一種快速篩選抗菌活性細菌和放線菌的方法
【專利摘要】本發明涉及了一種快速篩選抗菌活性細菌和放線菌的方法，其步驟包括（1）樣品采集；（2）培養基制備；（3）細菌和放線菌分離；（4）截取吸頭的制備；（5）抗菌活性菌株篩選。本發明提方法通過共培養的方式快速地篩選抗菌活性細菌和放線菌，與純種培養篩選抗菌活性細菌和放線菌相比，可以增加新穎抗菌活性菌株及抗菌活性物質的幾率，并且整個篩選過程快速，操作簡單，勞動強度較小，能夠快速、直觀、高效的篩選到抗菌活性的細菌和放線菌，為抗菌活性細菌和放線菌的篩選研究提供了極大方便。
【專利說明】一種快速篩選抗菌活性細菌和放線菌的方法
【技術領域】
[0001]本發明涉及一種微生物的快速分離方法，更具體的說是一種快速篩選抗菌活性細菌和放線菌的方法。
【背景技術】
[0002]抗生素的長期廣泛使用導致耐藥性病原細菌種類增加，甚至出現“超級細菌”，新的感染性疾病也不斷涌現，致使新型抗菌物質的研究與開發迫在眉睫(李越中，陳琦.海洋微生物資源及其產生生物活性代謝產物的研究，生物工程進展，2000，20 (5): 28-31)。在對微生物資源的長期研究開發過程中發現，從微生物次生代謝產物中發現新抗菌物質的難度越來越大。抗生素的篩選方法直接影響新抗生素的篩選效率。(王幸，吳文惠，陳志華，張潔，包斌.海洋微生物次生代謝產物的結構特征和生物活性的研究進展，中國天然藥物，2010，8(4): 309-320)。分子生物學技術快速發展，通過構建宏基因組文庫篩選新型天然產物可以避開微生物的分離過程，擴大了天然產物篩選范圍。但是，目前環境大片段DNA的提取困難、基因在宿主細胞中不表達或表達量低、無法進行高通量的活性物質篩選等問題制約了宏基因組文庫的實用性。通過化學修飾或全化學合成可以獲得新穎抗生素，但是合成過程復雜，且造成環境污染。通過基因組發掘可以提高天然產物的發現效率，但是天然產物基因簇的功能鑒定一直是尚未解決的難題(朱夢奕，何璟.放線菌基因組大片段克隆載體及異源表達宿主改 造的研究進展，微生物學通報，2013，40(10): 1920-1928)。由此可見，對微生物進行調查，篩選新型天然產物產生菌株，仍然是一種重要的開發新型抗生素的途徑。
[0003]近期研究表明，兩種或多種微生物的共培養可以刺激微生物產生新穎的次級代謝產物，對新穎物質的開發有重要意義，提供了通過共培養提高新穎抗菌物質的篩選效率的可能性。(黃兵，劉寧，黃英，陳勁春.放線菌與枯草芽孢桿菌的共培養及其對活性次生代謝產物的影響，生物工程學報，2009，25(6): 932-940)。但是，目前對新穎抗菌物質的篩選方法多以單一的純菌種進行的篩選方法。通過共培養篩選新穎抗菌物質產生細菌和放線菌，按照傳統的方法，首先分離細菌和放線菌，對所有菌株和其它菌株共同液體培養發酵，制備發酵上清液或發酵液有機溶劑萃取液，進一步用濾紙片法、管碟法、打孔法測定抑菌活性(李小俊，成麗霞，吳彥彬，邊艷青.拮抗菌抗菌譜及發酵液拮抗能力測定的新方法，生物技術，2007，17(1): 55-58)。該方法成本高，周期長，勞動強度大。

【發明內容】

[0004]本發明所要解決的技術問題是針對現有技術的不足，提供一種成本低、操作簡單、周期短、效率高的通過共培養方式篩選抗菌活性細菌及放線菌的方法。
[0005]本發明所要解決的技術問題是通過以下的技術方案來實現的。本發明是一種快速篩選抗菌活性細菌和放線菌的方法，其特點是，其步驟如下::
(I)樣品采集:用無菌取樣瓶采集海水、海泥、土壤和河水等樣品，迅速送至實驗室并盡快進行細菌和放線菌分離。
[0006](2)培養基制備:2216E培養基:蛋白胨5g，酵母膏lg，FePO4 0.lg，陳海水1000ml ;高氏一號培養基:可溶性淀粉 20.0g7KNO3 1.0g, K2HPO4 0.5g, MgSO4.7Η20 0.5g.NaCl 0.5g，FeSO4.7H20 0.01g，蒸餾水1000 ml, pH7.2 ;營養瓊脂培養基:牛肉膏3g，蛋白胨10g，NaCl 5g，蒸餾水1000 ml，pH7.2 ;PDA培養基:馬鈴薯200g，葡萄糖20g，蒸餾水1000 ml,自然pH;若上述培養基為固體培養基，添加瓊脂20g/L;除2216E培養基外，若用于海洋樣品菌株的分離，則培養基中蒸餾水用海水代替；
