Bmpr-1b或prlr基因snp位點預測小尾寒羊泌乳量的方法
【專利摘要】本發明涉及畜牧領域，公開了BMPR-1B或PRLR基因SNP位點預測小尾寒羊泌乳量的方法。本發明所述方法包括：抽提小尾寒羊基因組DNA；擴增含SNP位點BMPR-IB?A746G的序列或含SNP位點PRLR基因E2-C34T的序列；判定BMPR-IB?A746G或PRLR基因E2-C34T突變基因型。應用本發明可根據泌乳控制基因型的不同進行飼養管理，提高泌乳量，保證羔羊有足夠的乳汁攝入，提高成活率，減少養殖經濟損失。本發明為預測和分子選育小尾寒羊泌乳量提供了分子水平的技術支撐，應用本發明將大幅度提高羔羊成活率和發育速度，產生更好的養殖經濟效益，具有良好的應用前景。
【專利說明】
【技術領域】
[0001] 本發明涉及畜牧領域，具體涉及BMPR-1B或PRLR基因 SNP位點預測小尾寒羊泌乳 量的方法。 BMPR-1B或PRLR基因SNP位點預測小尾寒羊泌乳量的方法

【背景技術】
[0002] 小尾寒羊是肉裘兼用型綿羊品種，長發育快、早熟、繁殖力強、性能遺傳穩定、適應 性強，早熟、多胎、多羔：生長快、體格大肉多、肉質好：小尾寒羊4月齡即可育肥出欄，年出 欄率400%以上；體重6月齡可達50千克，周歲時可達100千克，成年羊可達130?190千 克。周歲育肥羊屠宰率55. 6%，凈肉率45. 89%。
[0003] 小尾寒羊繁殖力極強，兩年三產，不少是一年兩產。據統計小尾寒羊平均產羔率為 281. 9%，最多一胎可產9羔。由于產羔較多，存在因母乳不夠或者質量較差，造成羔羊死 亡，成活率很低的問題，造成較大損失；同時，母羊的泌乳存在個體差異，同樣飼養條件下， 同一群體中，同樣的產羔數，有的母羊泌乳量很多，羔羊全部成活，有的母羊泌乳量較少，造 成羔羊因饑餓，營養不良、抗病力下降，進而造成死亡或者發育緩慢，達不到斷奶體重，造成 羔羊斷奶后營養缺乏死亡，造成較大的經濟損失，在飼養管理水平較低的羊場損失更加嚴 重。
[0004] 在斷奶前三個月，由于產羔較多，母羊的泌乳量成為羔羊成活的最為重要的因素 之一。關于家畜的泌乳量的測定及預測，傳統的方法是通過母畜產仔后，通過1-2個泌乳期 泌乳量測定和后裔測定來實現的，如奶牛和奶山羊的泌乳測定，通過一個泌乳期每天的泌 乳量測定來確定其泌乳能力，以及通過女兒的泌乳量的測定來預測父本的泌乳能力大小。 但傳統的方法測定泌乳量，費時費力，只能對過去的選育進行評價，不能很好地預測未來或 者剛出生的家畜。


【發明內容】

[0005] 本發明的發明目的是提供一種BMPR-1B或PRLR基因 SNP位點預測小尾寒羊泌乳 量的方法，包括以下步驟：抽提小尾寒羊基因組DNA ;擴增含SNP位點BMPR-IB A746G的序 列或含SNP位點PRLR基因 E2-C34T的序列；判定BMPR-IB A746G或PRLR基因 E2-C34T突 變基因型。
[0006] BMPR-IB 基因 （bone morphogenetic protein receptor IB BMPR-1B)骨形態蛋白 受體1B基因是屬于BMP家族的I型受體，存在于許多細胞類型中，主要調節細胞生長和 分化。BMPR-1B蛋白首先合成無生物活性的前體蛋白，蛋白水解后形成活性二聚體。活性 二聚體再與受體復合物結合導致I型受體磷酸化，I型受體再作用于受體細胞內的Smadl 和Smad5并使其磷酸化。Smadl和Smad5被激活后再結合Smad4,該復合物進入細胞核后與 PDRII-BF1結合形成一個有活性的轉錄調節復合體，其與特異的啟動基元結合，再作用于下 游的因子，從而影響特定基因的轉錄，進而達到參與細胞生理活動的目的。
