一株有效抑制煙草青枯病菌及玉米紋枯病菌的多粘類芽孢桿菌的制作方法
【專利摘要】本發明涉及一株能有效抑制煙草青枯病菌(Ralstonia?solanacearum)和玉米紋枯病菌(Rrizoctonia?solani)的多粘類芽孢桿菌(Paenibacillus?polymyxa)的分離及應用，屬于微生物【技術領域】。多粘類芽孢桿菌(P.polymyxa)C2c分離自泰安小麥根際，能有效抑制煙草青枯病菌和玉米紋枯病菌的生長，尤其是對煙草青枯病菌的室內抑菌效果超過化學藥劑80％福美雙水分散粒劑。C2c對玉米大斑病菌(Exserohilum?turcicum)、小麥赤霉病菌(Fusarium?graminearum)和煙草炭疽病菌(Colletotrichum?nicotianae)等也有很好的抑制作用。
【專利說明】一株有效抑制煙草青枯病菌及玉米紋枯病菌的多粘類芽孢 桿菌

【技術領域】
[0001] 本發明屬微生物學領域，涉及一株多粘類芽孢桿菌（Paenibacillus polymyxa)的 分離及應用，特別是涉及一株能有效抑制煙草青枯病菌（Ralstonia solanacearum)和玉米 紋枯病菌（Rrizoctonia solani)生長的多粘類芽孢桿菌。

【背景技術】
[0002] 由青枯勞爾氏菌（Ralstonia solanacearum)引起的青枯病是煙草上最具毀滅性 的細菌性病害，發生面積廣，是對煙葉產量及品質造成重大損失的系統性侵染病害。該病廣 泛分布于世界熱帶、亞熱帶及溫暖濕潤的地區。1940年前后，該病在美國和印度尼西亞的危 害最為嚴重，此后，在日本、澳大利亞、韓國等許多產煙國家逐漸演變為煙草上的重要病害 (朱賢朝等，2002)。煙草青枯病在我國南方每年都有發生，近些年已經發展到北方煙區，成 為我國煙葉生產上的重要制約因素。
[0003] 玉米是我國重要的糧食、飼料作物及工業原料，在我國國民經濟和農業生產上占 有重要地位，玉米生產直接關系著我國糧食戰略安全。近年來玉米紋枯病（Rhizoctonia solani)的發生呈上升趨勢，危害日益加重，制約了玉米生產的發展。
[0004] 因為化學農藥的長期不合理大量使用會引發抗藥性、殘留和病蟲再猖獗等3R問 題，生物防治在植物病害防治中的作用越來越受重視。土壤中的一些微生物，對植物病原菌 有良好的抑制作用，在植物病害防治中有重要的應用價值。類芽孢桿菌屬（Paenibacillus) 中的許多菌株，特別是多粘類芽孢桿菌（P. polymyxa)分布廣、數量多，營養需求簡單、繁殖 快、競爭定殖力強，可產生多種抗生素和活性物質。多粘類芽孢桿菌（P. polymyxa)在多種 作物上有促生及抑菌抗病作用，我國農業部已將多粘類芽孢桿菌屬（Paenibacillus)列為 免做安全鑒定的一級菌種（楊少波等，2008)。Egamberdiyeva(2007)證實多粘類芽孢桿菌 (P. polymyxa)可以促進玉米對氮、磷、鉀等營養物質的吸收從而起到促生作用。
[0005] 本發明從小麥根際分離到1株多粘類芽孢桿菌C2c，能有效抑制煙草青枯病菌 (R. solanacearum)和玉米紋枯病菌（R. solani)的生長，尤其是其對煙草青枯病菌的抑制 效果超過80%福美雙水分散粒劑，對玉米大斑病菌（Exserohilum turcicum)、小麥赤霉病 菌（Fusarium graminearum)等多種病原真菌也有很好的抑制效果。


