一種檢測(cè)產(chǎn)黃曲霉素霉菌的生物芯片、檢測(cè)試劑盒及檢測(cè)方法
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明涉及生物芯片【技術(shù)領(lǐng)域】，特別涉及一種檢測(cè)產(chǎn)黃曲霉素霉菌的生物芯片，還涉及含有此生物芯片的檢測(cè)試劑盒，及檢測(cè)產(chǎn)黃曲霉素霉菌的檢測(cè)方法。核苷酸探針堿基序列如序列表中序列1-6所示。檢測(cè)產(chǎn)黃曲霉素霉菌的試劑盒，含有生物芯片。檢測(cè)方法：提取待測(cè)樣品RNA或，進(jìn)行標(biāo)記，或反轉(zhuǎn)錄成cDNA后進(jìn)行標(biāo)記；將標(biāo)記后的片段與載有所述載有核苷酸探針的生物芯片進(jìn)行雜交，掃描采集信號(hào)。僅使用3對(duì)探針，就可以對(duì)產(chǎn)黃曲霉素霉菌進(jìn)行檢測(cè)，簡(jiǎn)化了檢測(cè)步驟；本發(fā)明的生物芯片，特異性強(qiáng)，準(zhǔn)確率100%，能檢測(cè)到低拷貝的RNA樣品，靈敏度高。
【專(zhuān)利說(shuō)明】一種檢測(cè)產(chǎn)黃曲霉素霉菌的生物芯片、檢測(cè)試劑盒及檢測(cè) 方法
[0001]

【技術(shù)領(lǐng)域】 本發(fā)明涉及生物芯片【技術(shù)領(lǐng)域】，特別涉及一種檢測(cè)產(chǎn)黃曲霉素霉菌的生物芯片，還涉 及含有此生物芯片的檢測(cè)試劑盒，及產(chǎn)黃曲霉素霉菌的檢測(cè)方法。
[0002]

【背景技術(shù)】 生物芯片，又稱(chēng)DNA芯片或基因芯片，它們是DNA雜交探針技術(shù)與半導(dǎo)體工業(yè)技術(shù)相結(jié) 合的結(jié)晶。該技術(shù)系指將大量探針?lè)肿庸潭ㄓ谥С治锷虾笈c帶熒光標(biāo)記的DNA樣品分子進(jìn) 行雜交，通過(guò)檢測(cè)每個(gè)探針?lè)肿拥碾s交信號(hào)強(qiáng)度進(jìn)而獲取樣品分子的數(shù)量和序列信息。
[0003] 生物芯片是指包被在硅片、尼龍膜等固相支持物上的高密度的組織、細(xì)胞、蛋白 質(zhì)、核酸、糖類(lèi)以及其它生物組分的微點(diǎn)陣。芯片與標(biāo)記的樣品進(jìn)行雜交，通過(guò)檢測(cè)雜交信 號(hào)即可實(shí)現(xiàn)對(duì)生物樣品的分析。目前常見(jiàn)的生物芯片主要有基因芯片，蛋白質(zhì)芯片、組織芯 片等?；蛐酒部梢越凶鰎everse northern - dot blots。目前主要有檢測(cè)基因突變的 基因芯片和檢測(cè)基因表達(dá)水平的基因表達(dá)譜芯片?；蛐酒夹g(shù)主要包括芯片微陣列制 備、樣品制備、雜交、信號(hào)的檢測(cè)和分析等。蛋白質(zhì)芯片主要是蛋白質(zhì)如抗原或抗體在載體 上的有序排列，依據(jù)蛋白質(zhì)分子、蛋白質(zhì)與核酸相互作用的原理進(jìn)行雜交、檢測(cè)和分析。從 不同的組織內(nèi)進(jìn)行活體解剖后取出圓柱狀的組織，然后包埋在受體區(qū)組內(nèi)，這樣的石蠟塊 集成體便構(gòu)成了組織芯片。
[0004] 黃曲毒素（aflatoxin)，也稱(chēng)作黃曲霉素，是一種有強(qiáng)烈生物毒性的化合物，常由 黃曲霉及另外幾種霉菌在霉變的谷物中產(chǎn)生，如大米、豆類(lèi)、花生等，是目前為止最強(qiáng)的致 癌物質(zhì)。加熱至280°C以上才開(kāi)始分解，所以一般的加熱不易破壞其結(jié)構(gòu)。黃曲毒素主要有 B1、B2、G1與G2等4種，又以B1的毒性最強(qiáng)。食米儲(chǔ)存不當(dāng)，極容易發(fā)霉變黃，產(chǎn)生黃曲毒 素。黃曲毒素與肝癌有密切關(guān)系，還會(huì)引起組織失血、厭食等癥狀。I960年在英國(guó)發(fā)生了因 喂食黃曲毒素花生柏而導(dǎo)致大批火雞暴斃事件。警惕黃曲毒素的危害，要注意剔除霉變的 食物顆粒，還可采用以水淘洗的辦法進(jìn)一步凈化易沾染的食物中的霉菌。當(dāng)然，用高溫?zé)?炸至280°C以上也可以達(dá)到分解毒素和去除污染的效果。
[0005] 目前，檢測(cè)產(chǎn)黃曲霉素霉菌的傳統(tǒng)方法主要是分離鑒定，并同時(shí)用HPLC進(jìn)行黃曲 霉素的檢測(cè)，上述檢測(cè)方法存在操作繁瑣、準(zhǔn)確度、靈敏度差的問(wèn)題。
[0006] 胡娜在南昌大學(xué)的博士論文《基因芯片技術(shù)在黃曲霉毒素生物合成相關(guān)基因檢測(cè) 中的應(yīng)用研究》中探討了建立芯片檢測(cè)與黃曲霉毒素生物合成相關(guān)基因的技術(shù)平臺(tái)，所用 探針來(lái)源于寄生曲霉，待測(cè)樣品為黃曲霉霉菌。芯片掃描結(jié)果顯示熒光信號(hào)穩(wěn)定，與反轉(zhuǎn)錄 擴(kuò)增結(jié)果一致，無(wú)背景干擾，結(jié)果可靠。但此論文使用了 27對(duì)探針，檢測(cè)誤差的可能性增 大，而且其中部分探針對(duì)其他產(chǎn)黃曲霉素的菌株并不適用。
[0007]