[0007] 催乳素受體（prolactin receptor,PRLR)是催乳素行使功能所必需的。催乳素基 因的主要功能是促進哺乳動物個體的乳腺發育、乳汁生成、發動和維持泌乳方面發揮重要 作用。例如，PRLR在垂體PRL與乳蛋白基因的信號轉導過程中起核心作用。兩分子PRLR與 一分子PRL結合，啟動JAK2/STAT5信號傳導途徑，最終激活反式作用因子STAT5,使其作用 于乳蛋白基因啟動子區的靶序列，啟動或增強以乳蛋白基因啟動子為作用元件的靶基因的 表達。
[0008] 發明人對小尾寒羊的BMPR-1B基因研究表明，小尾寒羊中存在BMPR-1B基因 A746G 突變，并與2個月抽樣8次的泌乳量關聯性研究表明，該突變與小尾寒羊的泌乳量密切相 關，小尾寒羊泌乳量呈AA>AG>GG。
[0009] 對小尾寒羊PRLR基因的研究表明，小尾寒羊PRLR基因第二外顯子34位存在一個 C-T突變（記為E2-C34T)，與2個月抽樣8次的泌乳量進行相關性分析，表明該突變與小尾 寒羊的泌乳量密切相關，泌乳量呈CT>TT。
[0010] 同樣飼養條件下，個體泌乳量分泌的差異從根本上講是由控制泌乳的基因造成 的，因此，通過我們通過基因與泌乳性能相關性的研究，確定BMPR-1B基因 A746G突變和 PRLR基因 E2-C34T位點與泌乳量大小密切相關，本發明可通過兩個基因兩個SNP檢測就可 以預測小尾寒羊的泌乳量大小，從而為生產和育種提供技術支撐。
[0011] 本發明還提供一種預測小尾寒羊泌乳量的方法，包括以下步驟：抽提小尾寒羊基 因組DNA ;分別擴增含SNP位點PRLR基因 E2-C34T和PRLR基因 E2-C34T的序列；判定PRLR 基因 E2-C34T及PRLR基因 E2-C34T突變基因型。
[0012] 綜合BMPR-1B基因 A746G位點，PRLR基因 E2-C34T位點及兩個位點基因型組合與 平均總泌乳量的分析，得出結論，BMPR-1B基因 A746G位點和PRLR基因 E2-C34T位點顯著 影響了小尾寒羊母羊的泌乳量，由此我們可以通過檢測BMPR-1B基因 A746G位點和PRLR基 因 E2-C34T位點的基因型，就可以準確地預測小尾寒羊的泌乳量大小。
[0013] 通過BMPR-1B基因和PRLR基因2個SNP位點不同基因型組合分析表明，小尾寒羊 泌乳量呈CT/++>TT/++>CT/B+>TT/B+>CT/BB>TT/BB。通過兩個基因兩個SNP位點的檢測獲 得基因型，就可以預測小尾寒羊的泌乳量大小，也可以通過分子育種選育小尾寒羊高泌乳 量種群。
[0014] 本發明還提供預測小尾寒羊泌乳量的試劑盒，包括基因組DNA抽提試劑、用于擴 增含SNP位點BMPR-IB A746G序列的引物對和或用于擴增含SNP位點PRLR基因 E2-C34T 序列的引物對以及PCR體系反應試劑。
[0015] 本發明的另一個目的是提供檢測SNP位點BMPR-IB A746G的物質或檢測SNP位點 PRLR基因 E2-C34T的物質在制備預測小尾寒羊泌乳量的試劑盒中的應用。
[0016] 基因的選擇是遺傳基礎上的直接選擇，家畜出生即可進行基因的鑒別，從而可以 達到精確選擇和縮短育種進程，在生產中應用本發明，根據泌乳控制基因型的不同，進行飼 養管理，進行后天的補救，提高泌乳量量，保證了羔羊有足夠的乳汁攝入，提高成活率，減少 養殖經濟損失。