【發明內容】

[0006] 本發明的目的是提供1株抑制煙草青枯病菌（R. solanacearum)和玉米紋枯病菌 (R. solani)生長的多粘類芽孢桿菌（P. polymyxa)。
[0007] 本發明是采用如下技術方案實現的：生防菌株分離自山東小麥根際。采用紙碟片 法，篩選出對煙草青枯病菌具有良好抑制作用的拮抗菌株，命名為C2c。通過對C2c菌株16S rDNA序列測定及系統進化分析將其鑒定為多粘類芽孢桿菌（Paenibacillus. polymyxa)。 測定了生防菌株C2c的抑菌譜，證明其對玉米紋枯病菌等多種病原真菌也有非常好的抑制 效果。
[0008] 保藏信息
[0009] 保藏時間：2014年6月19日
[0010] 保藏單位名稱：中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心CGMCC
[0011] 保藏編號：CGMCC N0. 9361
[0012] 保藏單位地址：北京市朝陽區北辰西路1號院3號
[0013] 分類命名：多粘類芽孢桿菌

【專利附圖】

【附圖說明】
[0014] 圖1為多粘類芽孢桿菌C2c對煙草青枯病菌的抑制作用
[0015] 圖2為根據C2c 16S rDNA序列構建的系統發育樹
[0016] 圖3為多粘類芽孢桿菌C2c與80%福美雙水分散粒劑（稀釋100倍、200倍）對 煙草青枯病菌的抑制作用
[0017] 圖4為多粘類芽孢桿菌C2c對不同病原真菌的拮抗作用：
[0018] a圖為玉米紋枯病菌；b圖為玉米大斑病菌；c圖為玉米青枯病菌；d圖為小麥赤霉 病菌。

