同時提高小球藻中葉綠素和蛋白質含量的高密度培養方法
【專利摘要】本發明提供一種小球藻高密度培養方法，包括如下步驟，(1)將活化后的小球藻進行連續光照培養，使其處于對數生長期；(2)將步驟(1)中處于對數生長期的小球藻培養液作為種子液，將其接入異養發酵容器中在黑暗條件下進行異養培養，培養溫度為28～35℃，培養時間為3～5天，異養發酵容器中所用培養基其碳氮比為28.4～113.4；(3)將小球藻培養液稀釋至小球藻細胞密度高達10～20?g/L，向小球藻培養液中加入氮源，使小球藻培養液中含有14.7～88.2?mmol/L的氮元素，再對小球藻進行光誘導培養，培養溫度為28～35℃，培養時間為1～3天。該培養方法能同時提高小球藻中蛋白質和葉綠素含量。
【專利說明】同時提高小球藻中葉綠素和蛋白質含量的高密度培養方法

【技術領域】
[0001] 本發明涉及小球藻培養方法，屬于微藻生物【技術領域】，特別涉及一種同時提高小 球藻中葉綠素和蛋白質含量的誘導高密度培養方法。

【背景技術】
[0002] 小球藻是小球藻屬的單細胞綠藻，小球藻生長速度快，蛋白質含量高，氨基酸組 分齊全，能提供人和動物生長所需的必需氨基酸，經大規模培養用作健康食品或水產養 殖餌料。小球藻作為一種新型蛋白資源，在毒性檢測和動物實驗中尚未發現任何不良反 應。小球藻中含有色素、礦物質、維他命和微量元素，是一種與傳統蛋白質資源品質相當甚 至優于傳統蛋白質資源的高價值蛋白質資源。微藻蛋白質的含量是微藻營養價值的主要 決定因素 （Pauline Spolaore, Claire Joannis-Cassan, Elie Duran et al. Commercial applications of microalgae[J]. Journal of Bioscience and Bioengineering, 2006, 10 1 (2) :87-96)。在各個種類微藻中，小球藻其葉綠素含量高，能作為天然色素添加劑應用于食 品加工行業。并且有研究表明，葉綠素具有抗胃潰瘍活性、抗過敏活性、抗腦血管疾病活性 等藥學效應，能用作藥用原料（Nakanishi Koichi. Chlorophyll rich and salt resistant Chlorella. European Patent 1142985[P]2001，10, 10)，葉綠素還能作為色素原料應用于 化妝品行業。
[0003] 小球藻的大規模生產大都采用光合自養方式，主要有開放式水池培養和管道式生 物反應器兩種系統。開放式水池培養具有設備簡單，生產投入資金低等優勢，但是由于光 照、溫度、pH等生長條件不可控，容易受外來生物及雜藻的污染，導致生物量濃度低，加大了 采收難度并提高了采收成本。管道式生物反應器雖然提高了小球藻的受光效率并能有效控 制小球藻的生長條件，但是設備投資成本高，最大的生物量濃度依然偏低。
[0004] 目前，異養培養的小球藻存在蛋白質和葉綠素含量低、油脂含量高的特點，不適宜 用于健康食品或水產養殖。當前，研究者熱衷于利用異養培養提高小球藻油脂含量來生產 油脂制備生物柴油或者利用異養培養生產類胡蘿卜素及其衍生物。而對于如何改善異養 生產的小球藻的細胞組分以使其具備高細胞密度、高蛋白質含量和高葉綠素含量的生產優 勢，還未見相關報道。


【發明內容】

[0005] 本發明為彌補現有技術的不足，提供一種同時提高小球藻中蛋白質和葉綠素含量 的小球藻高密度培養方法。
[0006] 本發明為達到其目的，采用的技術方案如下：一種同時提高小球藻中葉綠素和蛋 白質含量的高密度培養方法，包括如下步驟，
