 基因片段的正向引物:5’ -TATTGCTTGAGAATACACGTAG-3 ’、擴增 miR-2008 基因片段的正向引物:5 ’ -ATCAGCCTCGCTGTCAATACG-3以及擴增RNU6B內參基因的正向引物:5’ -CGTGAAGCGTTCCATATTTTAA-3’。
[0009]一種刺參腐皮綜合癥早期診斷的分子標記物的檢測方法，步驟如下:
a、總RNA的提取:取刺參體腔液1.0mL,800g離心5min,收集血細胞,加入RNAiso-plus試劑(購于Takara公司)1.0mL,震蕩混勻，室溫放置5min，再加入0.2mL氯仿，震蕩混勻，室溫靜置10min，4°C，12000rpm，離心15min，吸取上清至PE管中，加入該上清等體積的異丙醇，混勻，室溫靜置5min，4°C，12000rpm，離心10min，去上清，在沉淀中加入質量百分濃度為75%的乙醇lmL，4°C,12000rpm,離心5min，去上清，沉淀靜置5-lOmin，加20 μ L無RNA酶水，得到RNA提取液；
b、cDNA合成:取500ng上述RNA提取液用miScript反轉錄試劑盒(Qiagen,Germany)合成，得到cDNA，具體合成方法依cDNA合成試劑盒說明書進行；
c、PCR擴增:利用 miScript SYBR Green PCR 試劑盒進行(Qiagen, Germany),20ul擴增體系:SYBR Green混合液10.0ul，引物溶液Iul，cDNA溶液Iul，ddH20補充至 20ul ;擴增反應條件:95 0C 15 min，94 °C 15s, 60 °C 30s, 70 °C 30s,共 40 個循環，反應完成后進行熔解曲線分析；其中引物溶液包括擴增miR-137基因片段的正向引物:5’ -TATTGCTTGAGAATACACGTAG-3’，擴增miR-2008基因片段的正向引物:5’-ATCAGCCTCGCTGTCAATACG-3’、擴增miR-137基因片段和miR-2008基因片段的反向引物為通用引物，各引物濃度均為10uM，內參基因為RNU6B，擴增RNU6B內參基因用正向引物為5，-CGTGAAGCGTTCCATATTTTAA-3 ’，反向引物為通用引物；
d、鑒定:擴增完成后，利用方法分析基因表達量，若miR-137基因片段和miR-2008基因片段同時高水平表達，且表達倍數高于2.3則認為刺參處于腐皮綜合癥發病早期。
[0010]與現有技術相比，本發明的優點在于:本發明首次公開了一種預警刺參腐皮綜合癥的分子標記物及其疾病快速診斷應用，其中分子標記物為rniR-137、miR-2008和RNU6B內參基因以及擴増miR-137、miR-2008和RNU6B的正向引物；診斷刺參發病的方法為總RNA的提取、cDNA合成、PCR擴增和鑒定，鑒定快速、簡便、特異和有效，若兩種miRNA同時高水平表達且表達倍數達到2.3，則斷定改刺參處于發病早期，為腐皮綜合癥的治療提供指導，實現刺參腐皮綜合癥的早診斷、早治療，提高刺參的養殖效益，降低刺參腐皮綜合癥的危害。該標記物的發掘和應用為養殖刺參經濟效益提升，良種的快速篩選試劑盒的研發提供了可能，為進一步認識刺參腐皮綜合癥的發生機制和分子設計育種奠定了基礎。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0011]圖1為PCR擴增獲得的miR-137基因片段的溶解曲線圖；
圖2為PCR擴增獲得的miR-2008基因片段的溶解曲線圖。
【具體實施方式】
[0012]以下結合附圖實施例對本發明作進一步詳細描述。[0013]實施例1
刺參腐皮綜合癥發生指示分子標記物miR-137和miR-2008的篩選:2011年10月于遼寧省普蘭店某室內刺參養殖場采集腐皮綜合癥發病刺參個體30個，健康個體30個，分別獲取體腔液10.0mL, 800g離心5min,收集體腔細胞。利用Ambion公司的mirVana miRNA分離試劑盒純化miRNA，交由上海晶能生物科技有限公司完成miRNA文庫的構建和illuminaHiseq2000測序平臺的單端50bp測序模式的高通量測序分析。經低質量序列去除、miRBase比對、參考基因組和Rfam數據庫比對，獲得了包含miR-137和miR-2008序列在內的多個miRNA序列。
