一種過(guò)表達(dá)蘋果酸酶基因的重組載體及應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開(kāi)了一種過(guò)表達(dá)蘋果酸酶基因的重組載體及應(yīng)用。包括篩選標(biāo)記基因表達(dá)盒及目的基因表達(dá)盒；所述的篩選標(biāo)記基因表達(dá)盒包括抗性篩選基因，在抗性篩選基因的上游融合了大腸桿菌P1啟動(dòng)子，抗性篩選基因的下游融合了大腸桿菌ccdB終止子；所述的目的基因表達(dá)盒包括三角褐指藻fcpC基因啟動(dòng)子、蘋果酸酶基因、三角褐指藻fcpA基因終止子及一個(gè)Omega?leader序列，所述的Omega?leader序列在三角褐指藻fcpC基因啟動(dòng)子的下游。本發(fā)明的重組載體比較小，適合轉(zhuǎn)化，容易操作，都是三角褐指藻的同源序列，利于表達(dá)。通過(guò)過(guò)表達(dá)蘋果酸酶基因能夠顯著地提高微藻細(xì)胞內(nèi)的脂質(zhì)含量，為生物能源的研究奠定了基礎(chǔ)。
【專利說(shuō)明】一種過(guò)表達(dá)蘋果酸酶基因的重組載體及應(yīng)用

【技術(shù)領(lǐng)域】
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[0001]本發(fā)明屬于微藻基因工程領(lǐng)域，具體涉及一種過(guò)表達(dá)蘋果酸酶基因的重組載體及應(yīng)用。

【背景技術(shù)】
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[0002]傳統(tǒng)能源的不可再生性決定了其日益枯竭的趨勢(shì)，且造成環(huán)境問(wèn)題日益嚴(yán)重。能源危機(jī)和環(huán)境污染的日益嚴(yán)峻激起了人們的能源憂患意識(shí)及污染物零排放觀念，加強(qiáng)了對(duì)廢油脂及工業(yè)下腳料的回收處理及科學(xué)利用，推動(dòng)清潔新型能源的開(kāi)發(fā)利用。尋求一種安全可靠的、清潔的可再生能源已成為當(dāng)今世界共同關(guān)注的焦點(diǎn)。生物能源是指利用生物可再生原料及太陽(yáng)能生產(chǎn)的能源，包括生物質(zhì)能生物液體燃料及利用生物質(zhì)生產(chǎn)的能源如燃料酒精、生物柴油、生物質(zhì)氣化及液化燃料、生物制氫等(譚天偉，等，2003)。其中，生物柴油是采用來(lái)自動(dòng)物或植物脂肪酸單酯包括脂肪酸甲酯、脂肪酸乙酯及脂肪酸丙酯等與甲醇(或乙醇)經(jīng)酯交換反應(yīng)而得到的長(zhǎng)鏈脂肪酸甲(乙)酯，是一種可以替代普通石油柴油的可再生的清潔燃料，相較于其它種類的生物能源，生物柴油具有原料廣泛、生產(chǎn)高效、環(huán)境友好、凈化環(huán)境等突出特點(diǎn)(譚天偉，等，2002)。
[0003]Chisti通過(guò)建立數(shù)學(xué)模型和工程計(jì)算指出微藻生物能源是唯一可以取代石化油的生物柴油(Chisti，et al.,2007 ；Chisti, et al.，2008)。因具有清潔、高效、環(huán)保、產(chǎn)油量大等優(yōu)點(diǎn)，微藻生物能源被視為最具有發(fā)展?jié)摿Φ纳锊裼偷馁Y源(Metting，etal., 1996 ；Spolaore, et al.，2006 ；ffeers, et al.，1977 ；Hu et al., 2008)。娃藻是海洋浮游生物最重要的組成成分，在提供海洋初級(jí)生產(chǎn)力方面發(fā)揮著重要的作用。它們是研究發(fā)現(xiàn)新穎的在其他經(jīng)常研究的生物體中不存在的代謝路徑的主要研究對(duì)象，因?yàn)樵谒鼈冞M(jìn)化過(guò)程中形成一系列新穎的代謝路徑(Armbrust, et al.，2004)。由于三角褐指藻具有生長(zhǎng)周期短、生長(zhǎng)快、脂質(zhì)含量高等優(yōu)點(diǎn)，成為最具潛力的產(chǎn)油微藻(Yang, et al.，2013 ；Niu, etal.，2012)。因此，通過(guò)遺傳學(xué)改造提高三角褐指藻的脂質(zhì)含量與生物量是提高工業(yè)化生產(chǎn)產(chǎn)量的重要途徑。