[0007] (1)將活化后的小球藻進行連續光照培養，使其處于對數生長期；
[0008] (2)將步驟（1)中處于對數生長期的小球藻培養液作為種子液，將其接入異養發 酵容器中在黑暗條件下進行異養培養（種子液具體可以按照8 %?40 %的體積接種量進行 接種），培養溫度為28?35°C，培養時間為3?5天，異養發酵容器中所用培養基其碳氮比 為 28. 4 ?113. 4。
[0009] (3)將經過步驟（2)培養獲得的小球藻培養液稀釋至小球藻細胞密度高達10? 20 g/L，向小球藻培養液中加入氮源，使小球藻培養液中含有14. 7?88. 2 mmol/L的氮元 素，再對小球藻進行光誘導培養，培養溫度為28?35°C，培養時間為1?3天。對步驟（2) 培養獲得的小球藻培養液進行稀釋具體可以用Basal培養基來稀釋。
[0010] 步驟（3)中，向小球藻培養液中加入氮源，使小球藻培養液中含有14. 7?88. 2 mm〇l/L的氮元素，在此范圍內有利于在短時間內實現蛋白質和葉綠素最大速度的積累，小 球藻的蛋白質含量和葉綠素含量分別可在較短時間內達到30%以上、及1.5%以上的水 平，達到光自養細胞狀態下蛋白質和葉綠素的自然含量。較為優選的，步驟（3)中，向小球 藻培養液中加入氮源，使小球藻培養液中含有44. 1?88. 2 mmol/L的氮元素，在優選條件 下，小球藻的蛋白質含量和葉綠素含量分別可在較短時間內提高到53%以上、及3%以上 的水平。
[0011] 進一步的，步驟（2)中，異養發酵容器中所用培養基其配方由如下含量的各組分 組成：ΚΗ 2Ρ04 1 200?1300 mg/L、MgS04.7H20 950?1050 mg/L、EDTA-2Na 450?550 mg/L、 H3B03110 ?120 mg/L、CaCl2 ·2Η20 105 ?120 mg/L、FeS04 ·7Η20 45 ?55 mg/L、ZnS04 ·7Η20 85 ?90 mg/L、MnCl2 · 4H20 12 ?16 mg/L、Mo03 6· 5 ?7· 5 mg/L、CuS04 · 5H20 15. 5 ?16 mg/L、（C〇N03)2 ·6Η204. 5?5. 5 mg/L、培養基中還添加有碳源和氮源，其中所述碳源其在培 養基中的含量以使培養基中含有〇. 03?0. 33 mol/L的碳元素為準，所述氮源其在培養基 中的含量以使培養基的碳氮比保持在28. 4?113. 4為準。本發明在步驟（2)的異養階段， 通過調控異養階段培養基的碳氮比為28. 4?113. 4,可使小球藻達到高生物量濃度、高蛋 白質含量和高葉綠素含量，形成有利于后期光誘導的平臺。步驟（2)培養基中的碳氮比進 一步優選為28. 4?38,最優選為28. 4,在優選條件下，異養階段，小球藻的生物量濃度可達 到20g/L以上，蛋白質和葉綠素含量也分別可提高到17%以上、及0.6%以上。
[0012] 優選的，步驟（2)中，異養發酵容器中所用培養基為改良的Basal培養基，其配方 由如下濃度的各組分組成：KH 2P041250 mg/L、MgS04.7H20 1000 mg/L、EDTA-2Na 500 mg/L、 H3B03 114. 2 mg/L、CaCl2 · 2H20 111 mg/L、FeS04 · 7H20 49. 8 mg/L、ZnS04 · 7H20 88. 2 mg/ L、MnCl2 · 4H20 14. 2 mg/L、Mo037. 1 mg/L、CuS04 · 5H20 15. 7 mg/L、（C〇N03)2 · 6H20 4. 9 mg/ L、培養基中還添加有碳源和氮源，其中所述碳源其在培養基中的含量以使培養基中含有 0. 03?0. 33mol/L的碳元素為準，所述氮源其在培養基中的含量以使培養基的碳氮比保持 在28. 4?113. 4為準。培養基中碳元素濃度進一步可優選為0. 25?0. 33 mol/L，更優選 為0. 27?0. 28mol/L(例如向培養基中添加葡萄糖50g/L)。
