衍生自丙型肝炎病毒的核酸以及通過使用該核酸各自制備的表達(dá)載體、轉(zhuǎn)化細(xì)胞和丙型 ...的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明提供了包括丙型肝炎病毒基因組的5'非翻譯區(qū)、NS3蛋白質(zhì)編碼區(qū)、NS4A蛋白質(zhì)編碼區(qū)、NS4B蛋白質(zhì)編碼區(qū)、NS5A蛋白質(zhì)編碼區(qū)、NS5B蛋白質(zhì)編碼區(qū)和3'非翻譯區(qū)的核酸，其中所述核酸在NS3蛋白質(zhì)編碼區(qū)、NS5A蛋白質(zhì)編碼區(qū)或NS5B蛋白質(zhì)編碼區(qū)中具有引起選自下述的一個(gè)或多個(gè)氨基酸置換的核苷酸置換：M（1205）K、F（1548）L、C（1615）W、T（1652）N、A（2196）T、A（2218）S、H（2223）Q、Q（2281）R、K（2520）N和G（2374）S，如使用作為參考序列的在序列表中的SEQIDNO：6中所示的氨基酸序列定義的。
【專利說明】衍生自丙型肝炎病毒的核酸以及通過使用該核酸各自制備 的表達(dá)載體、轉(zhuǎn)化細(xì)胞和丙型肝炎病毒顆粒
[0001] 本申請(qǐng)是國際申請(qǐng)日為2009年12月25日、國際申請(qǐng)?zhí)枮镻CT/JP2009/071644、 進(jìn)入國家階段的申請(qǐng)?zhí)枮?00980157561. X、發(fā)明名稱為"衍生自丙型肝炎病毒的核酸以及 通過使用該核酸各自制備的表達(dá)載體、轉(zhuǎn)化細(xì)胞和丙型肝炎病毒顆粒"的PCT申請(qǐng)的分案申 請(qǐng)。

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0002] 本發(fā)明涉及丙型肝炎病毒衍生的核酸以及使用該核酸制備的表達(dá)載體、轉(zhuǎn)化細(xì)胞 和丙型肝炎病毒（HCV)顆粒。

【背景技術(shù)】
[0003] 使得有效病毒擴(kuò)增成為可能的實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)是病毒研究以及抗病毒藥物研究和開發(fā) 所必需的。此外，如果存在使用培養(yǎng)細(xì)胞用于擴(kuò)增病毒的系統(tǒng)或使用培養(yǎng)細(xì)胞用于評(píng)估病 毒生長的系統(tǒng)，那么病毒研究以及關(guān)于抗病毒藥物的研究和開發(fā)將得到極大進(jìn)步。
[0004] 丙型肝炎病毒(在下文中，稱為HCV)屬于黃病毒（Flaviviridae)科，包括單鏈 (+)有義RNA作為其基因組，并且已知其引起丙型肝炎。近期研究已揭示丙型肝炎病毒依 賴于基因型或血清型分類為許多類型。根據(jù)使用HCV毒株核苷酸序列的Simmonds等人的 系統(tǒng)發(fā)育分析法，HCV分類為6個(gè)基因型，并且基因型進(jìn)一步分類為幾個(gè)亞型（Simmonds， P.等人，H印atology，1994,10:1321-1324)。多種HCV基因型的全長基因組的核苷酸序列 目前已得到確定（Choo 等人，Science，1989, 244 :359-362 ;Kato 等人，J. Med. Virol·， 2001,64:334-339 ;0kamoto，H 等人，J. Gen Virol.，1992,73 :673-679 ;和 Yoshioka 等人， Hepatology,1992,16 ：293-299)〇
[0005] 直到最近，用HCV感染培養(yǎng)細(xì)胞或HCV基因組在培養(yǎng)細(xì)胞中的復(fù)制仍是不可能的。 因此，深入HCV復(fù)制機(jī)制或HCV感染機(jī)制之內(nèi)的研究需要使用黑猩猩作為實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的使用 體內(nèi)系統(tǒng)的實(shí)驗(yàn)。然而，由基因型Ib的HCV的Conl毒株、N毒株和0毒株以及基因型Ia的 HCV的H77毒株制備亞基因組復(fù)制子RNA已使得能夠在使用培養(yǎng)細(xì)胞的體外系統(tǒng)中進(jìn)行關(guān) 于深入HCV復(fù)制機(jī)制之內(nèi)的研究的實(shí)驗(yàn)（日本專利公開（Kokai)號(hào)2001-17187 A ;Lomann 等人，Science，1999,285 :110-113 ;Blight 等人，Science，2000, 290 :1972-1974 ;Friebe 等人，2001,75 :12047-12057 ;和 Ikeda 等人，J. Virol.，2002,76 :2997-3006)。此處，術(shù)語 "HCV亞基因組復(fù)制子RNA"指包括HCV基因組的一部分的RNA，其不能產(chǎn)生感染性HCV顆粒 但能夠自我復(fù)制引入細(xì)胞內(nèi)的HCV基因組衍生的RNA。
[0006] 此外，連同亞基因組復(fù)制子RNA，通過其經(jīng)由體外引入Huh7細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生感染性 HCV顆粒的全基因組復(fù)制子RNA已由基因型2a的HCV的JFH-I毒株制備。這已使得能 夠使用培養(yǎng)細(xì)胞用體外系統(tǒng)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，也用于深入HCV感染機(jī)制之內(nèi)的研究（Kato, T等 人，Gastroenterology，2003,125 :1808-1817 ;和 Wakita，T 等人，Nat Med.，2005,11 : 791-796)。此處，術(shù)語"HCV全基因組復(fù)制子RNA"指包括全長HCV基因組的RNA，其能夠自 我復(fù)制引入細(xì)胞內(nèi)的HCV基因組衍生的RNA并且能夠產(chǎn)生感染性HCV顆粒。
[0007] 同時(shí)，丙型肝炎目前主要通過用干擾素-α或干擾素-β的單藥劑療法以及用干 擾素-α和病毒唑的組合療法進(jìn)行治療，所述病毒唑是嘌呤核苷衍生物。然而，已知即使當(dāng) 執(zhí)行這些療法時(shí)，對(duì)于所有治療患者中的僅約60%觀察到療效。還已知如果療法中斷，那 么疾病在有效治療患者中的一半或更多中再次突然爆發(fā)。另外，干擾素的療效與HCV基因 型相關(guān)，并且從而已知療效對(duì)于基因型Ib低但對(duì)于基因型2a商（Mori，S.，等人，Biochem. Biophis. Res. Commun., 1992,183:334-342)。
[0008] 為什么干擾素療效取決于HCV基因型而不同的原因仍未得到闡明。認(rèn)為原因之一 是HCV復(fù)制機(jī)制或HCV復(fù)制效率中存在差異。
[0009] 然而，HCV亞基因組復(fù)制子RNA的存在局限于來自基因型IaUb和2a的HCV毒株 的幾個(gè)類型。此外，全基因組復(fù)制子RNA的存在局限于來自基因型2a的HCV的JFH-I毒 株的一個(gè)類型。因此，闡明HCV基因型和HCV復(fù)制機(jī)制或HCV復(fù)制效率之間的關(guān)系是困難 的。此外，可以人工制備且用于HCV疫苗的原料的病毒顆粒類型也局限于由全基因組復(fù)制 子RNA生成的那些。因此，具有特征性復(fù)制機(jī)制或復(fù)制效率的HCV的其他亞基因組復(fù)制子 RNAs或全基因組復(fù)制子RNA的發(fā)現(xiàn)是期望的。
[0010] 不存在來自相同基因型的HCV或來自就復(fù)制機(jī)制或復(fù)制效率而言具有不同特征 的相同HCV毒株的亞基因組復(fù)制子RNAs或全基因組復(fù)制子RNAs。因此，HCV復(fù)制機(jī)制或 HCV復(fù)制效率中的差異無法使用具有相同遺傳背景的樣品進(jìn)行比較。此外，無法鑒定通過新 抗HCV治療劑靶向的HCV復(fù)制所需的因子，并且無法篩選能夠不依賴于復(fù)制機(jī)制或復(fù)制效 率發(fā)揮有利效應(yīng)的抗HCV治療劑。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0011] 本發(fā)明待解決的問題 本發(fā)明的目的是提供具有高自我復(fù)制能力的新HCV亞基因組復(fù)制子RNA和全基因組復(fù) 制子RNA。
[0012] 用于解決問題的手段 本發(fā)明人已將由HCV基因組制備的亞基因組復(fù)制子RNA引入培養(yǎng)細(xì)胞內(nèi)，所述HCV基 因組從暴發(fā)性丙型肝炎患者中分離，并且隨后深入研究在已自我復(fù)制的亞基因組復(fù)制子 RNA中生成的突變。因此，他們已揭示了顯著增加自我復(fù)制能力（自主復(fù)制能力)的突變。此 夕卜，通過使編碼HCV基因組的結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)的區(qū)域等與具有顯著增加自我復(fù)制能力的突變的 HCV亞基因組復(fù)制子RNA連接，他們已成功制備了能夠產(chǎn)生感染性HCV顆粒的全基因組復(fù)制 子RNA。因此，他們已完成了本發(fā)明。
[0013] 具體地，本發(fā)明提供了包括丙型肝炎病毒基因組的5'非翻譯區(qū)、NS3蛋白質(zhì)編碼 區(qū)、NS4A蛋白質(zhì)編碼區(qū)、NS4B蛋白質(zhì)編碼區(qū)、NS5A蛋白質(zhì)編碼區(qū)、NS5B蛋白質(zhì)編碼區(qū)和3' 非翻譯區(qū)的核酸，其中所述核酸在NS3蛋白質(zhì)編碼區(qū)、NS5A蛋白質(zhì)編碼區(qū)或NS5B蛋白質(zhì)編 碼區(qū)中具有引起選自下述的一個(gè)或多個(gè)氨基酸置換的核苷酸置換：M (1205)K、F (1548)L、 C (1615)W、T (1652)N、A (2196)T、A (2218)S、H (2223)Q、Q (2281)R、K (2520)N 和 G (2374)S，如使用作為參考序列的在序列表中的SEQ ID NO :6中所示的氨基酸序列定義的。
[0014] 核酸優(yōu)選具有至少引起NS5A蛋白質(zhì)編碼區(qū)中的氨基酸置換A (2218) S的核苷酸 置換。
[0015] 核酸優(yōu)選進(jìn)一步包括丙型肝炎病毒基因組的核心蛋白質(zhì)編碼區(qū)、El蛋白質(zhì)編碼 區(qū)、E2蛋白質(zhì)編碼區(qū)、p7蛋白質(zhì)編碼區(qū)和NS2蛋白質(zhì)編碼區(qū)。
[0016] 在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，核酸編碼在序列表中的SEQ ID NO :5或6中所示的氨基 酸序列中具有選自下述的一個(gè)或多個(gè)氨基酸置換的氨基酸序列：M (1205) K、F (1548) L、 C (1615)W、T (1652)N、A (2196)T、A (2218)S、H (2223)Q、Q (2281)R、K (2520)N 和 G (2374)S，如使用作為參考序列的在序列表中的SEQ ID NO :6中所示的氨基酸序列定義的。
[0017] 在另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，核酸由序列表中的SEQ ID NO : 12或13中所示的核苷 酸序列組成。
[0018] 核酸可以進(jìn)一步包括標(biāo)記基因和/或IRES序列。
[0019] 核酸可以是亞基因組復(fù)制子RNA。
[0020] 可替代地，核酸可以是全基因組復(fù)制子RNA。
[0021] 包括HCV亞基因組序列的核酸用作用于合成HCV亞基因組復(fù)制子RNA的模板或直 接用作HCV亞基因組復(fù)制子RNA。將HCV亞基因組復(fù)制子RNA引入培養(yǎng)細(xì)胞內(nèi)，從而展示出 高于迄今獲得的HCV亞基因組復(fù)制子RNA的自我復(fù)制能力。因此，包括HCV亞基因組序列 的核酸可以用于篩選抑制HCV復(fù)制的抗HCV藥物或用于闡明HCV復(fù)制機(jī)制的研究。
[0022] 包括HCV全基因組序列的核酸用作用于合成HCV全基因組復(fù)制子RNA的模板或直 接用作HCV全基因組復(fù)制子RNA。將HCV全基因組復(fù)制子RNA引入培養(yǎng)細(xì)胞內(nèi)，從而展示出 高于迄今獲得的HCV全基因組復(fù)制子RNA的自我復(fù)制能力，并且可以有效產(chǎn)生感染性HCV 顆粒。
[0023] 本發(fā)明進(jìn)一步提供了包括在啟動(dòng)子下游可操作地連接的核酸的表達(dá)載體。
[0024] 本發(fā)明可以進(jìn)一步提供包括核酸的表達(dá)載體，所述核酸在啟動(dòng)子下游可操作地連 接，并且編碼全基因組復(fù)制子RNA。
[0025] 本發(fā)明還提供了通過引入全基因組復(fù)制子RNA或表達(dá)載體獲得的轉(zhuǎn)化細(xì)胞，所述 表達(dá)載體包括編碼全基因組復(fù)制子RNA的核酸。在此類轉(zhuǎn)化細(xì)胞中，優(yōu)選地，全基因組復(fù)制 子RNA是自我復(fù)制的。此類轉(zhuǎn)化細(xì)胞可以適當(dāng)?shù)赜糜诋a(chǎn)生丙型肝炎病毒（HCV)顆粒。根據(jù) 本發(fā)明進(jìn)一步提供了通過培養(yǎng)轉(zhuǎn)化細(xì)胞獲得的丙型肝炎病毒（HCV)顆粒。本發(fā)明還提供了 針對(duì)此類丙型肝炎病毒（HCV)顆粒的抗體。
[0026] 本說明書包括日本專利申請(qǐng)?zhí)?008-335016的說明書和附圖的公開內(nèi)容，本申請(qǐng) 要求所述專利的優(yōu)先權(quán)。
[0027] 發(fā)明效果 根據(jù)本發(fā)明，可以提供具有高自我復(fù)制能力的HCV亞基因組復(fù)制子RNA和HCV全基因 組復(fù)制子RNA。此類復(fù)制子RNA可以用于篩選抑制HCV復(fù)制的抗HCV藥物或用于闡明HCV 復(fù)制機(jī)制的研究。此外，本發(fā)明的HCV全基因組復(fù)制子RNA具有高于迄今獲得的HCV全基 因組復(fù)制子RNA的HCV顆粒生產(chǎn)能力。因此，可以在體外大量制備感染性HCV顆粒。因而 獲得的HCV顆粒可以用作HCV疫苗或抗原用于制備抗HCV抗體。
[0028]

【專利附圖】

【附圖說明】 圖IA顯示了 HCV JFH-2. 1毒株和JFH-2. 3毒株的全長基因組結(jié)構(gòu)。圖IB和IC顯示 了用于合成來自JFH-2. 1和JFH-2. 3毒株的HCV亞基因組復(fù)制子RNA的載體pSGR-JFH-2. 1 和pSGR-JFH-2. 3的結(jié)構(gòu)。圖ID顯示了來自JFH-2. 1和JFH-2. 3毒株的HCV亞基因組復(fù)制 子RNA的結(jié)構(gòu)。
[0029] 圖2顯示了顯示通過來自JFH-2. 1和JFH-2. 3毒株的HCV亞基因組復(fù)制子RNA引 入其內(nèi)的細(xì)胞的集落形成的照片。
[0030] 圖3顯示了在突變型復(fù)制子中發(fā)現(xiàn)的氨基酸突變，這在JFH-2. 3亞基因組復(fù)制子 RNA已引入其內(nèi)的細(xì)胞中發(fā)生。
[0031] 圖4顯示了在JFH-2. 3亞基因組復(fù)制子中發(fā)現(xiàn)的氨基酸置換引入其內(nèi)的突變型 JFH-2.1 HCV亞基因組復(fù)制子RNA (圖4A)，和顯示通過用其各自轉(zhuǎn)化的細(xì)胞的集落形成的 照片（圖4B)。
[0032] 圖5顯示了 J6/JFH-2. 1和J6/JFH-2. I A2217S嵌合HCV全基因組復(fù)制子RNAs的 結(jié)構(gòu)。
[0033] 圖6顯示了 J6/JFH-2. 1和J6/JFH-2. I A2217S嵌合HCV全基因組復(fù)制子RNAs弓I 入其內(nèi)的Huh7細(xì)胞中的核心蛋白質(zhì)水平隨著時(shí)間過去的變化。
[0034] 圖7顯示了得自J6/JFH-2. I A2217S嵌合HCV全基因組復(fù)制子RNA引入其內(nèi)的 Huh7細(xì)胞傳代培養(yǎng)物的培養(yǎng)上清液中的核心蛋白質(zhì)水平隨著時(shí)間過去的變化。
[0035] 圖8顯示了評(píng)估J6/JFH-2. I A2217S HCV顆粒的感染性的結(jié)果。
[0036] 圖9顯示了 JFH-2. 1基因組RNA (HCV全基因組復(fù)制子RNA)和JFH-2. I A2218S HCV全基因組復(fù)制子RNA的結(jié)構(gòu)。
[0037] 圖10顯示了得自JFH-2. I A2218S HCV全基因組復(fù)制子RNA引入其內(nèi)的Huh7細(xì) 胞傳代培養(yǎng)物的培養(yǎng)上清液中的核心蛋白質(zhì)水平隨著時(shí)間過去的變化。
[0038] 圖11顯示了評(píng)估JFH-2. I A2218S HCV顆粒的感染性的結(jié)果。
[0039] 圖12顯示了得自用J6/JFH-2. I A2217S衍生的突變型HCV RNA轉(zhuǎn)染的Huh7細(xì)胞 (Huh7. 5. 1細(xì)胞)傳代培養(yǎng)物的培養(yǎng)上清液中的核心蛋白質(zhì)水平隨著時(shí)間過去的變化。在圖 12 中，J6/JFH2-AS、CS、LP、TI、CS/LP、CS/TI、TI/LP、CS/TI/LP、AT/CS/TI/LP、引入所有 4A 突變的病毒和引入所有4B突變的病毒分別指示J6/JFH-2. I A2217S、J6/JFH-2. I A2217S (CS)、J6/JFH-2.1 A2217S (LP)、J6/JFH-2.1 A2217S (TI)、J6/JFH-2.1 A2217S (CS/LP)、 J6/JFH-2. I A2217S (CS/TI),J6/JFH-2. I A2217S (TI/LP),J6/JFH-2. I A2217S (CS/TI/ LP)、J6/JFH-2. I A2217S (AT/CS/TI/LP)、J6/JFH-2. I A2217S (TI/MT/MK/NT/IV/SG/TA) 和 J6/JFH-2.1 A2217S (AT/CS/TI/LP/MV/VG/IV/KR)。關(guān)于 J6/JFH-2.1 A2217S (TI/MT/ MK/NT/IV/SG/TA)的結(jié)果用空心圓圈顯示，并且關(guān)于 J6/JFH-2. I A2217S(AT/CS/TI/LP/MV/ VG/IV/KR)的結(jié)果用實(shí)心圓圈顯示。
[0040] 具體實(shí)施方案 (1)根據(jù)本發(fā)明的突變型HCV復(fù)制子RNA和編碼該RNA的核酸 丙型肝炎病毒（HCV)基因組是包括約9, 600個(gè)核苷酸的單鏈（ + )RNA。這種基因組RNA 包括5'非翻譯區(qū)（也稱為"5' UTR"或"5' NTR")、由結(jié)構(gòu)區(qū)和非結(jié)構(gòu)區(qū)組成的翻譯區(qū)、和3' 非翻譯區(qū)（也稱為"3'UTR"或"3'NTR")。在結(jié)構(gòu)區(qū)中，編碼HCV結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)，并且在非結(jié)構(gòu) 區(qū)中，編碼非結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)。
[0041] HCV結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)和非結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)首先由翻譯區(qū)作為連續(xù)前體蛋白質(zhì)(多聚蛋白質(zhì)） 轉(zhuǎn)錄且翻譯。使HCV結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)接受通過宿主細(xì)胞中的蛋白酶的有限降解，并且使非結(jié)構(gòu) 蛋白質(zhì)部分接受通過2類自動(dòng)催化作用的HCV蛋白酶活性的有限降解，并且隨后這些蛋白 質(zhì)作為成熟蛋白質(zhì)分開釋放。
[0042] HCV結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)是組成HCV病毒顆粒部分的核心、El、E2和p7。核心是核心蛋白 質(zhì)，El和E2是包膜蛋白質(zhì)，并且p7是形成在宿主細(xì)胞的膜上起作用的離子通道的蛋白質(zhì)。
[0043] HCV非結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)是NS2、NS3、NS4A、NS4B、NS5A和NS5B，它們是具有涉及病毒基 因組復(fù)制或HCV蛋白質(zhì)加工的活性的酶蛋白質(zhì)。各種HCV基因型是已知的，并且各種基因 型的HCV基因組已知具有相似的基因結(jié)構(gòu)。
[0044] HCV 5'非翻譯區(qū)（5' UTR或5' NTR)提供了用于蛋白質(zhì)翻譯的內(nèi)部核糖體進(jìn)入位 點(diǎn)（IRES)和復(fù)制所需的元件，包括來自全長HCV基因組的N末端的約340個(gè)核苷酸。