[0004]海洋硅藻三角褐指藻，一種廣泛使用的餌料藻，其快速增長(zhǎng)和高脂肪含量已成為有吸引力和有前途的，作為生物柴油的新來(lái)源，它的基因組在2008年已被測(cè)序(http://genome, jg1-psf.0rg/Phatr2/Phatr2.home, html),使得它也成為研究功能基因組學(xué)一個(gè)模型微藻。
[0005]載體兀件是決定微藻表達(dá)系統(tǒng)中DNA表達(dá)穩(wěn)定性的關(guān)鍵部件之一。隨著基因組測(cè)序技術(shù)的快速進(jìn)步，基因測(cè)通技術(shù)和序列信息注釋已被開(kāi)發(fā)用于傳輸序列功能性信息的渠道。通常，研究基因的功能可以使用各種的方法，如異位表達(dá)，基因沉默，蛋白質(zhì)亞細(xì)胞定位，啟動(dòng)子活性分析，結(jié)構(gòu)一功能分析，并在體內(nèi)或體外用生物化學(xué)測(cè)定基因表達(dá)模式分析。然而，對(duì)基于限制性內(nèi)切酶/連接酶克隆方法工程表達(dá)構(gòu)建體的常規(guī)方法是非常費(fèi)力和耗時(shí)的，并且經(jīng)常受到限制性酶切位點(diǎn)的阻礙。在模型藻萊茵衣藻和三角褐指藻甚至大多數(shù)高等植物中載體構(gòu)建是功能基因分析的主要障礙，因此，迫切需要?jiǎng)?chuàng)新和有效的技術(shù)手段克服以上困難。最近的通路克隆系統(tǒng)用兩步驟的位點(diǎn)特異性重組快速大規(guī)模克隆研究一個(gè)或者多個(gè)基因進(jìn)入載體(G and J，2004)。需連入載體的DNA片段，首先克隆到一個(gè)普通供體載體。然后，由兩個(gè)位點(diǎn)特異性重組位點(diǎn)(attBl和attB2位)中的供體質(zhì)粒側(cè)翼的DNA片段可以被精確地轉(zhuǎn)印到各種表達(dá)載體中，通過(guò)位點(diǎn)特異性重組反應(yīng)。一旦DNA產(chǎn)物被靶向到供體載體中，無(wú)需傳統(tǒng)的限制性內(nèi)切酶和連接酶克隆的簡(jiǎn)單反應(yīng)。將重組克隆系統(tǒng)，DNA的轉(zhuǎn)移構(gòu)建體整合到表達(dá)目的載體所介導(dǎo)Gateway技術(shù)，和許多開(kāi)放閱讀框條目(供體)的克隆的集合和表達(dá)質(zhì)粒已被廣泛用于功能基因組學(xué)中的許多生物創(chuàng)建(Aliverti etal.，2008)。然而，在這種方式中使用的酶的成本相對(duì)昂貴，特別是相關(guān)技術(shù)幾乎沒(méi)有在硅藻三角褐指藻中報(bào)道，并且轉(zhuǎn)化效率不高，因此通過(guò)利用選擇標(biāo)記基因構(gòu)造微藻的遺傳轉(zhuǎn)化的零背景的TA克隆載體。此外，該技術(shù)可靈活地適應(yīng)用于PCR擴(kuò)增的基因或片段開(kāi)發(fā)專門的表達(dá)載體的單步裝配(Chen et al.，2009)。通過(guò)限制性內(nèi)切酶XcmI的高效酶切，該質(zhì)粒可以形成兩個(gè)3’的T突出端以便用于TA克隆，我們這次構(gòu)建的T載體基于限制性內(nèi)切酶XcmI的靈活運(yùn)用(Chen et al.，2009)，T載體連接方式幾乎適用于所有的基因克隆連接工作，使得未來(lái)都省時(shí)省力連接目的基因到在三角褐指藻表達(dá)的載體。
[0006]用于遺傳轉(zhuǎn)化的關(guān)鍵步驟是有一個(gè)包含所有表達(dá)基因元件的載體，該載體包含選擇標(biāo)記(通常是抗生素抗性基因)的表達(dá)盒或者選擇質(zhì)粒在細(xì)菌或選擇在宿主生物體中的基因轉(zhuǎn)移，以及用于表達(dá)的宿主生物體中另一個(gè)靶基因表達(dá)盒的操作。然而，所生產(chǎn)的選擇標(biāo)記蛋白的獲得轉(zhuǎn)基因生物體后不想要的。構(gòu)建生產(chǎn)轉(zhuǎn)基因細(xì)胞異源蛋白質(zhì)有時(shí)是有問(wèn)題的，因?yàn)橐恍┑鞍踪|(zhì)可能會(huì)影響轉(zhuǎn)基因細(xì)胞或細(xì)胞的生長(zhǎng)，一個(gè)可行的選擇是使用誘導(dǎo)型啟動(dòng)子來(lái)限制選擇標(biāo)記蛋白在轉(zhuǎn)基因生物體的表達(dá)。誘導(dǎo)型啟動(dòng)子的發(fā)展也是必不可少的轉(zhuǎn)化載體允許選擇標(biāo)記物的表達(dá)，以及是在細(xì)胞中表達(dá)感興趣的基因的設(shè)計(jì)思路。
