用于提取家禽dna的細(xì)胞裂解液、試劑盒和方法
【專利摘要】本發(fā)明提供了一種用于提取家禽DNA的細(xì)胞裂解液，包括：0.5g/L～2.5g/L?Tris-HCl；0.3g/L～1.0g/L?KCl；1.5g/L～2.5g/L?MgCl2；0.5g/L～1.5g/L?EDTA；20mL/L～30mL/L?Triton?X-100；余量的水；用NaOH調(diào)節(jié)pH值為8。本發(fā)明還提供了一種含有上述技術(shù)方案所述的細(xì)胞裂解液的家禽DNA提取試劑盒。本發(fā)明還提供了一種家禽DNA提取方法。本發(fā)明提供的方法使得禽類血液DNA提取時(shí)間比傳統(tǒng)方法顯著縮短，在達(dá)到或超過試劑盒提取質(zhì)量的同時(shí)，其成本遠(yuǎn)低于試劑盒方法，步驟少，操作難度低于主流試劑盒。
【專利說明】用于提取家禽DNA的細(xì)胞裂解液、試劑盒和方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于生物育種【技術(shù)領(lǐng)域】，尤其涉及一種用于提取家禽DNA的細(xì)胞裂解液、 試劑盒和方法。

【背景技術(shù)】
[0002] 家禽分子育種作為現(xiàn)代家禽育種工作不可或缺的技術(shù)，常需要對(duì)核心群體進(jìn)行遺 傳背景鑒定、遺傳疾病剔除、隱性遺傳性狀提純，如雞羽色性狀中隱性白羽等分子檢測相關(guān) 工作以控制后代群體質(zhì)量。而DNA提取是后續(xù)分子實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)，因此，大規(guī)模、快速獲取家 禽基因組對(duì)家禽分子育種工作的開展十分必要。
[0003] 針對(duì)禽類血液紅細(xì)胞具有細(xì)胞核的特點(diǎn)并為了減少家禽對(duì)采樣的應(yīng)激，目前多以 翅下靜脈采血為主，以達(dá)到從少量靜脈血中提取足量的DNA以滿足實(shí)驗(yàn)需要的目的。現(xiàn)有 技術(shù)公開了多種家禽血液DNA提取技術(shù)，如申請(qǐng)?zhí)枮?01210100069. 2的中國專利文獻(xiàn)公 開了一種安全快速從血液中提取基因組DNA的方法，其以SDS (十二烷基硫酸鈉）與Trito X-100 (聚乙二醇對(duì)異辛基苯基醚）相混合為紅細(xì)胞裂解液，飽和氯化鈉溶液為蛋白質(zhì)沉淀 劑并使用乙醇沉淀DNA，該方法提取時(shí)間相對(duì)較短，能夠完成DNA粗提取工作，能普遍應(yīng)用 于血液DNA基因組提取。但是，該方法獲得DNA具有較高的蛋白污染，而且使用樣品量較 大，會(huì)加重采樣負(fù)擔(dān)、動(dòng)物應(yīng)激，減少血樣使用次數(shù)，對(duì)禽類血液DNA提取針對(duì)性不強(qiáng)，其耗 時(shí)比本發(fā)明長。
[0004] 申請(qǐng)?zhí)枮?01110030176. 8的中國專利文獻(xiàn)公開了一種動(dòng)物DNA提取的細(xì)胞裂解 液、試劑盒和方法，以鹽酸胍緩沖液為主要裂解液，并加入蛋白酶K后水浴過夜，以飽和酚 萃取DNA，該方法在傳統(tǒng)DNA提取方法酚-氯仿抽提法上進(jìn)一步改善，能得到一定質(zhì)量的 DNA基因組。但是，該方法耗時(shí)長，需過夜消化，提取全過程長達(dá)16小時(shí)以上，不利于快速、 批量操作。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 有鑒于此，本發(fā)明的目的在于提供一種用于提取家禽DNA的細(xì)胞裂解液、試劑盒 和方法，本發(fā)明提供的方法提取操作簡便、用時(shí)短，成本低。
[0006] 本發(fā)明提供了一種用于提取家禽DNA的細(xì)胞裂解液，包括：
[0007] 0· 5g/L ?2. 5g/L Tris-HCl ;0· 3g/L ?1. Og/L KC1 ;1· 5g/L ?2. 5g/L MgCl2 ; 0· 5g/L ?1. 5g/L EDTA ;20mL/L ?30mL/L Triton X-100 ;余量的水；用 NaOH 調(diào)節(jié) pH 值為 8〇