[0045] HCV 3'非翻譯區(qū)（3'UTR或3'NTR)具有幫助HCV復(fù)制的功能，且除多聚U區(qū)外還 包括約100個(gè)核苷酸的另外區(qū)域。
[0046] 應(yīng)用HCV基因組，本發(fā)明提供了可以高效率自我復(fù)制的RNA或編碼該RNA的DNA， 包括突變已引入其內(nèi)以增加自我復(fù)制能力的HCV亞基因組序列或HCV全基因組序列。
[0047] 術(shù)語"復(fù)制子RNA"在本發(fā)明中指在細(xì)胞中可自我復(fù)制(可自主復(fù)制）的RNA。引入 細(xì)胞內(nèi)的復(fù)制子RNA自我復(fù)制，并且所得到的RNA拷貝在細(xì)胞分裂后分配給子代細(xì)胞，從而 使得使用復(fù)制子RNA穩(wěn)定引入細(xì)胞內(nèi)是可能的。在本發(fā)明中，在HCV背景中的術(shù)語"基因 型"指根據(jù)由Simmonds等人開發(fā)的國際分類法（International Classification)分類的基 因型。
[0048] 在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了包括丙型肝炎病毒基因組的5'非翻譯區(qū)、 NS3蛋白質(zhì)編碼區(qū)、NS4A蛋白質(zhì)編碼區(qū)、NS4B蛋白質(zhì)編碼區(qū)、NS5A蛋白質(zhì)編碼區(qū)、NS5B蛋白 質(zhì)編碼區(qū)和3'非翻譯區(qū)的核酸，其中所述核酸在NS3蛋白質(zhì)編碼區(qū)、NS5A蛋白質(zhì)編碼區(qū)或 NS5B蛋白質(zhì)編碼區(qū)中具有引起選自下述的一個(gè)或多個(gè)氨基酸置換的核苷酸置換：M (1205) K、F (1548)L、C (1615)W、T (1652)N、A (2196)T、A (2218)S、H (2223)Q、Q (2281)R、 K (2520) N和G (2374) S，如使用作為參考序列的在序列表中的SEQ ID NO :6中所示的氨 基酸序列定義的。此類核酸一般是突變型HCV復(fù)制子RNA或編碼該突變型RNA的DNA。
[0049] 根據(jù)本發(fā)明的核酸是包括丙型肝炎病毒基因組的5'非翻譯區(qū)、NS3蛋白質(zhì)編碼 區(qū)、NS4A蛋白質(zhì)編碼區(qū)、NS4B蛋白質(zhì)編碼區(qū)、NS5A蛋白質(zhì)編碼區(qū)、NS5B蛋白質(zhì)編碼區(qū)和3' 非翻譯區(qū)的核酸，并且編碼包括至少NS3蛋白質(zhì)、NS5A蛋白質(zhì)或NS5B蛋白質(zhì)的氨基酸序列， 其中一個(gè)或多個(gè)氨基酸置換選自 M (1205)K、F (1548)L、C (1615)W、T (1652)N、A (2196) T、A(2218)S、H(2223)Q、Q(2281)R、K(2520)N和G(2374)S，如使用作為參考序列的 在序列表中的SEQ ID NO :6中所示的氨基酸序列定義的。
[0050] 如本文使用的，除RNA和DNA外，術(shù)語"核酸"還指經(jīng)由其結(jié)合形成的雜交核酸。另 夕卜，此處，術(shù)語"蛋白質(zhì)編碼區(qū)"指編碼給定蛋白質(zhì)的氨基酸序列的核苷酸序列，其可以包括 或可以不包括起始密碼子和終止密碼子。
[0051] 在說明書中，表達(dá)"如使用作為參考序列的在序列表中的SEQ ID NO :"X"中所示 的氨基酸序列定義的氨基酸置換"a (Z) b""，意指當(dāng)氨基酸序列Y (優(yōu)選地，與SEQ ID NO: "X"同源）與作為參考序列的在序列表中的SEQ ID NO :"X"中所示的序列比對(duì)時(shí)，待與位于 SEQ ID NO :"X"中所示的氨基酸序列中在位置"Z"上的氨基酸"a"比對(duì)的在給定氨基酸序 列Y中的氨基酸(這優(yōu)選地是但不限于與SEQ ID NO :"X"中相同的氨基酸"a"，或類似于氨 基酸"a"的氨基酸）由氨基酸"b"置換。此處，"a"和"b"代表給定氨基酸，其各自基于生 物學(xué)領(lǐng)域中一般用于氨基酸的單字母符號(hào)進(jìn)行描述。
[0052] 因此，例如，表達(dá)"如使用作為參考序列的在序列表中的SEQ ID NO :6中所示的氨 基酸序列定義的氨基酸置換A (2218) S"，意指當(dāng)HCV前體蛋白質(zhì)的氨基酸序列"Y"與SEQ ID NO :6中所示的氨基酸序列（HCV JFH-2. 3毒株的前體蛋白質(zhì)的氨基酸序列)比對(duì)時(shí)，待與 SEQ ID NO :6的位置2218上的氨基酸A (丙氨酸）比對(duì)的在給定氨基酸序列Y中的氨基酸 的S (絲氨酸)置換。因此，例如當(dāng)整個(gè)HCV前體蛋白質(zhì)的氨基酸序列中的第2217位丙氨酸 (在位置2217上的丙氨酸)與SEQ ID NO :6中所示的氨基酸序列中在位置2218上的丙氨酸 比對(duì)時(shí)，在目的氨基酸序列中在位置2217上的丙氨酸由絲氨酸的置換對(duì)應(yīng)于"如使用作為 參考序列的在序列表中的SEQ ID NO :6中所示的氨基酸序列定義的氨基酸置換A (2218) S"。
[0053] 此外，短語"如使用作為參考序列的在序列表中的SEQ ID NO :"X"中所示的氨基 酸序列定義的在位置"Z"上的氨基酸"，指當(dāng)SEQ ID NO :"X"中所示的序列與序列Y (優(yōu)選 地，與SEQ ID NO :"X"同源）比對(duì)時(shí)，待與SEQ ID NO :"X"中所示的氨基酸序列中在位置 "Z"上的氨基酸比對(duì)的在給定氨基酸序列Y中的氨基酸。表達(dá)"如使用作為參考序列的在 序列表中的SEQ ID NO :"X"中所示的核苷酸序列定義的在位置"Z"上的核苷酸"也將類似 地理解。
[0054] 在說明書中，如果核酸是RNA，并且RNA的核苷酸序列或核苷酸通過參考序列表中 的SEQ ID NO (S)指定，那么相關(guān)SEQ ID NO中所示的核苷酸序列中的"T (胸腺嘧啶）"應(yīng) 讀作"U (尿嘧啶)"。
[0055] 給定序列Y與SEQ ID NO :"X"中所示的序列的比對(duì)可以手工執(zhí)行，或通過例 如Clustal W多重比對(duì)程序（Thompson，J. D.等人，（1994)Nucleic Acids Res. 22,第 4673-4680頁）使用缺省設(shè)置執(zhí)行。
[0056] 在說明書中，每個(gè)HCV區(qū)域還可以用在每個(gè)區(qū)域的5'末端和3'末端上的核苷酸 位置進(jìn)行鑒定，如使用作為參考序列的SEQ ID NO :4中所示的核苷酸序列（JFH-2. 3毒株的 全長基因組序列）定義的。在SEQ ID NO :4中所示的核苷酸序列中，5'UTR范圍從核苷酸 位置1到340,核心編碼區(qū)(核心區(qū)）范圍從核苷酸位置341到913, El編碼區(qū)（El區(qū)）范圍 從核苷酸位置914到1492, E2編碼區(qū)（E2區(qū)）范圍從核苷酸位置1493到2593, p7編碼區(qū) (p7區(qū)）范圍從核苷酸位置2594到2782, NS2編碼區(qū)（NS2區(qū)）范圍從核苷酸位置2783到 3433, NS3編碼區(qū)（NS3區(qū)）范圍從核苷酸位置3434到5326, NS4A編碼區(qū)（NS4A區(qū)）范圍從 核苷酸位置5327到5488, NS4B編碼區(qū)（NS4B區(qū)）范圍從核苷酸位置5489到6271，NS5A編 碼區(qū)（NS5A區(qū)）范圍從核苷酸位置6272到7669, NS5B編碼區(qū)（NS5B區(qū)）范圍從核苷酸位置 7670到9445,并且3' UTR范圍從核苷酸位置9446到9686。
[0057] 在說明書中，HCV前體蛋白質(zhì)中的氨基酸可以用氨基酸編號(hào)進(jìn)行指定，所述氨基 酸編號(hào)通過用前體蛋白質(zhì)的翻譯起始甲硫氨酸(M)編號(hào)為"第一個(gè)"氨基酸而給定。例如， JFH-2. 1毒株的前體蛋白質(zhì)從翻譯起始甲硫氨酸開始，并且隨后以第3034位精氨酸（R)結(jié) 束。此外，JFH-2. 1毒株的第2218位氨基酸是NS5A區(qū)中包括的丙氨酸（A)。
[0058] 在說明書中，氨基酸置換通過例如A (2218)S或在位置2218上的A-S指示。具 體地，作為原則，它們都意指在位置2218上的A (丙氨酸）由S (絲氨酸）置換。在說明書 中，氨基酸或氨基酸殘基由生物學(xué)領(lǐng)域中一般用于氨基酸的單字母代碼或三字母代碼描述 (Sambrook 等人，Molecular Cloning :A Laboratory Manual 第 2 版，1989)。如上所述的氨 基酸也包括接受翻譯后修飾例如羥基化、糖基化或硫酸化的氨基酸。
[0059] 在本發(fā)明中，如使用作為參考序列的在序列表中的SEQ ID NO :6中所示的氨基酸 序列定義的，將選自 M (1205)K、F (1548)L、C (1615)W、T (1652)N、A (2196)T、A (2218) S、H (2223) Q、Q (2281) R、K (2520) N和G (2374) S的一個(gè)或多個(gè)氨基酸置換引入HCV前 體蛋白質(zhì)中的NS3蛋白質(zhì)、NS5A蛋白質(zhì)和NS5B蛋白質(zhì)內(nèi)，從而可以增加編碼HCV前體蛋白 質(zhì)的復(fù)制子RNA的自我復(fù)制能力。一個(gè)或多個(gè)氨基酸置換的此類引入可以通過使用本領(lǐng)域 技術(shù)人員已知的基因工程技術(shù)引入核苷酸置換執(zhí)行，所述核苷酸置換引起編碼HCV復(fù)制子 RNA的DNA內(nèi)的相關(guān)氨基酸置換。
[0060] 根據(jù)生物學(xué)領(lǐng)域中眾所周知的遺傳密碼表，通過比較置換后的氨基酸密碼子與置 換前的氨基酸密碼子，可以容易地指定引起一個(gè)或多個(gè)上述氨基酸置換的一個(gè)或多個(gè)核苷 酸置換。
[0061] 根據(jù)本發(fā)明的核酸例如突變型HCV復(fù)制子RNA或編碼該RNA的DNA并無限制，但 優(yōu)選具有引起來自上述氨基酸置換中的至少氨基酸置換A(2218)S的核苷酸置換。這是因 為該氨基酸置換對(duì)于增強(qiáng)自我復(fù)制是特別有效的。例如，引起氨基酸置換A (2218) S的核 苷酸置換優(yōu)選是這樣的核苷酸置換，其將編碼在氨基酸位置2218上的丙氨酸的密碼子(一 般而言，GCT、GCC、GCA或GCG)轉(zhuǎn)換為編碼絲氨酸的密碼子例如TCA、TCC、TCG、TCT、AGT或 AGC。
[0062] 除5'非翻譯區(qū)、NS3蛋白質(zhì)編碼區(qū)、NS4A蛋白質(zhì)編碼區(qū)、NS4B蛋白質(zhì)編碼區(qū)、NS5A 蛋白質(zhì)編碼區(qū)、NS5B蛋白質(zhì)編碼區(qū)和3'非翻譯區(qū)外，根據(jù)本發(fā)明的核酸例如突變型HCV復(fù) 制子RNA或編碼該RNA的DNA可以進(jìn)一步包括丙型肝炎病毒基因組的核心蛋白質(zhì)編碼區(qū)、 El蛋白質(zhì)編碼區(qū)、E2蛋白質(zhì)編碼區(qū)和p7蛋白質(zhì)編碼區(qū)。根據(jù)本發(fā)明的突變型HCV復(fù)制子 RNA或編碼該RNA的核酸可以進(jìn)一步包括丙型肝炎病毒基因組的NS2蛋白質(zhì)編碼區(qū)。根據(jù) 本發(fā)明的突變型HCV復(fù)制子RNA或編碼該RNA的核酸進(jìn)一步優(yōu)選包括核心蛋白質(zhì)編碼區(qū)、 El蛋白質(zhì)編碼區(qū)、E2蛋白質(zhì)編碼區(qū)、p7蛋白質(zhì)編碼區(qū)和NS2蛋白質(zhì)編碼區(qū)，并且更優(yōu)選以 這一次序包括它們。
[0063] 根據(jù)本發(fā)明的核酸的優(yōu)選例子是編碼在序列表中的SEQ ID NO :5或6中所示的 氨基酸序列中具有選自下述的一個(gè)或多個(gè)氨基酸置換的氨基酸序列的核酸:M (1205) K、 F (1548)L、C (1615)W、T (1652)N、A (2196)T、A (2218)S、H (2223)Q、Q (2281)R、K (2520)N和G(2374)S，如使用作為參考序列的在序列表中的SEQ ID NO :6中所示的氨基酸 序列定義的。核酸編碼從暴發(fā)性肝炎患者中分離的JFH-2. 1毒株（SEQ ID N0:5)或JFH-2. 3 毒株（SEQ ID NO :6)的前體蛋白質(zhì)的突變型。
[0064] 根據(jù)本發(fā)明的上述核酸的另一個(gè)優(yōu)選例子是包括序列表中的SEQ ID NO : 12或13 中所示的核苷酸序列的核酸。
[0065] 根據(jù)本發(fā)明的核酸例如突變型HCV復(fù)制子RNA或編碼該RNA的DNA優(yōu)選進(jìn)一步包 括外源基因例如標(biāo)記基因和/或IRES序列。此類標(biāo)記基因的例子包括可以對(duì)細(xì)胞賦予選 擇性通過其僅選擇表達(dá)相關(guān)基因的細(xì)胞的選擇標(biāo)記基因，和編碼充當(dāng)基因表達(dá)指示的基因 產(chǎn)物的報(bào)道基因。在本發(fā)明中，此類選擇標(biāo)記基因的優(yōu)選例子包括但不限于新霉素抗性基 因、胸苷激酶基因、卡那霉素抗性基因、吡啶硫胺素抗性基因、腺苷酰轉(zhuǎn)移酶基因、Zeocin抗 性基因和嘌呤霉素抗性基因。在本發(fā)明中，報(bào)道基因的優(yōu)選例子包括但不限于轉(zhuǎn)座子Tn9 衍生的氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶基因、大腸桿菌cWi)衍生的β葡糖醛酸酶或β 半乳糖苷酶基因、螢光素酶基因、綠色熒光蛋白基因、水母衍生的水母發(fā)光蛋白基因和分泌 的胎盤堿性磷酸酶（SEAP)基因。
[0066] 在本發(fā)明中的術(shù)語"IRES序列"指能夠引起核糖體與RNA內(nèi)部結(jié)合以便起始翻譯 的內(nèi)部核糖體進(jìn)入位點(diǎn)。在本發(fā)明中此類IRES序列的優(yōu)選例子包括但不限于EMCV IRES (腦心肌炎病毒的內(nèi)部核糖體進(jìn)入位點(diǎn)）、FMDV IRES和HCV IRES。
[0067] 根據(jù)本發(fā)明的核酸例如突變型HCV復(fù)制子RNA或編碼該RNA的DNA可以是包括 HCV亞基因組復(fù)制子序列的核酸，這僅包括丙型肝炎病毒基因組的5'非翻譯區(qū)、NS3蛋白質(zhì) 編碼區(qū)、NS4A蛋白質(zhì)編碼區(qū)、NS4B蛋白質(zhì)編碼區(qū)、NS5A蛋白質(zhì)編碼區(qū)、NS5B蛋白質(zhì)編碼區(qū) 和3'非翻譯區(qū)作為HCV衍生的序列。在本發(fā)明中，術(shù)語"HCV亞基因組"指HCV全長基因組 的部分序列。HCV亞基因組復(fù)制子RNA是包括HCV亞基因組的復(fù)制子RNA，但不包括范圍從 HCV全長基因組的5' UTR到3' UTR的全部區(qū)域。
[0068] 包括HCV亞基因組復(fù)制子序列的核酸的例子是RNA，其中在5'到3'方向，5' UTR、 包括來自核心編碼區(qū)5'末端的36個(gè)核苷酸的序列、螢光素酶基因(標(biāo)記基因)、腦心肌炎病 毒IRES序列、NS3區(qū)、NS4A區(qū)、NS4B區(qū)、NS5A區(qū)、NS5B區(qū)和3' UTR例如以此次序連接。
[0069] 根據(jù)本發(fā)明的核酸例如突變型HCV復(fù)制子RNA或編碼該RNA的DNA還可以是HCV 全基因組復(fù)制子RNA。術(shù)語"HCV全基因組復(fù)制子RNA"指包括范圍從HCV全長基因組的 5' UTR到3' UTR的全部區(qū)域的復(fù)制子RNA，具體地，5' UTR、核心蛋白質(zhì)編碼區(qū)(核心區(qū))、E1 蛋白質(zhì)編碼區(qū)（El區(qū))、E2蛋白質(zhì)編碼區(qū)（E2區(qū))、p7蛋白質(zhì)編碼區(qū)（p7區(qū))、NS2蛋白質(zhì)編碼 區(qū)（NS2區(qū))、NS3蛋白質(zhì)編碼區(qū)（NS3區(qū)）、NS4A蛋白質(zhì)編碼區(qū)（NS4A區(qū)）、NS4B蛋白質(zhì)編碼 區(qū)（NS4B區(qū)）、NS5A蛋白質(zhì)編碼區(qū)（NS5A區(qū)）、NS5B蛋白質(zhì)編碼區(qū)（NS5B區(qū)）和3' UTR。HCV 全基因組復(fù)制子RNA可以由HCV全長基因組序列組成或可以進(jìn)一步包括另外序列。在本發(fā) 明中，術(shù)語"HCV全長基因組"或"全長HCV基因組"指包括HCV基因組的全長序列（范圍從 5' UTR到3' UTR)的RNA或編碼該RNA的DNA。
[0070] (2)根據(jù)本發(fā)明的復(fù)制子RNA的制備 使用編碼突變型HCV復(fù)制子RNA的DNA并且隨后將其用作模板，通過經(jīng)由本領(lǐng)域技 術(shù)人員已知的任何基因工程技術(shù)制備復(fù)制子RNA表達(dá)載體，可以制備根據(jù)本發(fā)明的突變型 HCV復(fù)制子RNA，具體地突變型HCV亞基因組復(fù)制子RNA或突變型HCV全基因組復(fù)制子RNA。 本發(fā)明還提供了包括核酸(優(yōu)選地，編碼突變型HCV復(fù)制子RNA的DNA)的載體，特別是表達(dá) 載體，所述核酸例如突變型HCV復(fù)制子RNA、編碼該RNA的DNA等，其在啟動(dòng)子下游可操作地 連接。表達(dá)載體可以用于在體外有效合成突變型HCV復(fù)制子RNA。用于構(gòu)建根據(jù)本發(fā)明的 復(fù)制子RNA表達(dá)載體的基礎(chǔ)技術(shù)如Lohmann等人的文獻(xiàn)（Science, 285 :110-113,1999)和 Kato 等人的文獻(xiàn)（Gastroenterology，125 :1808-1817, 2003)中所述。
[0071] 作為可以用于制備根據(jù)本發(fā)明的核酸的HCV毒株，可以使用從HCV患者中分離的 任何毒株或其衍生毒株。更優(yōu)選使用從暴發(fā)性丙型肝炎患者中分離的HCV毒株。用于從 患者中分離HCV基因組的方法如Kato等人的文獻(xiàn)（Gastroenterology, 125 :1808-1817, 2003)中所述。在本發(fā)明中，在HCV背景中的術(shù)語"衍生毒株"指衍生自目的病毒株的毒株。
[0072] 任何丙型肝炎病毒毒株的基因組都可以用于制備根據(jù)本發(fā)明的核酸。優(yōu)選使用基 因型2a的丙型肝炎病毒的至少一個(gè)基因組。編碼NS3蛋白質(zhì)、NS4A蛋白質(zhì)、NS4B蛋白質(zhì)、 NS5A蛋白質(zhì)和NS5B蛋白質(zhì)的區(qū)域可以衍生自任何丙型肝炎病毒基因組。更優(yōu)選地，使用 來自基因型2a的丙型肝炎病毒的基因組的此類區(qū)域。進(jìn)一步優(yōu)選地，使用一個(gè)或多個(gè)上 述氨基酸置換引入其內(nèi)的來自HCV JFH-2. 1或HCV JFH-2. 3毒株、毒株的衍生毒株、或HCV JFH-I毒株的基因組的序列。
[0073] 根據(jù)本發(fā)明的核酸可以是來自一個(gè)、兩個(gè)或更多個(gè)類型的任意丙型肝炎病毒的基 因組的嵌合體。根據(jù)本發(fā)明的核酸可以是但不限于其中使用基因型2a的丙型肝炎病毒的 至少一個(gè)基因組的嵌合體。對(duì)于根據(jù)本發(fā)明的核酸的制備，例如可以使用HCV JFH-I毒株、 J6CF毒株、HCV JFH-2. 1毒株、HCV JFH-2. 3毒株或這些毒株的衍生毒株的基因組。
[0074] 根據(jù)本發(fā)明的突變型HCV復(fù)制子RNA可以例如通過下述方法進(jìn)行制備，但所述方 法并不限于下述方法。首先，通過常規(guī)方法使編碼上述突變型HCV復(fù)制子RNA的DNA連接在 載體中的RNA啟動(dòng)子下游，從而制備DNA克隆。RNA啟動(dòng)子的例子包括但不限于，T7啟動(dòng)子、 SP6啟動(dòng)子和T3啟動(dòng)子。T7啟動(dòng)子是特別優(yōu)選的。作為載體，可以使用pUC19 (TaKaRa)、 pBR322 (TaKaRa)>pGEM-3Z (Promega)>pSP72 (Promega)>pCRII (Invitrogen)>pT7Blue (Novagen)等，但例子并不限于這些。
[0075] 來自包括編碼突變型HCV復(fù)制子RNA的DNA的表達(dá)載體的突變型HCV復(fù)制子RNA 的制備(合成）可以使用例如MEGA script T7試劑盒（Ambion)等執(zhí)行。此外，當(dāng)載體引入 細(xì)胞內(nèi)用于表達(dá)時(shí)，優(yōu)選使用包括RNA聚合酶I啟動(dòng)子和終止子的載體(在W02007-037428 (HCV#9)中描述)。
[0076] 如此制備的突變型HCV復(fù)制子RNA可以通過本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的RNA提取法、 純化法等進(jìn)行提取且純化。