[0007]某些廣泛用于植物轉(zhuǎn)化的異源啟動(dòng)子已被用于在微藻的基因轉(zhuǎn)化中。如在甲藻Amphidinium中，花椰菜花葉病毒(CaMV) 35S啟動(dòng)子和pI’2’農(nóng)桿菌啟動(dòng)子啟動(dòng)了報(bào)告基因⑶S的表達(dá)(Leon and Fernandez, 2007)。然而，由于這些微細(xì)藻類的獨(dú)特的核特性,異源啟動(dòng)子表達(dá)量的影響，而不是如預(yù)期在高等植物中表達(dá)量高，在藻類中表現(xiàn)出相對(duì)低的表達(dá)水平，且通常為瞬時(shí)表達(dá)。與此相對(duì)，單細(xì)胞綠藻萊茵衣藻的RBCS2啟動(dòng)子比在轉(zhuǎn)基因鹽藻中使用35S啟動(dòng)子表現(xiàn)出更高的效率(Sun et al.，2005)。在羽狀娃藻Cylindrothecafusiformis和中心娃藻海鏈藻(Poulsenand Kroger.2005)中用內(nèi)源的巖藻黃素葉綠素a/c結(jié)合蛋白(fcp)啟動(dòng)子和硝酸還原酶(NR)啟動(dòng)子呈現(xiàn)相對(duì)較高的轉(zhuǎn)化效率(Poulsenet al.，2006)。從娃藻Cylindrotheca fusiformis中克隆的啟動(dòng)子在娃藻三角褐指藻中呈現(xiàn)相對(duì)較高效率的表達(dá)(Miyagawa et al.，2009)。此外和羽狀娃藻Cylindrothecafusiformis和中心娃藻Thalass1sira pseudonana相比，三角褐指藻遺傳轉(zhuǎn)化方法的技術(shù)限制，其轉(zhuǎn)換效率都比較低。因此，新型和有效的內(nèi)源性啟動(dòng)子的功能研究是外源基因在三角褐指藻高效表達(dá)的重要因素。
[0008] 綠色熒光蛋白是真核細(xì)胞中基因表達(dá)的定量基因(Soboleski，2004)。含綠色熒光蛋白(GFP)標(biāo)記基因的質(zhì)粒DNA可通過(guò)蛋白免疫印跡法和細(xì)胞熒光來(lái)檢測(cè)該蛋白質(zhì)的表達(dá)(Tolonen et al.，2006)。Scott等人已成功將綠色突光蛋白報(bào)告基因在衣藻Chlamydomonas reinhardtii 葉綠體中表達(dá)(Scott Franklin, 2002)。Li 等人在轉(zhuǎn)基因鹽藻成功表達(dá)硝酸還原酶誘導(dǎo)的綠色突光蛋白表達(dá)(Li et al.，2007)。Niu等人在三角褐指藻中成功建立誘導(dǎo)表達(dá)綠色熒光蛋白表達(dá)系統(tǒng)(Niu et al.，2012)。
[0009]目前微生物油脂的高額生產(chǎn)成本阻礙了其大規(guī)模產(chǎn)業(yè)化.提高產(chǎn)油微生物中的油脂含量是解決成本問(wèn)題的一個(gè)關(guān)鍵。然而，無(wú)論是在微生物還是植物中，油脂含量的提高都是一個(gè)具有較大難度的工作。研究者曾采取各種各樣的方法，包括基因修飾等方法來(lái)去除可能對(duì)油脂積累有阻礙作用的物質(zhì)，但這些嘗試都失敗了，或者說(shuō)油脂產(chǎn)量的提高不顯著(10%~15% ) (Rafledge et al.2010)。近年來(lái)研究證實(shí)，油脂積累期間蘋果酸酶活力的降低和油脂積累程度有直接的聯(lián)系.因此研究蘋果酸酶在產(chǎn)油藻類中的調(diào)控作用，對(duì)于實(shí)現(xiàn)提高產(chǎn)油生物中的油脂含量具有重大意義(Rafledge et al.2006)。