[0008] 作為優(yōu)選，所述細(xì)胞裂解液包括：
[0009] 1. 576g/L Tris-HCl ；0. 7455g/L KC1 ；2. 033g/L MgCl2 ；0. 7448g/L EDTA ；25mL/L Triton X-100 ;余量的水；用NaOH調(diào)節(jié)pH值為8。
[0010] 本發(fā)明還提供了一種用于提取家禽DNA的細(xì)胞緩沖液，包括：
[0011] 0· 5g/L ?2. 5g/L Tris-HCl ;0· 3g/L ?1. 0g/L KC1 ;1. 5g/L ?2. 5g/L MgCl2 ; 0· 5g/L ?1. 5g/L EDTA ;15g/L ?30g/L NaCl ;0· 5g/L ?1. 5g/L SDS ;余量的水；用 NaOH 調(diào)節(jié)pH值為8。
[0012] 作為優(yōu)選，所述細(xì)胞緩沖液包括：
[0013] 1. 576g/L Tris-HCl ；0. 7455g/L KC1 ；2. 033g/L MgCl2 ；0. 7448g/L EDTA； 23. 376g/L NaCl ;lg/L SDS ;余量的水；用 NaOH 調(diào)節(jié) pH 值為 8。
[0014] 本發(fā)明提供的上述細(xì)胞裂解液和細(xì)胞緩沖液優(yōu)選組合使用，即，本發(fā)明還提供了 一種用于提取家禽DNA的細(xì)胞裂解液，包括Buffer WY和Buffer YW，其中，
[0015] 所述 Buffer WY 包括：0· 5g/L ?2. 5g/L Tris-HCl ;0· 3g/L ?1. Og/L KC1 ;1· 5g/ L ?2. 5g/L MgCl2 ;0· 5g/L ?1. 5g/L EDTA ;20mL/L ?30mL/L Triton X-100 ;余量的水；用 NaOH調(diào)節(jié)pH值為8 ;
[0016] 所述 Buffer YW 包括：0· 5g/L ?2. 5g/L Tris-HCl ;0· 3g/L ?1. Og/L KC1 ;1. 5g/ L ?2. 5g/L MgCl2 ;0· 5g/L ?1. 5g/L EDTA ;15g/L ?30g/L NaCl ;0· 5g/L ?1. 5g/L SDS ; 余量的水；用NaOH調(diào)節(jié)pH值為8。
[0017] 作為優(yōu)選，所述 Buffer WY 包括：1. 576g/L Tris-HCl ;0· 7455g/L KC1 ;2. 033g/L MgCl2 ;0· 7448g/L EDTA ;25mL/L Triton X-100 ;余量的水；用 NaOH 調(diào)節(jié) pH 值為 8 ;
[0018] 所述 Buffer YW 包括：1. 576g/L Tris-HCl ;0· 7455g/L KC1 ;2. 033g/L MgCl2 ; 0· 7448g/L EDTA ;23. 376g/L NaCl ;lg/L SDS ;余量的水；用 NaOH 調(diào)節(jié) pH 值為 8。
[0019] 本發(fā)明還提供了一種含有上述技術(shù)方案所述的細(xì)胞裂解液的家禽DNA提取試劑 盒，即包括 Buffer WY 和 Buffer YW。
[0020] 作為優(yōu)選，所述試劑盒還包括：NaCl溶液、異丙醇、75%酒精和TE裂解液。
[0021] 作為優(yōu)選，所述試劑盒還包括蛋白酶K溶液，蛋白酶K溶液能夠使獲取的DNA純度 和收量較高。
[0022] 作為優(yōu)選，所述NaCl溶液的濃度為5mol/L。
[0023] 作為優(yōu)選，所述蛋白酶K溶液的濃度為20mg/mL。
[0024] 本發(fā)明還提供了一種家禽DNA提取方法，包括：
[0025] a)將新鮮抗凝家禽類血樣與Buffer WY溶液混合，經(jīng)水浴加熱后離心，將棄上清 后得到的物質(zhì)與Buffer WY溶液混合，離心后棄上清得到沉淀；所述Buffer WY溶液包括： 0· 5g/L ?2. 5g/L Tris-HCl ;0· 3g/L ?1. 0g/L KC1 ;L 5g/L ?2. 5g/L MgCl2 ;0· 5g/L ? 1. 5g/L EDTA ;20mL/L ?30mL/L Triton X-100 ;余量的水；用 NaOH 調(diào)節(jié) pH 值為 8 ;