[0013] 進一步的，步驟（2)中所用培養基，其所加氮源為有機氮源或無機氮源，所述氮源 可選自硝酸鈉、尿素、硝酸鉀、氨水、碳酸氫銨、硫酸銨、硝酸銨等，所加碳源為有機碳源，所 述有機碳源可選自葡萄糖、果糖、蔗糖、淀粉糖、木質纖維素水解物等。
[0014] 進一步的，步驟（3)中向小球藻培養液中加入的氮源為無機氮源，所述無機氮源 選自硝酸鈉、硝酸鉀、碳酸氫銨、硝酸銨、氨水、硫酸銨等。
[0015] 優選的，步驟（3)中，所述光誘導培養為間歇光照培養，光照強度為2000 lux? 20000 lux〇
[0016] 更為優選的，步驟（3)中，進行間歇光照培養的光暗周期為12h/12h。
[0017] 優選的，步驟（1)中，對小球藻進行光照培養所用的培養基為添加有5?15 g/L 葡萄糖的Basal培養基，連續光照培養3?6天。
[0018] Basal 培養基其配方為：1L 水中含有 KH2P041250 mg，MgS04· 7H20 1000 mg， EDTA-2Na500 mg，H3B03 114. 2 mg，CaCl2 · 2H20 111 mg，FeS04 · 7H20 49. 8 mg，ZnS04 · 7H20 88. 2 mg,MnCl2 ·4Η20 14. 2 mg,Mo03 7. 1 mg,CuS04 ·5Η20 15. 7 mg, (CoN03)2 ·6Η20 4. 9 mg。
[0019] 步驟⑵中所述的異養發酵容器選自搖瓶、發酵罐或生物反應器；步驟⑶的光誘 導培養在搖瓶、開放式跑道池、圓池或封閉式的光生物反應器中進行，步驟（1)和/或步驟 (3)所用的光源為自然光或者人工光。
[0020] 所述小球藻選自綠藻門小球藻屬中的蛋白核小球藻（Chlorella pyrenoidosa)、 捕圓小球藻（Chlorella ellipsoidea)、普通小球藻（Chlorella vulgaris)、原殼小球藻 (Chlorella protothecoides)等可發酵培養的小球藻。
[0021] 本發明提供的技術方案具有如下有益效果：
[0022] 1、本發明結合小球藻異養培養的高生物量優勢和光自養培養的高蛋白質和高葉 綠素含量的優勢，提供一種同時提高小球藻中蛋白質和葉綠素含量的高密度誘導培養方 法。該方法基于構建有利于光自養階段小球藻快速恢復光自養能力的異養培養平臺，相對 快速提高異養階段細胞的蛋白質含量和葉綠素含量，實現高細胞密度的異養種子液在光誘 導條件下高效積累蛋白質和葉綠素。采用本發明的小球藻高密度培養方法，既能保持小球 藻的高細胞密度狀態，又能獲得高含量蛋白質和葉綠素，為小球藻作為蛋白質資源、飼料蛋 白資源和天然色素的工業化生產提供了高效的培養方法。
[0023] 2、本發明在步驟（2)的異養階段，通過調控異養階段培養基的碳氮比，使小球藻 達到高生物量濃度，形成有利于后期光誘導的平臺。
[0024] 3、本發明通過調節異養培養的碳氮比，構建異養階段高細胞密度、相對富含蛋白 質和葉綠素的物質平臺，為光合作用儲備了葉綠素，縮短了小球藻由異養狀態轉為光自養 狀態的適應周期，能使小球藻快速進入光自養狀態；在相對富含蛋白質和葉綠素的基礎上 進一步調節光自養階段氮源供給量，促使小球藻高效積累蛋白質和葉綠素，大大縮短了小 球藻的光誘導時間。