[0014]刺參腐皮綜合癥發生指示分子標記物miR-137和miR-2008的鑒定:2012年2年從山東威海采集自然發病的刺參樣品10只，健康樣品10只，采用定量PCR技術分析了miR-137和miR-2008的表達水平。結果表明:與健康個體相比，發病刺參個體miR-137和miR-2008表達水平上調3.2倍以上，證實miR-137和miR-2008是指示刺參腐皮綜合癥發生的理想分子標記物。上述分子標記物miR-137基因片段的核苷酸序列如SEQ ID N0.1所示:5’ -UAUUGCUUGAGAAUACACGUAG-3’，分子標記物miR-2008基因片段的核苷酸序列如SEQID N0.2所示:5’ -AUCAGCCUCGCUGUCAAUACG-3’。其中RNU6B內參基因的核苷酸序列如SEQID N0.3 所示:5’ -CGUGAAGCGUUCCAUAUUUUAA-3’。
[0015]實施例2
擴增上述實施例1的miR-137基因片段的正向引物的核苷酸序列如SEQ ID N0.4所示:5’ -TATTGCTTGAGAATACACGTAG-3’，擴增上述實施例1的miR-2008基因片段的正向引物的核苷酸序列如SEQ ID N0.5所示:5’-ATCAGCCTCGCTGTCAATACG-3，擴增上述實施例1的RNU6B內參基因的正向引物的核苷酸序列如SEQ ID N0.6所示:5’-CGTGAAGCGTTCCATATTTTAA-3’。在進行實時熒光定量分析miR-137基因片段和miR-2008基因片段表達水平時，我們隨機選擇3個刺參樣品進行。PCR結束后記錄觀察miR-137基因片段的溶解曲線(圖1)和miR-2008基因片段的溶解曲線(圖2)。溶解曲線為單峰圖則表明擴增產物為特異性擴增。隨后將擴增產物與PMD-18T載體(Takara，中國)連接，連接產物轉化感受態大腸桿菌ToplOF’，過夜培養，挑取單克隆10個，利用載體引物篩選陽性克隆送上海Invitrogen公司測序。測序結果經生物信息學分析，證實為刺參miR-137基因片段和miR-2008基因片段序列，表明反應的特異性。
[0016]實施例3
2012年3月，從寧波市奉化市博旺水產養殖有限公司中采集到發病刺參個體5只，未發病個體5只，采用下述方法驗證試劑盒檢測效率:
a、總RNA的提取:分別取刺參體腔液1.0mL, 800g離心5min，收集血細胞，加入RNAiso-plus試劑(購于Takara公司)1.0mL,震蕩混勻，室溫放置5min,再加入0.2mL氯仿，震蕩混勻，室溫靜置10min，4°C，12000rpm，離心15min，吸取上清至PE管中，加入該上清等體積的異丙醇，混勻，室溫靜置5min, 4°C, 12000rpm,離心10min,去上清,在沉淀中加入質量百分濃度75%的乙醇lmL，4°C,12000rpm,離心5min，去上清，沉淀靜置5-10min，加20 μ L無RNA酶水，得到RNA提取液；
b、cDNA合成:取500ng總RNA的上述提取液用miScript反轉錄試劑盒(Qiagen,Germany)合成,得到cDNA,具體合成方法依cDNA合成試劑盒說明書進行；C、PCR 擴增:利用 miScript SYBR Green PCR 試劑盒進行(貨號 218193，Qiagen 公司，Germany), 20ul擴增體系:SYBR Green混合液10.0ul,引物溶液lul, cDNA溶液Iul，ddH20 補充至 20ul ;擴增反應條件:95 °C 15min，94°C 15s, 60 °C 30s, 70 °C 30s,共40個循環，反應完成后進行熔解曲線分析；其中引物溶液包括擴增miR-137基因片段的正向引物:5’ -TATTGCTTGAGAATACACGTAG-3’，擴增miR-2008基因片段的正向引物:5’ -ATCAGCCTCGCTGTCAATACG-3’、擴增 miR-137 基因片段和 miR-2008 基因片段的反向引物為通用引物(核苷酸序列如SEQ ID N0.7所示:GAATCGAGCACCAGTTACGCATG),各引物濃度均為10uM，內參基因為RNU6B，擴增RNU6B內參基因用正向引物為5’ -CGTGAAGCGTTCCATATTTTAA-3’，反向引物為通用引物(核苷酸序列如SEQ ID N0.7所示:GAATCGAGCACCAGTTACGCATG)；
d、鑒定:擴增完成后，利用2_ΛΛετ方法分析基因表達量，其中發病組5個個體miR-137基因片段和miR-2008基因片段均呈現高水平表達，且表達倍數為健康組的3.0倍以上，表明試劑盒檢測的準確性。
[0017]實施例4
2011年2月，從寧波市奉化市博旺水產養殖有限公司中購買未有明顯發病癥狀刺參20只，分別標號，采用下述方法計算每個個體的miR-137和miR-2008的相對表達水平，養殖15天，觀察得病情況:
a、總RNA的提取:分別取刺參體腔液1.0mL, 800g離心5min，收集血細胞，加入RNAiso-plus試劑(購于Takara公司)1.0mL,震蕩混勻，室溫放置5min,再加入0.2mL氯仿，震蕩混勻，室溫靜置10min，4°C，12000rpm，離心15min，吸取上清至PE管中，加入該上清等體積的異丙醇，混勻，室溫靜置5min, 4°C, 12000rpm,離心10min,去上清,在沉淀中加入質量百分濃度75%的乙醇lmL，4°C,12000rpm,離心5min，去上清，沉淀靜置5-10min，加20 μ L無RNA酶水，得到RNA提取液；
b、cDNA合成:取500ng總RNA的上述提取液用miScript反轉錄試劑盒(Qiagen,Germany)合成,得到cDNA,具體合成方法依cDNA合成試劑盒說明書進行；
c、PCR擴增:利用 miScript SYBR Green PCR 試劑盒進行(Qiagen, Germany),20ul擴增體系:SYBR Green混合液10.0ul，引物溶液Iul，cDNA溶液Iul，ddH20補充至 20ul ;擴增反應條件:95 0C 15 min，94 °C 15s, 60 °C 30s, 70 °C 30s,共 40 個循環，反應完成后進行熔解曲線分析；其中引物溶液包括擴增miR-137基因片段的正向引物:5’ -TATTGCTTGAGAATACACGTAG-3’，擴增miR-2008基因片段的正向引物:5，-ATCAGCCTCGCTGTCAATACG-3’、擴增 miR-137 基因片段和 miR-2008 基因片段的反向引物為通用引物(核苷酸序列如SEQ ID N0.7所示GAATCGAGCACCAGTTACGCATG),各引物濃度均為10uM，內參基因為RNU6B，擴增RNU6B內參基因用正向引物為5’ -CGTGAAGCGTTCCATATTTTAA-3’，反向引物為通用引物(核苷酸序列如SEQ ID N0.7所示:GAATCGAGCACCAGTTACGCATG)；
d、鑒定:擴增完成后，利用2_ΛΛετ方法分析基因表達量，20個個體中，miR-137基因片段和miR-2008基因片段表達水平最高的3個個體(表達量為對照組的2.5倍以上)，在養殖的第5天，活動能力降低、出現厭食等癥狀，在地7天，體表出現了明顯的化皮特征。
[0018]實施例52013年12月，從山東青島購的養殖刺參15只，其中10只養殖于含高密度的病原菌燦爛弧菌海水中，另外5只則養殖于普通海水中，采用實施例1的方法計算miR-137和miR-2008的相對表達水平，結果如下:
a、總RNA的提取:分別取刺參體腔液1.0mL, 800g離心5min，收集血細胞，加入RNAiso-plus試劑(購于Takara公司)1.0mL,震蕩混勻，室溫放置5min,再加入0.2mL氯仿，震蕩混勻，室溫靜置10min，4°C，12000rpm，離心15min，吸取上清至PE管中，加入該上清等體積的異丙醇，混勻，室溫靜置5min, 4°C, 12000rpm,離心10min,去上清,在沉淀中加入質量百分濃度75%的乙醇lmL，4°C,12000rpm,離心5min，去上清，沉淀靜置5_10min，加20 μ L無RNA酶水，得到RNA提取液；
b、cDNA合成:取500ng總RNA的上述提取液用miScript反轉錄試劑盒(Qiagen,Germany)合成,得到cDNA,具體合成方法依cDNA合成試劑盒說明書進行；
c、PCR擴增:利用 miScript SYBR Green PCR 試劑盒進行(Qiagen, Germany),20ul擴增體系:SYBR Green混合液10.0ul，引物溶液Iul，cDNA溶液Iul，ddH20補充至 20ul ;擴增反應條件:95 0C 15 min，94 °C 15s, 60 °C 30s, 70 °C 30s,共 40 個循環，反應完成后進行熔解曲線分析；其中引物溶液包括擴增miR-137基因片段的正向引物:5’ -TATTGCTTGAGAATACACGTAG-3’，擴增miR-2008基因片段的正向引物:5，-ATCAGCCTCGCTGTCAATACG-3’、擴增 miR-137 基因片段和 miR-2008 基因片段的反向引物為通用引物(核苷酸序列如SEQ ID N0.7所示:GAATCGAGCACCAGTTACGCATG),各引物濃度均為10uM，內參基因為RNU6B，擴增RNU6B內參基因用正向引物為5’ -CGTGAAGCGTTCCATATTTTAA-3’，反向引物為通用引物(核苷酸序列如SEQ ID N0.7所示:GAATCGAGCACCAGTTACGCATG)；