[0026] b)將所述步驟a)得到的沉淀與Buffer YW溶液和蛋白酶K溶液混合，水浴加熱后 加入NaCl溶液，在核酸純化柱中純化后離心，得到濾液；所述Buffer YW溶液包括：0. 5g/ L ?2. 5g/L Tris-HCl ;0· 3g/L ?1. 0g/L KC1 ;L 5g/L ?2. 5g/L MgCl2 ;0· 5g/L ?1. 5g/L EDTA ;15g/L ?30g/L NaCl ;0· 5g/L ?L 5g/L SDS ;余量的水；用 NaOH 調(diào)節(jié) pH 值為 8 ;
[0027] c)將所述步驟b)得到的濾液與異丙醇混合，離心后棄上清，然后與75%酒精混 合，離心后棄上清，加熱后加入TE裂解液溶解。
[0028] 作為優(yōu)選，所述步驟a)具體為：將10?20 μ L新鮮抗凝家禽類血樣與1000 μ L Buffer WY溶液震蕩混合，60?70°C水浴加熱5min?8min后10000?15000rpm/min離心 1?3min，將棄上清后得到的物質(zhì)與1000 μ L Buffer WY溶液震蕩混合，10000?15000rpm/ min離心1?3min后棄上清得到沉淀。
[0029] 作為優(yōu)選，所述步驟a)更具體為：將10yL新鮮抗凝家禽類血樣與lOOOyL Buffer WY溶液震蕩混合，6(TC水浴加熱8min，12000rpm/min離心2min，將棄上清后得到的 物質(zhì)與1000 μ L Buffer WY溶液震蕩混合，使沉淀物質(zhì)分散，12000rpm/min離心2min后棄 上清得到沉淀。
[0030] 作為優(yōu)選，所述步驟b)具體為：將所述步驟a)得到的沉淀與200 μ L Buffer YW 溶液和10 μ L20mg/mL的蛋白酶K溶液震蕩混合，60?70°C水浴加熱20min?30min后加 入100 μ L5mol/L的NaCl溶液，在核酸純化柱中純化后6000?10000rpm/min離心lmin，得 到濾液。
[0031] 作為優(yōu)選，所述步驟b)更具體為：將所述步驟a)得到的沉淀與200 μ L Buffer YW 溶液和10 μ L20mg/mL的蛋白酶K溶液震蕩混合，60°C水浴加熱25min并搖晃兩次；然后加 入100 μ L5mol/L的NaCl溶液，混合均勻后在核酸純化柱中純化，8000rpm/min離心lmin, 得到濾液，并將濾液轉(zhuǎn)移到另一 1. 5mlEP管中。
[0032] 作為優(yōu)選，所述步驟c)具體為：將所述步驟b)得到的濾液與等體積的異丙醇混 合，10000?15000rpm/min離心3?5min后棄上清，然后與1000?1500yL75%酒精震蕩 混合，10000?15000rpm/min離心1?3min后棄上清，70?75°C烘箱加熱1?3min后加 入50mLTE裂解液溶解。
[0033] 作為優(yōu)選，所述步驟c)更具體為：將所述步驟b)得到的濾液與等體積的異丙醇充 分混合均勻，12000rpm/min離心5min后棄上清，然后與1000 μ L75%酒精震蕩混合，混勻后 12000rpm/min離心3min后棄上清，72°C烘箱加熱3min后加入50mLTE裂解液溶解，將樣品 放于-20°C冰箱保存?zhèn)溆谩?br> [0034] 作為優(yōu)選，所述禽類血樣可以為鵝血、雞血、鴨血或者鴿子血。
[0035] 另外，本發(fā)明提供的方法也可以無需加入蛋白酶K溶液，此時(shí)得到的DNA純度和收 量略低，但是能夠滿足普通PCR要求。
[0036] 與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明提供的家禽DNA提取方法具有如下優(yōu)點(diǎn)之一：
[0037] 1、本發(fā)明解決了目前常規(guī)DNA提取方法需消化過夜或需數(shù)小時(shí)消化等耗時(shí)長的 問題，顯著縮短常規(guī)方法提取禽類血樣DNA所需時(shí)間，將整個(gè)DNA提取過程控制在1小時(shí) 內(nèi)，理論時(shí)間為49min，真正實(shí)現(xiàn)快速獲取家禽DNA基因組的目的，本方法比TaKaRa全血基 因組提取試劑盒省時(shí)約30min。