[0010]蘋果酸酶(ME)催化不可逆的氧化脫羧反應(yīng)，使蘋果酸氧化脫羧形成丙酮酸和CO2 的過(guò)程需要輔酶 NAD(P) +和二價(jià)離子的參與(Chang and Tong2003 ；Vongsangnak, etal.2012)。按輔酶專一性和對(duì)底物的選擇性可以將蘋果酸酶分為3類:第I類是NAD+依賴型ME (NAD — ME) (EC1.1.1.38)，具有催化草酰乙酸脫羧的能力；第2類是能同時(shí)利用NAD+和NADP+的ME (NADP—ME) (EC1.1.1.39)，但利用NAD+時(shí)活性更高，不能催化草酰乙酸脫羧；第3類是NADP+依賴型ME(EC1.1.1.40)，也具有催化草酰乙酸脫羧的能力。產(chǎn)油藻類中的蘋果酸酶主要是第3類。
[0011]反應(yīng)產(chǎn)生的NAD(P)H對(duì)脂肪酸生成至關(guān)重要，為細(xì)胞代謝提供了必須的還原力(Wynn, et al.1999 ；ffynn and Ratledgel997 ；ffynn and Ratledge2000)。研究報(bào)道 ME 廣泛地存在于各類生物體中參與著各類代謝路徑，如脂肪生成、能量代謝、乙酸代謝、厭氧生長(zhǎng)以及光合作用(Wynn, etal.1999 ;Moreadith and Lehninger 1984 ;Hi 11 et al.1996 ；Goodridge et al.1996)。
[0012]雖然微生物代謝途徑中有許多生成NADPH的過(guò)程，但脂肪酸合成酶幾乎只能利用由蘋果酸酶產(chǎn)生的NADPH。因此，蘋果酸酶可能產(chǎn)生了一個(gè)單獨(dú)的NADPH池，這個(gè)單獨(dú)的NADPH池與脂肪酸合成酶直接偶聯(lián).使得產(chǎn)生的NADPH優(yōu)先進(jìn)入脂肪酸合成途徑，或者說(shuō)產(chǎn)油微生物中脂肪酸合成酶和蘋果酸酶等可能有機(jī)地復(fù)合在一起，形成脂代謝體(Lipogenicmetabolon) (Wynn, et al.2001)。還沒(méi)有研究指出其他的NADPH生成酶有提供脂肪酸合成酶所需還原力的功能。因此蘋果酸酶可能是產(chǎn)油微生物中唯一可以提供脂肪酸生物合成所需NADPH的酶。
[0013]基于蘋果酸酶對(duì)微生物油脂積累的重要調(diào)控作用，如果能鑒定和分離產(chǎn)油微生物的蘋果酸酶基因，利用基因工程手段選擇性增加或降低蘋果酸酶的活性，將有利于定向獲得功能性油脂及次生代謝產(chǎn)物。
[0014]目前，已經(jīng)有一些關(guān)于脂質(zhì)積累與ME關(guān)系的研究。有些研究表明ME的表達(dá)與動(dòng)物脂肪組織中脂肪形成的關(guān)系(Al-Dwairi, et al.2012 ；Zhou, et al.2012)，ME基因還與月旨質(zhì)合成與分泌以及II型糖尿病相關(guān)(Bourneuf, et al.2006 ；Ibrahim, et al.2010)。在特定的啟動(dòng)子gpdl的控制下在Mucor circinelloides中過(guò)表達(dá)ME基因,轉(zhuǎn)化株ME的活性是野生型的2-3倍、脂質(zhì)積累是野生型的2.5倍(Zhang et al.2007)。還有研究表明過(guò)表達(dá)ME的大腸桿菌在有蘋果酸的培養(yǎng)基中培養(yǎng)，能產(chǎn)生更多的NADPH，使轉(zhuǎn)化株的細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)積累提高4倍。共表達(dá)乙酰輔酶A羧化酶與蘋果酸酶能夠顯著地提高總脂產(chǎn)量，轉(zhuǎn)化株的脂質(zhì)含量比野生型的脂質(zhì)含量提高了 5.6倍(Meng，et al.2011)。異源表達(dá)ME也能夠提高 ME 的活性和脂質(zhì)積累。Mucor circinelloides 的 ME 基因在 Rhodotorula glutinis中過(guò)表達(dá)，使得Rhodotorula glutinis轉(zhuǎn)化株在脂質(zhì)積累的末期ME活性及脂質(zhì)含量都增加了兩倍多(Li, et al.2013)。
[0015]相反有研究表明，加入抑制因子的Mucor circinelloide的ME活性顯著下降，因?yàn)橐种埔蜃幽軌蛞种浦|(zhì)代謝從而降低ME的活性(Kendrick，et al.1992)。


【發(fā)明內(nèi)容】