(3)細菌和放線菌分離:將所取樣品進行梯度稀釋，取50μ L不同稀釋度的稀釋液分別涂布于添加終濃度為50 mg/ml的重鉻酸鉀溶液的平板用于細菌和放線菌分離。海洋樣品的細菌和放線菌用2216E平板和海水配制的高氏一號平板；陸源樣品的細菌和放線菌用營養瓊脂平板和高氏一號平板；30°C倒置培養，細菌培養2-7d，放線菌培養7-14d，根據菌落特征和革蘭氏染色后顯微鏡觀察后判斷不同菌種；
(4)截取吸頭的制備:取Iml移液器吸頭，以寬口端為準，截取12mm，其余部分鋸掉，邊緣打磨光滑，121°C滅菌20min ；
(5)抗菌活性菌株篩選:從斜面中挑取coli保存菌種，在厚度約為3mm營養瓊脂培養基平板上三區劃線，37°C倒置培養至出現單菌落；超凈臺內用無菌截取吸頭在單菌落對應點上方打孔，并使培養基保留在吸頭內；用此吸頭的另一端在稀釋涂布分離的細菌或放線菌單菌落上打孔，并用無菌鑷子輕壓吸頭內的培養基，使吸頭內上下兩端的培養基接觸，即和待篩選的細菌或放線菌形成共培養。將此共培養微生物的截取吸頭置于taphylococcus aureus、Escheri chi a col1、Saccharomycescere vi siae ^ Peni ci Ilium expansum等含菌指示平板，指示細菌用培養基為營養瓊脂培養基，真菌為PDA培養基。于指示菌適合的溫度培養后觀察，并用游標卡尺測定抑菌圈的大小；抑菌圈越大，菌株抗菌活性越強；從而快速篩選得到抗菌活性細菌和放線菌。
[0007]本發明中涉及的菌株均來自于中國普通微生物菌種保藏中心， Escherichiacoli 的保藏號為 CGMCC 1.487，Staphylococcus aureus 的保藏號為 CGMCC 1.2465，Saccharomyces cerevisiae 的保藏號為 CGMCC 2.114, Peni ci Ilium expansum 的保藏號為CGMCC 3.3703。
[0008]本發明所述的一種快速篩選抗菌活性細菌和放線菌的方法的步驟(5)中，通過截取吸頭將coli和待篩選細菌或放線菌共培養，并放于指示菌平板，指示菌培養后測定抑菌圈直徑，根據抑菌圈的有無和大小快速篩選抗菌活性菌株。
[0009]與現有技術相比，本發明的有益效果是，本發明提方法通過共培養的方式快速地篩選抗菌活性細菌和放線菌，與純種培養篩選抗菌活性細菌和放線菌相比，可以增加新穎抗菌活性菌株及抗菌活性物質的幾率，并且整個篩選過程快速，操作簡單，勞動強度較小，能夠快速、直觀、高效的篩選到抗菌活性的細菌和放線菌，為抗菌活性細菌和放線菌的篩選研究提供了極大方便。
【具體實施方式】
[0010]以下通過實施例進一步說明本發明的技術方案，而不構成對其權利的限制。
[0011] 實施例1，一種快速篩選抗菌活性細菌和放線菌的方法，其步驟如下:(1)樣品采集:用無菌取樣瓶采集海水、海泥、土壤和河水等樣品，迅速送至實驗室并盡快進行細菌和放線菌分離；
(2)培養基制備:2216E培養基:蛋白胨5g，酵母膏lg，FePO40.lg，陳海水1000ml ；高氏一號培養基:可溶性淀粉 20.0g，KNO3 1.0g, K2HPO4 0.5g, MgSO4.7H20 0.5g.NaCl0.5g,FeSO4.7Η20 0.01g，蒸餾水1000 ml，pH7.2 ;營養瓊脂培養基:牛肉膏3g，蛋白胨10g，NaCl 5g，蒸餾水1000 ml, pH7.2 ;PDA培養基:馬鈴薯200g，葡萄糖20g，蒸餾水1000 ml,自然pH ;若上述培養基為固體培養基，添加瓊脂20g/L ;除2216E培養基外，若用于海洋樣品菌株的分離，則培養基中蒸餾水用海水代替；