[0077] (3)包括自我復(fù)制的突變型HCV復(fù)制子RNA的轉(zhuǎn)化細(xì)胞的制備 將上述制備的復(fù)制子RNA例如突變型HCV復(fù)制子RNA引入宿主細(xì)胞內(nèi)，從而可以獲得 包括自我復(fù)制的復(fù)制子RNA的轉(zhuǎn)化細(xì)胞。本發(fā)明還提供了經(jīng)由突變型HCV復(fù)制子RNA引入 細(xì)胞內(nèi)獲得的轉(zhuǎn)化細(xì)胞，復(fù)制子RNA在所述轉(zhuǎn)化細(xì)胞中自我復(fù)制。
[0078] 復(fù)制子RNA引入其內(nèi)的細(xì)胞可以是使得HCV復(fù)制子能夠復(fù)制的任何細(xì)胞。此類細(xì) 胞更優(yōu)選是人肝衍生的細(xì)胞、人子宮頸衍生的細(xì)胞或人胚腎衍生的細(xì)胞。此類細(xì)胞的例子 包括Huh7細(xì)胞、HepG2細(xì)胞、頂Y-N9細(xì)胞、HeLa細(xì)胞和293細(xì)胞。此類細(xì)胞的進(jìn)一步合適 例子包括Huh7細(xì)胞的衍生株，例如Huh7. 5細(xì)胞和Huh7. 5. 1細(xì)胞。此外，CD81基因和/或 Claudin 1基因在其中表達(dá)的細(xì)胞，例如Huh7細(xì)胞、!fepG2細(xì)胞、MY-N9細(xì)胞、HeLa細(xì)胞或 293細(xì)胞也是此類細(xì)胞的例子。在這些細(xì)胞中，優(yōu)選使用Huh7細(xì)胞或Huh7細(xì)胞的衍生細(xì) 胞。
[0079] 復(fù)制子RNA可以使用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的任何技術(shù)引入細(xì)胞內(nèi)。此類技術(shù)的例 子包括磷酸鈣共沉淀、DEAE葡聚糖法、脂轉(zhuǎn)染、顯微注射和電穿孔。優(yōu)選地，執(zhí)行脂轉(zhuǎn)染和 電穿孔。更優(yōu)選地，特別優(yōu)選執(zhí)行基于電穿孔的方法。
[0080] 關(guān)于復(fù)制子RNA，可以引入單獨(dú)的靶復(fù)制子RNA，或還可以引入與另一種核酸混合 的靶復(fù)制子RNA。為了改變復(fù)制子RNA的量同時(shí)使待引入的RNA量維持在恒定水平，使靶復(fù) 制子RNA與從待用于引入的細(xì)胞中提取的總細(xì)胞RNA混合，并且隨后將混合物引入細(xì)胞內(nèi)。 待引入細(xì)胞內(nèi)的復(fù)制子RNA的量可以依賴于待采用的引入方法決定。在本文中待使用的復(fù) 制子RNA的量范圍優(yōu)選地為1皮克到100微克，并且更優(yōu)選10皮克到10微克。
[0081] 當(dāng)使用包括標(biāo)記基因的復(fù)制子RNA時(shí)，復(fù)制子RNA已引入其內(nèi)且自我復(fù)制的細(xì)胞 可以使用標(biāo)記基因的表達(dá)進(jìn)行選擇。
[0082] 通過常規(guī)方法可以由引入細(xì)胞內(nèi)且培養(yǎng)細(xì)胞后形成的集落克隆活細(xì)胞。以此類方 式，可以建立包括自我復(fù)制的復(fù)制子RNA的細(xì)胞克隆。
[0083] 如此建立的細(xì)胞克隆優(yōu)選實(shí)際上通過下述證實(shí)復(fù)制子RNA的自我復(fù)制：例如，檢 測細(xì)胞中來自所引入復(fù)制子RNA的復(fù)制子RNA的復(fù)制，證實(shí)復(fù)制子RNA中標(biāo)記基因的表達(dá)， 或證實(shí)HCV蛋白質(zhì)(例如核心)的表達(dá)。通過使針對(duì)待由引入的復(fù)制子RNA表達(dá)的HCV蛋白 質(zhì)的抗體與從細(xì)胞克隆中提取的蛋白質(zhì)反應(yīng)，可以證實(shí)HCV蛋白質(zhì)的表達(dá)。這種方法可以 通過本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的任何蛋白質(zhì)檢測方法執(zhí)行。具體地，例如，該方法可以通過下述 執(zhí)行：將從細(xì)胞克隆中提取的蛋白質(zhì)樣品點(diǎn)在硝酸纖維素膜上，使抗HCV蛋白質(zhì)抗體(例如 抗核心特異性抗體或從丙型肝炎患者中收集的抗血清)與膜反應(yīng)，并且隨后檢測抗HCV蛋白 質(zhì)抗體。如果從細(xì)胞克隆中提取的蛋白質(zhì)中檢測到HCV蛋白質(zhì)，那么可以得出結(jié)論HCV衍 生的復(fù)制子RNA自我復(fù)制，并且HCV蛋白質(zhì)在細(xì)胞克隆中表達(dá)。如此建立且優(yōu)選證實(shí)的細(xì) 胞克隆是通過引入根據(jù)本發(fā)明的復(fù)制子RNA獲得的轉(zhuǎn)化細(xì)胞。
[0084] 作為用于評(píng)估復(fù)制子RNA在轉(zhuǎn)化細(xì)胞中的復(fù)制能力的方法，可以測量連接到HCV 亞基因組復(fù)制子RNA或HCV全基因組復(fù)制子RNA內(nèi)的外源基因的功能。當(dāng)外源基因是藥物 抗性基因時(shí)，評(píng)估可以通過測定在包含藥物的選擇培養(yǎng)基中生長的細(xì)胞數(shù)目或細(xì)胞集落數(shù) 目來進(jìn)行。此外，當(dāng)外源基因是酶基因時(shí)，復(fù)制能力可以通過測量酶活性進(jìn)行評(píng)估。作為另 一種方法，復(fù)制能力可以通過經(jīng)由定量PCR定量測定復(fù)制的RNA量進(jìn)行評(píng)估。
[0085] 已證實(shí)HCV基因組的有效復(fù)制需要在HCV基因組的核苷酸序列中突變的出現(xiàn) (Lohmann，V.等人，J. Virol.，75:1437-1449,2001)。改善復(fù)制的突變被稱為適應(yīng)性突變。 根據(jù)本發(fā)明的突變型HCV復(fù)制子RNA是具有顯著增強(qiáng)的自我復(fù)制的復(fù)制子RNA。通過培養(yǎng) 的繼續(xù)，適應(yīng)性突變?cè)贖CV復(fù)制子RNA中發(fā)生，并且復(fù)制可以得到顯著改善。如使用作為參 考序列的在序列表中的SEQ ID NO :6中所示的氨基酸序列定義的氨基酸置換A(2218)S導(dǎo) 致復(fù)制能力方面的此類顯著增強(qiáng)。
[0086] (4)感染性HCV顆粒的產(chǎn)生 在本發(fā)明中，對(duì)通過引入根據(jù)本發(fā)明的HCV復(fù)制子RNA獲得的轉(zhuǎn)化細(xì)胞進(jìn)行傳代培養(yǎng)， 從而使得感染性HCV顆粒可以產(chǎn)生且優(yōu)選釋放到培養(yǎng)基內(nèi)。此處，根據(jù)本發(fā)明的HCV復(fù)制 子RNA是這樣的復(fù)制子RNA，其除丙型肝炎病毒基因組的5'非翻譯區(qū)，分別編碼NS3蛋白 質(zhì)、NS4A蛋白質(zhì)、NS4B蛋白質(zhì)、NS5A蛋白質(zhì)和NS5B蛋白質(zhì)的序列，和3'非翻譯區(qū)外，還包 括HCV結(jié)構(gòu)區(qū)。具體地，HCV復(fù)制子RNA是： 除丙型肝炎病毒基因組的5'非翻譯區(qū)，分別編碼NS3蛋白質(zhì)、NS4A蛋白質(zhì)、NS4B蛋白 質(zhì)、NS5A蛋白質(zhì)和NS5B蛋白質(zhì)的序列，和3'非翻譯區(qū)外，進(jìn)一步包括丙型肝炎病毒基因組 的核心蛋白質(zhì)編碼區(qū)、El蛋白質(zhì)編碼區(qū)、E2蛋白質(zhì)編碼區(qū)和p7蛋白質(zhì)編碼區(qū)的核酸； 除丙型肝炎病毒基因組的5'非翻譯區(qū)，分別編碼NS3蛋白質(zhì)、NS4A蛋白質(zhì)、NS4B蛋白 質(zhì)、NS5A蛋白質(zhì)和NS5B蛋白質(zhì)的序列，和3'非翻譯區(qū)外，進(jìn)一步包括核心蛋白質(zhì)編碼區(qū)、 El蛋白質(zhì)編碼區(qū)、E2蛋白質(zhì)編碼區(qū)、p7蛋白質(zhì)編碼區(qū)和NS2蛋白質(zhì)編碼區(qū)的核酸（HCV全 基因組復(fù)制子RNA);或 包括在序列表中的SEQ ID NO : 12或13中所示的核苷酸序列的核酸，或 包括編碼在序列表中的SEQ ID N0:5或6中所示的氨基酸序列中具有選自下述的一個(gè) 或多個(gè)氨基酸置換的氨基酸序列的核苷酸序列的核酸：M (1205) K、F (1548) L、C (1615) W、T (1652)N、A (2196)T、A (2218)S、H (2223)Q、Q (2281)R、K (2520)N 和 G (2374) S，如使用作為參考序列的在序列表中的SEQ ID NO :6中所示的氨基酸序列定義。
[0087] 能夠產(chǎn)生感染性HCV顆粒的根據(jù)本發(fā)明的轉(zhuǎn)化細(xì)胞的一般例子包括全長嵌合復(fù) 制子RNA和此類全長嵌合復(fù)制子RNA已引入其內(nèi)的轉(zhuǎn)化細(xì)胞，其中所述全長嵌合復(fù)制子RNA 包括JFH-I毒株衍生的5'非翻譯區(qū)J6CF毒株衍生的核心蛋白質(zhì)編碼區(qū)、El蛋白質(zhì)編碼 區(qū)、E2蛋白質(zhì)編碼區(qū)和p7蛋白質(zhì)編碼區(qū)JFH-I毒株衍生的NS2蛋白質(zhì)編碼區(qū)；和此外，編 碼氨基酸序列的核苷酸序列，其中一個(gè)或多個(gè)且優(yōu)選任何一個(gè)上述氨基酸置換已引入HCV JFH-2. 1毒株或HCV JFH-2. 3毒株衍生的NS3蛋白質(zhì)編碼區(qū)、NS4A蛋白質(zhì)編碼區(qū)、NS4B蛋 白質(zhì)編碼區(qū)、NS5A蛋白質(zhì)編碼區(qū)、NS5B蛋白質(zhì)編碼區(qū)、和3'非翻譯區(qū)。
[0088] 此類轉(zhuǎn)化細(xì)胞的病毒顆粒生產(chǎn)能力也可以使用針對(duì)HCV蛋白質(zhì)(例如核心蛋白 質(zhì)、El蛋白質(zhì)或E2蛋白質(zhì))的抗體進(jìn)行檢測，所述HCV蛋白質(zhì)組成釋放到培養(yǎng)基(培養(yǎng)溶液） 內(nèi)的HCV病毒顆粒。此外，HCV病毒顆粒的存在也可以通過下述進(jìn)行間接檢測：使用特異性 引物通過RT-PCR擴(kuò)增且檢測在培養(yǎng)溶液中的HCV病毒顆粒中包含的HCV復(fù)制子RNA。
[0089] 通過上述轉(zhuǎn)化細(xì)胞產(chǎn)生的HCV顆粒對(duì)細(xì)胞(優(yōu)選地，HCV敏感細(xì)胞)是感染性的。在 本發(fā)明中，術(shù)語"HCV敏感細(xì)胞"指由HCV感染的細(xì)胞。此類HCV敏感細(xì)胞優(yōu)選肝細(xì)胞或淋巴 譜系細(xì)胞，但例子并不限于這些。肝細(xì)胞的具體例子包括原代肝細(xì)胞、Huh7細(xì)胞、HepG2細(xì) 胞、頂Y-N9細(xì)胞、HeLa細(xì)胞和293細(xì)胞。淋巴譜系細(xì)胞的具體例子包括Molt4細(xì)胞、HPB-Ma 細(xì)胞和Daudi細(xì)胞。然而,例子并不限于這些細(xì)胞。
[0090] 制備的HCV顆粒是否是感染性的可以通過下述進(jìn)行測定：使用通過培養(yǎng)上述轉(zhuǎn)化 細(xì)胞（HCV復(fù)制子RNA已引入其內(nèi)）獲得的培養(yǎng)上清液處理HCV容許細(xì)胞(例如Huh-7)，在 給定時(shí)間段后(例如在48小時(shí)后)用抗核心抗體免疫染色細(xì)胞，并且隨后測定受感染細(xì)胞的 數(shù)目。可替代地，測定可以通過下述進(jìn)行：使細(xì)胞提取物接受在SDS-聚丙烯酰胺凝膠上的 電泳，通過蛋白質(zhì)印跡檢測核心蛋白質(zhì)，并且從而檢測受感染細(xì)胞。
[0091] 本發(fā)明還涉及用于制備HCV顆粒的方法，通過下述進(jìn)行：培養(yǎng)能夠產(chǎn)生感染性HCV 顆粒的上述轉(zhuǎn)化細(xì)胞，并且隨后優(yōu)選獲得(例如收集培養(yǎng)上清液）釋放到培養(yǎng)基(優(yōu)選地，培 養(yǎng)溶液）內(nèi)的HCV顆粒。本發(fā)明提供了通過該方法獲得的HCV顆粒和優(yōu)選地感染性HCV顆 粒。HCV顆粒還感染HCV敏感動(dòng)物例如黑猩猩，以便能夠誘導(dǎo)HCV衍生的肝炎。
[0092] (5)亞基因組復(fù)制子RNA的用途 根據(jù)本發(fā)明的HCV亞基因組復(fù)制子RNA已引入其內(nèi)的轉(zhuǎn)化細(xì)胞可以用于篩選抑制HCV 亞基因組復(fù)制子RNA復(fù)制的化合物。
[0093] 更具體而言，例如，將其中在5'到3'方向，5' UTR、范圍從核心編碼區(qū)的5'末端 到核苷酸36的序列、螢光素酶基因(標(biāo)記基因）、腦心肌炎病毒IRES序列、NS3區(qū)、NS4A區(qū)、 NS4B區(qū)、NS5A區(qū)、和NS5B區(qū)和3' UTR以這個(gè)次序連接的RNA引入Huh7細(xì)胞內(nèi)。隨后，用 待篩選的化合物處理細(xì)胞。在48 - 72小時(shí)后，測量螢光素酶活性。與未用化合物處理的 組比較抑制螢光素酶活性的化合物被視為具有抑制HCV亞基因組復(fù)制子RNA復(fù)制的作用。 相應(yīng)地，還可以測定哪種化合物可以具有抑制HCV復(fù)制的活性，所述HCV具有與復(fù)制子RNA 或特別地NS3至NS5B區(qū)由其衍生的HCV毒株的基因型相同的基因型，或在相關(guān)HCV毒株已 從其中分離的具有HCV相關(guān)疾病的患者等中觀察到。
[0094] (6) HCV顆粒的用途 本發(fā)明的HCV顆粒也可以用于篩選抑制HCV感染的抗體或化合物。
[0095] 根據(jù)本發(fā)明的HCV顆粒也優(yōu)選用作疫苗或抗原用于制備抗HCV抗體。
[0096] 具體地，根據(jù)本發(fā)明的HCV顆粒可以不作修飾地用作疫苗。HCV顆粒還可以進(jìn)行 經(jīng)由本領(lǐng)域已知的方法減毒或滅活且隨后使用。通過加入滅活劑且使滅活劑與例如病毒 懸浮液混合，并且允許滅活劑與病毒反應(yīng)，可以滅活病毒，所述滅活劑例如福爾馬林、β -丙 酸內(nèi)酯或戊二醒（glutardialdehyde) (Appaiahgari，Μ. Β. & Vrati，S.，Vaccine，22 : 3669-3675,2004)。
[0097] 可以將疫苗配制成可以施用的劑型，例如溶液或懸浮液。疫苗可以以適合于將其 溶解或懸浮于溶液中的固態(tài)進(jìn)行制備。可替代地，此類制劑可以在脂質(zhì)體中進(jìn)行乳化或包 封。活性免疫原性成分例如HCV顆粒通常與賦形劑混合，所述賦形劑是藥學(xué)上可接受的且 與待在本文中使用的活性成分相容。合適賦形劑的例子包括水、生理鹽水、右旋糖、甘油、乙 醇及其混合物。進(jìn)一步地，疫苗可以包含微量輔助劑(例如濕潤劑或乳化劑)、pH緩沖劑和/ 或增強(qiáng)疫苗功效的佐劑。有效佐劑的例子包括但不限于氫氧化鋁、N-乙酰基-胞壁酰-L-蘇 氨酰-D-異谷氨酰胺（thr-MDP)、N-乙酰基-去甲（nor)-胞壁酰-L-丙氨酰-D-異谷氨酰 胺(被稱為CGP11637、去甲-MDP)、N-乙酰基胞壁酰-L-丙氨酰-D-異谷氨酰胺酰-L-丙氨 酸-2- (1' -2' -二棕櫚酰-sn-甘油-3-羥基磷酰氧基)-乙胺(被稱為CGP19835A、MTP-PE) 和RIBI。RIBI包括在2%角鯊烯/Tween (κ)80乳狀液中的從細(xì)菌中提取的3種組分；即單 磷酰脂質(zhì)Α、海藻糖二霉菌酸酯和細(xì)胞壁骨架（HPL+TDM+CWS)。佐劑的作用可以通過測量得 自包括HCV顆粒的疫苗施用的抗體量進(jìn)行測定。
[0098] 疫苗一般例如通過注射例如皮下注射或肌內(nèi)注射腸胃外施用。作為其他劑量形式 合適的其他制劑的例子包括栓劑和口服制劑。
[0099] 具有佐劑活性的一種或多種化合物可以加入HCV疫苗中。佐劑是對(duì)于免疫系統(tǒng)的 非特異性刺激劑。此類物質(zhì)增強(qiáng)宿主針對(duì)HCV疫苗的免疫應(yīng)答。本領(lǐng)域已知的佐劑的具 體例子包括弗氏完全和不完全佐劑、維生素 Ε、非離子嵌段聚合物、胞壁酰二肽、皂苷、礦物 油、植物油和卡波普（Carbopol)。特別適合于經(jīng)粘膜施用的佐劑的例子包括大腸桿菌(凡 co7i)不耐熱毒素（LT)和霍亂毒素（CT)。其他合適佐劑的例子包括氫氧化錯(cuò)、磷酸錯(cuò)或氧 化鋁、油乳劑(例如Bayol %或Marcol 5?)、皂苷和維生素 E加溶物。相應(yīng)地，本發(fā)明的優(yōu) 選實(shí)施方案的疫苗包括佐劑。
[0100] 關(guān)于用于皮下、皮內(nèi)、肌內(nèi)或靜脈內(nèi)施用的可注射溶液，在可注射溶液中用于與本 發(fā)明的HCV疫苗組合施用的藥學(xué)上可接受的載體或稀釋劑的其他具體例子包括穩(wěn)定劑、碳 水化合物(例如山梨糖醇、甘露醇、淀粉、蔗糖、葡萄糖或葡聚糖)、蛋白質(zhì)(例如白蛋白或酪 蛋白）、含蛋白質(zhì)物質(zhì)(例如牛血清或脫脂乳）和緩沖液(例如磷酸鹽緩沖液)。
[0101] 用于栓劑的常規(guī)粘合劑和載體的例子可以包括聚亞烷基二醇和甘油三酯。此類栓 劑可以由包括0.5%- 50%且優(yōu)選1%- 20%活性成分的混合物進(jìn)行制備。口服制劑包括 一般使用的賦形劑。賦形劑的例子包括藥物級(jí)的甘露醇、乳糖、淀粉、硬脂酸鎂、糖精鈉、纖 維素和碳酸鎂。
[0102] 本發(fā)明的疫苗可以是溶液、懸浮液、片劑、丸劑、膠囊、持續(xù)釋放制劑或粉末的形 式，并且它的活性成分(病毒顆粒或其部分）占其10% - 95 %且優(yōu)選25 % - 70%。
[0103] 本發(fā)明的疫苗以適合于劑型的方式和可以發(fā)揮預(yù)防和/或治療作用的量施用。待 施用的量一般范圍為0.01 ug - 100,000 Ug抗原/劑量。該量依賴于待治療的患者、患 者在免疫系統(tǒng)中抗體合成的能力和期望的保護(hù)程度而改變。此外，該量依賴于施用途徑而 改變，所述施用途徑例如口服、皮下、皮內(nèi)、肌內(nèi)或靜脈內(nèi)施用。
[0104] 本發(fā)明的疫苗可以根據(jù)單一施用方案且優(yōu)選根據(jù)多次施用方案進(jìn)行施用。在多次 施用方案的情況下，在疫苗接種起始時(shí)執(zhí)行1 - 10次分開施用，并且隨后可以用維持或增 強(qiáng)免疫應(yīng)答所需的時(shí)間間隔執(zhí)行另一次施用。例如，第二次施用可以在第一次后1 - 4個(gè) 月執(zhí)行。需要時(shí)，施用可以隨后在第一次后數(shù)月執(zhí)行。施用方案至少部分根據(jù)個(gè)別患者的 需要來決定，并且方案取決于由醫(yī)生做出的判斷。
[0105] 進(jìn)一步地，包括本發(fā)明的HCV顆粒的疫苗可以與另一種免疫學(xué)試劑(例如免疫球 蛋白）一起施用。
[0106] 進(jìn)一步地，本發(fā)明的HCV顆粒疫苗可以針對(duì)可能的新HCV感染預(yù)防性地使用，其經(jīng) 由施用于健康個(gè)體以誘導(dǎo)針對(duì)HCV的免疫應(yīng)答而實(shí)施。本發(fā)明的HCV顆粒疫苗也可以用作 治療疫苗，以在體內(nèi)誘導(dǎo)針對(duì)HCV的強(qiáng)免疫應(yīng)答以消除HCV，其經(jīng)由施用于由HCV感染的患 者，經(jīng)由施用于由HCV感染的患者而實(shí)施。
[0107] 本發(fā)明的HCV顆粒還用作待用于制備抗HCV抗體的抗原。待用作抗原的HCV顆粒 期望地具有較高純度。通過離心和/或使用濾器等從包含HCV顆粒的培養(yǎng)溶液中去除細(xì)胞 或細(xì)胞碎片。細(xì)胞碎片已從其中去除的此類溶液還可以使用超濾膜濃縮約10 - 100倍，所 述超濾膜具有范圍為100, 〇〇〇 - 500, 000的分子量截止。細(xì)胞碎片已從其中去除的包含 HCV顆粒的此類溶液可以通過以任何次序組合或單獨(dú)的層析(例如凝膠過濾層析、離子交換 層析和親和層析）和密度梯度離心進(jìn)行純化。
[0108] (7 )針對(duì)HCV顆粒的抗體 本發(fā)明還提供了針對(duì)上文（4)中獲得的HCV顆粒的抗體。此類抗體的優(yōu)選例子特別地 包括針對(duì)HCV顆粒的抗體，所述HCV顆粒具有JFH-2. 1或JFH-2. 3毒株的結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)(核 心、El、E2和p7)。更具體而言，針對(duì)具有JFH-2. 3毒株的結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)(核心、El、E2和p7) 的HCV顆粒的抗體例子是針對(duì)通過轉(zhuǎn)化細(xì)胞產(chǎn)生的HCV顆粒的抗體,所述轉(zhuǎn)化細(xì)胞通過引 入編碼下述的HCV復(fù)制子RNA獲得：作為核心蛋白質(zhì)范圍從序列表中SEQ ID NO :6的氨基 酸位置1到191的氨基酸序列；作為El蛋白質(zhì)范圍從其氨基酸位置192到384的氨基酸序 列；作為E2蛋白質(zhì)范圍從其氨基酸位置385到751的氨基酸序列；和作為p7蛋白質(zhì)范圍從 氨基酸位置752到814的氨基酸序列。