[0038] 2、本發(fā)明解決了常規(guī)方法提取DNA過程中操作步驟過多的問題，只需6步即可完 成DNA提取工作，而TaKaRa全血基因組提取試劑盒需15步操作，操作繁瑣。
[0039] 3、本發(fā)明克服了試劑盒提取成本貴、無法大批量應(yīng)用的問題：TaKaRa全血基因組 提取試劑盒成本約10元一個(gè)樣，而本方法一個(gè)樣成本在〇. 9元左右。
[0040] 4、本發(fā)明對(duì)核酸純化柱的使用方法使得整個(gè)DNA提取過程無需吸取上清溶液，吸 上清是DNA提取的限速步驟，需要謹(jǐn)慎操作，常常需要消耗大量時(shí)間而且容易造成蛋白質(zhì) 污染，人為操作因素對(duì)結(jié)果影響較大。本發(fā)明方法以核酸純化柱濾過基因組DNA，使DNA在 濾液中而蛋白質(zhì)等沉淀留在濾膜上。本發(fā)明對(duì)核酸純化柱的使用方法與試劑盒相反，試劑 盒是濾過蛋白質(zhì)而使DNA沉淀留在濾膜上，無需吸取上清液，使用核酸純化柱濾過DNA液使 所得DNA蛋白污染低，純度高，省時(shí)省力。
[0041] 5、本發(fā)明提取得到的DNA純度和收量較高，能夠達(dá)到甚至超過試劑盒提取質(zhì)量。
[0042] 總之，本發(fā)明提供的方法使得禽類血液DNA提取時(shí)間比傳統(tǒng)方法顯著縮短，t匕 TaKaRa全血基因組提取試劑盒等主流試劑盒所需時(shí)間更短。在達(dá)到或超過試劑盒提取質(zhì)量 的同時(shí)，其成本遠(yuǎn)低于試劑盒方法，步驟少，操作難度低于主流試劑盒。本發(fā)明實(shí)現(xiàn)了在實(shí) 驗(yàn)室快速、低廉、商質(zhì)量獲取禽類血液基因組DNA的目的。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0043] 圖1為本發(fā)明實(shí)施例提供的方法提取的DNA電泳結(jié)果；
[0044] 圖2為本發(fā)明實(shí)施例及比較例提供的方法提取的DNA電泳結(jié)果；
[0045] 圖3為本發(fā)明實(shí)施例1獲取的DNA模板PCR擴(kuò)增結(jié)果；
[0046] 圖4為本發(fā)明實(shí)施例6?10提供的方法提取的DNA電泳結(jié)果。

【具體實(shí)施方式】
[0047] 以下結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明提供的用于提取家禽DNA的細(xì)胞裂解液、試劑盒和方法 進(jìn)行進(jìn)一步說明。
[0048] 以下各實(shí)施例中所用試劑如下：Buffer WY、Buffer YW、5mol/L NaCl溶液、異丙 醇、75%酒精、TE裂解液、20mg/ml蛋白酶K溶液；
[0049] Buffer WY ：Tris-HCll. 576g, KC10. 7455g, MgCl22. 033g, EDTAO. 7448g, Triton X-100 25ml，定容至 1000ml，NaOH 調(diào)節(jié) PH 至 8. 0。
[0050] Buffer Yff ：Tris-HCll. 576g, KC10. 7455g, MgCl22. 033g, EDTAO. 7448g, NaC123. 376g，SDSlg，定容至 1000ml，NaOH 調(diào)節(jié) PH 至 8. 0。
[0051] 實(shí)施例1
[0052] 1.取lOul新鮮抗凝鵝血于1. 5ml EP中，加入lOOOul Buffer WY溶液，震蕩混勻， 于60°C水浴8min，12000rpm/min離心2min后，棄上清；沉淀中再加入lOOOul BufferWY溶 液，震蕩使沉淀分散，12000rpm/min離心2min后，棄上清。
[0053] 2.向上一步得到的沉淀中加入200ul Buffer YW溶液以及20mg/ml蛋白酶K溶液 l〇ul，震蕩混勻，于60°C水浴25min并搖晃兩次。
[0054] 3.向上一步所得混合液中加入5mol/L NaCl溶液100ul，混勻后將全部溶液轉(zhuǎn)移 至核酸純化柱中，8000rpm/min離心lmin，將所得濾液轉(zhuǎn)入重新編號(hào)的1. 5ml EP管中。