(3)細菌和放線菌分離:將所取樣品進行梯度稀釋，取50μ L不同稀釋度的稀釋液分別涂布于添加終濃度為50 mg/ml的重鉻酸鉀溶液的平板用于細菌和放線菌分離。海洋樣品的細菌和放線菌用2216E平板和海水配制的高氏一號平板；陸源樣品的細菌和放線菌用營養瓊脂平板和高氏一號平板；30°C倒置培養，細菌培養2-7d，放線菌培養7-14d，根據菌落特征和革蘭氏染色后顯微鏡觀察后判斷不同菌種；
(4)截取吸頭的制備:取Iml移液器吸頭，以寬口端為準，截取12mm，其余部分鋸掉，邊緣打磨光滑，121°C滅菌20min ；
(5)抗菌活性菌株篩選:從斜面中挑取coli保存菌種，在厚度約為3mm營養瓊脂培養基平板上三區劃線，37°C倒置培養至出現單菌落；超凈臺內用無菌截取吸頭在單菌落對應點上方打孔，并使培養基保留在吸頭內。用此吸頭的另一端在稀釋涂布分離的細菌或放線菌單菌落上打孔，并用無菌鑷子輕壓吸頭內的培養基，使吸頭內上下兩端的培養基接觸，即和待篩選的細菌或放線菌形成共培養。將此共培養微生物的截取吸頭置于 taphylococcus aureus、Escheri chi a col1、Saccharomycescere vi siae ^ Peni ci Ilium expansum等含菌指示平板，指示細菌用培養基為營養瓊脂培養基，真菌為PDA培養基。于指示菌適合的溫度培養后觀察，并用游標卡尺測定抑菌圈的大小；抑菌圈越大，菌株抗菌活性越強；從而快速篩選得到抗菌活性細菌和放線菌。
[0012](6)菌株的培養特征及生理生化鑒定
抗菌活性的細菌及放線菌的鑒定參照《Bergey’ s manual of detrerminativebacteriology)) (ninth edition)進行。
[0013]實施例2，實施例1所述的一種快速篩選抗菌活性細菌和放線菌的方法的步驟(5)中，通過截取吸頭將coli和待篩選細菌或放線菌共培養,并放于指示菌平板，指示菌培養后測定抑菌圈直徑，根據抑菌圈的有無和大小快速篩選抗菌活性菌株。
[0014]實例例3，對比實驗:
1.現有技術方法篩選。
[0015]從連云港海域連島取海水、海泥，花果山上采集土壤和淡水樣品，通過稀釋涂布法利用2216E培養基和海水配制的高氏一號培養基分離海洋樣品中的細菌和放線菌，用營養瓊脂培養基和高氏一號培養基分離陸地樣品中的細菌和放線菌。將純化后的單菌落接種至斜面培養后4°C保藏。共分離獲得細菌691株，放線菌93株。將不同海洋細菌和陸源細菌接種至2216E培養基和營養瓊脂培養基，海洋放線菌和陸源放線菌分別接種海水和蒸餾水配制的高氏一號培養基，培養至細胞壓積2%后，取0.2mL接種100 mL三角瓶中裝有25 mL發酵培養基，發酵10 d, 8, OOOg,離心10 min,上清液過0.22 Mm微孔濾膜后為待測樣品，采用管碟法測定抑菌活性。每個牛津杯中加入200 μ L發酵樣品，采免含 Staphylococcus aureus、Escherichia coli > PeniciIlium 6^/73/75--等含菌指平板，30°C培養后觀察,共獲得抗aureus活性細菌139株,放線菌25株；抗Escherichia coli活性細菌67株，放線菌15株 '抵PeniciIIium expansum活性細菌96株，放線菌16株。
[0016]2.本發明方法篩選。
[0017]用上述同樣的樣品，通過稀釋涂布法，取50 μ L不同稀釋度的稀釋液分別涂布于添加終濃度為50 mg/ml的重鉻酸鉀溶液的平板用于細菌和放線菌分離。海洋樣品的細菌和放線菌用2216E平板和海水配制的高氏一號平板。陸源樣品的細菌和放線菌用營養瓊脂平板和高氏一號平板。從斜面中挑取coli保存菌種，在厚度約為3mm營養瓊脂培養基平板上三區劃線，37°C倒置培養至出現單菌落；超凈臺內用無菌截取吸頭在單菌落對應點上方打孔，并使培養基保留在吸頭內。用此吸頭的另一端在稀釋涂布分離的細菌或放線菌單菌落上打孔，并用無菌鑷子輕壓吸頭內的培養基，使吸頭內上下兩端的培養基接觸，熱Escherichia coli和待篩選的細菌或放線菌形成共培養。將此共培養微生物的