[0017] 本發明為預測和分子選育小尾寒羊泌乳量提供了分子水平的技術支撐，應用本發 明將大幅度提高羔羊成活率和發育速度，產生更好的養殖經濟效益，具有良好的應用前景。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0018] 圖1為PRLR基因 E2-C34T位點的測序結果判定。

【具體實施方式】
[0019] 本發明公開了 BMPR-1B基因或PRLR基因 SNP位點預測小尾寒羊泌乳量的方法，本 領域技術人員可以借鑒本文內容，適當改進工藝參數實現。特別需要指出的是，所有類似 的替換和改動對本領域技術人員來說是顯而易見的，它們都被視為包括在本發明。本發明 的方法及應用已經通過較佳實施例進行了描述，相關人員明顯能在不脫離本
【發明內容】
、精 神和范圍內對本文所述的方法和應用進行改動或適當變更與組合，來實現和應用本發明技 術。
[0020] 為了使本領域的技術人員更好地理解本發明的技術方案，下面結合具體實施例對 本發明作進一步的詳細說明。
[0021] 實施例1 :BMPR-1B基因 A746G位點檢測方法
[0022] 1.樣品采集和DNA提取
[0023] 小尾寒羊頸靜脈采血，所采血樣為2_5mL/只綿羊，用肝素鈉抗凝，-20°C凍存。用 酚氯仿抽提法提取基因組DNA，溶于超純水，4°C保存待用。
[0024] 2.弓丨物序列
[0025] 根據綿羊骨形態發生蛋白受體 IB (bone morphogenetic protein receptor IB，BMPR-IB)基因（GenBank登陸號AF357007和AF298885)包含A746G突變位點的序列設 計引物，擴增長度為140bp，引物序列為：
[0026] Forward:5'-GTCGCTATGGGGAAGTTTGGATG-3' ；
[0027] Reverse: 5 ' -CAAGATGTTTTCATGCCTCATCAACACGGTC-3 '。
[0028] 3. PCR-RFLP
[0029] PCR20 μ 1 反應體系組成：Taq DNA 聚合酶（5u/ μ 1) 0· 12 μ 1 ; 10 X PCR 緩沖液 2μ 1 ;MgC12(25mmol/L)2y 1 ;dNTP(2. 5mmol/L)2y 1 ;基因組 DNAlul(50ng 左右）；上游弓丨 物（lOpmol/ml) 1· 0 μ 1 ;下游引物（lOpmol/ml) 1· 0 μ 1 ;最后加水至20 μ 1混勻進行PCR擴 增。
[0030] 采用PCR反應程序如下：94°C，4分鐘；94°C，30秒，62°C，30秒，72°C，30秒共35 個循環，72°C，4分鐘；4°C下保存。
[0031] PCR擴增產物用Avail酶進行酶切，反應總體積為20uL :內切酶（10u/ μ 1)0. 8μ 1 ;10XBuffer2y 1 ;PCR產物· 4μ 1 ;加水至 20μ 1，37。。反應 6h。
[0032] 4.結果判定
[0033] 用Avail內切酶對BMPR-IB A746G突變引物的PCR擴增產物（140bp)進行酶切， 瓊脂糖電泳對酶切產物進行檢測。突變純合子切為110和30bp，雜合子140、110、30bp三條 帶，未突變個體不能被切開。突變純合子命名為BB，雜合子為B+，正常個體為++。
[0034] 實施例2、PRLR基因 E2-C34T位點檢測方法
[0035] 1.樣品采集和DNA提取
[0036] 小尾寒羊頸靜脈采血，所采血樣為2_5mL/只綿羊，用肝素鈉抗凝，-20。C凍存。用 酚氯仿抽提法提取基因組DNA，溶于超純水，4°C保存待用。