d、鑒定:擴增完成后，利用2_ΛΛσ方法分析基因表達量，病原菌感染組的miR-137基因片段和miR-2008基因片段均呈現不同的表達模式，其中個別個體在感染后的第I天miR-137表達量下調，其余個體的miR-137和miR-2008的表達水平均超過對照組的2.5倍以上。感染后3天，miR-137和miR-2008表達水平均上調的個體出現了化皮的一些特征，最終發病。
[0019]上述實施例是對本發明的進一步說明，但本發明的保護范圍以權利要求書為準。
【權利要求】
1.一種用于刺參腐皮綜合癥早期診斷的分子標記物，其特征在于所述的分子標記物的基因片段如下:分子標記物miR-137基因片段的核苷酸序列為.5’ -UAUUGCUUGAGAAUACACGUAG-3’，分子標記物miR-2008基因片段的核苷酸序列為.5， -AUCAGCCUCGCUGUCAAUACG-3，。
2.一種用于刺參腐皮綜合癥早期診斷的分子標記物擴增引物，其特征在于:擴增權利要求1所述的miR-137基因片段的正向引物的核苷酸序列為:.5’ -TATTGCTTGAGAATACACGTAG-3’，擴增權利要求1所述的miR-2008基因片段的正向引物的核苷酸序列為:5’ -ATCAGCCTCGCTGTCAATACG-3，擴增RNU6B內參基因的正向引物的核苷酸序列為:5’ -CGTGAAGCGTTCCATATTTTAA-3’。
3.一種用于刺參腐皮綜合癥早期診斷的試劑盒，其特征在于包括權利要求2所述的擴增 miR-137 基因片段的正向引物:5’ -TATTGCTTGAGAATACACGTAG-3’、擴增 miR-2008 基因片段的正向引物:5’ -ATCAGCCTCGCTGTCAATACG-3以及擴增RNU6B內參基因的正向引物:.5’ -CGTGAAGCGTTCCATATTTTAA-3’。
4.一種利用權利要求1所述的刺參腐皮綜合癥早期診斷的分子標記物的檢測方法，其特征在于步驟如下: a、總RNA的提取:取刺參體腔液1.0mL,800g離心5min,收集血細胞,加入RNAiso-plus試劑(購于Takara公司)1.0mL,震蕩混勻，室溫放置5min，再加入0.2mL氯仿，震蕩混勻，室溫靜置10min，4°C，12000rpm，離心15min，吸取上清至PE管中，加入該上清等體積的異丙醇，混勻，室溫靜置5min，4°C，12000rpm，離心10min，去上清，在沉淀中加入質量百分濃度為75%的乙醇ImL, 40C，12000rpm,離心5min,去上清，沉淀靜置5-lOmin，加20 μ L無RNA酶水，得到RNA提取液； b、cDNA合成:取500ng上述RNA提取液用miScript反轉錄試劑盒(Qiagen,Germany)合成，得到cDNA，具體合成方法依cDNA合成試劑盒說明書進行； c、PCR擴增:利用 miScript SYBR Green PCR 試劑盒進行(Qiagen, Germany),.20ul擴增體系:SYBR Green混合液10.0ul，引物溶液Iul，cDNA溶液Iul，ddH20補充至 20ul ;擴增反應條件:95 0C 15 min, 94 °C 15s, 60 °C 30s, 70 °C 30s,共 40 個循環，反應完成后進行熔解曲線分析；其中引物溶液包括擴增miR-137基因片段的正向引物:5’ -TATTGCTTGAGAATACACGTAG-3’，擴增miR-2008基因片段的正向引物:.5’-ATCAGCCTCGCTGTCAATACG-3’、擴增miR-137基因片段和miR-2008基因片段的反向引物為通用引物，各引物濃度均為10uM，內參基因為RNU6B，擴增RNU6B內參基因用正向引物為.5，-CGTGAAGCGTTCCATATTTTAA-3 ’，反向引物為通用引物； d、鑒定:擴增完成后，利用方法分析基因表達量，若miR-137基因片段和miR-2008基因片段同時高水平表達，且表達倍數高于2.3則認為刺參處于腐皮綜合癥發病早期。
【文檔編號】C12Q1/68GK104017864SQ201410209458
【公開日】2014年9月3日 申請日期:2014年5月16日 優先權日:2014年5月16日
【發明者】李成華, 張鵬娟, 金春華, 李太武, 李曄, 歐昌榮, 張衛衛 申請人:寧波大學