[0025] 4、本發明通過優化異養階段的碳氮比，在小球藻的細胞干重濃度高達21. 45g/ 1的狀態下，蛋白質含量和葉綠素含量分別為22. 98%和0.91%，而未經優化的異養培養 基培養下，小球藻的細胞干重濃度為13. 64g/l，對應的蛋白質含量和葉綠素含量分別為 7. 77 %和0. 10%。經過進一步光照培養，在起始細胞密度為11. 09g/l的光誘導條件培養 48h后，小球藻的生物量濃度為8. 5g/l，同時獲得了最高蛋白質含量54. 10%和最高葉綠素 含量3. 14%。
[0026] 5、本發明用異養發酵的方式獲得高細胞濃度的小球藻培養液，其生長周期短，能 實現自動化，藻種重現性好；光誘導培養階段的起始細胞密度高，光誘導時間短，蛋白質含 量和葉綠素含量高。本方法大大縮短了生產周期，提高了生產效率。
[0027] 6、本發明在光誘導培養階段，其起始細胞密度高，在高細胞密度下進行小球藻的 光誘導培養，從而使得異養階段獲得的高細胞密度的種子液不用稀釋太多倍數，從而大大 減少了下游采收的壓力，能很大程度上降低小球藻規?；a的成本。光誘導的起始細胞 密度高，在光自養階段具有種群優勢，能有效抵御細菌污染或雜藻污染，對環境耐受能力 強，提高了藻液純度。
[0028] 大量分析本發明諸多實施例中蛋白質含量和葉綠素含量的關系，發現在異養階段 和光誘導自養階段，小球藻的蛋白質含量和葉綠素含量具有正相關性，參見圖7,這為實際 生產中實時監控藻液品質提供了快速評價的方法依據。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0029] 圖1是實施例1?4中，在不同碳氮比的異養培養基下生長的蛋白核小球藻的生 物量濃度變化趨勢圖，圖中所示的數字28. 4、37. 8、56. 7、113. 4均為碳氮比；
[0030] 圖2是實施例1?4中，在不同碳氮比的異養培養基下生長的蛋白核小球藻的蛋 白質含量變化趨勢圖，圖中所示的數字28. 4、37. 8、56. 7、113. 4均為碳氮比；
[0031] 圖3是實施例1?4中，在不同碳氮比的異養培養基下生長的蛋白核小球藻的葉 綠素含量變化趨勢圖，圖中所示的數字28. 4、37. 8、56. 7、113. 4均為碳氮比；
[0032] 圖4是實施例5?10中，在不同氮源濃度的光誘導培養下生長的蛋白核小球藻的 蛋白質含量變化趨勢圖，圖中所示的14. 7、29. 4、44. 1、58. 8、73. 5、88. 2 mmol/L均為氮元素 濃度；
[0033] 圖5是實施例5?10中，在不同氮源濃度的光誘導培養下生長的蛋白核小球藻的 葉綠素含量變化趨勢圖，圖中所示的14. 7、29. 4、44. 1、58. 8、73. 5、88. 2 mmol/L均為氮元素 濃度；
[0034] 圖6是實施例11中，蛋白核小球藻在5L玻璃發酵罐中進行光誘導下蛋白質含量 和葉綠素含量變化趨勢圖；
[0035] 圖7是各實施例中蛋白質含量和葉綠素含量的正相關關系圖。

【具體實施方式】
[0036] 下面結合附圖對本發明的技術方案做進一步說明：
[0037] 本發明中，各個實施例選用的藻種均為蛋白核小球藻（Chlorella pyrenoidosa)， 由北京大學陳峰教授惠贈。
[0038] 實施例1 :
[0039] 按如下步驟培養蛋白核小球藻：
[0040] (1)將活化后的蛋白核小球藻接種于裝有l〇〇ml Basal培養基（含10g/l葡萄糖） 的250 ml三角瓶中，在28±1°C、2000 lux、130 r/m條件下連續光照培養6天，使其處于對 數生長期；