[0109] 抗體可以通過給哺乳動(dòng)物或鳥類施用本發(fā)明的HCV顆粒進(jìn)行制備。哺乳動(dòng)物的例 子包括小鼠、大鼠、兔、山羊、綿羊、馬、牛、豚鼠、單峰駱駝、雙峰駱駝和美洲駝（lamas)。單 峰駱駝、雙峰駱駝和美洲駝適合于制備單獨(dú)由H鏈組成的抗體。鳥類的例子包括雞、鵝和鴕 鳥。可以從本發(fā)明的HCV顆粒已施用于其的動(dòng)物獲得血清，并且隨后可以通過眾所周知的 方法由其獲得抗體。
[0110] 產(chǎn)生單克隆抗體生產(chǎn)細(xì)胞的雜交瘤可以應(yīng)用用本發(fā)明的HCV顆粒免疫的動(dòng)物 的細(xì)胞進(jìn)行制備。用于產(chǎn)生雜交瘤的方法是本領(lǐng)域眾所周知的，并且可以采用在例如 Antibodies ：A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Laboratory, 1988)中描述的方 法。
[0111] 單克隆抗體生產(chǎn)細(xì)胞可以經(jīng)由細(xì)胞融合或經(jīng)由其他方法進(jìn)行制備，所述其他方法 涉及引入癌基因的DNA或用EB病毒感染用于B淋巴細(xì)胞的永生化。
[0112] 更具體而言，通過給小鼠施用HCV顆粒用于制備抗HCV單克隆抗體的程序如下所 述。一般地，4 - 10周齡的小鼠用HCV顆粒作為抗原進(jìn)行免疫，但在需要時(shí)可以省略純 化步驟。免疫接種一般通過與佐劑一起皮下或腹膜內(nèi)施用抗原數(shù)次來執(zhí)行。此類佐劑的 例子包括但不限于弗氏完全和不完全佐劑、氫氧化鋁凝膠、百日咳嗜血桿菌（Hemophilus pertussis)疫苗、Titer Max Gold (Vaxel)和 GERBU 佐劑（GERBU Biotechnik)。最后的 免疫接種通過靜脈內(nèi)或腹膜內(nèi)施用HCV顆粒執(zhí)行，而不施用任何佐劑。在用HCV顆粒最后 免疫接種后第3到10天時(shí)且優(yōu)選在第4天時(shí)，根據(jù)已知方法從免疫接種的小鼠中切除脾 (Antibodies ：A Laboratory Manual Cold Spring Harbor Laboratory,1988)。
[0113] 本文采用的方法涉及制備來自脾的脾細(xì)胞和脾細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞融合，以便制備 產(chǎn)生單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞。作為待用于細(xì)胞融合的骨髓瘤細(xì)胞，可以使用任何骨髓瘤 細(xì)胞，只要它們可在體外復(fù)制。此類骨髓瘤細(xì)胞的例子包括小鼠衍生的建立的細(xì)胞系，例 如8-氮雜鳥嘌呤抗性小鼠（BALB/c-衍生的）骨髓瘤細(xì)胞系(例如P3-X63Ag8-Ul (P3-U1 )、 SP2/0-Agl4 (SP2/0)、P3-X63-Ag8653 (653)、P3-X63-Ag8 (X63)和 P3/NSl/l-Ag4-l (NS1))。 這些細(xì)胞系可從RIKEN BioResource Center、ATCC(美國典型培養(yǎng)物保藏中心)或ECACC(歐 洲細(xì)胞培養(yǎng)物保藏中心European Collection of Cell Cultures)獲得。培養(yǎng)和傳代培養(yǎng) 根據(jù)已知方法執(zhí)行（Antibodies :A Laboratory Manual Cold Spring Harbor Laboratory, 1988, Selected Methods in Cellular Immunology ff. H. Freeman and Company,1980)。
[0114] 洗滌因而獲得的脾細(xì)胞和骨髓瘤細(xì)胞，并且隨后以I (骨髓瘤細(xì)胞）：1-10 (脾細(xì) 胞）的比率混合，隨后為細(xì)胞融合反應(yīng)。作為融合加速劑，可以使用具有平均分子量范圍為 1000 - 6000的聚乙二醇、聚乙烯醇等。此外，細(xì)胞還可以使用商購可得的細(xì)胞融合儀器使 用電刺激(例如電穿孔）進(jìn)行融合。
[0115] 在細(xì)胞融合后，使細(xì)胞懸浮于培養(yǎng)基中，并且隨后洗滌。細(xì)胞使用用于培養(yǎng)骨髓瘤 細(xì)胞的培養(yǎng)基進(jìn)行洗滌，例如Dulbecco改良Eagle培養(yǎng)基或RPMI-1640培養(yǎng)基。用于培養(yǎng) 融合細(xì)胞的培養(yǎng)基補(bǔ)充有HAT補(bǔ)充物，以便僅選擇性獲得靶融合細(xì)胞。通過集落形成方法 在甲基纖維素培養(yǎng)基中執(zhí)行有限稀釋(在稀釋至IO 3 - IO7細(xì)胞/毫升（ml)后，將細(xì)胞以IO2 -IO6細(xì)胞/孔種植到96孔細(xì)胞培養(yǎng)微量板內(nèi)）或克隆。
[0116] 雜交瘤可以通過一般方法進(jìn)行篩選，并且方法并無特別限制。例如，收集培養(yǎng)上清 液的部分，將上清液加入固定的HCV蛋白質(zhì)中，并且隨后加入標(biāo)記的二次抗體用于溫育。結(jié) 合能力可以通過酶聯(lián)免疫吸附測定（ELISA)或放射免疫測定（RIA)進(jìn)行測量，或接受斑點(diǎn) 印跡分析或蛋白質(zhì)印跡分析。選擇證實(shí)產(chǎn)生與靶抗原反應(yīng)的抗體的雜交瘤系作為產(chǎn)生單克 隆抗體的雜交瘤系。
[0117] 此外，產(chǎn)生具有抑制HCV感染活性的抗HCV單克隆抗體的雜交瘤可以通過使用感 染性HCV顆粒用于測量抑制HCV感染的活性的方法進(jìn)行選擇，如下述例子中所述。
[0118] 首先，使感染性HCV顆粒(用于制備HCV顆粒的方法如上所述)和抗體樣品混合，并 且隨后允許在37°C反應(yīng)1小時(shí)。將樣品（50 μ 1)加入在混合前那天以5 X IO3細(xì)胞/孔 在96孔板中培養(yǎng)的Huh7細(xì)胞中，并且隨后使細(xì)胞在37°C培養(yǎng)2. 5小時(shí)。在培養(yǎng)后，去除樣 品，用PBS洗滌細(xì)胞，加入新鮮培養(yǎng)基，并且隨后連續(xù)培養(yǎng)細(xì)胞。在48小時(shí)后，去除培養(yǎng)上 清液，將生成物用PBS洗滌1次，加入100 μ I ISOGEN (Nippon Gene)，并且隨后由細(xì)胞制 備RNA。在RNA定量后，測量HCV基因組RNA的量。通過定量RT-PCR的HCV RNA檢測根據(jù) Takeuchi等人的方法通過檢測HCV RNA的5'非翻譯區(qū)的RNA來進(jìn)行（Takeuchi T.等人， Gastroenterology, 116 :636-642,1999)。
[0119] 用于評(píng)估抑制HCV感染的活性的另一種方法如下。首先，使抗體樣品和感染性HCV 顆粒混合，并且隨后允許在37°C反應(yīng)1小時(shí)。接下來，將50微升（μ 1)上述樣品加入在混 合前那天以I X IO4細(xì)胞/孔在96孔板中培養(yǎng)的Huh-7細(xì)胞中，并且隨后使細(xì)胞在37°C 培養(yǎng)2. 5小時(shí)。在培養(yǎng)后，去除樣品，用PBS洗滌細(xì)胞，加入新鮮培養(yǎng)基，并且隨后連續(xù)培 養(yǎng)細(xì)胞。在72小時(shí)后，去除培養(yǎng)上清液，并且隨后將板置于冰冷的甲醇中，從而將細(xì)胞固 定。隨后，通過風(fēng)干去除甲醇，并且隨后使用包含0.3% Triton(K)-X 100 (GE Healthcare) 的BlockAce (K) (Dainippon Pharmaceutical)溶解細(xì)胞。HCV感染的細(xì)胞在熒光顯微鏡檢 查（Olympus Corporation, IX-70)下進(jìn)行計(jì)數(shù)，其使用克隆2H9抗HCV核心抗體(參見Nat Med. (2005) 11:第 791-6 頁·）和山羊抗小鼠 IgG_Alexa488 (Molecular Probes)。其中 HCV感染已被抑制的孔中的樣品證實(shí)為陽性克隆，從而可以選擇靶雜交瘤。如上所述選擇的 雜交瘤產(chǎn)生的單克隆抗體是本發(fā)明的抗體的優(yōu)選實(shí)施方案。
[0120] 通過此類技術(shù)獲得的單克隆或多克隆抗體用于HCV的診斷、治療和預(yù)防。如果抗 體來自動(dòng)物，那么可以制備與人抗體形成的嵌合抗體。特別優(yōu)選的嵌合抗體是通過將小鼠 抗體的高變位點(diǎn)的序列移植到人抗體內(nèi)制備的人源化抗體(人型抗體)等。此類人源化抗體 對(duì)于HCV的治療或預(yù)防是特別有用的。
[0121] 應(yīng)用本發(fā)明的HCV顆粒制備的抗體可以與藥學(xué)上可接受的增溶劑、添加劑、穩(wěn)定 齊IJ、緩沖劑等一起施用。此類抗體可以經(jīng)由任何途徑進(jìn)行施用。皮下、皮內(nèi)或靜脈內(nèi)施用是 優(yōu)選的，并且靜脈內(nèi)施用是更優(yōu)選的。
[0122] 本發(fā)明可以使用在相關(guān)領(lǐng)域的一般技術(shù)范圍內(nèi)的分子生物學(xué)和免疫學(xué)技術(shù)進(jìn)行。 此類技術(shù)在各種文獻(xiàn)包括已知實(shí)驗(yàn)方案等中充分說明。例如，此類技術(shù)在Sambrook等人， Molecular Cloning :A Laboratory Manual(第3 卷，2001)，編輯 Harlow 等人，Antibodies: A Laboratory Manual (1988)中詳細(xì)描述。
[0123] (8)使用突變型HCV RNA復(fù)制細(xì)胞的HCV病毒顆粒的短時(shí)間產(chǎn)生 根據(jù)本發(fā)明的核酸例如突變型HCV復(fù)制子RNA或編碼該突變型RNA的DNA，和優(yōu)選地核 酸例如衍生自2種或更多種HCV毒株的嵌合突變型HCV復(fù)制子RNAs或編碼該RNAs的DNAs 可以進(jìn)一步包括引起氨基酸置換的核苷酸置換。
[0124] 在一個(gè)實(shí)施方案中，核酸例如突變型HCV復(fù)制子RNA (其為HCV J6毒株和HCV JFH-2. 1毒株的嵌合體）或編碼該RNA的DNA，和優(yōu)選地J6/JFH-2. I A2217S RNA (其為具 有SEQ ID NO : 12中所示的核苷酸序列的嵌合突變型HCV復(fù)制子RNA)或編碼該RNA的DNA 可以包括核苷酸置換，其引起1或2個(gè)或更多個(gè)氨基酸和特別優(yōu)選地7個(gè)或更多個(gè)氨基酸 的置換。氨基酸置換可以是但不限于選自下述的至少1個(gè)、優(yōu)選2個(gè)或更多個(gè)、進(jìn)一步優(yōu) 選地3或4個(gè)或更多個(gè)、和特別優(yōu)選地7或8個(gè)氨基酸置換：在位置148上的A - T (核心 區(qū))，在位置356上的M - V(E1區(qū))，在位置405上的M - K、在位置417上的N - T和在位 置626上的V - G (Ε2區(qū)），在位置868上的M - T (NS2區(qū)），在位置1642上的T - A (NS3 區(qū)），在位置1687上的I - V(NS4A區(qū)），在位置1722上的I - V和在位置1767上的K -R (NS4B區(qū)），在位置2204上的S - G和在位置2219上的C - S(NS5A區(qū)），在位置2695上的 T - I和在位置3016上的L - P (NS5B區(qū))，如使用作為參考序列的由J6/JFH-2. I A2217S RNA編碼的前體蛋白質(zhì)的氨基酸序列（SEQ ID NO:88)定義的。例如，J6/JFH-2. I A2217S RNA或編碼該RNA的DNA可以具有這樣的核苷酸置換，其引起選自下述的例如2個(gè)或更多 個(gè)(優(yōu)選地3或4個(gè)或更多個(gè))、或所有7個(gè)氨基酸置換：在位置405上的M - K、在位置417 上的N - T、在位置868上的M - T、在位置1642上的T - A、在位置1722上的I - V、在位 置2204上的S - G和在位置2695上的T - I。可替代地，J6/JFH-2. I A2217S RNA或編碼 該RNA的DNA可以具有這樣的核苷酸置換，其引起選自下述的2個(gè)或更多個(gè)(優(yōu)選地3或4 個(gè)或更多個(gè))，例如所有8個(gè)氨基酸置換：在位置148上的A - T、在位置356上的M - V、在 位置626上的V - G、在位置1687上的I - V、在位置1767上的K - R、在位置2219上的 C - S、在位置2695上的T - I和在位置3016上的L - P。具有引起此類另外氨基酸置換的 核苷酸置換的多突變型復(fù)制子(例如為HCV J6毒株與HCV JFH-2. 1毒株或JFH-2. 3毒株的 嵌合體的突變型HCV復(fù)制子)的RNA或編碼該RNA的DNA已引入其內(nèi)的細(xì)胞，在復(fù)制起始后 相對(duì)立即地起始病毒顆粒的產(chǎn)生，并且隨后可以以大量穩(wěn)定產(chǎn)生病毒顆粒數(shù)十天(例如40 天)。因此，如果使用此類突變型復(fù)制子，那么病毒顆粒可以在復(fù)制起始后的短時(shí)間段內(nèi)以 大量產(chǎn)生。本發(fā)明還提供了此類有利的多突變型HCV復(fù)制子RNA或編碼該RNA的DNA。本 發(fā)明還提供了包括編碼多突變型HCV復(fù)制子RNA的DNA的表達(dá)載體和載體已引入其內(nèi)的重 組細(xì)胞。本發(fā)明還提供了多突變型復(fù)制子RNA已引入其內(nèi)的細(xì)胞。作為此類多突變型復(fù)制 子引入其內(nèi)的根據(jù)本發(fā)明的細(xì)胞，可以使用例如肝細(xì)胞衍生的細(xì)胞或淋巴樣譜系細(xì)胞。肝 細(xì)胞衍生的細(xì)胞的例子包括但不限于Huh7細(xì)胞、Huh7細(xì)胞、!fepG2細(xì)胞、頂Y-N9細(xì)胞、HeLa 細(xì)胞和293細(xì)胞。淋巴樣譜系細(xì)胞的例子包括但不限于Molt4細(xì)胞、HPB-Ma細(xì)胞和Daudi 細(xì)胞。
[0125] 將多突變型復(fù)制子已引入其內(nèi)的細(xì)胞培養(yǎng)相對(duì)短的時(shí)間段，從而使得病毒顆粒可 以以大量有效產(chǎn)生。培養(yǎng)期可以是例如從培養(yǎng)開始起1天或更多天、更優(yōu)選地2天或更多 天、甚至更加優(yōu)選地3天或更多天、進(jìn)一步優(yōu)選地5天或更多天、和特別優(yōu)選地10天或更多 天。培養(yǎng)期可以是從培養(yǎng)開始起60天或更少天、更優(yōu)選地50天或更少天、甚至更加優(yōu)選地 40天或更少天、進(jìn)一步優(yōu)選地30天或更少天、和特別優(yōu)選地20天或更少天。雖然HCV復(fù)制 子已引入其內(nèi)的細(xì)胞一般已知在復(fù)制起始后從早期到中期其病毒顆粒生產(chǎn)量趨于急劇降 低一次，但多突變型HCV復(fù)制子已引入其內(nèi)的根據(jù)本發(fā)明的細(xì)胞是非常有利的，因?yàn)樗鼈?可以在短時(shí)間段內(nèi)以大量穩(wěn)定產(chǎn)生病毒顆粒。本發(fā)明還提供了使用多突變型復(fù)制子RNA或 編碼該RNA的DNA已引入其內(nèi)的根據(jù)本發(fā)明的細(xì)胞用于產(chǎn)生HCV病毒顆粒的方法。
[0126] (9)序列概括 此外，在本申請(qǐng)中由SEQ ID NOS :指定的序列如下概括。
[0127] SEQ ID NO :1 :包含在重組質(zhì)粒pSGR-JFH-2. 1中范圍從T7啟動(dòng)子到3' UTR的部 分的核苷酸序列 SEQ ID NO :2 :包含在重組質(zhì)粒pSGR-JFH-2. 3中范圍從T7啟動(dòng)子到3' UTR的部分的 核苷酸序列 SEQ ID NO :3 :HCV JFH-2. 1毒株的全長基因組序列（編碼全長基因組RNA的核苷酸序 列） SEQ ID NO :4 :HCV JFH-2. 3毒株的全長基因組序列（編碼全長基因組RNA的核苷酸序 列） SEQ ID NO :5 :HCV JFH-2. 1毒株的前體蛋白質(zhì)的氨基酸序列 SEQ ID NO :6 :HCV JFH-2. 3毒株的前體蛋白質(zhì)的氨基酸序列 SEQ ID NO :7 :HCV J6CF毒株的結(jié)構(gòu)區(qū)(包含核心、E1、E2和p7)的核苷酸序列 SEQ ID NO :8 :HCV JFH-I毒株的5' UTR的核苷酸序列 SEQ ID NO :9 :HCV JFH-I毒株的NS2區(qū)的核苷酸序列 SEQ ID NO :10 :HCV JFH-2. 1 毒株的范圍從 NS3 區(qū)到 3' UTR (包含 NS3、NS4A、NS4B、 NS5A和NS5B區(qū)和3' UTR)的序列 SEQ ID NO :11 :嵌合HCV基因組序列J6/JFH-2. 1的核苷酸序列 SEQ ID NO :12 :嵌合HCV基因組序列J6/JFH-2. I A2217S的核苷酸序列 SEQ ID NO :13 :突變型HCV基因組序列JFH-2. I A2218S的核苷酸序列 SEQ ID NO :14 :HCV JFH-2. 1毒株的前體蛋白質(zhì)的NS3至NS5B區(qū)的氨基酸序列 SEQ ID NO :15 :HCV JFH-2. 3毒株的前體蛋白質(zhì)的NS3至NS5B區(qū)的氨基酸序列 SEQ ID NOS :16-77 :引物 SEQ ID NO :78 :突變型嵌合HCV基因組序列J6/JFH-2. I A2217S (CS)的核苷酸序列 SEQ ID NO :79 :突變型嵌合HCV基因組序列J6/JFH-2. I A2217S (LP)的核苷酸序列 SEQ ID NO :80 :突變型嵌合HCV基因組序列J6/JFH-2. I A2217S (TI)的核苷酸序列 SEQ ID NO :81 :突變型嵌合HCV基因組序列J6/JFH-2. I A2217S (CS/LP)的核苷酸序 列 SEQ ID NO :82 :突變型嵌合HCV基因組序列J6/JFH-2. I A2217S (CS/TI)的核苷酸序 列 SEQ ID NO :83 :突變型嵌合HCV基因組序列J6/JFH-2. I A2217S (TI/LP)的核苷酸序 列 SEQ ID N0:84:突變型嵌合HCV基因組序列J6/JFH-2. I A2217S(CS/TI/LP)的核苷酸 序列 SEQ ID NO :85 :突變型嵌合 HCV 基因組序列 J6/JFH-2. I A2217S (AT/CS/TI/LP)的核 苷酸序列 SEQ ID NO :86 :突變型嵌合HCV基因組序列 J6/JFH-2. I A2217S(TI/MT/MK/NT/IV/SG/ TA)的核苷酸序列 SEQ ID N0:87:突變型嵌合 HCV 基因組序列 J6/JFH-2.1 A2217S(AT/CS/TI/LP/MV/VG/ IV/KR)的核苷酸序列 SEQ ID NO :88 :由J6/JFH-2. I A2217S編碼的前體蛋白質(zhì)的氨基酸序列 SEQ ID NO :89 :由J6/JFH-2. I A2217S (CS)編碼的前體蛋白質(zhì)的氨基酸序列 SEQ ID NO :90 :由J6/JFH-2. I A2217S (LP)編碼的前體蛋白質(zhì)的氨基酸序列 SEQ ID NO :91 :由J6/JFH-2. I A2217S (TI)編碼的前體蛋白質(zhì)的氨基酸序列 SEQ ID NO :92 :由J6/JFH-2. I A2217S (CS/LP)編碼的前體蛋白質(zhì)的氨基酸序列 SEQ ID NO :93 :由J6/JFH-2. I A2217S (CS/TI)編碼的前體蛋白質(zhì)的氨基酸序列 SEQ ID NO :94 :由J6/JFH-2. I A2217S (TI/LP)編碼的前體蛋白質(zhì)的氨基酸序列 SEQ ID NO :95 :由J6/JFH-2. I A2217S (CS/TI/LP)編碼的前體蛋白質(zhì)的氨基酸序列 SEQ ID NO :96 :由J6/JFH-2. I A2217S (AT/CS/TI/LP)編碼的前體蛋白質(zhì)的氨基酸序 列 SEQ ID NO :97 :由 J6/JFH-2. I A2217S (TI/MT/MK/NT/IV/SG/TA)編碼的前體蛋白質(zhì)的 氨基酸序列 SEQ ID NO :98 :由 J6/JFH-2. I A2217S (AT/CS/TI/LP/MV/VG/IV/KR)編碼的前體蛋白 質(zhì)的氨基酸序列 本文引用的所有出版物、專利和專利申請(qǐng)整體引入本文作為參考。
[0128] [實(shí)施例] 本發(fā)明參考下述實(shí)施例進(jìn)一步舉例說明。然而，這些實(shí)施例并不限制本發(fā)明的技術(shù)范 圍。