[0055] 4.加入等體積異丙醇于上述濾液中，充分混勻后12000rpm/min離心5min，棄上 清。
[0056] 5.加入75%酒精lOOOul,震蕩混勻后12000rpm/min離心3min，棄上清。
[0057] 6.放入72°C烘箱3min后，加入50ml的TE裂解液溶解，將樣品放于-20°C冰箱保 存?zhèn)溆谩?br> [0058] 7.所得0嫩液用1.5%瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳檢測，并用核酸蛋白儀似11〇￥116?1118 檢測其濃度，結(jié)果參見圖1和表1，圖1為本發(fā)明實(shí)施例提供的方法提取的DNA電泳結(jié)果，其 中，Μ為Marker ;表1為本發(fā)明實(shí)施例及比較例提供的DNA的核酸蛋白儀檢測結(jié)果。由圖1 可知，本發(fā)明提供的方法提取鵝血的DNA的條帶明亮單一。
[0059] 實(shí)施例2
[0060] 1.取10ul新鮮抗凝雞血于1.5ml EP中，加入lOOOul Buffer WY溶液，震蕩混勻， 于60°C水浴8min，12000rpm/min離心2min后，棄上清；沉淀中再加入lOOOul Buffer WY溶 液，震蕩使沉淀分散，12000rpm/min離心2min后，棄上清。
[0061] 2.向上一步得到的沉淀中加入200ul Buffer YW溶液以及20mg/ml蛋白酶K溶液 l〇ul，震蕩混勻，于60°C水浴25min并搖晃兩次。
[0062] 3.向上一步所得混合液中加入5mol/L NaCl溶液100ul，混勻后將全部溶液轉(zhuǎn)移 至核酸純化柱中，8000rpm/min離心lmin，將所得濾液轉(zhuǎn)入重新編號(hào)的1. 5ml EP管中。
[0063] 4.加入等體積異丙醇于上述濾液中，充分混勻后12000rpm/min離心5min，棄上 清。
[0064] 5.加入75%酒精lOOOul,震蕩混勻后12000rpm/min離心3min，棄上清。
[0065] 6.放入72°C烘箱3min后，加入50ml的TE裂解液溶解，將樣品放于-20°C冰箱保 存?zhèn)溆谩?br> [0066] 7.所得0嫩液用1.5%瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳檢測，并用核酸蛋白儀似11〇￥116?1118 檢測其濃度，結(jié)果參見圖1和表1，圖1為本發(fā)明實(shí)施例提供的方法提取的DNA電泳結(jié)果，其 中，Μ為Marker ;表1為本發(fā)明實(shí)施例及比較例提供的DNA的核酸蛋白儀檢測結(jié)果。由圖1 可知，本發(fā)明提供的方法提取雞血的DNA的條帶明亮單一。
[0067] 實(shí)施例3
[0068] 1.取10ul新鮮抗凝鴿子血于1. 5ml EP中，加入lOOOul Buffer WY溶液，震蕩混 勻，于60°C水浴8min，12000rpm/min離心2min后，棄上清；沉淀中再加入lOOOul Buffer WY溶液，震蕩使沉淀分散，12000rpm/min離心2min后，棄上清。
[0069] 2.向上一步得到的沉淀中加入200ul Buffer YW溶液以及20mg/ml蛋白酶K溶液 l〇ul，震蕩混勻，于60°C水浴25min并搖晃兩次。
[0070] 3.向上一步所得混合液中加入5mol/L NaCl溶液100ul，混勻后將全部溶液轉(zhuǎn)移 至核酸純化柱中，8000rpm/min離心lmin，將所得濾液轉(zhuǎn)入重新編號(hào)的1. 5ml EP管中。
[0071] 4.加入等體積異丙醇于上述濾液中，充分混勻后12000rpm/min離心5min，棄上 清。
[0072] 5.加入75%酒精lOOOul,震蕩混勻后12000rpm/min離心3min，棄上清。