[0041] (2)將步驟（1)中獲得的種子液按8% (v/v)接種量接入含有裝液量為50 ml培 養基的250ml三角瓶中，起始生物量濃度為0. 25±0.05g/l。其中，培養基其配方為：ΚΗ2Ρ04 1250 mg/L、MgS04*7H20 1000 mg/L、EDTA-2Na 500 mg/L、H3B03 114. 2mg/L、CaCl2*2H20 lllmg/L、FeS04 · 7H20 49. 8 mg/L、ZnS04 · 7H20 88. 2 mg/L、MnCl2 · 4H20 14. 2mg/L、M〇03 7. lmg/L、CuS04 · 5H20 15. 7 mg/L、（CoN03)2 · 6H20 4. 9 mg/L、同時在 Basal 培養基中添加 葡萄糖和硝酸鈉，葡萄糖添加量為50g/L(培養基中碳元素的摩爾濃度約為0. 28mol/L)，硝 酸鈉的添加量以使培養基中碳氮比為113. 4為準。將三角瓶置于黑暗控溫搖床中，溫度為 28±1°C，轉速為160r/m，pH為6. 1±0. 1。異養培養5天。每天取樣4 ml藻液，離心洗漆 后在70°C烘干至恒重稱干重，剩余藻液離心洗滌后冷凍干燥，用于測試蛋白質和葉綠素的 含量。
[0042] 蛋白質測定方法：準確稱取40mg冷凍干燥至恒重的蛋白核小球藻藻粉，放入F0SS 公司KJELTEC?2300型半自動凱氏定氮儀配套消化管中，加入10ml濃硫酸于消化管中，再加 入催化劑片劑，放入消化爐，420°C消化2h，待消解液冷卻后放入已去除空白的凱氏定氮儀 中測量蛋白質含量。
[0043] 葉綠素測定方法：準確稱取10mg冷凍干燥后至恒重的蛋白核小球藻藻粉，放入 10ml螺口刻度試管中，加入90%乙醇溶液，用錫紙包裹試管，超聲2min后放入4°C冰箱，如 此反復提取至藻粉無色，在4000r/m、4°C下離心lOmin。取上清并定容至10ml，用紫外可見 分光光度計測量其在648nm和664nm下的吸光值，計算出葉綠素含量。
[0044] 實施例2?4
[0045] 實施例2?4與實施例1均基本相同，不同點在于步驟⑵中所用培養基的碳氮 比不同，實施例2?4中步驟（2)所用培養基的碳氮比分別為56. 7、37. 8、28. 4。
[0046] 實施例1?4培養效果分析：
[0047] 由圖1所示，在葡萄糖濃度為50g/l，培養基碳氮比范圍為28. 4?113. 4的范圍 內，隨著碳氮比的下降，蛋白核小球藻最大生物量濃度呈增加趨勢。實施例1?4獲得的最 大生物量濃度分別為13. 64g/l、20. 01g/l、20. 31g/l、21. 45g/l，在實施例4中獲得的最大 生物量濃度最高。由圖2和圖3可以看出，種子液接種于培養基進行異養培養后的第一天， 蛋白核小球藻由光能自養生長變為異養生長，蛋白質含量和葉綠素含量驟然下降。對比實 施例1?4可知，蛋白質含量和葉綠素含量隨著碳氮比的降低而增加，實施例1中，蛋白質 和葉綠素含量一直降低，而實施例4中的蛋白質和葉綠素含量在后期培養過程中會增加。 實施例1的最終蛋白質含量和葉綠素含量為7. 77 %和0. 10%，實施例2的最終蛋白質含量 和葉綠素含量為12. 41 %和0. 32%，實施例3的最終蛋白質含量和葉綠素含量為17. 07 %和 0. 63%，實施例4的最終蛋白質含量和葉綠素含量為22. 98%和0. 91%。由實施例1?4的 結果可以看出，異養階段培養基中碳氮比的優化，不僅能在異養階段實現高生物量濃度，還 能相對提高蛋白質含量和葉綠素含量，構建有利于光誘導進一步提高蛋白質和葉綠素含量 的種子液平臺。在實施例1-4中，可以看出碳氮比為28. 4和碳氮比為37. 