【發(fā)明內(nèi)容】
為了解決以上現(xiàn)有技術(shù)中存在的檢測(cè)產(chǎn)黃曲霉素霉菌操作繁瑣、準(zhǔn)確度、靈敏度差的 問(wèn)題，本申請(qǐng)?zhí)峁┝艘环N檢測(cè)產(chǎn)黃曲霉素霉菌的生物芯片。
[0008] 本發(fā)明是通過(guò)以下措施實(shí)現(xiàn)的： 一種檢測(cè)產(chǎn)黃曲霉素霉菌的生物芯片，包括固相載體和固定在該固相載體上的核苷酸 探針，所述核苷酸探針堿基序列如下： AFLo-Ι :5' -GCCTTGACATGGAAACCATC-3'， AFL〇-2 :5' -CCAAGATGGCCTGCTCTTTA-3' ； AFLD-1 :5' -ACGGATCACTTAGCCAGCAC-3'， AFLD-2 :5' -CTACCAGGGGAGTTGAGATCC-3' ； AFLp-Ι :5' -GCCTTGCAAACACACTTTCA-3'， AFLp-2 :5' -AGTTGTTGAACGCCCCAGT-3'。
[0009] -種檢測(cè)產(chǎn)黃曲霉素霉菌的試劑盒，含有所述的生物芯片。
[0010] 一種產(chǎn)黃曲霉素霉菌的檢測(cè)方法，包括以下步驟： (1) 提取待測(cè)樣品RNA,進(jìn)行CY3/CY5標(biāo)記,或者反轉(zhuǎn)錄成cDNA后進(jìn)行標(biāo)記； (2) 將標(biāo)記后的RNA片段或者cDNA片段與載有核苷酸探針的生物芯片進(jìn)行雜交，掃描 采集信號(hào)。
[0011] 本發(fā)明的有益效果： 僅使用3對(duì)探針，就可以對(duì)產(chǎn)黃曲霉素霉菌進(jìn)行檢測(cè)，簡(jiǎn)化了檢測(cè)步驟；本申請(qǐng)的生物 芯片，特異性強(qiáng)，準(zhǔn)確率1〇〇%，能檢測(cè)到低拷貝的RNA樣品，靈敏度高。由于產(chǎn)黃曲霉素的霉 菌種類(lèi)眾多，有的在一定條件下才能產(chǎn)生黃曲霉素，該方法能有效鑒別區(qū)分產(chǎn)黃曲霉素的 霉菌和產(chǎn)黃曲霉素的環(huán)境條件，能在早期發(fā)現(xiàn)產(chǎn)黃曲霉素的霉菌，有助于提前采取措施進(jìn) 行處理。