【具體實施方式】
[0019] 下面結合具體實施例，進一步闡述本發明。應理解這些實施例僅用于說明本發明 而不用于限制本發明的范圍。下列實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規條 件進行。
[0020] 實施例1 :生防菌的分離和保存
[0021] 根據方中達（1979)的方法篩選生防菌株。采集小麥根際土壤10g，加入到盛有 90mL無菌水的三角瓶中，將三角瓶置搖床上，180r/min振蕩20min，制成土壤懸液。將制備 好的土壤懸液靜置lOmin，采用10倍系列稀釋法，依次稀釋到10'10'ΚΓ 4和ΚΓ5,每個濃 度吸取100 μ L于NA平板上，涂布均勻，每個濃度重復三次。將平板于28°C恒溫培養箱中培 養24h。挑取細菌菌落進行劃線，純化三次后測定抑菌效果，篩選有抑菌活性的菌株。
[0022] 實施例2 :生防菌對煙草青枯病的抑菌效果
[0023] 將煙草青枯菌于TTC培養基上活化，生防菌于LB培養基上活化，挑取單菌落于LB 液體培養基中，放置28°C震蕩培養箱，180rpm，培養6-8h，8000rpm離心5min，收集菌體，用 無菌水重懸，調節濃度為1. 0 X 109cfu/mL。
[0024] 采用紙碟片法，在預先準備的LB平板中央放置直徑為7mm的紙碟片，在紙碟片上 加生防菌菌懸液10 μ L，待培養基將生防菌充分吸收后，倒置于28°C培養箱培養24h。將平 板轉移到通風櫥內噴施煙草青枯病菌菌懸液。噴霧要均勻一致，溶液霧化程度高，使霧化菌 懸液自然散落于培養基上，避免形成明顯液滴，沖散原有菌落。待平板表面液滴充分吸收后 將平板轉移到28°C恒溫培養箱，24h后十字交叉法測量抑菌圈直徑。
[0025] 結果表明生防菌C2c對煙草青枯病菌有很好的抑菌效果，接種煙草青枯病菌24h 后，C2c抑菌圈直徑達77. 05mm(圖1)。
[0026] 實施例3 :菌株C2c的鑒定
[0027] 利用引物 16S-8-F(5' -CAC GGA TCC AGA GTT TGA TYM TGG CTC AG-3')和 leS-lSlO-Rb' -CCG GGT TTC CCC ATT CGG-3')擴增菌株 C2c 的 16S rDNA。擴增 體系為：10XPCR Buffer2. 5μ L，dNTP(2. 5mmol/L) 1· Ομ L，16S-8-F(10moL/L) 1· Ομ L， 16S-1510-R(10moL/L)1.0yL，模板DNA 1.0yL，Taq DNA聚合酶（5U/L)0.125yL，加 ddH20至終體積25. Ο μ L ;以ddH20替代模板的體系作為陰性對照擴增體系。擴增程序為 94°C 3min ;94°C 30s，57°C 30s，72°C lmin50s，30 個循環；72°C lOmin ;4°C保存。反應結束 后，將PCR產物置于1. Ο %瓊脂糖凝膠進行電泳分析。參照美國AXYGEN公司PCR純化回 收試劑盒回收PCR產物，將回收的目的片段在4°C中與PMD18-T過夜連接。連接反應體系 為：10\了40嫩1^8&86 1311打61'14 1^，？]\?18-1'(50叩/^1^)0.3 4 1^，目的0嫩7.7 4 1^，了40嫩 Ligase(350U/y L) 1 μ L〇
[0028] 熱激法將連接產物轉化感受態細胞：將100 μ L大腸桿菌感受態細胞置于冰上融 化，加入10 μ L連接產物，輕輕攪動以混勻，將混合物于冰上放置25min，然后42°C水浴熱激 90S，迅速冰上放置5min，加800 μ L LB液體培養基（不含抗生素），混勻，37°C，180r/min振 蕩45min。8000rpm離心2min，取出800 μ L上清，重懸菌體，將菌體均勻涂在含有氨芐青霉 素的抗生素平板上，然后將平板正向放置30min，37°C倒置培養14-16h。挑去單菌落于含有 液體LB培養基（含氨芐抗生素0. lmg/mL)的試管中，37°C，180r/min，震蕩培養4-6h，保存 于2. OmLl離心管中。
[0029] 堿裂解法提取質粒DNA(韓志勇等，2000)。將提取的質粒置于1. 0%瓊脂糖凝膠進 行電泳，以空PUC18質粒作為對照。將含有重組質粒的菌株，以菌液形式送測序公司測序。 每個菌液樣品送2個克隆。將測序結果在NCBI上BLAST，利用Mega軟件構建系統發育樹。
[0030] 電泳檢測表明，從C2c基因組中擴增到了大約1.5kb的片段。經測定，C2c 16S rDNA序列長為1517nt，具體序列如SEQ. NO. 1所示。
[0031] 在根據16S rDNA序列構建的系統樹中，C2c與多粘類芽孢桿菌（P. polymyxa)聚 類到一支（圖2)。
[0032] 實施例4 :C2c與80%福美雙水分散粒劑對煙草青枯病病菌抑制效果比較
[0033] 采用紙碟片法，測定100倍和200倍稀釋濃度的80%福美雙水分散粒劑以及生防 菌C2c對煙草青枯病病菌抑菌圈直徑。
[0034] 結果表明，C2c的抑菌圈直徑為29. 70mm，100倍稀釋濃度和200倍稀釋濃度的 80%福美雙水分散粒劑對煙草青枯病菌的抑菌圈直徑分別為18. 20mm和14. 30mm，說明多 粘類芽孢桿菌C2c對煙草青枯病的抑制效果明顯超過參試藥劑80%福美雙水分散粒劑（圖 3)。
[0035] 實施例5 :生防菌抑菌譜的測定
[0036] 采用對峙培養法（Si jam等，2005)。在預先準備的直徑為90mm的PDA平板上均勻 對稱放置2片直徑為7mm的紙碟片，在紙碟片上分別滴加生防菌C2c菌懸液10 μ L，待培養 基將生防菌菌液充分吸收后，倒置于28°C恒溫培養箱培養24h。將直徑為6mm的病原真菌 菌餅放置在兩紙碟片中央，封口，最后放入28°C恒溫培養箱中培養。7天后測量病原真菌自 然生長半徑及生防菌處生長半徑，計算抑制率 ：
[0037] 抑制率=(1-生防菌處病菌半徑/對照處病菌半徑）/2X 100%