[0129] (實(shí)施例I) JFH-2. 1毒株和JFH-2. 3毒株衍生的HCV亞基因組復(fù)制子RNA表達(dá)載 體的構(gòu)建 使用從暴發(fā)性肝炎患者中分離的基因型2a的HCV JFH-2. 1毒株和JFH-2. 3毒株的 全長基因組克隆DNA的非結(jié)構(gòu)區(qū)，如下分開構(gòu)建HCV亞基因組復(fù)制子RNA表達(dá)載體質(zhì)粒 pSGR-JFH-2. 1 和 pSGR-JFH-2. 3(圖 1)。圖 IA 顯示了 HCV JFH-2. 1 毒株和 JFH-2. 3 毒株的 全長基因組結(jié)構(gòu)。
[0130] 質(zhì)粒 pSGR-JFH-2. 1 和 pSGR-JFH-2. 3 根據(jù) Kato 等人的文獻(xiàn)（Gastroenterology， 125 :1808-1817,2003)和W005028652A1中所述的程序進(jìn)行構(gòu)建。具體地，首先，提供重組 質(zhì)粒pJFH-2. 1和pJFH-2. 3,其中將編碼HCV JFH-2. 1毒株或JFH-2. 3毒株的全長基因組 的cDNA插入質(zhì)粒載體pUC19中的T7啟動(dòng)子的控制下。隨后，用新霉素抗性基因 （neo ;也 稱為新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶基因）和EMCV-IRES (腦心肌炎病毒的內(nèi)部核糖體進(jìn)入位點(diǎn)）置換 重組質(zhì)粒pJFH-2. 1和pJFH-2. 3中的結(jié)構(gòu)區(qū)和非結(jié)構(gòu)區(qū)的部分。用限制酶執(zhí)行切割，以 切除插入的片段，并且隨后將片段克隆到重組載體內(nèi)，以分開構(gòu)建質(zhì)粒pSGR-JFH-2. 1和 pSGR-JFH-2. 3〇
[0131] 圖IB和圖IC顯示了質(zhì)粒載體pSGR-JFH-2. 1和pSGR-JFH-2. 3的結(jié)構(gòu)。在圖IB 和圖IC中，"T7"指示T7啟動(dòng)子。T7啟動(dòng)子是使用來自每種質(zhì)粒載體的T7 RNA聚合酶的 HCV亞基因組復(fù)制子RNA表達(dá)所需的序列元件。在質(zhì)粒載體pSGR-JFH-2. 1和pSGR-JFH-2. 3 中，5' UTR、NS3-NS5B編碼區(qū)和3' UTR是來自HCV JFH-2. 1或JFH-2. 3毒株的序列。此處， "neo"指示新霉素抗性基因，并且"EMCV IRES"指示腦心肌炎病毒的內(nèi)部核糖體進(jìn)入位點(diǎn)。 由這些載體表達(dá)的HCV亞基因組復(fù)制子RNA是由T7啟動(dòng)子下游的區(qū)域轉(zhuǎn)錄的RNA，如圖ID 中所示。
[0132] 在pSGR-JFH-2. 1和pSGR-JFH-2. 3中由T7啟動(dòng)子及其下游連接的HCV亞基因組 復(fù)制子RNA編碼區(qū)組成的核苷酸序列分別顯示于SEQ ID NOS :1和2中。
[0133] 此外，本文使用的HCV JFH-2. 1毒株和JFH-2. 3毒株的全長基因組序列分別顯示 于SEQ ID NOS :3和4中。由HCV JFH-2. 1和JFH-2. 3毒株的全長基因組序列編碼的病毒前 體蛋白質(zhì)（多聚蛋白質(zhì)）的氨基酸序列分別顯示于SEQ ID NOS :5和6中。SEQ ID NO :5中 所示的氨基酸序列由SEQ ID NO :3的核苷酸序列的核苷酸位置341 - 9445(包括終止密碼 子)編碼。在SEQ ID NO :6中所示的氨基酸序列由SEQ ID NO :4的核苷酸序列的核苷酸位 置341 - 9445 (包括終止密碼子)編碼。此外，HCV JFH-2. 1毒株和JFH-2. 3毒株的前體蛋 白質(zhì)中的NS3至NS5B區(qū)的氨基酸序列分別顯示于SEQ ID N0:14和15中。SEQ ID N0:14 的氨基酸序列（NS3-NS5B區(qū)）對(duì)應(yīng)于SEQ ID NO :5的氨基酸位置1032 - 3034。此外，SEQ ID NO :15的氨基酸序列（NS3-NS5B區(qū)）對(duì)應(yīng)于SEQ ID NO :5的氨基酸位置1032 - 3034。 此處，如圖IB和圖IC中所示，雖然HCV JFH-2. 1毒株的前體蛋白質(zhì)（SEQ ID NO :5)的氨基 酸位置1205 - 1206 (在NS3區(qū)中）的序列是丙氨酸（A)-異亮氨酸（I)，但HCV JFH-2. 3毒 株的前體蛋白質(zhì)（SEQ ID NO :6)的氨基酸位置1205 - 1206 (在NS3區(qū)中）的序列是甲硫 氨酸(M)-亮氨酸（L)。
[0134] (實(shí)施例2) HCV亞基因組復(fù)制子RNA的制備 對(duì)于HCV亞基因組復(fù)制子RNA的制備，將如實(shí)施例1中所述構(gòu)建的表達(dá)載體 pSGR-JFH-2. 1和pSGR-JFH-2. 3各自用限制酶油<3 I進(jìn)行切割，從而制備模板DNA用于PCR。 隨后，在將綠豆核酸酶（Mung Bean Nuclease)20 U (反應(yīng)溶液總體積：50 μ 1)加入10 μ g -20 yg模板DNA中用于酶處理后，將這些油a I切割片段各自在30°C溫育30分鐘。綠豆 核酸酶是催化使雙鏈DNA的單鏈部分選擇性地降解和成為平端的反應(yīng)的酶。一般而言，當(dāng) 通過直接使用上述油a I切割片段作為模板用RNA聚合酶進(jìn)行RNA轉(zhuǎn)錄時(shí)，其中已在3'末 端加入對(duì)應(yīng)于I識(shí)別序列的部分的額外CUGAU個(gè)核苷酸)的復(fù)制子RNA得以合成。此 處，在本實(shí)施例中，用綠豆核酸酶處理油a I切割片段，從而從油a I切割片段中去除CUGA 的4個(gè)核苷酸。
[0135] 接下來，對(duì)包含油a I切割片段用綠豆核酸酶處理的溶液實(shí)施根據(jù)常規(guī)方法的蛋 白質(zhì)去除處理，以純化CUGA的4個(gè)核苷酸已從其中去除的油a I切割片段用于在接下來的 反應(yīng)中用作模板DNA。根據(jù)該模板DNA，使用MEGAscript (Ambion)通過基于T7啟動(dòng)子的 轉(zhuǎn)錄反應(yīng)在體外合成RNA。具體地，根據(jù)制造商的說明書，制備包含0.5 yg- 1.0 yg模 板DNA的20 μ 1反應(yīng)溶液，隨后在37°C反應(yīng)3 - 16小時(shí)。
[0136] 在RNA合成完成后，將DNA酶（2U)加入反應(yīng)溶液中用于在37°C反應(yīng)15分鐘， 以去除模板DNA。使用酸性苯酚進(jìn)一步執(zhí)行RNA提取，從而獲得由pSGR-JFH-2. 1和 pSGR-JFH-2. 3轉(zhuǎn)錄的HCV亞基因組復(fù)制子RNAs。
[0137] (實(shí)施例3) HCV亞基因組復(fù)制子復(fù)制細(xì)胞克隆的建立 通過常規(guī)方法，使來自實(shí)施例2中制備的JFH-2. 1毒株或JFH-2. 3毒株的各（1 μ g)合 成HCV亞基因組復(fù)制子RNA與從Huh7細(xì)胞中提取的總細(xì)胞RNA混合，以將RNA總量調(diào)整至 10 μ g。隨后，通過電穿孔將混合RNA引入Huh7細(xì)胞內(nèi)。將電穿孔的Huh7細(xì)胞種植在培 養(yǎng)皿上，并且培養(yǎng)16 - 24小時(shí)，并且隨后將G418(新霉素）加入培養(yǎng)皿中。隨后，繼續(xù)培 養(yǎng)，同時(shí)每周替換培養(yǎng)基2次。在種植后培養(yǎng)21天后，用結(jié)晶紫染色活細(xì)胞。作為結(jié)果，如 圖2中所示，對(duì)于來自JFH-2. 1或JFH-2. 3毒株的復(fù)制子RNA已引入其內(nèi)的細(xì)胞，可以證實(shí) 集落形成。集落形成指示HCV亞基因組復(fù)制子RNA已在細(xì)胞中復(fù)制。
[0138] 關(guān)于對(duì)于其證實(shí)集落形成的上述復(fù)制子RNA轉(zhuǎn)染的細(xì)胞，將活細(xì)胞的集落在培養(yǎng) 21天后由上述培養(yǎng)皿進(jìn)一步克隆，并且隨后繼續(xù)培養(yǎng)。通過此類集落克隆可以建立多個(gè)細(xì) 胞克隆品系。將所得到的這些細(xì)胞克隆指定為JFH-2. 1亞基因組復(fù)制子細(xì)胞和JFH-2. 3亞 基因組復(fù)制子細(xì)胞。認(rèn)為所引入的JFH-2. 1毒株衍生的亞基因組復(fù)制子RNA或JFH-2. 3毒 株衍生的亞基因組復(fù)制子RNA在如此建立的細(xì)胞克隆中自我復(fù)制。
[0139] (實(shí)施例4)在JFH-2. 3亞基因組復(fù)制子細(xì)胞中的復(fù)制子RNA的序列分析 對(duì)于實(shí)施例3中建立的JFH-2. 3亞基因組復(fù)制子細(xì)胞中存在的亞基因組復(fù)制子 RNA進(jìn)行序列分析。首先，從建立的JFH-2. 3亞基因組復(fù)制子細(xì)胞的10個(gè)克隆中提取 總RNA，并且隨后通過RT-PCR擴(kuò)增其中包含的HCV亞基因組復(fù)制子RNA。對(duì)于擴(kuò)增， 5'-TAATACGACTCACTATAG-3'（SEQIDN0 :16)和5'-GCGGCTCACGGACCTTTCAC-3'（SEQID NO :17)用作引物。將所得到的擴(kuò)增產(chǎn)物克隆到測序克隆載體內(nèi)，并且隨后通過常規(guī)方法實(shí) 施序列分析。
[0140] 作為結(jié)果，在從細(xì)胞內(nèi)獲得的亞基因組復(fù)制子RNA中，發(fā)現(xiàn)引起在NS3區(qū)中的4 個(gè)位置(在位置1205上的M - K、在位置1548上的F - L、在位置1615上的C - W和在位 置1652上的T - N)、在NS5A區(qū)中的5個(gè)位置(在位置2196上的A - T、在位置2218上的 A - S、在位置2223上的H - Q、在位置2281上的Q - R和在位置2373上的G - S)、在NS5B 區(qū)中的1個(gè)位置(在位置2519上的K - N)(這在非結(jié)構(gòu)區(qū)中）的氨基酸置換的核苷酸置換 (圖3)。這些氨基酸置換中的大多數(shù)存在于NS3區(qū)或NS5A區(qū)內(nèi)，如上所述。這些氨基酸置 換的位置基于JFH-2. 3毒株的前體蛋白質(zhì)的全長氨基酸序列（SEQ ID NO :6)進(jìn)行描述。此 夕卜，在克隆2的位置2218上和在克隆3的位置2223上的氨基酸置換在ISDR區(qū)（干擾素敏 感性決定區(qū)）內(nèi)發(fā)生（圖3)。在JFH-2. 1/2. 3毒株的前體蛋白質(zhì)的氨基酸序列（SEQ ID NO: 6)中，ISDR區(qū)對(duì)應(yīng)于位置2214 - 2249。
[0141] (實(shí)施例5)在JFH-2. 3亞基因組復(fù)制子細(xì)胞中的HCV亞基因組的突變分析 為了檢查在實(shí)施例4中發(fā)現(xiàn)的核苷酸突變是否影響亞基因組復(fù)制子RNA在細(xì)胞中的復(fù) 制，將引起在NS3區(qū)內(nèi)的3個(gè)位置(在位置1548上的F - L、在位置1615上的C - W和在位 置1652上的T - N)和在NS5A區(qū)內(nèi)的3個(gè)位置(在位置2218上的A - S、在位置2223上的 H - Q和在位置2281上的Q - R)上的氨基酸置換的核苷酸置換各自引入在實(shí)施例1中制 備的HCV JFH-2. 1毒株衍生的亞基因組復(fù)制子RNA表達(dá)質(zhì)粒載體內(nèi)（圖4A)。
[0142] 具體地，首先，將 pSGR-JFH-2. 1 用作模板，加入 Phusion High-Fidelity DNA Polymerase試劑盒（FINNZYMES)附帶的10 μ 1的10 X緩沖液和4 μ 1的2毫摩爾（mM) dNTP 混合物，以及各 1 μ 1 的 10 微摩爾（μ M)引物 EcoT7-F(5'-CCGGAATTCTAATACGACTC-3' (SEQIDN0:18))和 1548FL-R(5，-GGGCGTGTTGAGATACGCTCTAAGCCTGAC-3，（SEQIDN0: 19))，并且隨后加入去離子水以使總量最終達(dá)到49. 5 μ?。其后，向其中加入0.5 μ? Phusion DNA Polymerase (FINNZYMES)，并且執(zhí)行PCR。PCR執(zhí)行30個(gè)循環(huán)，其中每個(gè)循環(huán) 由98°C、10秒，55°C、15秒和72°C、30秒組成。將所得到的PCR產(chǎn)物指定為PCR產(chǎn)物編號(hào)1。 接下來，將pSGR-JFH-2. 1 用作模板，加入 Phusion High-Fidelity DNA Polymerase 試劑盒 (FINNZYMES)附帶的10 μ 1的10 X緩沖液和4 μ 1的2 mM dNTP混合物，以及各1 μ 1 的 10 μΜ 引物 5563-R (5，-CTGCAGCAAGCCTTGGATCT-3,（SEQ ID NO :20))和 1548FL-F (5， -TTAGAGCGTATCTCAACACGCCCGGCCTAC-3'（SEQ ID NO :21))，并且隨后加入去離子水以使總量 最終達(dá)到49.5 μ 1。其后，向其中加入 0.5 μ I Phusion DNA Polymerase (FINNZYMES), 并且執(zhí)行PCR。PCR執(zhí)行30個(gè)循環(huán)，其中每個(gè)循環(huán)由98 °C、10秒，55 °C、15秒和72 °C、1分 30秒組成。將所得到的PCR產(chǎn)物指定為PCR產(chǎn)物編號(hào)2。
[0143] 使這些PCR產(chǎn)物各自純化且溶解于15 μ I H2O中。將PCR產(chǎn)物編號(hào)1和PCR產(chǎn)物 編號(hào)2的DNAs以各1 μ 1的量混合。將生成物用作模板，加入Phusion High-Fidelity DNA Polymerase試劑盒（FINNZYMES)附帶的10 μ 1的10 X緩沖液和4 μ 1的2 mMdNTP混合 物，以及各 1 μ 1 的 10 μ M 引物 EcoT7-F(5'-CCGGAATTCTAATACGACTC-3'（SEQ ID NO :18)) 和 5563-R (5'-CTGCAGCAAGCCTTGGATCT-3，（SEQ ID N0:20))，并且加入去離子水以使總量 最終達(dá)到 49. 5 μ 1。其后，向其中加入 0· 5 μ I Phusion DNA Polymerase (FINNZYMES)， 并且執(zhí)行PCR。PCR執(zhí)行30個(gè)循環(huán)，其中每個(gè)循環(huán)由98°C、10秒，55°C、15秒和72°C、2分鐘 組成。將所得到的PCR產(chǎn)物指定為PCR產(chǎn)物編號(hào)3。使PCR產(chǎn)物純化且隨后溶解于30 μ 1 H2O 中。
[0144] pSGR-JFH-2. 1和純化的PCR產(chǎn)物編號(hào)3用限制酶feoR I和feoT22 I進(jìn)行消化。 通過瓊脂糖凝膠電泳使每種HCV cDNA片段分級(jí)分離，并且隨后純化。使這2種DNA片段與 Ligation Mix(Takara Bio Inc.)混合，并且使2種DNA片段彼此連接。將因而獲得的具有引 起在位置1548上的氨基酸置換F - L的核苷酸置換的重組表達(dá)載體指定為pSGR-JFH-2. 1 F1548L。
[0145] 將 pSGR-JFH-2. 1 用作模板，加入 Phusion High-Fidelity DNA Polymerase 試 劑盒（FINNZYMES)附帶的10 μ 1的10 X緩沖液和4 μ 1的2 mM dNTP混合物，以及 各lμl的10μM引物EcoT7-F(5'-CCGGAATTCTAATACGACTC-3'（SEQIDN0 :18))和 1615CW-R (5'-AGTCGGGCCAGCCACTTCCACATGGCGTCC-3，（SEQ ID N0:22))，并且隨后加入去 離子水以使總量最終達(dá)到49. 5 μ 1。其后，向其中加入0· 5 μ I Phusion DNA Polymerase (FINNZYMES)，并且執(zhí)行PCR。PCR執(zhí)行30個(gè)循環(huán)，其中每個(gè)循環(huán)由98°C、10秒，55°C、15秒 和72°C、30秒組成。將所得到的PCR產(chǎn)物指定為PCR產(chǎn)物編號(hào)4。接下來，將pSGR-JFH-2. 1 用作模板，加入 Phusion High-Fidelity DNA Polymerase 試劑盒（FINNZYMES)附帶的 10 μ 1的10 X緩沖液和4 μ 1的2 mM dNTP混合物，以及各1 μ 1的10 μ M引物5563-R (5'-CTGCAGCAAGCCTTGGATCT-3'（SEQIDN0:20))和1615CW-F(5'-ATGTGGAAGTGGCTGGCC CGACTCAAGCCT-3'（SEQIDN0 :23))，并且隨后加入去離子水以使總量最終達(dá)到49.5μl。 其后，向其中加入 0.5 μ I Phusion DNA Polymerase (FINNZYMES)，并且執(zhí)行 PCR。PCR 執(zhí) 行30個(gè)循環(huán)，其中每個(gè)循環(huán)由98°C、10秒，55°C、15秒和72°C、1分30秒組成。將所得到的 PCR產(chǎn)物指定為PCR產(chǎn)物編號(hào)5。
[0146] 使PCR產(chǎn)物各自純化且溶解于15 μ I H2O中。將PCR產(chǎn)物編號(hào)4和PCR產(chǎn)物編 號(hào)5的DNAs以各1 μ 1的量混合。將生成物用作模板，加入Phusion High-Fidelity DNA Polymerase試劑盒（FINNZYMES)附帶的10 μ 1的10 X緩沖液和4 μ 1的2 mMdNTP混合 物，以及各 1 μ 1 的 10 μ M 引物 EcoT7-F(5'-CCGGAATTCTAATACGACTC-3'（SEQ ID NO :18)) 和 5563-R (5'-CTGCAGCAAGCCTTGGATCT-3，（SEQ ID N0:20))，并且加入去離子水以使總量 最終達(dá)到 49. 5 μ 1。其后，向其中加入 0· 5 μ I Phusion DNA Polymerase (FINNZYMES), 并且執(zhí)行PCR。PCR執(zhí)行30個(gè)循環(huán)，其中每個(gè)循環(huán)由98°C、10秒，55°C、15秒和72°C、2分鐘 組成。將所得到的PCR產(chǎn)物指定為PCR產(chǎn)物編號(hào)6。使PCR產(chǎn)物純化且隨后溶解于30 μ 1 H2O 中。
[0147] pSGR-JFH-2. 1和純化的PCR產(chǎn)物編號(hào)6用限制酶feoR I和feoT22 I進(jìn)行消化。 通過瓊脂糖凝膠電泳使每種HCV cDNA片段分級(jí)分離并且隨后純化。使這2種DNA片段與 Ligation Mix(Takara Bio Inc.)混合，并且使2種DNA片段彼此連接。將因而獲得的具有引 起在位置1615上的氨基酸置換C - W的核苷酸置換的重組表達(dá)載體指定為pSGR-JFH-2. 1 C1615W。
[0148] 將 pSGR-JFH-2. 1 用作模板，加入 Phusion High-Fidelity DNA Polymerase 試 劑盒（FINNZYMES)附帶的10 μ 1的10 X緩沖液和4 μ 1的2 mM dNTP混合物，以及 各lμl的10μM引物EcoT7-F(5'-CCGGAATTCTAATACGACTC-3'（SEQIDN0 :18))和 1652TN-R (5'-CTTGCATGCAATTGGCGATGTACTTCGTCC-3，（SEQ ID N0:24))，并且隨后加入去 離子水以使總量最終達(dá)到49. 5 μ 1。其后，向其中加入0· 5 μ I Phusion DNA Polymerase (FINNZYMES)，并且執(zhí)行PCR。PCR執(zhí)行30個(gè)循環(huán)，其中每個(gè)循環(huán)由98°C、10秒，55°C、15秒 和72°C、30秒組成。將所得到的PCR產(chǎn)物指定為PCR產(chǎn)物編號(hào)7。接下來，將pSGR-JFH-2. 1 用作模板，加入 Phusion High-Fidelity DNA Polymerase 試劑盒（FINNZYMES)附帶的 10 μ 1的10 X緩沖液和4 μ 1的2 mM dNTP混合物，以及各1 μ 1的10 μ M引物5563-R (5'-CTGCAGCAAGCCTTGGATCT-3'（SEQIDN0:20))和 1652TN-F(5'-GTACATCGCCAATTGCAT GCAAGCTGACCT-3'（SEQIDN0:25))，并且隨后加入去離子水以使總量最終達(dá)到49.5μl。 其后，向其中加入 0.5 μ I Phusion DNA Polymerase (FINNZYMES)，并且執(zhí)行 PCR。PCR 執(zhí) 行30個(gè)循環(huán)，其中每個(gè)循環(huán)由98°C、10秒，55°C、15秒和72°C、1分30秒組成。將所得到的 PCR產(chǎn)物指定為PCR產(chǎn)物編號(hào)8。