Staphylococcus aureus 'Escherichia coli ^PeniciIlium指不平
板，30°C培養后觀察,共獲得抗aureus活性細菌185株,放線菌33株；抗Escherichia coli 活性細菌 73 株，放線菌 18 株-MiPenicillium expansum 活性細菌 121株，放線菌25株。
[0018]通過以上對比實驗可以看出，本發明方法篩選得到的抗性菌株數量顯著提高。值得關注的是，通過共培養，使單培養沒有抗菌活性的菌株產生抗菌活性，但沒有通過共培養使有抗菌活性的菌株失去抗菌活性現象的發生。
【權利要求】
1.一種快速篩選抗菌活性細菌和放線菌的方法，其特征在于，其步驟如下: (1)樣品采集:用無菌取樣瓶采集海水、海泥、土壤或者河水樣品，迅速送至實驗室； (2)培養基制備:2216E培養基:蛋白胨5g，酵母膏lg，FePO40.lg，陳海水1000ml ；高氏一號培養基:可溶性淀粉 20.0g，KNO3 1.0g, K2HPO4 0.5g, MgSO4.7H20 0.5g.NaCl0.5g,FeSO4.7Η20 0.01g，蒸餾水1000 ml，pH7.2 ;營養瓊脂培養基:牛肉膏3g，蛋白胨10g，NaCl 5g，蒸餾水1000 ml, pH7.2 ;PDA培養基:馬鈴薯200g，葡萄糖20g，蒸餾水1000 ml,自然pH ;若上述培養基為固體培養基，添加瓊脂20g/L ;除2216E培養基外，若用于海洋樣品菌株的分離，則培養基中蒸餾水用海水代替； (3)細菌和放線菌分離:將所取樣品進行梯度稀釋，取50//L不同稀釋度的稀釋液分別涂布于添加終濃度為50 mg/ml的重鉻酸鉀溶液的平板用于細菌和放線菌分離；海洋樣品的細菌和放線菌用2216E平板和海水配制的高氏一號平板；陸源樣品的細菌和放線菌用營養瓊脂平板和高氏一號平板；30°C倒置培養，細菌培養2-7d，放線菌培養7-14d，根據菌落特征和革蘭氏染色后顯微鏡觀察后判斷不同菌種； (4)截取吸頭的制 備:取Iml移液器吸頭，以寬口端為準，截取12mm，其余部分鋸掉，邊緣打磨光滑，121°C滅菌20min ； (5)抗菌活性菌株篩選:從斜面中挑取coli保存菌種，在厚度為3mm營養瓊脂培養基平板上三區劃線，37°C倒置培養至出現單菌落；超凈臺內用無菌截取吸頭在單菌落對應點上方打孔，并使培養基保留在吸頭內；用此吸頭的另一端在稀釋涂布分離的細菌或放線菌單菌落上打孔，并用無菌鑷子輕壓吸頭內的培養基，使吸頭內上下兩端的培養基接觸，即Escherichia coli和待篩選的細菌或放線菌形成共培養；將此共培養微生物的截取吸頭置于taphylococcus aureus、Escheri chi a coli > Saccharomycescerevisiae^PeniciIlium expansum含菌指示平板，指示細菌用培養基為營養瓊脂培養基，真菌為PDA培養基；于指示菌適合的溫度培養后觀察，并用游標卡尺測定抑菌圈的大小；抑菌圈越大，菌株抗菌活性越強；從而快速篩選得到抗菌活性細菌和放線菌。
2.根據權利要求1所述的一種快速篩選抗菌活性細菌和放線菌的方法，其特征在于:步驟(5)中通過截取吸頭將AscAericAia coli和待篩選細菌或放線菌共培養,并放于指示菌平板，指示菌培養后測定抑菌圈直徑，根據抑菌圈的有無和大小快速篩選抗菌活性菌株。
【文檔編號】C12R1/19GK103966141SQ201410212912
【公開日】2014年8月6日 申請日期:2014年5月20日 優先權日:2014年5月20日
【發明者】劉姝, 房耀維, 王淑軍, 呂明生, 焦豫良 申請人:淮海工學院