8的實施例在生物 量干重上幾乎沒有差異，但碳氮比為28. 4的實施例的蛋白質含量和葉綠素含量明顯高于 碳氮比為37. 8的實施例3。碳氮比為113. 4的實施例1中小球藻的生物量濃度低，是因為 過高的碳氮比使小球藻處于氮缺乏狀態，不僅不利于生長，也不利于合成蛋白質和葉綠素。 分析可知，在碳源濃度一定時，低碳氮比不僅能達到高生物量濃度，還能獲得高的蛋白質和 葉綠素含量。在實施例4中，碳氮比為28. 4的情況下獲得了最高的生物量濃度21. 45g/l、 最1?的蛋白質含量22. 98 %和最1?的葉綠素含量0. 91 %。
[0048] 實施例5
[0049] 按如下步驟培養蛋白核小球藻：
[0050] (1)將活化后的蛋白核小球藻接種于裝有100 ml Basal培養基（含10g/l葡萄 糖）的250ml三角瓶中，在28±1°C、2000 lux、130 r/m條件下連續光照培養6天，使其處 于對數生長期；
[0051] (2)將步驟⑴中獲得的種子液按8% (v/v)接種量接入培養基裝液量為50ml的 250ml三角瓶中，起始生物量濃度為0. 30±0.05g/l。其中，培養基其配方為：ΚΗ2Ρ04 1250 mg/L、MgS04 · 7H20 1000 mg/L、EDTA-2Na 500 mg/L、H3B03 114. 2mg/L、CaCl2 · 2H20 lllmg/ L、FeS04 · 7H20 49. 8 mg/L、ZnS04 · 7H20 88. 2 mg/L、MnCl2 · 4H20 14. 2mg/L、Mo03 7. lmg/L、 CuS04*5H20 15.7 mg/L、（CoN03)2*6H20 4.9 mg/L、同時在 Basal 培養基中添加葡萄糖和硝 酸鈉，葡萄糖添加量為50 g/L，硝酸鈉的添加量以使培養基中碳氮比為28. 4為準。將三角 瓶置于黑暗控溫搖床中，溫度為28±1°C，轉速為160 r/m，pH為6. 1±0. 1，異養培養4天。
[0052] (3)將步驟⑵獲得的異養種子液用Basal培養基將其稀釋1倍后用三角瓶培養， 稀釋完后立即放入搖床進行光照，光暗周期為12h/12h，光照強度為5000±400 lux，起始細 胞密度為11.09±0.07g/l，培養溫度為28±1°C，轉速為160r/m，同時向培養液中加入硝酸 鈉（氮源），使培養液中含有14. 7 mmol/L的氮元素，培養時間為60h。每12小時取一次樣， 樣品離心洗滌后冷凍干燥，用于測蛋白質含量和葉綠素含量。
[0053] 實施例6?10
[0054] 與實施例5基本相同，不同點在于步驟（3)中向培養液中加入氮源的濃度不同， 實施例6?10中步驟（3)的培養液中的氮元素濃度分別為29. 4、44. 1、58. 8、73. 5、88. 2 mmol/L〇
[0055] 實施例5?10培養效果分析：
[0056] 參見圖4和圖5,在氮兀素濃度為14. 7 mmol/1和29. 4 mmol/1的光誘導培養條 件下，蛋白核小球藻的蛋白質含量和葉綠素含量相對異養種子液有一定程度的增加，但顯 著性低于高濃度氮源（44. 1、58. 8、73. 5、88. 2 mmol/L)下生長的蛋白核小球藻的蛋白質含 量和葉綠素含量。實施例5的最高蛋白質含量和葉綠素含量分別為30. 16%和1. 65%，實 施例6的蛋白質小球澡的最1?蛋白質含量和葉綠素含量分別為45. 17%和2. 62%。在氣兀 素濃度為44. 1、58. 5、73. 5、88. 2 mmol/1的光誘導培養條件下，蛋白核小球藻的蛋白質含 量和葉綠素含量顯著性高于低濃度氮源下培養的蛋白核小球藻，但是各濃度之間無顯著差 異。