[0149] 使PCR產(chǎn)物各自純化且溶解于15 μ I H2O中。將PCR產(chǎn)物編號(hào)7和PCR產(chǎn)物編 號(hào)8的DNAs以各1 μ 1的量混合。將生成物用作模板，加入Phusion High-Fidelity DNA Polymerase試劑盒（FINNZYMES)附帶的10 μ 1的10 X緩沖液和4 μ 1的2 mMdNTP混合 物，以及各 1 μ 1 的 10 μ M 引物 EcoT7-F(5'-CCGGAATTCTAATACGACTC-3'（SEQ ID NO :18)) 和 5563-R (5'-CTGCAGCAAGCCTTGGATCT-3，（SEQ ID N0:20))，并且加入去離子水以使總量 最終達(dá)到 49. 5 μ 1。其后，向其中加入 0· 5 μ I Phusion DNA Polymerase (FINNZYMES), 并且執(zhí)行PCR。PCR執(zhí)行30個(gè)循環(huán)，其中每個(gè)循環(huán)由98°C、10秒，55°C、15秒和72°C、2分鐘 組成。將所得到的PCR產(chǎn)物指定為PCR產(chǎn)物編號(hào)9。使PCR產(chǎn)物純化且隨后溶解于30 μ 1 H2O 中。
[0150] pSGR-JFH-2. 1和純化的PCR產(chǎn)物編號(hào)9用限制酶feoR I和feoT22 I進(jìn)行消化。 通過瓊脂糖凝膠電泳使每種HCV cDNA片段分級(jí)分離并且隨后純化。使這2種DNA片段與 Ligation Mix(Takara Bio Inc.)混合，并且使2種DNA片段彼此連接。將因而獲得的具有引 起在位置1652上的氨基酸置換T - N的核苷酸置換的重組表達(dá)載體指定為pSGR-JFH-2. 1 T1652N。
[0151] 將 pSGR-JFH-2. 1 用作模板，加入 Phusion High-Fidelity DNA Polymerase 試 劑盒（FINNZYMES)附帶的10 μ 1的10 X緩沖液和4 μ 1的2 mM dNTP混合物，以及 各 1 μ 1 的 10 μΜ 引物 5162-F (5, -TGGGACGCCATGTGGAAGTG-3'（SEQ ID NO :26))和 2196AT-R (5'-TGATCCCCGTGTCAAGCGCCGCGCCGCAGT-3，（SEQ ID N0:27))，并且隨后加入去 離子水以使總量最終達(dá)到49. 5 μ 1。其后，向其中加入0· 5 μ I Phusion DNA Polymerase (FINNZYMES)，并且執(zhí)行PCR。PCR執(zhí)行30個(gè)循環(huán)，其中每個(gè)循環(huán)由98°C、10秒，55°C、15秒和 72°C、30秒組成。將所得到的PCR產(chǎn)物指定為PCR產(chǎn)物編號(hào)10。接下來，將pSGR-JFH-2. 1 用作模板，加入 Phusion High-Fidelity DNA Polymerase 試劑盒（FINNZYMES)附帶的 10 μ 1的10 X緩沖液和4 μ 1的2 mM dNTP混合物，以及各1 μ 1的10 μ M引物7827-R (5，-AAAGTTACCTTTTTAGCCCT-3'（SEQIDN0:28))和2196AT-F(5，-CGCGGCGCTTGACACGGG GATCACCTCCAT-3'（SEQIDN0 :29))，并且隨后加入去離子水以使總量最終達(dá)到49.5μl。 其后，向其中加入 0.5 μ I Phusion DNA Polymerase (FINNZYMES)，并且執(zhí)行 PCR。PCR 執(zhí) 行30個(gè)循環(huán)，其中每個(gè)循環(huán)由98°C、10秒，55°C、15秒和72°C、1分30秒組成。將所得到的 PCR產(chǎn)物指定為PCR產(chǎn)物編號(hào)11。
[0152] 使PCR產(chǎn)物各自純化且溶解于15 μ I H2O中。將PCR產(chǎn)物編號(hào)10和PCR產(chǎn)物編 號(hào)11的DNAs以各1 μ 1的量混合。將生成物用作模板，加入Phusion High-Fidelity DNA Polymerase試劑盒（FINNZYMES)附帶的10 μ 1的10 X緩沖液和4 μ 1的2 mMdNTP混合 物，以及各 1 μ 1 的 10 μ M 引物 5162-F(5'-TGGGACGCCATGTGGAAGTG-3'（SEQ ID NO :26)) 和 7827-R (5'-AAAGTTACCTTTTTAGCCCT-3，（SEQ ID N0:28))，并且加入去離子水以使總量 最終達(dá)到 49. 5 μ 1。其后，向其中加入 0· 5 μ I Phusion DNA Polymerase (FINNZYMES), 并且執(zhí)行PCR。PCR執(zhí)行30個(gè)循環(huán)，其中每個(gè)循環(huán)由98 °C、10秒，55 °C、15秒和72 °C、2分 鐘組成。將所得到的PCR產(chǎn)物指定為PCR產(chǎn)物編號(hào)12。使PCR產(chǎn)物純化且隨后溶解于30 μ I H2O 中。
[0153] pSGR-JFH-2. 1和純化的PCR產(chǎn)物編號(hào)12用限制酶feoT22 I和/?/ I進(jìn)行消化。 通過瓊脂糖凝膠電泳使每種HCV cDNA片段分級(jí)分離，并且隨后純化。使這2種DNA片段與 Ligation Mix(Takara Bio Inc.)混合，并且使2種DNA片段彼此連接。將因而獲得的具有引 起在位置2196上的氨基酸置換A - T的核苷酸置換的重組表達(dá)載體指定為pSGR-JFH-2. 1 A2196T。
[0154] 將 pSGR-JFH-2. 1 用作模板，加入 Phusion High-Fidelity DNA Polymerase 試 劑盒（FINNZYMES)附帶的10 μ 1的10 X緩沖液和4 μ 1的2 mM dNTP混合物，以及 各 1 μ 1 的 10 μΜ 引物 5162-F (5, -TGGGACGCCATGTGGAAGTG-3'（SEQ ID NO :26))和 2218AS-R (5'-GGTGCAGGTGGACCGCAGCGACGGTGCTGA-3，（SEQ ID N0:30))，并且隨后加入去 離子水以使總量最終達(dá)到49. 5 μ 1。其后，向其中加入0· 5 μ I Phusion DNA Polymerase (FINNZYMES)，并且執(zhí)行PCR。PCR執(zhí)行30個(gè)循環(huán)，其中每個(gè)循環(huán)由98°C、10秒，55°C、15秒和 72°C、30秒組成。將所得到的PCR產(chǎn)物指定為PCR產(chǎn)物編號(hào)13。接下來，將pSGR-JFH-2. 1 用作模板，加入 Phusion High-Fidelity DNA Polymerase 試劑盒（FINNZYMES)附帶的 10 μ 1的10 X緩沖液和4 μ 1的2 mM dNTP混合物，以及各1 μ 1的10 μ M引物7827-R (5，-AAAGTTACCTTTTTAGCCCT-3'（SEQIDN0:28))和2218AS-F(5，-CCGTCGCTGCGGTCCACC TGCACCACCCAC-3'（SEQIDN0 :31))，并且隨后加入去離子水以使總量最終達(dá)到49.5μl。 其后，向其中加入 0.5 μ I Phusion DNA Polymerase (FINNZYMES)，并且執(zhí)行 PCR。PCR 執(zhí) 行30個(gè)循環(huán)，其中每個(gè)循環(huán)由98°C、10秒，55°C、15秒和72°C、1分30秒組成。將所得到的 PCR產(chǎn)物指定為PCR產(chǎn)物編號(hào)14。
[0155] 使PCR產(chǎn)物各自純化且溶解于15 μ I H2O中。將PCR產(chǎn)物編號(hào)13和PCR產(chǎn)物編 號(hào)14的DNAs以各1 μ 1的量混合。將生成物用作模板，加入Phusion High-Fidelity DNA Polymerase試劑盒（FINNZYMES)附帶的10 μ 1的10 X緩沖液和4 μ 1的2 mMdNTP混合 物，以及各 1 μ 1 的 10 μ M 引物 5162-F (5'-TGGGACGCCATGTGGAAGTG-3,（SEQ ID NO :26)) 和 7827-R (5'-AAAGTTACCTTTTTAGCCCT-3，（SEQ ID N0:28))，并且加入去離子水以使總量 最終達(dá)到 49. 5 μ 1。其后，向其中加入 0· 5 μ I Phusion DNA Polymerase (FINNZYMES)， 并且執(zhí)行PCR。PCR執(zhí)行30個(gè)循環(huán)，其中每個(gè)循環(huán)由98 °C、10秒，55 °C、15秒和72 °C、2分 鐘組成。將所得到的PCR產(chǎn)物指定為PCR產(chǎn)物編號(hào)15。使PCR產(chǎn)物純化且隨后溶解于30 μ I H2O 中。
[0156] pSGR-JFH-2. 1和純化的PCR產(chǎn)物編號(hào)15用限制酶feoT22 I和/?/ I進(jìn)行消化。 通過瓊脂糖凝膠電泳使每種HCV cDNA片段分級(jí)分離，并且隨后純化。使這2種DNA片段與 Ligation Mix(Takara Bio Inc.)混合，并且使2種DNA片段彼此連接。將因而獲得的具有引 起在位置2218上的氨基酸置換A - S的核苷酸置換的重組表達(dá)載體指定為pSGR-JFH-2. 1 A2218S。
[0157] 將 pSGR-JFH-2. 1 用作模板，加入 Phusion High-Fidelity DNA Polymerase 試 劑盒（FINNZYMES)附帶的10 μ 1的10 X緩沖液和4 μ 1的2 mM dNTP混合物，以及 各 1 μ 1 的 10 μΜ 引物 5162-F (5, -TGGGACGCCATGTGGAAGTG-3'（SEQ ID NO :26))和 2223HQ-R (5'-TAGGTGTTGCTTTGGGTGGTGCAGGTGGCC-3，（SEQ ID N0:32))，并且隨后加入去 離子水以使總量最終達(dá)到49. 5 μ 1。其后，向其中加入0· 5 μ I Phusion DNA Polymerase (FINNZYMES)，并且執(zhí)行PCR。PCR執(zhí)行30個(gè)循環(huán)，其中每個(gè)循環(huán)由98°C、10秒，55°C、15秒和 72°C、30秒組成。將所得到的PCR產(chǎn)物指定為PCR產(chǎn)物編號(hào)16。接下來，將pSGR-JFH-2. 1 用作模板，加入 Phusion High-Fidelity DNA Polymerase 試劑盒（FINNZYMES)附帶的 10 μ 1的10 X緩沖液和4 μ 1的2 mM dNTP混合物，以及各1 μ 1的10 μ M引物7827-R (5'-AAAGTTACCTTTTTAGCCCT-3'（SEQIDN0:28))和 2223HQ-F(5'-CTGCACCACCCAAAGCAA CACCTATGACGT-3'（SEQIDN0:33))，并且隨后加入去離子水以使總量最終達(dá)到49.5μl。 其后，向其中加入 0.5 μ I Phusion DNA Polymerase (FINNZYMES)，并且執(zhí)行 PCR。PCR 執(zhí) 行30個(gè)循環(huán)，其中每個(gè)循環(huán)由98°C、10秒，55°C、15秒和72°C、1分30秒組成。將所得到的 PCR產(chǎn)物指定為PCR產(chǎn)物編號(hào)17。
[0158] 使PCR產(chǎn)物各自純化且溶解于15 μ I H2O中。將PCR產(chǎn)物編號(hào)16和PCR產(chǎn)物編 號(hào)17的DNAs以各1 μ 1的量混合。將生成物用作模板，加入Phusion High-Fidelity DNA Polymerase試劑盒（FINNZYMES)附帶的10 μ 1的10 X緩沖液和4 μ 1的2 mMdNTP混合 物，以及各 1 μ 1 的 10 μ M 引物 5162-F(5'-TGGGACGCCATGTGGAAGTG-3'（SEQ ID NO :26)) 和 7827-R (5'-AAAGTTACCTTTTTAGCCCT-3，（SEQ ID N0:28))，并且加入去離子水以使總量 最終達(dá)到 49. 5 μ 1。其后，向其中加入 0· 5 μ I Phusion DNA Polymerase (FINNZYMES), 并且執(zhí)行PCR。PCR執(zhí)行30個(gè)循環(huán)，其中每個(gè)循環(huán)由98 °C、10秒，55 °C、15秒和72 °C、2分 鐘組成。將所得到的PCR產(chǎn)物指定為PCR產(chǎn)物編號(hào)18。使PCR產(chǎn)物純化且隨后溶解于30 μ I H2O 中。
[0159] pSGR-JFH-2. 1和純化的PCR產(chǎn)物編號(hào)18用限制酶feoT22 I和/?/ I進(jìn)行消化。 通過瓊脂糖凝膠電泳使每種HCV cDNA片段分級(jí)分離，并且隨后純化。使這2種DNA片段與 Ligation Mix(Takara Bio Inc.)混合，并且使2種DNA片段彼此連接。將因而獲得的具有引 起在位置2223上的氨基酸置換H - Q的核苷酸置換的重組表達(dá)載體指定為pSGR-JFH-2. 1 H2223Q。
[0160] 將 pSGR-JFH-2. 1 用作模板，加入 Phusion High-Fidelity DNA Polymerase 試 劑盒（FINNZYMES)附帶的10 μ 1的10 X緩沖液和4 μ 1的2 mM dNTP混合物，以及 各 1 μ? 的 10 μΜ 引物 5162-F (5，-TGGGACGCCATGTGGAAGTG-3，（SEQ ID NO:26)) 和 2281QR-R (5, -TGGGAATTGTTTCTCGGGG-3'（SEQ ID NO :35))，并且隨后加入去離子 水以使總量最終達(dá)到49.5 μ 1。其后，向其中加入0.5 μ I Phusion DNA Polymerase (FINNZYMES)，并且執(zhí)行PCR。PCR執(zhí)行30個(gè)循環(huán)，其中每個(gè)循環(huán)由98 °C、10秒，55 °C、 15秒和72 °C、30秒組成。將所得到的PCR產(chǎn)物指定為PCR產(chǎn)物編號(hào)X。接下來， 將 pSGR-JFH-2. 1 用作模板，加入 Phusion High-Fidelity DNA Polymerase 試劑盒 (FINNZYMES)附帶的10 μ 1的10 X緩沖液和4 μ 1的2 mM dNTP混合物，以及各1 μ 1 的 10 μΜ 引物 7827-R (5, -AAAGTTACCTTTTTAGCCCT-3，（SEQ ID NO :28))和 2281QR-F (5'-TACTTGATCCCCGAGAAAC-3，（SEQ ID N0:34))，并且隨后加入去離子水以使總量最終達(dá) 到 49. 5 μ 1。其后，向其中加入 0· 5 μ I Phusion DNA Polymerase (FINNZYMES)，并且執(zhí) 行PCR。PCR執(zhí)行30個(gè)循環(huán)，其中每個(gè)循環(huán)由98°C、10秒，55°C、15秒和72°C、1分30秒組 成。將所得到的PCR產(chǎn)物指定為PCR產(chǎn)物編號(hào)Y。
[0161] 使PCR產(chǎn)物各自純化且溶解于15 μ I H2O中。將PCR產(chǎn)物編號(hào)X和PCR產(chǎn)物編 號(hào)Y的DNAs以各1 μ 1的量混合。將生成物用作模板，加入Phusion High-Fidelity DNA Polymerase試劑盒（FINNZYMES)附帶的10 μ 1的10 X緩沖液和4 μ 1的2 mMdNTP混合 物，以及各 1 μ 1 的 10 μ M 引物 5162-F(5'-TGGGACGCCATGTGGAAGTG-3'（SEQ ID NO :26)) 和 7827-R (5'-AAAGTTACCTTTTTAGCCCT-3，（SEQ ID N0:28))，并且加入去離子水以使總量 最終達(dá)到 49. 5 μ 1。其后，向其中加入 0· 5 μ I Phusion DNA Polymerase (FINNZYMES), 并且執(zhí)行PCR。PCR執(zhí)行30個(gè)循環(huán)，其中每個(gè)循環(huán)由98°C、10秒，55°C、15秒和72°C、2分鐘 組成。將所得到的PCR產(chǎn)物指定為PCR產(chǎn)物編號(hào)Z。使PCR產(chǎn)物純化且隨后溶解于30 μ 1 H2O 中。
[0162] pSGR-JFH-2. 1和純化的PCR產(chǎn)物編號(hào)Z用限制酶feoT22 I和/?/ I進(jìn)行消化。 通過瓊脂糖凝膠電泳使每種HCV cDNA片段分級(jí)分離，并且隨后純化。使這2種DNA片段與 Ligation Mix(Takara Bio Inc.)混合，并且使2種DNA片段彼此連接。將因而獲得的具有引 起在位置2281上的氨基酸置換Q - R的核苷酸置換的重組表達(dá)載體指定為pSGR-JFH-2. 1 Q2281R。
[0163] 將這些質(zhì)粒用油a I進(jìn)行切割，并且隨后實(shí)施酚氯仿提取和乙醇沉淀。使用因而 切割的質(zhì)粒作為模板和MEGAscript T7試劑盒（Ambion)合成每種HCV RNA。
[0164] 通過電穿孔將如上所述獲得的突變型JFH-2. 1衍生的亞基因組復(fù)制子RNA (3 μ g)引入Huh7細(xì)胞內(nèi)。將電穿孔的Huh7細(xì)胞種植在培養(yǎng)皿上，并且培養(yǎng)16 - 24小時(shí)， 并且隨后將G418 (新霉素）加入培養(yǎng)皿中。隨后，繼續(xù)培養(yǎng)，同時(shí)每周替換培養(yǎng)基2次。在 種植后培養(yǎng)21天后，用結(jié)晶紫染色活細(xì)胞（圖4B)。作為結(jié)果，雖然在不含突變的JFH-2. 1 衍生的亞基因組復(fù)制子RNA已引入其內(nèi)的細(xì)胞（圖4B，上）中無法觀察到集落形成，但在引 入突變的亞基因組復(fù)制子RNA已引入其內(nèi)的細(xì)胞中明確觀察到集落形成。特別地，在位置 2218上具有A - S突變的亞基因組復(fù)制子RNA發(fā)揮顯著增加的集落形成能力，指示高復(fù)制 子復(fù)制能力的獲得。因此，證實(shí)如上所述在HCV前體蛋白質(zhì)中發(fā)現(xiàn)的這些氨基酸突變，特別 是在位置2218上的A - S氨基酸突變(在下文中也稱為A (2218)S)，增強(qiáng)HCV亞基因組復(fù) 制子RNA的復(fù)制。
[0165] (實(shí)施例 6)表達(dá)載體 pJ6/JFH-2. 1 和 pJ6/JFH-2. I A2218S 的構(gòu)建 為了評(píng)估通過使用如上文實(shí)施例中獲得的基于JFH-2. 1毒株衍生的突變型HCV基因組 序列的復(fù)制子RNA是否可以在培養(yǎng)細(xì)胞中產(chǎn)生HCV顆粒，構(gòu)建表達(dá)具有全長HCV基因組序 列的復(fù)制子RNA (HCV全基因組復(fù)制子RNA)的質(zhì)粒載體。
[0166] 具體地，參考J6/JFH-1嵌合HCV基因組能夠有效產(chǎn)生HCV顆粒的報(bào)道 (Lindenbach 等人，Science (2005) 309,第 623-626 頁)，使用另一種 HCV 毒株，JFH-I 毒株 (基因型2a)衍生的5'UTR序列（SEQIDN0:8)、J6CF毒株(基因型2a)衍生的結(jié)構(gòu)區(qū)的序 列（包含核心、E1、E2和p7區(qū)的序列；SEQ ID NO :7)、JFH-1毒株衍生的NS2區(qū)（SEQ ID NO : 9)、和范圍為NS3區(qū)到3' UTR的JFH-2. 1毒株衍生的序列（包含NS3、NS4A、NS4B、NS5A和 NS5B區(qū)和3' UTR ;SEQ ID NO : 10)以這個(gè)次序進(jìn)行連接，以形成嵌合HCV基因組序列J6/ JFH-2. I (SEQ ID N0:11)(圖5B)。隨后，將嵌合HCV基因組序列J6/JFH-2. 1摻入質(zhì)粒 PUC19中的T7啟動(dòng)子的控制下，從而構(gòu)建重組表達(dá)載體pJ6/JFH-2. 1，如下所述。通過將在 實(shí)施例5中證實(shí)增加復(fù)制子復(fù)制效率的NS5A區(qū)內(nèi)的A (2218) S突變引入到J6/JFH-2. 1 內(nèi)，制備表達(dá)突變型復(fù)制子J6/JFH-2. I A2217S的載體pJ6/JFH-2. I A2217S (圖5B)。J6/ JFH-2. I A2217S的核苷酸序列顯示于SEQ ID NO :12中。在SEQ ID NO :12的序列中，在 J6/JFH-2. I (SEQ ID NO :11)的核苷酸位置6989上的G變成T，從而引入在位置2217上從 A到S的氨基酸突變。通過根據(jù)先前報(bào)道的程序執(zhí)行構(gòu)建（Wakita，T等人，Nat Med.，11 : 791-796,2005)。由J6/JFH-2.1 A2217S的全長基因組序列編碼的前體蛋白質(zhì)的氨基酸序 列顯示于SEQ ID NO :88中。在SEQ ID NO :5中所示的JFH-2. 1全長氨基酸序列中在位置 2218上的氨基酸是丙氨酸（A)，并且定位于這個(gè)位置上的丙氨酸與嵌合HCV J6/JFH2. 1的 全長氨基酸序列中在位置2217上的丙氨酸比對(duì)。即，在由J6/JFH-2. I A2217S的全長基因 組核苷酸序列（SEQ ID NO :12)編碼的蛋白質(zhì)中，在位置2217上的丙氨酸由絲氨酸（S)置 換。在這種情況下，這個(gè)置換也對(duì)應(yīng)于如使用作為參考序列的SEQ ID NO :6中所示的氨基 酸序列定義的氨基酸置換A (2218) S。僅因?yàn)榉奖愕脑颍蛔冃蛷?fù)制子的名稱已從先前 名稱J6/JFH-2. I A2218S變成J6/JFH-2. I A2117S，并且因此它們指的是相同復(fù)制子。編碼 突變型復(fù)制子的表達(dá)載體的名稱也類似地變成PJ6/JFH-2. I A2117S。