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[0016]本發(fā)明的第一個(gè)目的是提供一種過(guò)表達(dá)蘋果酸酶基因的重組載體。
[0017]本發(fā)明的過(guò)表達(dá)蘋果酸酶基因的重組載體，是一個(gè)多功能的微藻轉(zhuǎn)化載體。該重組載體包括篩選標(biāo)記基因表達(dá)盒及目的基因表達(dá)盒；所述的篩選標(biāo)記基因表達(dá)盒包括抗性篩選基因，在抗性篩選基因的上游融合了大腸桿菌Pl啟動(dòng)子，抗性篩選基因的下游融合了大腸桿菌CCdB終止子；所述的目的基因表達(dá)盒包括三角褐指藻fcpC基因啟動(dòng)子、蘋果酸酶基因、三角褐指藻fcpA基因終止子及一個(gè)Omega leader序列，所述的Omega leader序列在三角褐指藻fcpC基因啟動(dòng)子的下游。
[0018]所述的大腸桿菌Pl啟動(dòng)子的序列如SEQ ID N0.1所示，大腸桿菌ccdB終止子的序列如SEQ ID N0.2所示，三角褐指藻fcpC基因啟動(dòng)子的序列如SEQ ID N0.3所示，蘋果酸酶基因的序列如SEQ ID N0.4所示，三角褐指藻fcpA基因終止子的序列如SEQ ID N0.5所不，Omega leader 序列如 SEQ ID N0.6 所不。
[0019]所述的目的基因表達(dá)盒，優(yōu)選在三角褐指藻fcpC基因啟動(dòng)子和三角褐指藻fcpA基因終止子之間通過(guò)不依賴于連接反應(yīng)的高效克隆方法引入上游XcmI序列和下游XcmI序列，形成了目的基因TA克隆位點(diǎn)，所述的XcmI序列如SEQ ID N0.7所示。
[0020]所述的目的基因表達(dá)盒，優(yōu)選在三角褐指藻fcpA基因終止子前融合一個(gè)MYC標(biāo)簽序列，所述的MYC標(biāo)簽序列如SEQ ID N0.8所示。
[0021]所述的抗性篩選基因，優(yōu)選為氯霉素酰基轉(zhuǎn)移酶基因，其核苷酸序列如SEQ IDN0.9所示。
[0022]所述的表達(dá)盒是指含有啟動(dòng)子、目的基因或目的基因克隆位點(diǎn)和終止子、且其中的基因能正常進(jìn)行轉(zhuǎn)錄和翻譯的序列。
[0023]所述的融合為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的DNA片段連接技術(shù)。
[0024]不依賴于連接反應(yīng)的高效克隆方法(LIC)屬于現(xiàn)有技術(shù)。
[0025]本發(fā)明的第二個(gè)目的是提供所述的過(guò)表達(dá)蘋果酸酶基因的重組載體在構(gòu)建高效的微藻生物產(chǎn)油器中的應(yīng)用。
[0026]所述的微藻，優(yōu)選為三角褐指藻。
[0027]本發(fā)明的過(guò)表達(dá)蘋果酸酶基因的重組載體包括2個(gè)基因表達(dá)盒，一個(gè)為篩選標(biāo)記基因表達(dá)盒，另一為目的基因表達(dá)盒。篩選標(biāo)記基因表達(dá)盒集成了真核和原核的表達(dá)盒，采用氯霉素酰基轉(zhuǎn)移酶基因作為抗性篩選基因，其上游融合了來(lái)自大腸桿菌的Pl啟動(dòng)子和三角褐指藻fcpC基因啟動(dòng)子，下游融合了大腸桿菌CCdB終止子和三角褐指藻fcpA基因終止子。該融合表達(dá)盒使得氯霉素酰基轉(zhuǎn)移酶基因既能在大腸桿菌中表達(dá)，又能在三角褐指藻中表達(dá)。該設(shè)計(jì)有效減小了表達(dá)載體的大小，便于載體的克隆操作以及高效的轉(zhuǎn)化。本發(fā)明中采用了三角褐指藻的內(nèi)源性的高效啟動(dòng)子fcpC，fcpC與三角褐指藻的光合作用相關(guān)，因此具有極高的啟動(dòng)效率，是理想的構(gòu)建載體元件。