【具體實(shí)施方式】
[0012] 為了更好的理解本發(fā)明，下面結(jié)合具體實(shí)施例來(lái)進(jìn)一步說(shuō)明。
[0013] 實(shí)施例1 :探針的獲得 以Genebank中的序列信息為背景，設(shè)計(jì)了 3對(duì)引物，堿基序列如下： AFLo-Ι :5' -GCCTTGACATGGAAACCATC-3'， AFL〇-2 :5' -CCAAGATGGCCTGCTCTTTA-3' ； AFLD-1 :5' -ACGGATCACTTAGCCAGCAC-3'， AFLD-2 :5' -CTACCAGGGGAGTTGAGATCC-3' ； AFLp-Ι :5' -GCCTTGCAAACACACTTTCA-3'， AFLp-2 :5' -AGTTGTTGAACGCCCCAGT-3'。
[0014] 實(shí)施例2 :生物芯片檢測(cè)實(shí)驗(yàn) 2. 1試劑準(zhǔn)備 2. 1. 1芯片洗液： 根據(jù)需要及實(shí)際情況，按如下比例配制洗滌液I和Π 。
[0015] 1)洗液I :SSC終濃度為2X，SDS終濃度為0. 2%。以配制總量500 ml為例，量取 440 ml蒸餾水倒入1000 ml試劑瓶中，加入50 ml 20 XSSC，混勻。再加入10 ml 10 %SDS， 混勻，室溫存貯?；蚋鶕?jù)需求按比例配制。
[0016] 2)洗液II :SSC終濃度為0.2X。以配制總量500 ml為例，量取495 ml蒸餾水 倒入1000 ml試劑瓶中，加入5 ml 20XSSC，混勻，室溫存貯?；蚋鶕?jù)需求按比例配制。
[0017] 提示：若10%SDS產(chǎn)生白色絮狀沉淀，請(qǐng)置于42°C水浴中溶解混勻后配制洗液 2. 1. 2無(wú)菌水(本試劑盒不提供，請(qǐng)自行準(zhǔn)備并高壓滅菌后備用） 2. 1. 3無(wú)水乙醇 2. 1. 4冰水混合物 2. 2樣品準(zhǔn)備 可直接使用無(wú)菌水沖洗樣品得到帶有霉菌的水樣。
[0018] 提示：如果不能馬上進(jìn)行芯片檢測(cè)，可在2_8°C保存48小時(shí)，48小時(shí)后最好將肉湯 冰凍保存。
[0019] 2.3儀器和材料要求 晶芯LuxScan 10K-A微陣列芯片掃描儀， 晶芯基因微陣列芯片雜交盒， 渦旋振蕩器， 離心機(jī)(規(guī)格：可離心1. 5 ml離心管)， 微量移液器(規(guī)格：〇· 1-10 μ 1，2-20 μ 1，20-200 μ 1，200-1000 μ 1 各一把)， PCR擴(kuò)增儀， 移液器吸頭(要求潔凈無(wú)菌，規(guī)格：1〇 μ1，200 μ?,?πι?)， 離心管(要求潔凈無(wú)菌，規(guī)格：200 μ 1，1. 5 ml)， 各種規(guī)格的離心管架， 電泳儀， 雜交爐或雜交水浴鍋(可控溫42°C )， 芯片洗片盒， 水平搖床， 離心機(jī)(規(guī)格：可離心50 ml離心管）； 2.4細(xì)菌樣品RNA提取 2. 5 RNA進(jìn)行標(biāo)記,或者使用反轉(zhuǎn)錄試劑盒生成cDNA,并進(jìn)行標(biāo)記 2.6雜交及洗片 將雜交Buffer在42°C融化，按下面體系配制雜交液，雜交液95°C變性5分鐘，冰浴5 分鐘，備用。
[0020] 表1反應(yīng)體系

【權(quán)利要求】
1. 一種檢測(cè)產(chǎn)黃曲霉素霉菌的生物芯片，包括固相載體和固定在該固相載體上的核苷 酸探針，其特征在于所述核苷酸探針堿基序列如下： AFLo-Ι :5' -GCCTTGACATGGAAACCATC-3'， AFL〇-2 :5' -CCAAGATGGCCTGCTCTTTA-3' ； AFLD-1 :5' -ACGGATCACTTAGCCAGCAC-3'， AFLD-2 :5' -CTACCAGGGGAGTTGAGATCC-3' ； AFLp-Ι :5' -GCCTTGCAAACACACTTTCA-3'， AFLp-2 :5' -AGTTGTTGAACGCCCCAGT-3'。
2. -種檢測(cè)產(chǎn)黃曲霉素霉菌的試劑盒，其特征在于含有權(quán)利要求1所述的生物芯片。
3. -種產(chǎn)黃曲霉素霉菌的檢測(cè)方法，其特征在于包括以下步驟： (1) 提取待測(cè)樣品RNA，進(jìn)行熒光標(biāo)記，或者反轉(zhuǎn)錄成cDNA后進(jìn)行標(biāo)記； (2) 將標(biāo)記后的RNA或cDNA片段與載有權(quán)利要求1所述載有核苷酸探針的生物芯片進(jìn) 行雜交，掃描采集信號(hào)。
【文檔編號(hào)】C12Q1/68GK104152548SQ201410318976
【公開(kāi)日】2014年11月19日 申請(qǐng)日期:2014年7月7日 優(yōu)先權(quán)日:2014年7月7日
【發(fā)明者】黃超, 李新國(guó), 萬(wàn)書(shū)波, 孟靜靜, 郭峰, 張佳蕾, 張正, 楊莎, 趙海軍, 孫博通 申請(qǐng)人:山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)研究中心