[0037] 2. E2-C34T突變位點測序引物序列
[0038] 根據綿羊催乳素受體基因 PRLR第二外顯子序列設計引物，引物序列為：
[0039] Forward:5'-GACGTTTCCTCCACCACAGAT-3'
[0040] Reverse:5'-CCAACACACACGTGCTCAGA-3'
[0041] PCR產物長度為270bp，將PCR產物送上海生工生物有限公司進行序列測定。依據 測序圖譜，判定SNP位點。
[0042] 3.依據測序圖譜判定測序結果見圖1。
[0043] 實施例3、BMPR-1B基因和PRLR基因 SNP位點與泌乳量相關性分析
[0044] 1.小尾寒羊泌乳量測定
[0045] 在同一羊場同一飼養條件下，48只小尾寒羊產蓋后進行每周一次泌乳量的抽樣測 定，連續測定2個月即8次，測定時母羊和羔羊隔離24小時，母羊在擠奶前天晚20. 00點擠 干凈奶隔離，在次日上午8. 00,中午14. 00,晚20. 00進行三次擠奶，并進行稱量和記錄，三 次合并作為該母羊一天的泌乳量，乳汁稱量后反哺給羔羊。
[0046] 2. BMPR-1B基因 A746G位點與泌乳量相關性分析
[0047] 利用SPSS13. 0統計分析軟件，采用最小二乘方差分析BMPR-IB A746G位點不同基 因型個體與泌乳量的相關性，結果見下表1。
[0048] 表1小尾寒羊產泌乳量與BMPR-IB A746G位點的相關性
[0049] 單位：g
[0050]

【權利要求】
1. 一種預測小尾寒羊泌乳量的方法，其特征在于，包括以下步驟：抽提小尾寒羊基因 組DNA ;擴增含SNP位點BMPR-IB A746G的序列；判定BMPR-IB A746G突變基因型。
2. -種預測小尾寒羊泌乳量的方法，其特征在于，包括以下步驟：抽提小尾寒羊基因 組DNA ;擴增含SNP位點PRLR基因 E2-C34T的序列；判定PRLR基因 E2-C34T突變基因型。
3. -種預測小尾寒羊泌乳量的方法，其特征在于，包括以下步驟：抽提小尾寒羊基因 組DNA ;分別擴增含SNP位點PRLR基因 E2-C34T和PRLR基因 E2-C34T的序列；判定PRLR 基因 E2-C34T及PRLR基因 E2-C34T突變基因型。
4. 一種預測小尾寒羊泌乳量的試劑盒，其特征在于，包括基因組DNA抽提試劑、用于擴 增含SNP位點BMPR-IB A746G序列的引物對以及PCR體系反應試劑。
5. -種預測小尾寒羊泌乳量的試劑盒，其特征在于，包括基因組DNA抽提試劑、用于擴 增含SNP位點PRLR基因 E2-C34T序列的引物對及PCR體系反應試劑。
6. -種預測小尾寒羊泌乳量的試劑盒，其特征在于，包括基因組DNA抽提試劑、用于擴 增含SNP位點BMPR-IB A746G序列的引物對、用于擴增含SNP位點PRLR基因 E2-C34T序列 的引物對以及PCR體系反應試劑。
7. 檢測SNP位點BMPR-IB A746G的物質在制備預測小尾寒羊泌乳量的試劑盒中的應 用。
8. 檢測SNP位點PRLR基因 E2-C34T的物質在制備預測小尾寒羊泌乳量的試劑盒中的 應用。
【文檔編號】C12Q1/68GK104087677SQ201410351937
【公開日】2014年10月8日 申請日期:2014年7月22日 優先權日:2014年7月22日
【發明者】史洪才, 牛志剛, 李曉林, 袁燕, 張寧, 賀三剛, 張雪梅, 黃俊成 申請人:新疆維吾爾自治區畜牧科學院中國-澳大利亞綿羊育種研究中心