[0028]目的基因表達(dá)盒，用于表達(dá)外源基因，采用三角褐指藻的高表達(dá)水平的fcpC基因的啟動(dòng)子及終fcpA基因的終止子。目的基因表達(dá)盒內(nèi)通過(guò)特別設(shè)計(jì)的2個(gè)XcmI內(nèi)切酶位點(diǎn)引入了 TA克隆的連接方式。XcmI酶切線性化的載體即可直接一個(gè)步驟克隆Taq聚合酶PCR的產(chǎn)物。在三角褐指藻fcpC基因啟動(dòng)子的后面融合了一個(gè)Omega leader序列，曾有相關(guān)研究表明，把CaMV35S啟動(dòng)子-419~_90(E12)序列與omega序列相串聯(lián)，⑶S基因在轉(zhuǎn)基因煙草中有最大的表達(dá)活性。用這種結(jié)構(gòu)增強(qiáng)⑶S基因表達(dá)，在轉(zhuǎn)基因煙草中⑶S活性比僅僅用CaMV35S啟動(dòng)子高20-70倍(Mitsuhara et al., 1996)。由此可以看出，omega序列具有提聞啟動(dòng)子活性進(jìn)而提聞目的基因表達(dá)的作用。
[0029]在三角褐指藻fcpA基因終止子的前面，添加的另外一個(gè)序列MYC-tag，具有高效，可靠，穩(wěn)定的特性屬于被廣泛應(yīng)用的成熟的理想的蛋白標(biāo)簽。在1985年就有相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道將MYC序列位于終止密碼子之前,用于western blot檢測(cè)目的基因的表達(dá)(Evan etal.，1985)。MYC-tag應(yīng)用于本發(fā)明的過(guò)表達(dá)蘋果酸酶基因的重組載體，可以解決一些后續(xù)載體的應(yīng)用問(wèn)題。例如在載體攜帶三角褐指藻的內(nèi)源性基因進(jìn)行過(guò)表達(dá)研究時(shí)，因?yàn)闊o(wú)內(nèi)源性基因表達(dá)的蛋白與藻細(xì)胞內(nèi)自身表達(dá)的蛋白相同，無(wú)法使用特定的抗體進(jìn)行檢測(cè)，MYC標(biāo)簽可以方便可靠的檢測(cè)出基因是否成功的導(dǎo)入了細(xì)胞中。另一方面，對(duì)于其他非三角褐指藻內(nèi)源性的基因的攜帶導(dǎo)入實(shí)驗(yàn)中，也可以不必再針對(duì)不同的蛋白而使用不同的抗體，而可以統(tǒng)一使用MYC抗體進(jìn)行檢測(cè)，節(jié)約了成本。
[0030]本發(fā)明的過(guò)表達(dá)蘋果酸酶基因的重組載體比較小，適合轉(zhuǎn)化，容易操作，都是三角褐指藻的同源序列，利于表達(dá)。
[0031]本發(fā)明的過(guò)表達(dá)蘋果酸酶基因的重組載體能夠在微藻中進(jìn)行過(guò)表達(dá)蘋果酸酶基因。蘋果酸酶(ME)催化不可逆的氧化脫羧反應(yīng)，使蘋果酸氧化脫羧形成丙酮酸和CO2的過(guò)程需要輔酶NAD (P) + 和二價(jià)離子的參與(Chang and Tong2003 ；Vongsangnak, et al.2012),反應(yīng)產(chǎn)生的NAD(P)H對(duì)脂肪酸生成至關(guān)重要，為細(xì)胞代謝提供了必須的還原力。雖然微生物代謝途徑中有許多生成NADPH的過(guò)程，但脂肪酸合成酶幾乎只能利用由蘋果酸酶產(chǎn)生的NADPH。因此，蘋果酸酶可能產(chǎn)生了一個(gè)單獨(dú)的NADPH池，這個(gè)單獨(dú)的NADPH池與脂肪酸合成酶直接偶聯(lián).使得產(chǎn)生的NADPH優(yōu)先進(jìn)入脂肪酸合成途徑，或者說(shuō)產(chǎn)油微生物中脂肪酸合成酶和蘋果酸酶等可能有機(jī)地復(fù)合在一起，形成脂代謝體(Lipogenic metabolon)(Wynn, et al.2001)。還沒(méi)有研究指出除了蘋果酸酶和6-磷酸葡萄糖脫氫酶以外的其他NADPH生成酶有提供脂肪酸合成酶所需還原力的功能。因此蘋果酸酶可能是產(chǎn)油微生物中少有的可以提供脂肪酸生物合成所需NADPH的酶。通過(guò)過(guò)表達(dá)蘋果酸酶基因能夠顯著地提高微藻細(xì)胞內(nèi)的脂質(zhì)含量，為生物能源的研究奠定了基礎(chǔ)。

【專利附圖】

【附圖說(shuō)明】
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[0032]圖1為目的基因表達(dá)盒構(gòu)建圖；