[0167] 具體地，將pJ6/JFH_2. 1 用作模板，加入Phusion High-Fidelity DNA Polymerase 試劑盒（FINNZYMES)附帶的10 μ?的10 X緩沖液和4 μ?的2mMdNTP混合物，以及 各 1 μ 1 的 10 μΜ 引物 5162-F (5, -TGGGACGCCATGTGGAAGTG-3'（SEQ ID NO :26))和 2218AS-R (5'-GGTGCAGGTGGACCGCAGCGACGGTGCTGA-3，（SEQ ID N0:30))，并且隨后加入去 離子水以使總量最終達(dá)到49. 5 μ 1。其后，向其中加入0· 5 μ I Phusion DNA Polymerase (FINNZYMES)，并且執(zhí)行PCR。PCR執(zhí)行30個(gè)循環(huán)，其中每個(gè)循環(huán)由98°C、10秒，55°C、15秒 和72°C、30秒組成。將所得到的PCR產(chǎn)物指定為PCR產(chǎn)物編號(hào)19。接下來，將pJ6/JFH-2. 1 用作模板，加入 Phusion High-Fidelity DNA Polymerase 試劑盒（FINNZYMES)附帶的 10 μ 1的10 X緩沖液和4 μ 1的2 mM dNTP混合物，以及各1 μ 1的10 μ M引物7827-R (5，-AAAGTTACCTTTTTAGCCCT-3'（SEQIDN0:28))和2218AS-F(5，-CCGTCGCTGCGGTCCACC TGCACCACCCAC-3'（SEQIDN0 :31))，并且隨后加入去離子水以使總量最終達(dá)到49.5μl。 其后，向其中加入 0.5 μ I Phusion DNA Polymerase (FINNZYMES)，并且執(zhí)行 PCR。PCR 執(zhí) 行30個(gè)循環(huán)，其中每個(gè)循環(huán)由98°C、10秒，55°C、15秒和72°C、1分30秒組成。將所得到的 PCR產(chǎn)物指定為PCR產(chǎn)物編號(hào)20。
[0168] 使這些PCR產(chǎn)物各自純化且溶解于15 μ I H2O中。將PCR產(chǎn)物編號(hào)19和PCR產(chǎn) 物編號(hào)20的DNAs以各1 μ 1的量混合。將生成物用作模板，加入Phusion High-Fidelity DNA Polymerase 試劑盒（FINNZYMES)附帶的 10 μ 1 的 10 X 緩沖液和 4 μ 1 的 2 mM dNTP 混合物，以及各 1 μ 1 的 10 μ M 引物 5162-F (5'-TGGGACGCCATGTGGAAGTG-3,（SEQ ID NO : 26))和 7827-R(5'-AAAGTTACCTTTTTAGCCCT-3'（SEQ ID NO :28))，并且加入去離子水以使總 量最終達(dá)到 49. 5 μ 1。其后，向其中加入 0· 5 μ I Phusion DNA Polymerase(FINNZYMES), 并且執(zhí)行PCR。PCR執(zhí)行30個(gè)循環(huán)，其中每個(gè)循環(huán)由98 °C、10秒，55 °C、15秒和72 °C、2分 鐘組成。將所得到的PCR產(chǎn)物指定為PCR產(chǎn)物編號(hào)21。使PCR產(chǎn)物純化且隨后溶解于30 μ I H2O 中。
[0169] PJ6/JFH-2. 1和純化的PCR產(chǎn)物編號(hào)21用限制酶feoT22 I和/?/ I進(jìn)行消化。 通過瓊脂糖凝膠電泳使每種HCV cDNA片段分級(jí)分離，并且隨后純化。使這2種DNA片段與 Ligation Mix(Takara Bio Inc.)混合，并且使2種DNA片段彼此連接。將因而獲得的具有 引起在位置2218上的氨基酸置換A - S的核苷酸置換的重組表達(dá)載體指定為pJ6/JFH-2. 1 A2217S。
[0170] (實(shí)施例7)J6/JFH-2. 1和J6/JFH-2. I A2217S RNA已引入其內(nèi)的細(xì)胞中的HCV復(fù) 制子復(fù)制能力的評(píng)估 使用實(shí)施例6中構(gòu)建的表達(dá)載體pJ6/JFH-2. 1和pJ6/JFH-2. I A2217S，通過類似于實(shí) 施例2中那些的程序制備HCV復(fù)制子RNA (嵌合HCV全基因組復(fù)制子RNA)。將因而獲得的 HCV 復(fù)制子 RNAs，J6/JFH-2. I HCV RNA 和 J6/JFH-2. I A2217S HCV RNA 各自通過電穿孔引 入Huh7細(xì)胞內(nèi)。在引入后，在電穿孔后4、12、24、48、72和96小時(shí)時(shí)收集細(xì)胞，并且隨后使 用HCV抗原ELISA測試試劑盒（Ortho Clinical Diagnostics)定量細(xì)胞中包含的HCV核 心蛋白質(zhì)，并且從而評(píng)估細(xì)胞中的HCV復(fù)制子復(fù)制能力（圖6)。
[0171] 作為結(jié)果，發(fā)現(xiàn)J6/JFH-2. I A2217S HCV RNA已引入其內(nèi)的細(xì)胞中的核心蛋白質(zhì) 的量在引入后48小時(shí)時(shí)和其后增加，指示細(xì)胞中的HCV復(fù)制子的有效復(fù)制。相比之下，即使 在引入后96小時(shí)時(shí)也未發(fā)現(xiàn)J6/JFH-2.1 HCV RNA已引入其內(nèi)的細(xì)胞中的核心蛋白質(zhì)的量 增加。上述結(jié)果證實(shí)在NS5A區(qū)中在位置2218上的A - S突變對(duì)于細(xì)胞中嵌合HCV復(fù)制子 RNA的有效復(fù)制也是重要的。此處，"位置2218"意指如使用作為參考序列的SEQ ID NO :6 中所示的氨基酸序列定義的突變位置，并且突變的嵌合HCV的全長氨基酸序列中的相應(yīng)突 變是在位置2217上的A - S突變。
[0172] (實(shí)施例8) J6/JFH-2. I A2217S HCV RNA已引入其內(nèi)的細(xì)胞中的HCV顆粒生產(chǎn)能 力的評(píng)估 在培養(yǎng)基（Dulbecco改良Eagle培養(yǎng)基（DMEM) -10 %胎牛血清）中以類似于實(shí)施例7 中那種的方式傳代培養(yǎng)J6/JFH-2. I A2217S HCV RNA已引入其內(nèi)的Huh7細(xì)胞時(shí)，使用HCV 抗原ELISA測試試劑盒（Ortho Clinical Diagnostics)隨著時(shí)間過去定量培養(yǎng)上清液中 包含的HCV核心蛋白質(zhì)，以證實(shí)HCV顆粒的產(chǎn)生（圖7)。
[0173] 作為結(jié)果，雖然在HCV復(fù)制子RNA引入后60天在培養(yǎng)上清液中幾乎未證實(shí)核心蛋 白質(zhì)，但發(fā)現(xiàn)核心蛋白質(zhì)的量在引入后60天-80天時(shí)增加。在80天后，核心蛋白質(zhì)以幾 乎恒定的水平檢測到。這些結(jié)果證實(shí)當(dāng)細(xì)胞在向其中引入RNA后傳代培養(yǎng)時(shí)，J6/JFH-2.1 A2217S HCV RNA使得產(chǎn)生能夠細(xì)胞外釋放的病毒顆粒。
[0174] (實(shí)施例9) J6/JFH-2. I A2217S HCV顆粒的感染性的評(píng)估 檢查 J6/JFH-2. I A2217S HCV RNA衍生的HCV顆粒(在下文中，稱為 J6/JFH-2. I A2217S HCV顆粒）是否具有感染性，所述HCV顆粒的產(chǎn)生在實(shí)施例8中加以證實(shí)。首先，類似于上 述實(shí)施例，通過電穿孔將J6/JFH-2. I A2217S HCV RNA引入Huh7細(xì)胞內(nèi)，并且隨后執(zhí)行傳 代培養(yǎng)。將在引入細(xì)胞內(nèi)后第88天時(shí)的培養(yǎng)上清液加入首次用于實(shí)驗(yàn)的（naive) Huh7細(xì) 胞內(nèi)。在72小時(shí)后，通過病灶（focus)形成測定來測定HCV感染細(xì)胞的數(shù)目，并且計(jì)算感 染效價(jià)（圖8)。
[0175] 作為結(jié)果，發(fā)現(xiàn)感染效價(jià)是5. 21 X IO3集落形成單位（ffu)/ml。將該值除以培 養(yǎng)上清液中的HCV核心的量（3. 96 X IO3飛摩爾/升（fmol/L))。因此，感染效價(jià)/單位 HCV蛋白質(zhì)計(jì)算為1. 32 (感染效價(jià)/核心值)。
[0176] 結(jié)果證實(shí)經(jīng)由J6/JFH-2. I A2217S HCV RNA引入細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生的HCV顆粒具有感染 性。
[0177] (實(shí)施例10) JFH-2. 1和JFH-2. I A2218S HCV全基因組復(fù)制子RNA表達(dá)載體的構(gòu) 建 構(gòu)建表達(dá)具有JFH-2. 1毒株的全長基因組序列的復(fù)制子RNA(HCV全基因組復(fù)制子RNA (圖9A))的質(zhì)粒載體pJFH-2. 1，所述復(fù)制子RNA包括5' UTR區(qū)、結(jié)構(gòu)區(qū)(核心、E1、E2和p7 區(qū)）、非結(jié)構(gòu)區(qū)（NS2、NS3、NS4A、NS4B、NS5A和NS5B區(qū)）和3' UTR區(qū)，以便評(píng)估使用JFH-2. 1 毒株的HCV基因組RNA在培養(yǎng)細(xì)胞中是否可以產(chǎn)生HCV顆粒，其基于證實(shí)嵌合HCV全基因 組復(fù)制子J6/JFH-2. I A2217S HCV RNA使得能夠產(chǎn)生感染性HCV顆粒的實(shí)施例6-9的結(jié)果 進(jìn)行。
[0178] 此外，將在實(shí)施例7-9中證實(shí)對(duì)于J6/JFH-2. I A2217S嵌合HCV復(fù)制子RNA的細(xì) 胞內(nèi)復(fù)制或由其產(chǎn)生感染性HCV顆粒重要的在NS5A區(qū)中在位置2218上的A - S突變以類 似于實(shí)施例6中那種的方式引入JFH-2. 1基因組序列內(nèi)。構(gòu)建表達(dá)突變型全基因組復(fù)制 子JFH-2. I A2218S的載體pJFH-2. I A2218S (圖9B)。通過根據(jù)先前報(bào)道的程序執(zhí)行構(gòu)建 (Wakita，T 等人，Nat Med，（2005))。JFH-2. I A2218S 的核苷酸序列顯示于 SEQ ID NO : 13中。在SEQ ID N0:13的序列中，A2218S氨基酸突變已通過在JFH-2. I (SEQ ID N0:3) 的核苷酸位置6992上的G至T的改變引入。
[0179] (實(shí)施例11) JFH-2. I A2218S HCV RNA已引入其內(nèi)的細(xì)胞中的HCV顆粒生產(chǎn)能力 的評(píng)估 使用實(shí)施例10中構(gòu)建的表達(dá)載體pJFH-2. I A2218S，通過類似于實(shí)施例2中那些的技 術(shù)制備HCV復(fù)制子RNA(突變型HCV全基因組復(fù)制子RNA)。將因而獲得的HCV復(fù)制子RNA， JFH-2. I A2218S HCV RNA，通過電穿孔引入Huh7細(xì)胞內(nèi)。其后，在培養(yǎng)基(含10%胎牛血清 的Dulbecco改良Eagle培養(yǎng)基（DMEM))中傳代培養(yǎng)細(xì)胞時(shí)，使用HCV抗原ELISA測試試劑 盒（Ortho Clinical Diagnostics)隨著時(shí)間過去定量培養(yǎng)上清液中包含的HCV核心蛋白 質(zhì)，以證實(shí)HCV顆粒的產(chǎn)生（圖10)。
[0180] 作為結(jié)果，在HCV復(fù)制子RNA引入后40天在培養(yǎng)上清液中幾乎未證實(shí)核心蛋白 質(zhì)。然而，發(fā)現(xiàn)核心蛋白質(zhì)的量在引入后40 - 60天后增加。在60天時(shí)和其后，核心蛋白 質(zhì)以幾乎恒定的水平檢測到。這些結(jié)果證實(shí)在RNA引入細(xì)胞內(nèi)后傳代培養(yǎng)細(xì)胞時(shí)，JFH-2. 1 A2218S HCV RNA使得產(chǎn)生能夠細(xì)胞外釋放的病毒顆粒。
[0181] (實(shí)施例12) JFH-2. I A2218S HCV顆粒的感染性的評(píng)估 檢查 JFH-2. I A2218S HCV RNA 衍生的 HCV 顆粒(在下文中，稱為 JFH-2. I A2218S HCV 顆粒)是否具有感染性，所述HCV顆粒的產(chǎn)生在實(shí)施例11中加以證實(shí)。首先，類似于上述實(shí) 施例，通過電穿孔將JFH-2. I A2218S HCV RNA引入Huh7細(xì)胞內(nèi)，并且隨后執(zhí)行傳代培養(yǎng)。 將在引入細(xì)胞內(nèi)后第63天時(shí)的培養(yǎng)上清液加入首次用于實(shí)驗(yàn)的Huh7細(xì)胞內(nèi)。在72小時(shí) 后，通過病灶形成方法來測定HCV感染細(xì)胞的數(shù)目，并且計(jì)算感染效價(jià)（圖11 )。
[0182] 作為結(jié)果，感染效價(jià)是4. 32 X IO4 ffu/ml。將該值除以培養(yǎng)上清液中的HCV核 心的量（1.17 X IO4 fmol/L)。因此，感染效價(jià)/單位HCV蛋白質(zhì)計(jì)算為3.69 (感染效價(jià) /核心值)。結(jié)果證實(shí)通過JFH-2. I A2218S HCV RNA引入細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生的HCV顆粒具有感染 性，并且發(fā)現(xiàn)感染效價(jià)/單位蛋白質(zhì)高于J6/JFH-2. I A2217S HCV顆粒。
[0183] (實(shí)施例13)關(guān)于得自J6/JFH-2. I A2217S RNA復(fù)制細(xì)胞的傳代培養(yǎng)的核苷酸序 列的突變分析 以0. 03的moi (感染復(fù)數(shù)）用Huh-7細(xì)胞（J6/JFH-2. I A2217S HCV RNA已引入其內(nèi) 的Huh-7細(xì)胞，其包含在實(shí)施例8中獲得的具有高感染效價(jià)的J6/JFH-2. I A2217S HCV顆 粒）的培養(yǎng)上清液感染新鮮的未感染的Huh-7細(xì)胞。對(duì)受感染細(xì)胞進(jìn)行傳代培養(yǎng)，直至培 養(yǎng)上清液中核心蛋白質(zhì)的量和感染效價(jià)分別達(dá)到1，〇〇〇 fmol/L和1，000 ffu/ml或更多。 用包含病毒的培養(yǎng)上清液的感染并使受感染細(xì)胞的傳代培養(yǎng)重復(fù)3 - 4次，并且隨后對(duì)于 培養(yǎng)上清液中包含的HCV RNA進(jìn)行序列分析。采用2個(gè)感染系，并且將其分別指定為4A和 4B。首先，從感染系4A和4B的包含J6/JFH-2. I A2217S HCV顆粒的Huh-7細(xì)胞的每種培 養(yǎng)上清液中提取RNA，并且隨后通過RT-PCR擴(kuò)增其中包含的HCV RNA。將隨機(jī)引物（6聚體 (6 mer)，Takara Bio Inc.)用于擴(kuò)增。將擴(kuò)增產(chǎn)物克隆到測序克隆載體內(nèi)，并且隨后通過 常規(guī)方法實(shí)施序列分析。
[0184] 作為結(jié)果，在感染系4A的情況下，發(fā)現(xiàn)引起在7個(gè)位置上的氨基酸置換的核苷酸 置換：在處于結(jié)構(gòu)區(qū)中的E2區(qū)中的2個(gè)位置(在位置405上的M - K和在位置417上的 N - T);以及在處于非結(jié)構(gòu)區(qū)中的NS2區(qū)中的1個(gè)位置(在位置868上的M - T)、NS3區(qū)中 的1個(gè)位置(在位置1642上的T -A)、NS4B區(qū)中的1個(gè)位置（在位置1722上的I - V)、 NS5A區(qū)中的1個(gè)位置(在位置2204上的S - G)、和NS5B區(qū)中的1個(gè)位置(在位置2695上 的T - I)。此外，在感染系4B的情況下，發(fā)現(xiàn)引起在8個(gè)位置上的氨基酸置換的核苷酸置 換：在處于結(jié)構(gòu)區(qū)中的核心區(qū)中的1個(gè)位置(在位置148上的A - T)、El區(qū)中的1個(gè)位置 (在位置356上的M - V)、E2區(qū)中的1個(gè)位置(在位置626上的V - G);以及在處于非結(jié)構(gòu) 區(qū)中的NS4A區(qū)中的1個(gè)位置(在位置1687上的I - V)、NS4B區(qū)中的1個(gè)位置(在位置1767 上的K - R)、NS5A區(qū)中的1個(gè)位置(在位置2219上的C - S)、和NS5B區(qū)中的2個(gè)位置(在 位置2695上的T - I和在位置3016上的L - P)。此外，在本實(shí)施例和下述實(shí)施例中所示 的氨基酸突變的位置指示在相關(guān)突變型氨基酸序列中的位置。
[0185] (實(shí)施例14)J6/JFH-2. I A2217S衍生的突變型HCV全基因組RNA表達(dá)載體的構(gòu)建 通過將實(shí)施例13中獲得的突變的各種組合引入質(zhì)粒pJ6/JFH-2. I A2217S內(nèi)來制備 質(zhì)粒，以便證實(shí)在實(shí)施例13中發(fā)現(xiàn)的突變是否是適應(yīng)性突變。具體地，將pJ6/JFH-2. 1 A2217S 用作模板，加入 Phusion High-Fidelity DNA Polymerase 試劑盒（FINNZYMES)附 帶的10 μ 1的10 X緩沖液和4 μ 1的2 mM dNTP混合物，以及各1 μ 1的10 μ M引 物 2219CS-S (5，-GCGTTCCACCAGTGCCACCCACGGCACGGC-3，（SEQ ID 勵(lì)：36))和 80351?-2& (5'-CCACACGGACTTGATGTGGT-3，（SEQ ID NO:37))，并且隨后加入去離子水以使總量最終 達(dá)到 49. 5 μ 1。其后，向其中加入 0· 5 μ I Phusion DNA Polymerase (FINNZYMES)，并且 執(zhí)行PCR。PCR執(zhí)行30個(gè)循環(huán)，其中每個(gè)循環(huán)由98 °C、10秒，55 °C、15秒和72 °C、30秒組 成。將所得到的PCR產(chǎn)物指定為PCR產(chǎn)物編號(hào)22。接下來，將pJ6/JFH-2. 1用作模板，加入 Phusion High-Fidelity DNA Polymerase 試劑盒（FINNZYMES)附帶的 10 μ 1 的 10 X 緩 沖液和4 μ 1的2 mM dNTP混合物，以及各1 μ 1的10 μ M引物6586S-IH(5'-CAAGACCGC CATCTGGAGGGTGGCGGCCTC-3'（SEQ ID NO :38))和 2219CS-R(5'-GGTGGCACTGGTGGAACGCAGCG ACGGGGC-3'（SEQIDN0:39))，并且隨后加入去離子水以使總量最終達(dá)到49.5μl。其后， 向其中加入 0.5 μ I Phusion DNA Polymerase (FINNZYMES)，并且執(zhí)行 PCR。PCR 執(zhí)行 25 個(gè)循環(huán)，其中每個(gè)循環(huán)由98°C、10秒，55°C、15秒和72°C、1分30秒組成。將所得到的PCR 產(chǎn)物指定為PCR產(chǎn)物編號(hào)23。