實施例7的最高蛋白質含量和葉綠素含量分別為54. 10%和3. 14%，實施例8的最高 蛋白質含量和葉綠素含量分別為53. 08 %和3. 04%，實施例9的最高蛋白質含量和葉綠素 含量分別為53. 86 %和3. 07%，實施例10的最高蛋白質含量和葉綠素含量分別為53. 50% 和3. 05%。由實施例5?10的結果可見，氮源濃度是影響光誘導階段蛋白質積累和葉綠素 積累的關鍵因素，在一定范圍內，蛋白質含量和葉綠素含量隨著氮源濃度的增加而增加，但 是過多的氮源并不能進一步促進蛋白質和葉綠素的積累。各實例中蛋白核小球藻都在48h 達到最1?蛋白質含量和最1?葉綠素含量。在實施例7中，在獲得最1?蛋白質含量54. 1 %和 最高葉綠素含量3. 14%的同時，生物量濃度高達8. 5g/l。
[0057] 實施例11
[0058] (1)將活化后的蛋白核小球藻接種于裝有100 ml Basal培養基（含10g/l葡萄 糖）的250ml三角瓶中，在28± 1°C、20001ux、130r/m條件下連續光照培養6天，使其處于 對數生長期；
[0059] (2)將步驟（1)中獲得的種子液按8% (v/v)接種量接入培養基的裝液量為50ml 的250ml三角瓶中，起始生物量濃度為0. 35±0. 05g/l。該步驟所用的培養基與實施例5中 的培養基相同，不再贅述。將三角瓶置于黑暗控溫搖床中，溫度為28土1°C，轉速為160 r/ m，pH為6· 1±0· 1，異養培養4天。
[0060] (3)將步驟⑵獲得的1. 5L異養種子液用Basal培養基稀釋1倍后用5L玻璃發 酵罐培養，工作體積為3L，光暗周期為12h/12h，光照強度為6000±500 lux，起始細胞密度 為10. 03±0. lg/Ι，培養溫度為28±1°C，攪拌速率為200 r/m，pH控制在6. 1，同時向培養 液中加入氮源，使培養液中含有44. 1 mmol/1的氮元素，培養時間為60h。每12小時取一次 樣，樣品離心洗滌后冷凍干燥，用于測蛋白質含量和葉綠素含量，結果參見圖6。
[0061] 實施例11中，蛋白核小球澡在48h獲得最大蛋白質含量和最大葉綠素含量，分別 為51. 4%和2. 91%，與此同時，生物量濃度高達8. lg/1。
[0062] 以上所述，僅是本發明的較佳實施例而已，并非對本發明做任何形式上的限制，故 凡未脫離本發明技術方案的內容，依據本發明的技術實質對以上實施例所做的任何簡單修 改、等同變化與修飾，均仍屬于本發明技術方案的范圍內。
【權利要求】
1. 一種同時提高小球藻中葉綠素和蛋白質含量的高密度培養方法，其特征在于，包括 如下步驟： (1) 將活化后的小球藻進行連續光照培養，使其處于對數生長期； (2) 將步驟（1)中處于對數生長期的小球藻培養液作為種子液，將其接入異養發酵容 器中在黑暗條件下進行異養培養，培養溫度為28?35°C，培養時間為3?5天，異養發酵容 器中所用培養基其碳氮比為28. 4?113. 4 ; (3) 將經過步驟（2)培養獲得的小球藻培養液稀釋至小球藻細胞密度為10?20g/L， 向小球藻培養液中加入氮源，使小球藻培養液中含有14. 7?88. 2mmol/L的氮元素，再對小 球藻進行光誘導培養，培養溫度為28?35°C，培養時間為1?3天。