[0038] 結果表明，C2c對玉米紋枯病菌的抑制率為48. 37%，對玉米大斑病菌的抑制率為 36. 36%，對小麥赤霉病菌的抑制率為36. 67%，對玉米青枯病菌的抑制率分別為34. 44% (圖 4)。
[0039] 以上所述，僅是本發明的個別實施例，并非對本發明作任何形式上的限制，凡是依 據本發明的技術實質對以上實施例所作的任何簡單修改、等同變化與修飾，均仍屬于本發 明技術方案的范圍內。
[0001] <110〉山東農業大學 <120>-株有效抑制煙草青枯病菌及玉米紋枯病菌的多粘類芽孢桿菌 <160>27 <210>1 <211>1517 <212>DNA <Π3>多粘類芽孢桿菌C2c <400>1 1 agagtttgat tatggctcag gacgaacgct ggcggcgtgc ctaatacatg caagtcgagc 61 ggggttattt agaagcttgc ttctaaataa cctagcggcg gacgggtgag taacacgtag 121 gcaaoctgcc cacaagacag ggataactac cggaaacggt agctaataoc cgatacatcc 181 ttttcctgca tgggagaagg aggaaagacg gagtaatctg tcacttgtgg atgggcctgc 241 ggcgcattag ctagttggtg gggtaaaggc ctaccaaggc gacgatgcgt agccgacctg 301 agagggtgat cggccacact gggactgaga cacggcccag actcctacgg gaggcagcag 361 tagggaatct tccgcaatgg gcgaaagcct gacggagcaa cgccgogtga gtgatgaagg 421 ttttcggatc gtaaagctct gttgccaggg aagaacgtct tgtagagtaa ctgctacaag 481 agtgacggta cctgagaaga aagccccggc taactacgtg ccagcagccg cggtaatacg 541 tagggggcaa gcgttgtccg gaattattgg gcgtaaagcg cgcgcaggcg gctctttaag 601 tctggtgttt aatcccgagg ctcaacttcg ggtcgcactg gaaactgggg agcttgagtg 661 cagaagagga gagtggaatt ccacgtgtag cggtgaaatg cgtagagatg tggaggaaca 721 ccagtggcga aggcgactct ctgggctgta actgacgctg aggcgcgaaa gcgtggggag 781 caaacaggat tagataccct ggtagtccac gccgtaaacg atgaatgcta ggtgttaggg 841 gtttcgatac ccttggtgcc gaagttaaca cattaagcat tccgcctggg gagtacggtc 901 gcaagactga aactcaaagg aattgacggg gacccgcaca agcagtggag tatgtggttt 961 aattcgaagc aacgcgaaga accttaccag gtcttgacat ccctctgacc ggtctagaga 1021 taggcctttc cttcgggaca gaggagacag gtggtgcatg gttgtcgtca gctcgtgtcg 1081 tgagatgttg ggttaagtcc cgcaacgagc gcaaccctta tgcttagttg ccagcaggtc 1141 aagctgggca ctctaagcag actgccggtg acaaaccgga ggaaggtggg gatgacgtca 1201 aatcatcatg ccccttatga cctgggctac acacgtacta caatggccgg tacaacggga 1261 agcgaagccg cgaggtggag ccaatcctag aaaagccggt ctcagttcgg attgtaggct 1321 gcaactcgcc tacatgaagt cggaattgct agtaatcgcg gatcagcatg ccgcggtgaa 1381 tacgttcccg ggtcttgtac acaccgcccg tcacaccacg agagtttaca acacccgaag 1441 tcggtgaggt aaccgcaagg ggccagccgc cgaaggtggg gtagatgatt ggggtgaagt 1501 cgtaacaagg taaccct
【權利要求】
1. 一株多粘類芽孢桿菌（Paenibacillus polymyxa)C2c，其特征在于能有效抑制青枯 病菌和立枯絲核菌的生長，現保存于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保 藏單位簡稱：CGMCC ;保藏號：CGMCC NO. 9361 ;其16S rDNA核苷酸序列如SEQ. NO. 1所示。
2. 如權利要求1所述的多粘類芽孢桿菌（Paenibacillus polymyxa)C2c在防治作 物病害中的應用，所述病原菌為青枯勞爾氏菌（Ralstonia solanacearum)和立枯絲核菌 (Rhizoctonia solani)〇
【文檔編號】C12N1/20GK104087540SQ201410331911
【公開日】2014年10月8日 申請日期:2014年7月14日 優先權日:2014年7月14日
【發明者】李向東, 畢濤, 王曉強, 陳秀齋, 田延平 申請人:山東農業大學