[0033]圖2為pHY18表達(dá)載體結(jié)構(gòu)圖，Pnr/Tnr:硝酸還原酶啟動(dòng)子/終止子；PfcpC:三角褐指藻fcpC啟動(dòng)子，TfcpA:三角褐指藻fcpA終止子；CAT:氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶基因；0ri:PUC19質(zhì)粒復(fù)制起點(diǎn)；
[0034]圖3為CAT在大腸桿菌和三角褐指藻中的表達(dá)，A左為商業(yè)化載體pMD19_T轉(zhuǎn)化大腸桿菌；A右為pHY18載體轉(zhuǎn)化大腸桿菌(LB培養(yǎng)基含3511^171氯霉素)；B左為轉(zhuǎn)化載體pHY18-eGFP的三角褐指藻生長(zhǎng)在25011^1/1氯霉素f/2_si培養(yǎng)基中，B右為野生型三角褐指藻；
[0035]圖4為PCR驗(yàn)證和微藻蛋白質(zhì)印跡分析，A為用引物P201和P202PCR擴(kuò)增轉(zhuǎn)化eGFP基因融合，其中，泳道1:轉(zhuǎn)基因株系，泳道2:未轉(zhuǎn)基因藻株，泳道M:100bp Marker，箭頭表示0.7-kb的eGFP的條帶；B為Western blot分析用抗Myc及抗GFP抗體檢測(cè)綠色突光蛋白，β-actin作為內(nèi)部對(duì)照基因和探討，泳道1:未轉(zhuǎn)基因藻株，泳道2:轉(zhuǎn)基因株系；
[0036]圖5共聚焦顯微鏡觀察eGFP基因，A為轉(zhuǎn)基因三角褐指藻株，B為未轉(zhuǎn)化的三角褐指藻B;
[0037]圖6為ME基因的PCR擴(kuò)增結(jié)果圖，泳道M為10bp的ladder marker ;泳道I和泳道2為ME基因的擴(kuò)增結(jié)果；
[0038]圖7為ME基因編碼的蛋白序列的進(jìn)化樹(shù)；
[0039]圖8為PtME_pHY18重組質(zhì)粒的BamH I酶切圖，泳道Ml為Ikb的ladder marker ；泳道M2為10bp的ladder marker ;泳道I為PtME_pHY18重組質(zhì)粒的BamH I酶切結(jié)果；泳道2為PtME-pHY18重組質(zhì)粒；
[0040]圖9為PtME_pHY18重組質(zhì)粒的引物圖譜；
[0041]圖10為抗生素篩選陽(yáng)性三角褐指藻的培養(yǎng)結(jié)果照片，其中，A為200mg.l-1氯霉素平板篩選陽(yáng)性藻的照片，Wildtype為未轉(zhuǎn)化藻,Transgenic為轉(zhuǎn)化藻；B為200mg *L_1氯霉素濃度的f/2培養(yǎng)基培養(yǎng)轉(zhuǎn)化藻和未轉(zhuǎn)化藻,Wild type為未轉(zhuǎn)化藻,Transgenic為轉(zhuǎn)化藻；
[0042]圖11為轉(zhuǎn)化藻的三角褐指藻的單細(xì)胞PCR驗(yàn)證結(jié)果，泳道M為10bp的laddermarker ;泳道I為以野生型的藻為DNA為模板，以引物Pt51+Pt52的擴(kuò)增結(jié)果；泳道2為以野生型的藻為DNA為模板，以引物Pt89+Pt92r的擴(kuò)增結(jié)果；泳道3_6為以轉(zhuǎn)化藻DNA為模板，分別以 Pt51+Pt52、Pt51+Pt92r、Pt89+Pt52、Pt89+Pt92r 為 PCR 引物的擴(kuò)增結(jié)果。
[0043]圖12為轉(zhuǎn)化藻的Southernblot驗(yàn)證分析圖，其中control為未轉(zhuǎn)化藻，ME-2為轉(zhuǎn)化藻中脂質(zhì)積累較多的一株；
[0044]圖13為轉(zhuǎn)化藻的MYC蛋白的Western blot分析圖，其中，control為未轉(zhuǎn)化藻，MEl為轉(zhuǎn)化藻株I ;ME2為轉(zhuǎn)化藻株2 ；
[0045]圖14為ME基因表達(dá)蛋白的蛋白定位的膠體金免疫電鏡圖，A為野生型的三角褐指藻，B為過(guò)表達(dá)ME基因的轉(zhuǎn)基因三角褐指藻，OB為油體；Mt為線粒體；Ch為葉綠體；
[0046]圖15為轉(zhuǎn)化藻中的ME基因的qPCR分析圖；
[0047]圖16為轉(zhuǎn)化藻的ME的酶活檢測(cè)結(jié)果；