2. 根據權利要求1所述的培養方法，其特征在于，步驟（2)中，異養發酵容器中所用 培養基其配方由如下含量的各組分組成：ΚΗ 2Ρ04 1 200?1300 mg/L、MgS04,7H20 950? 1050mg/L、EDTA-2Na 450 ?550 mg/L、H3B03 110 ?120 mg/L、CaCl2 · 2H20 105 ?120 mg/ L、FeS04 · 7H20 45 ?55 mg/L、ZnS04 · 7H20 85 ?90 mg/L、MnCl2 · 4H20 12 ?16 mg/L、 M〇03 6. 5 ?7. 5mg/L、CuS04 · 5H20 15. 5 ?16 mg/L、（C〇N03)2 · 6H20 4. 5 ?5. 5 mg/L，培養 基中還添加有碳源和氮源，其中所述碳源其在培養基中的含量以使培養基中含有0. 03mol/ L?0. 33mol/L的碳元素為準，所述氮源其在培養基中的含量以使培養基的碳氮比保持在 28. 4 ?113. 4 為準。
3. 根據權利要求2所述的培養方法，其特征在于，步驟（2)中，異養發酵容器中所用培 養基其配方由如下含量的各組分組成：KH2P041250 mg/L、MgS04,7H20 1000 mg/L、EDTA-2Na 500 mg/L、H3B03 114. 2 mg/L、CaCl2 · 2H20 111 mg/L、FeS04 · 7H20 49. 8 mg/L、ZnS04 · 7H20 88. 2 mg/L、MnCl2 ·4Η20 14. 2 mg/L、Mo03 7. 1 mg/L、CuS04 ·5Η20 15. 7 mg/L、（CoN03)2 ·6Η20 4. 9 mg/L，培養基中還添加有碳源和氮源，其中所述碳源其在培養基中的含量以使培養基 中含有0. 03?0. 33mol/L的碳元素為準，所述氮源其在培養基中的含量以使培養基的碳氮 比保持在28. 4?113. 4為準。
4. 根據權利要求2或3所述的培養方法，其特征在于，步驟（2)的培養基中，其添加的 氮源為有機氮源或無機氮源，其添加的碳源為有機碳源；步驟（3)中向小球藻培養液中加 入的氮源為無機氮源。
5. 根據權利要求2或3所述的培養方法，其特征在于，步驟（2)中，所述碳源其在培養 基中的含量以使培養基中含有〇. 25?0. 33 mol/L的碳元素為準。
6. 根據權利要求1?3任一項所述的培養方法，其特征在于，步驟（2)中，異養發酵容 器中所用培養基其碳氮比為28. 4?38 ;步驟（3)中，向小球藻培養液中加入氮源，使小球 藻培養液中含有44. 1?88. 2 mmol/L的氮元素。
7. 根據權利要求1所述的培養方法，其特征在于，步驟（3)中，所述光誘導培養為間歇 光照培養，光照強度為2000 lux?20000 lux，光暗周期為12h/12h。
8. 根據權利要求1所述的培養方法，其特征在于，步驟（1)中，對小球藻進行光照培養 所用的培養基為添加有5?15g/L葡萄糖的Basal培養基，連續光照培養3?6天。
9. 根據權利要求1所述的培養方法，其特征在于，步驟（2)中所述的異養發酵容器選自 搖瓶、發酵罐或生物反應器；步驟（3)的光誘導培養在搖瓶、開放式跑道池、圓池或封閉式 的光生物反應器中進行；步驟（1)和/或步驟（3)所用的光源為自然光或者人工光。
10.根據權利要求1所述的培養方法，其特征在于，所述小球藻選自綠藻門小球藻屬中 如蛋白核小球藻（Chlorella pyrenoidosa)、捕圓小球藻（Chlorella ellipsoidea)、普通 小球藻（Chlorella vulgaris)、或原殼小球藻（Chlorella protothecoides)類的可發酵培 養的小球藻。
【文檔編號】C12R1/89GK104152357SQ201410384442
【公開日】2014年11月19日 申請日期:2014年8月6日 優先權日:2014年8月6日
【發明者】魏東, 陳嬌敏 申請人:華南理工大學