[0073] 6.放入72°C烘箱3min后，加入50ml的TE裂解液溶解，將樣品放于-20°C冰箱保 存?zhèn)溆谩?br> [0074] 7.所得0嫩液用1.5%瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳檢測，并用核酸蛋白儀似11〇￥116?1118 檢測其濃度，結(jié)果參見圖1和表1，圖1為本發(fā)明實(shí)施例提供的方法提取的DNA電泳結(jié)果，其 中，Μ為Marker ;表1為本發(fā)明實(shí)施例及比較例提供的DNA的核酸蛋白儀檢測結(jié)果。由圖1 可知，本發(fā)明提供的方法提取鴿子血的DNA的條帶明亮單一。
[0075] 實(shí)施例4
[0076] 1.取10ul新鮮抗凝鴨血于1. 5ml EP中，加入lOOOul Buffer WY溶液，震蕩混勻， 于60°C水浴8min，12000rpm/min離心2min后，棄上清；沉淀中再加入lOOOul Buffer WY溶 液，震蕩使沉淀分散，12000rpm/min離心2min后，棄上清。
[0077] 2.向上一步得到的沉淀中加入200ul Buffer YW溶液以及20mg/ml蛋白酶K溶液 l〇ul，震蕩混勻，于60°C水浴25min并搖晃兩次。
[0078] 3.向上一步所得混合液中加入5mol/L NaCl溶液100ul，混勻后將全部溶液轉(zhuǎn)移 至核酸純化柱中，8000rpm/min離心lmin，將所得濾液轉(zhuǎn)入重新編號(hào)的1. 5ml EP管中。
[0079] 4.加入等體積異丙醇于上述濾液中，充分混勻后12000rpm/min離心5min，棄上 清。
[0080] 5.加入75%酒精lOOOul，震蕩混勻后12000rpm/min離心3min，棄上清。
[0081] 6.放入72°C烘箱3min后，加入50ml的TE裂解液溶解，將樣品放于-20°C冰箱保 存?zhèn)溆谩?br> [0082] 7.所得0嫩液用1.5%瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳檢測，并用核酸蛋白儀似11〇￥116?1118 檢測其濃度，結(jié)果參見圖1和表1，圖1為本發(fā)明實(shí)施例提供的方法提取的DNA電泳結(jié)果，其 中，Μ為Marker ;表1為本發(fā)明實(shí)施例及比較例提供的DNA的核酸蛋白儀檢測結(jié)果。由圖1 可知，本發(fā)明提供的方法提取鴨血的DNA的條帶明亮單一。
[0083] 對(duì)比例1
[0084] 于寶生物工程（大連）有限公司購買試劑盒TaKaRa MiniBEST Whole Blood Genomic DNA Extraction Kit。按照試劑盒操作說明提取新鮮抗凝鵝血樣DNA,并用1.5% 瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳檢測，并用核酸蛋白儀NanoVue Plus檢測其濃度，結(jié)果參見圖2和表 1，其中，圖2為本發(fā)明實(shí)施例及比較例提供的方法提取的DNA電泳結(jié)果，其中，Μ為Marker， E為實(shí)施例1，e為對(duì)比例1 ;表1為本發(fā)明實(shí)施例及比較例提供的DNA的核酸蛋白儀檢測結(jié) 果。由圖2可知，本發(fā)明提供的方法提取鵝血的DNA的條帶明亮單一，其亮度高于試劑盒提 取的DNA。
[0085] 對(duì)比例2
[0086] 于寶生物工程（大連）有限公司購買試劑盒TaKaRa MiniBEST Whole Blood Genomic DNA Extraction Kit。按照試劑盒操作說明提取新鮮抗凝雞血樣DNA,并用1.5% 瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳檢測，并用核酸蛋白儀NanoVue Plus檢測其濃度，結(jié)果參見圖2和表 1，其中，圖2為本發(fā)明實(shí)施例及比較例提供的方法提取的DNA電泳結(jié)果，其中，Μ為Marker， J為實(shí)施例2, j為對(duì)比例2 ;表1為本發(fā)明實(shí)施例及比較例提供的DNA的核酸蛋白儀檢測結(jié) 果。由圖2可知，本發(fā)明提供的方法提取雞血的DNA的條帶明亮單一，其亮度高于試劑盒提 取的DNA。
[0087] 對(duì)比例3