[0048]圖17，A為尼羅紅染色測(cè)定每106細(xì)胞的轉(zhuǎn)化藻和未轉(zhuǎn)化藻的中性脂質(zhì)含量；B為每ml藻液的轉(zhuǎn)化藻和未轉(zhuǎn)化藻的中性脂質(zhì)含量；C為轉(zhuǎn)化藻和未轉(zhuǎn)化藻的生長(zhǎng)曲線；D為轉(zhuǎn)化藻和未轉(zhuǎn)化藻缺氮48小時(shí)和96小時(shí)后的中性脂質(zhì)含量；
[0049]圖18為轉(zhuǎn)化藻和未轉(zhuǎn)化藻的激光掃描共聚焦顯微鏡檢測(cè)圖，A為轉(zhuǎn)化藻；B為未轉(zhuǎn)化藻。

【具體實(shí)施方式】
:
[0050]以下實(shí)施例是對(duì)本發(fā)明的進(jìn)一步說(shuō)明，而不是對(duì)本發(fā)明的限制。
[0051]本發(fā)明所使用的限制性內(nèi)切酶、T4DNA連接酶、NEB高保真Pfu聚合酶(購(gòu)自NewEnglandB1labsjUSA);所有引物及核苷酸序列的合成委托生工生物工程(上海)股份有限公司完成。大腸桿菌DH5ci感受態(tài)細(xì)胞購(gòu)自廣州鼎國(guó)生物有限公司。
[0052]過(guò)表達(dá)蘋果酸酶基因的重組載體構(gòu)建過(guò)程中所使用的引物序列如表1所示。
[0053]表1:載體設(shè)計(jì)中使用的引物
[0054]

【權(quán)利要求】
1.一種過(guò)表達(dá)蘋果酸酶基因的重組載體，其特征在于，包括篩選標(biāo)記基因表達(dá)盒及目的基因表達(dá)盒；所述的篩選標(biāo)記基因表達(dá)盒包括抗性篩選基因，在抗性篩選基因的上游融合了大腸桿菌Pl啟動(dòng)子，抗性篩選基因的下游融合了大腸桿菌CCdB終止子；所述的目的基因表達(dá)盒包括三角褐指藻fcpC基因啟動(dòng)子、蘋果酸酶基因、三角褐指藻fcpA基因終止子及一個(gè)Omega leader序列，所述的Omega leader序列在三角褐指藻fcpC基因啟動(dòng)子的下游； 所述的大腸桿菌Pl啟動(dòng)子的序列如SEQ ID N0.1所示,大腸桿菌ccdB終止子的序列如SEQ ID N0.2所示，三角褐指藻fcpC基因啟動(dòng)子的序列如SEQ ID N0.3所示，蘋果酸酶基因的序列如SEQ ID N0.4所示,三角褐指藻fcpA基因終止子的序列如SEQ ID N0.5所示，Omega leader 序列如 SEQ ID N0.6 所不。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的過(guò)表達(dá)蘋果酸酶基因的重組載體，其特征在于，所述的目的基因表達(dá)盒，其中在三角褐指藻fcpC基因啟動(dòng)子和三角褐指藻fcpA基因終止子之間通過(guò)不依賴于連接反應(yīng)的高效克隆方法引入上游XcmI序列和下游XcmI序列，形成了目的基因TA克隆位點(diǎn)，所述的XcmI序列如SEQ ID N0.7所示。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的過(guò)表達(dá)蘋果酸酶基因的重組載體，其特征在于，所述的目的基因表達(dá)盒，在三角褐指藻fcpA基因終止子前融合一個(gè)MYC標(biāo)簽序列，所述的MYC標(biāo)簽序列如SEQ ID N0.8所示。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的過(guò)表達(dá)蘋果酸酶基因的重組載體，其特征在于，所述的抗性篩選基因?yàn)槁让顾仵；D(zhuǎn)移酶基因，其核苷酸序列如SEQ ID N0.9所示。
5.權(quán)利要求1所述的過(guò)表達(dá)蘋果酸酶基因的重組載體在構(gòu)建高效的微藻生物產(chǎn)油器中的應(yīng)用。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的過(guò)表達(dá)蘋果酸酶基因的重組載體在構(gòu)建高效的微藻生物產(chǎn)油器中的應(yīng)用，其特征在于，所述的微藻為三角褐指藻。
【文檔編號(hào)】C12N1/13GK104131024SQ201410329101
【公開(kāi)日】2014年11月5日 申請(qǐng)日期:2014年7月10日 優(yōu)先權(quán)日:2014年7月10日
【發(fā)明者】李宏業(yè), 薛姣, 楊維東, 劉潔生 申請(qǐng)人:暨南大學(xué)