[0088] 于寶生物工程（大連）有限公司購買試劑盒TaKaRa MiniBEST Whole Blood Genomic DNA Extraction Kit。按照試劑盒操作說明提取新鮮抗凝鴻子血樣DNA,并用 1.5%瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳檢測，并用核酸蛋白儀NanoVue Plus檢測其濃度，結(jié)果參見圖 2和表1，其中，圖2為本發(fā)明實(shí)施例及比較例提供的方法提取的DNA電泳結(jié)果，其中，Μ為 Marker，G為實(shí)施例3, g為對(duì)比例3 ;表1為本發(fā)明實(shí)施例及比較例提供的DNA的核酸蛋白 儀檢測結(jié)果。由圖2可知，本發(fā)明提供的方法提取鴿子血的DNA的條帶明亮單一，其亮度高 于試劑盒提取的DNA。
[0089] 對(duì)比例4
[0090] 于寶生物工程（大連）有限公司購買試劑盒TaKaRa MiniBEST Whole Blood Genomic DNA Extraction Kit。按照試劑盒操作說明提取新鮮抗凝鴨血樣DNA,并用1.5% 瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳檢測，并用核酸蛋白儀NanoVue Plus檢測其濃度，結(jié)果參見圖2和表 1，其中，圖2為本發(fā)明實(shí)施例及比較例提供的方法提取的DNA電泳結(jié)果，其中，Μ為Marker， Y為實(shí)施例4, y為對(duì)比例4 ;表1為本發(fā)明實(shí)施例及比較例提供的DNA的核酸蛋白儀檢測結(jié) 果。由圖2可知，本發(fā)明提供的方法提取鴨血的DNA的條帶明亮單一，其亮度高于試劑盒提 取的DNA。
[0091] 表1本發(fā)明實(shí)施例及比較例提供的DNA的核酸蛋白儀檢測結(jié)果
[0092]

【權(quán)利要求】
1. 一種用于提取家禽DNA的細(xì)胞裂解液，其特征在于，包括： 0· 5g/L ?2. 5g/L Tris-HCl ;0· 3g/L ?1. Og/L KC1 ;L 5g/L ?2. 5g/L MgCl2 ;0· 5g/ L ?1. 5g/L EDTA ;20mL/L ?30mL/L Triton X-100 ;余量的水；用 NaOH 調(diào)節(jié) pH 值為 8。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的細(xì)胞裂解液，其特征在于，包括： 1.576g/L Tris-HCl ；0. 7455g/L KC1 ；2. 033g/L MgCl2 ；0. 7448g/L EDTA ；25mL/L Triton X-100 ;余量的水；用NaOH調(diào)節(jié)pH值為8。
3. -種用于提取家禽DNA的細(xì)胞緩沖液，其特征在于，包括： 0· 5g/L ?2. 5g/L Tris-HCl ;0· 3g/L ?1. Og/L KC1 ;L 5g/L ?2. 5g/L MgCl2 ;0· 5g/ L ?1. 5g/L EDTA ;15g/L ?30g/L NaCl ;0· 5g/L ?1. 5g/L SDS ;余量的水；用 NaOH 調(diào)節(jié) pH 值為8。
4. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的細(xì)胞緩沖液，其特征在于，包括： 1.576g/L Tris-HCl ；0.7455g/L KC1 ；2.033g/L MgCl2 ；0. 7448g/L EDTA ；23.376g/L NaCl ;lg/L SDS ;余量的水；用NaOH調(diào)節(jié)pH值為8。
5. -種用于提取家禽DNA的細(xì)胞裂解液，其特征在于，包括Buffer WY和Buffer YW， 其中， 所述 Buffer WY 包括：0· 5g/L ?2. 5g/L Tris-HCl ;0· 3g/L ?1. Og/L KC1 ;1. 5g/L ? 2. 5g/L MgCl2 ;0· 5g/L?1. 5g/L EDTA ;20mL/L?30mL/L Triton X-100 ;余量的水；用 NaOH 調(diào)節(jié)pH值為8 ; 所述 Buffer YW 包括：0· 5g/L ?2. 5g/L Tris-HCl ;0· 3g/L ?1. Og/L KC1 ;1. 5g/L ? 2. 5g/L MgCl2 ;0· 5g/L ?1. 5g/L EDTA ;15g/L ?30g/L NaCl ;0· 5g/L ?1. 5g/L SDS ;余量 的水；用NaOH調(diào)節(jié)pH值為8。
6. 根據(jù)權(quán)利要求5所述的細(xì)胞裂解液，其特征在于，所述Buffer WY包括：1. 576g/L Tris-HCl ;0· 7455g/L KC1 ;2. 033g/L MgCl2 ;0· 7448g/L EDTA ;25mL/L Triton X-100 ;余量 的水；用NaOH調(diào)節(jié)pH值為8 ; 所述Buffer YW包括：1. 576g/L Tris-HCl ;0· 7455g/L KC1 ;2. 033g/L MgCl2 ;0· 7448g/ L EDTA ;23. 376g/L NaCl ;lg/L SDS ;余量的水；用 NaOH 調(diào)節(jié) pH 值為 8。
7. 含有權(quán)利要求5或6所述的細(xì)胞裂解液的家禽DNA提取試劑盒。
8. 根據(jù)權(quán)利要求7所述的試劑盒，其特征在于，還包括：NaCl溶液、異丙醇、75%酒精和 TE裂解液。
9. 一種家禽DNA提取方法，包括： a) 將新鮮抗凝家禽類血樣與Buffer WY溶液混合，經(jīng)水浴加熱后離心，將棄上清后得 到的物質(zhì)與Buffer WY溶液混合，離心后棄上清得到沉淀；所述Buffer WY溶液包括：0. 5g/ L ?2. 5g/L Tris-HCl ;0· 3g/L ?1. Og/L KC1 ;L 5g/L ?2. 5g/L MgCl2 ;0· 5g/L ?1. 5g/L EDTA ;20mL/L ?30mL/L Triton X-100 ;余量的水；用 NaOH 調(diào)節(jié) pH 值為 8 ; b) 將所述步驟a)得到的沉淀與Buffer YW溶液和蛋白酶K溶液混合，水浴加熱后加 入NaCl溶液，在核酸純化柱中純化后離心，得到濾液；所述Buffer YW溶液包括：0. 5g/L? 2. 5g/L Tris-HCl ;0· 3g/L?1. Og/L KC1 ;1· 5g/L?2. 5g/L MgCl2 ;0· 5g/L?1. 5g/L EDTA ; 15g/L ?30g/L NaCl ;0· 5g/L ?L 5g/L SDS ;余量的水；用 NaOH 調(diào)節(jié) pH 值為 8 ; c) 將所述步驟b)得到的濾液與異丙醇混合，離心后棄上清，然后與75%酒精混合，離 心后棄上清，加熱后加入TE裂解液溶解。
10.根據(jù)權(quán)利要求10所述的提取方法，其特征在于，所述步驟a)具體為：將10?20 μ L 新鮮抗凝家禽類血樣與l(KK)μLBuf?erWY溶液震蕩混合，60?7(rC水浴加熱5min?8min 后10000?15000rpm/min離心1?3min，將棄上清后得到的物質(zhì)與ΙΟΟΟμ L BufferWY溶 液震蕩混合，10000?15000rpm/min離心1?3min后棄上清得到沉淀； 所述步驟b)具體為：將所述步驟a)得到的沉淀與200yL Buffer YW溶液和 10 μ L20mg/mL的蛋白酶K溶液震蕩混合，60?70°C水浴加熱20min?30min后加入 100 μ L5mol/L的NaCl溶液，在核酸純化柱中純化后6000?10000rpm/min離心lmin，得到 濾液； 所述步驟c)具體為：將所述步驟b)得到的濾液與等體積的異丙醇混合，10000? 15000卬111/1^11離心3?51^11后棄上清，然后與1000?150(^1^75%酒精震蕩混合，10000? 15000rpm/min離心1?3min后棄上清，70?75°C烘箱加熱1?3min后加入50mLTE裂解 液溶解。
【文檔編號(hào)】C12N15/10GK104152438SQ201410403604
【公開日】2014年11月19日 申請(qǐng)日期:2014年8月15日 優(yōu)先權(quán)日:2014年8月15日
【發(fā)明者】王也, 劉顯慶, 劉益平, 金潔, 卿瑩, 朱慶 申請(qǐng)人:四川農(nóng)業(yè)大學(xué)