[0186] 使PCR產(chǎn)物各自純化且溶解于15 μ I H2O中。將PCR產(chǎn)物編號(hào)22和PCR產(chǎn)物編 號(hào)23的DNAs以各1 μ 1的量混合。將生成物用作模板，加入Phusion High-Fidelity DNA Polymerase試劑盒（FINNZYMES)附帶的10 μ 1的10 X緩沖液和4 μ 1的2 mMdNTP混合 物，以及各 1 μ 1 的 10 μ M 引物 6586S-IH(5'-CAAGACCGCCATCTGGAGGGTGGCGGCCTC-3'（SEQ IDN0:38))和 8035R-2a(5'-CCACACGGACTTGATGTGGT-3'（SEQIDN0:37))，并且加入去 離子水以使總量最終達(dá)到49. 5 μ 1。其后，向其中加入0· 5 μ I Phusion DNA Polymerase (FINNZYMES)，并且執(zhí)行PCR。PCR執(zhí)行25個(gè)循環(huán)，其中每個(gè)循環(huán)由98°C、10秒，55°C、15秒 和72°C、2分鐘組成。將所得到的PCR產(chǎn)物指定為PCR產(chǎn)物編號(hào)24。使PCR產(chǎn)物純化且隨 后溶解于30 μ I H2O中。
[0187] pJ6/JFH-2. I A2217S和純化的PCR產(chǎn)物編號(hào)24用限制酶財(cái)/7 I和/?/ I進(jìn)行消 化。通過瓊脂糖凝膠電泳使每種HCV cDNA片段分級(jí)分離，并且隨后純化。使這2種DNA片 段與Ligation Mix (Takara Bio Inc.)混合，并且使2種DNA片段彼此連接。將因而獲得 的具有引起在位置2217上的氨基酸置換A - S(對(duì)應(yīng)于如使用作為參考序列的SEQ ID NO : 6的氨基酸序列定義的在位置2218上的氨基酸置換A - S)和在位置2219上的C - S的核 苷酸置換的重組表達(dá)載體指定為PJ6/JFH-2. I A2217S(CS)。克隆到pJ6/JFH-2. I A2217S (CS)內(nèi)的突變型HCV全基因組序列J6/JFH-2. I A2217S (CS)的核苷酸序列顯示于SEQ ID NO :78中，并且由該核苷酸序列編碼的HCV病毒前體蛋白質(zhì)的氨基酸序列顯示于SEQ ID NO :89 中。
[0188] 接下來，將 pJ6/JFH-2· I A2217S 用作模板，加入 Phusion High-Fidelity DNA Polymerase試劑盒（FINNZYMES)附帶的10 μ 1的10 X緩沖液和4 μ 1的2 mMdNTP混合 物，以及各 1 μ 1 的 10 μ M 引物 9124S-IH(5'-TTCAGCCCTCAGAAAACTTGGGGCGCCACC-3'（SEQ IDN0:40))和3016LR-R(5，-GGAGTAGGCTAgGGAGTAACAAGCGGGGTC-3，（SEQIDN0 :41))， 并且隨后加入去離子水以使總量最終達(dá)到49. 5 μ?。其后，向其中加入0.5 μ? Phusion DNA Polymerase (FINNZYMES)，并且執(zhí)行PCR。PCR執(zhí)行25個(gè)循環(huán)，其中每個(gè)循環(huán)由98°C、 10秒，55°C、15秒和72°C、30秒組成。將所得到的PCR產(chǎn)物指定為PCR產(chǎn)物編號(hào)25。接 下來，將 PJ6/JFH-2.1 用作模板，加入 Phusion High-Fidelity DNA Polymerase 試劑盒 (FINNZYMES)附帶的10 μ 1的10 X緩沖液和4 μ 1的2 mM dNTP混合物，以及各1 μ I 的10μM引物3016LP-S(5，-TTGTTACTCCCTAGCCTACTCCTACTCTTT-3'（SEQIDN0:42))和 M13R (5'-AACAGCTATGACCATG-3，（SEQ ID NO:43))，并且隨后加入去離子水以使總量最終 達(dá)到 49. 5 μ 1。其后，向其中加入 0· 5 μ I Phusion DNA Polymerase (FINNZYMES)，并且 執(zhí)行PCR。PCR執(zhí)行25個(gè)循環(huán)，其中每個(gè)循環(huán)由98°C、10秒，55°C、15秒和72°C、1分30秒 組成。將所得到的PCR產(chǎn)物指定為PCR產(chǎn)物編號(hào)26。
[0189] 使PCR產(chǎn)物各自純化且溶解于15 μ I H2O中。將PCR產(chǎn)物編號(hào)25和PCR產(chǎn)物編 號(hào)26的DNAs以各1 μ 1的量混合。將生成物用作模板，加入Phusion High-Fidelity DNA Polymerase試劑盒（FINNZYMES)附帶的10 μ 1的10 X緩沖液和4 μ 1的2 mM dNTP混 合物，以及各 1 μ 1 的 10 μ M 引物 9124S-IH (5, -TTCAGCCCTCAGAAAACTTGGGGCGCCACC-3' (SEQIDN0:40))和M13R(5'-AACAGCTATGACCATG-3'（SEQIDN0 :43))，并且加入去離 子水以使總量最終達(dá)到49. 5 μ 1。其后，向其中加入0· 5 μ I Phusion DNA Polymerase (FINNZYMES)，并且執(zhí)行PCR。PCR執(zhí)行25個(gè)循環(huán)，其中每個(gè)循環(huán)由98°C、10秒，55°C、15秒 和72°C、2分鐘組成。將所得到的PCR產(chǎn)物指定為PCR產(chǎn)物編號(hào)27。使PCR產(chǎn)物純化且隨 后溶解于30 μ I H2O中。
[0190] pJ6/JFH-2. I A2217S和純化的PCR產(chǎn)物編號(hào)27用限制酶feoR V和油a I進(jìn)行消 化。通過瓊脂糖凝膠電泳使每種HCV cDNA片段分級(jí)分離，并且隨后純化。使這2種DNA片 段與Ligation Mix (Takara Bio Inc.)混合，并且使2種DNA片段彼此連接。將因而獲得 的具有引起在位置2217上的氨基酸置換A - S(對(duì)應(yīng)于如使用作為參考序列的SEQ ID NO : 6的氨基酸序列定義的在位置2218上的氨基酸置換A - S)和在位置3016上的L - P的核 苷酸置換的重組表達(dá)載體指定為PJ6/JFH-2. I A2217S(LP)。克隆到pJ6/JFH-2. I A2217S (LP)內(nèi)的突變型HCV全基因組序列J6/JFH-2. I A2217S (LP)的核苷酸序列顯示于SEQ ID NO :79中，并且由該核苷酸序列編碼的HCV病毒前體蛋白質(zhì)的氨基酸序列顯示于SEQ ID NO :90 中。
[0191] 接下來，將通過逆轉(zhuǎn)錄由實(shí)施例13中獲得的感染系4B的HCV RNA制備的cDNA 用作模板，加入 Phusion High-Fidelity DNA Polymerase 試劑盒（FINNZYMES)附帶的 10 μ 1的10 X緩沖液和4 μ 1的2 mM dNTP混合物，以及各1 μ 1的10 μ M引物7993S-IH (5'-CAGCTTGTCCGGGAGGGC-3'（SEQ ID NO :44))和8892R-2a(5'-AGCCATGAATTGATAGGGGA-3' (SEQ ID NO :45))，并且隨后加入去離子水以使總量最終達(dá)到49. 5 μ 1。其后，向其中加入 0· 5 μ I Phusion DNA Polymerase (FINNZYMES)，并且執(zhí)行 PCR。PCR 執(zhí)行 30 個(gè)循環(huán)，其中 每個(gè)循環(huán)由98°C、10秒，55°C、15秒和72°C、30秒組成。將所得到的PCR產(chǎn)物指定為PCR產(chǎn) 物編號(hào)28。
[0192] pJ6/JFH-2. I A2217S和純化的PCR產(chǎn)物編號(hào)28用限制酶fci/36 I和分/ I進(jìn)行 消化。通過瓊脂糖凝膠電泳使每種HCV cDNA片段分級(jí)分離，并且隨后純化。使這2種DNA 片段與Ligation Mix (Takara Bio Inc.)混合，并且使2種DNA片段彼此連接。將因而獲 得的具有引起在位置2217上的氨基酸置換A - S (對(duì)應(yīng)于如使用用作參考序列的SEQ ID NO :6的氨基酸序列定義的在位置2218上的氨基酸置換A - S)和在位置2695上的T - I 的核苷酸置換的重組表達(dá)載體指定為PJ6/JFH-2. I A2217S(TI)。克隆到pJ6/JFH-2. 1 A2217S (TI)內(nèi)的突變型HCV全基因組序列J6/JFH-2. I A2217S (TI)的核苷酸序列顯示 于SEQ ID NO :80中，并且由該核苷酸序列編碼的HCV病毒前體蛋白質(zhì)的氨基酸序列顯示于 SEQ ID NO :91 中。
[0193] 接下來，將 pJ6/JFH-2· I A2217S 用作模板，加入 Phusion High-Fidelity DNA Polymerase試劑盒（FINNZYMES)附帶的10 μ 1的10 X緩沖液和4 μ 1的2 mMdNTP混合 物，以及各 1 μ 1 的 10 μ M 引物 450S-IH (5'-TGCCGCGCAGGGGCCCCAGGTTGGGTGTGC-3,（SEQ IDN0:46))和148AT-S(5，-GAGAGCTCTGGtGACGCCGCCGAGCGGGGC-3，（SEQIDN0 :47))，并 且隨后加入去離子水以使總量最終達(dá)到49. 5 μ 1。其后，向其中加入0. 5 μ I Phusion DNA Polymerase(FINNZYMES)，并且執(zhí)行PCR。PCR執(zhí)行25個(gè)循環(huán)，其中每個(gè)循環(huán)由98°C、10秒， 55°C、15秒和72°C、30秒組成。將所得到的PCR產(chǎn)物指定為PCR產(chǎn)物編號(hào)29。接下來，將 PJ6/JFH-2.1 用作模板，加入Phusion High-Fidelity DNA Polymerase試劑盒（FINNZYMES) 附帶的10 μ 1的10 X緩沖液和4 μ 1的2 mM dNTP混合物，以及各1 μ 1的10 μ M引 物 148AT-R (5，-GGCGGCGTCaCCAGAGCTCTCGCGCATGGC-3， （SEQ ID Ν0:48))和 1440R-IH (5'-GCTCCCTGCATAGAGAAGTA-3，（SEQ ID Ν0:49))，并且隨后加入去離子水以使總量最終 達(dá)到 49. 5 μ 1。其后，向其中加入 0· 5 μ I Phusion DNA Polymerase (FINNZYMES)，并且 執(zhí)行PCR。PCR執(zhí)行30個(gè)循環(huán)，其中每個(gè)循環(huán)由98°C、10秒，55°C、15秒和72°C、1分30秒 組成。將所得到的PCR產(chǎn)物指定為PCR產(chǎn)物編號(hào)30。
[0194] 使PCR產(chǎn)物各自純化且溶解于15 μ I H2O中。將PCR產(chǎn)物編號(hào)29和PCR產(chǎn)物編 號(hào)30的DNAs以各1 μ 1的量混合。將生成物用作模板，加入Phusion High-Fidelity DNA Polymerase試劑盒（FINNZYMES)附帶的10 μ 1的10 X緩沖液和4 μ 1的2 mMdNTP混合 物，以及各 1 μ 1 的 10 μ M 引物 450S-IH (5'-TGCCGCGCAGGGGCCCCAGGTTGGGTGTGC-3,（SEQ IDN0:46))和 1440R-IH(5'-GCTCCCTGCATAGAGAAGTA-3'（SEQIDN0:49))，并且加入去 離子水以使總量最終達(dá)到49. 5 μ 1。其后，向其中加入0· 5 μ I Phusion DNA Polymerase (FINNZYMES)，并且執(zhí)行PCR。PCR執(zhí)行25個(gè)循環(huán)，其中每個(gè)循環(huán)由98°C、10秒，55°C、15秒 和72°C、2分鐘組成。將所得到的PCR產(chǎn)物指定為PCR產(chǎn)物編號(hào)31。使PCR產(chǎn)物純化且隨 后溶解于30 μ I H2O中。
[0195] pJ6/JFH-2. I A2217S和純化的PCR產(chǎn)物編號(hào)31用限制酶C/a I和fciw I進(jìn)行消 化。通過瓊脂糖凝膠電泳使每種HCV cDNA片段分級(jí)分離，并且隨后純化。使這2種DNA片 段與Ligation Mix (Takara Bio Inc.)混合，并且使2種DNA片段彼此連接。將因而獲得 的具有引起在位置2217上的氨基酸置換A - S(對(duì)應(yīng)于如使用作為參考序列的SEQ ID NO : 6的氨基酸序列定義的在位置2218上的氨基酸置換A - S)和在位置148上的A - T的核 苷酸置換的重組表達(dá)載體指定為PJ6/JFH-2. I A2217S (AT)。
[0196] 類似地，構(gòu)建重組表達(dá)載體 PJ6/JFH-2. I A2217S (CS/LP)、PJ6/JFH-2. I A2217S (CS/TI)、pJ6/JFH-2.1 A2217S (TI/LP)、pJ6/JFH-2.1 A2217S (CS/TI/LP)和 pJ6/JFH-2.1 A2217S(AT/CS/TI/LP)。此外，通過將上述氨基酸突變以各種組合引入J6/JFH-2. I A2217S 的全長氨基酸序列內(nèi)構(gòu)建這些載體。克隆到PJ6/JFH-2. I A2217S (CS/LP)、pJ6/JFH-2. 1 A2217S (CS/TI)、pJ6/JFH-2.1 A2217S (TI/LP)、pJ6/JFH-2.1 A2217S (CS/TI/LP)和 pJ6/ JFH-2. I A2217S (AT/CS/TI/LP)載體內(nèi)的突變型 HCV 全基因組序列 J6/JFH-2. I A2217S (CS/LP),J6/JFH-2. I A2217S (CS/TI),J6/JFH-2. I A2217S (TI/LP),J6/JFH-2. I A2217S (CS/TI/LP)和 J6/JFH-2.1 A2217S (AT/CS/TI/LP)的核苷酸序列分別顯示于 SEQ ID NOS : 81、82、83、84和85中。由該核苷酸序列編碼的HCV病毒前體蛋白質(zhì)的氨基酸序列分別顯示 于 SEQ ID NO :92、93、94、95 和 96 中。
[0197] 如下制備感染系4A的所有突變已引入其內(nèi)的病毒復(fù)制子。首先，將通 過逆轉(zhuǎn)錄由實(shí)施例13中獲得的感染系4A的HCV RNA制備的cDNA用作模板，力口 入 Phusion High-Fidelity DNA Polymerase 試劑盒（FINNZYMES)附帶的 10 μ 1 的 1〇\緩沖液和4 41的2禮（1階13混合物，以及各141的1〇4]\1引物20995-2& (5，-ACGGACTGTTTTAGGAAGCA-3，（SEQ ID NO :50))和3509R-2a(5，-TCTTGTCGCGCCCCGTCA-3' (SEQ ID NO :51))，并且隨后加入去離子水以使總量最終達(dá)到49. 5 μ 1。其后，向其中 加入 0.5 μ I Phusion DNA Polymerase (FINNZYMES)，并且執(zhí)行 PCR。PCR 執(zhí)行 35 個(gè) 循環(huán)，其中每個(gè)循環(huán)由98 °C、10秒，55 °C、15秒和72 °C、20秒組成。將所得到的PCR產(chǎn) 物用作模板，力口入 Phusion High-Fidelity DNA Polymerase 試劑盒（FINNZYMES)附 帶的10 μ 1的10 X緩沖液和4 μ 1的2 mM dNTP混合物，以及各1 μ 1的10 μ M 引物 2285S-2a (5, -AATTTCACTCGTGGGGATCG-3，（SEQ ID NO :52))和 3280R-IH (5'-TGACCTTCTTCTCCATCGGACTG-3，（SEQ ID N0:53))，并且隨后加入去離子水以使總量最 終達(dá)到 49. 5 μ 1。其后，向其中加入 0· 5 μ I Phusion DNA Polymerase(FINNZYMES)，并且 執(zhí)行PCR。PCR執(zhí)行30個(gè)循環(huán)，其中每個(gè)循環(huán)由98°C、10秒，55°C、15秒和72°C、20秒組成。 將所得到的PCR產(chǎn)物指定為PCR產(chǎn)物編號(hào)32。pJ6/JFH-2. I A2217S (TI)和純化的PCR產(chǎn) 物編號(hào)32用限制酶幻μ I和III進(jìn)行消化。通過瓊脂糖凝膠電泳使每種HCV cDNA片段 分級(jí)分離，并且隨后純化。使這2種DNA片段與Ligation Mix (Takara Bio Inc.)混合， 并且使2種DNA片段彼此連接。將因而獲得的具有引起在位置2217上的氨基酸置換A - S (對(duì)應(yīng)于如使用作為參考序列的SEQ ID NO :6的氨基酸序列定義的在位置2218上的氨基酸 置換A - S)、在位置2695上的T - I和在位置868上的M - T的核苷酸置換的重組表達(dá)載 體指定為 PJ6/JFH-2.1 A2217S (TI/MT)。
[0198] 接下來，將通過逆轉(zhuǎn)錄由實(shí)施例13中獲得的感染系4A的HCV RNA制備的 包含引起在位置405上的M - K突變和在位置417上的N - T突變的核苷酸置換的 cDNA 用作模板，力[]入 Phusion High-Fidelity DNA Polymerase 試劑盒（FINNZYMES) 附帶的10 μ 1的10 X緩沖液和4 μ 1的2 mM dNTP混合物，以及各1 μ 1的10 μΜ 引物 2099S-2a (5, -ACGGACTGTTTTAGGAAGCA-3'（SEQ ID NO :50))和 3509R_2a (5'-TCTTGTCGCGCCCCGTCA-3，（SEQ ID N0:51))，并且隨后加入去離子水以使總量最終 達(dá)到49.5 μ 1。其后，向其中加入 0.5 μ I Phusion DNA Polymerase (FINNZYMES)，并 且執(zhí)行PCR。PCR執(zhí)行30個(gè)循環(huán)，其中每個(gè)循環(huán)由98°C、10秒，55°C、15秒和72°C、20 秒組成。將PCR產(chǎn)物用作模板，加入Phusion High-Fidelity DNA Polymerase試劑盒 (FINNZYMES)附帶的10 μ 1的10 X緩沖液和4 μ 1的2 mM dNTP混合物，以及各1 μ 1 的 10 μ M 引物 2285S-2a (5, -AATTTCACTCGTGGGGATCG-3'（SEQ ID NO :52))和 3280R-IH (5'-TGACCTTCTTCTCCATCGGACTG-3，（SEQ ID N0:53))，并且隨后加入去離子水以使總量最 終達(dá)到 49. 5 μ 1。其后，向其中加入 0· 5 μ I Phusion DNA Polymerase (FINNZYMES)，并 且執(zhí)行PCR。PCR執(zhí)行40個(gè)循環(huán)，其中每個(gè)循環(huán)由98°C、10秒，55°C、15秒和72°C、20秒組 成。將所得到的PCR產(chǎn)物指定為PCR產(chǎn)物編號(hào)33。pJ6/JFH-2. I A2217S (TI/MT)和純化 的PCR產(chǎn)物編號(hào)33用限制酶幻奶I進(jìn)行消化。通過瓊脂糖凝膠電泳使每種HCV cDNA片段 分級(jí)分離，并且隨后純化。使這2種DNA片段與Ligation Mix (Takara Bio Inc.)混合， 并且使2種DNA片段彼此連接。將因而獲得的具有引起在位置2217上的氨基酸置換A - S (對(duì)應(yīng)于如使用作為參考序列的SEQ ID NO :6的氨基酸序列定義的在位置2218上的氨基酸 置換A - S)、在位置2695上的T - I、在位置868上的M - T、在位置405上的M - K和在 位置417上的N - T的核苷酸置換的重組表達(dá)載體指定為pJ6/JFH-2. I A2217S (TI/MT/ MK/NT)。
[0199] 接下來，將通過逆轉(zhuǎn)錄由實(shí)施例13中獲得的感染系4A的HCV RNA制備的包含引起 在位置1722上的I - V突變的核苷酸置換的cDNA用作模板，加入LA-Taq DNA Polymerase 試劑盒（Takara Bio Inc.)附帶的10 μ 1的10 X緩沖液和4 μ 1的2 mM dNTP混合物， 以及各 1 μ 1 的 10 μΜ 引物 4547S-2a (5, -AAGTGTGACGAGCTCGCGG-3'（SEQ ID NO :54)) 和 7677R-IH (5'-TATGACATGGAGCAGCACAC-3，（SEQ ID N0:55))，并且隨后加入去離子水以 使總量最終達(dá)到49.5 μ 1。其后，向其中加入0.5 μ I LA-Taq DNA Polymerase (Takara Bio Inc.)，并且執(zhí)行PCR。PCR執(zhí)行30個(gè)循環(huán)，其中每個(gè)循環(huán)由95°C、30秒，60°C、30秒和 72°C、3分鐘組成。將PCR產(chǎn)物用作模板，加入LA-Taq DNA Polymerase試劑盒（Takara Bio Inc.)附帶的10 μ 1的10 X緩沖液和4 μ 1的2 mM dNTP混合物，以及各1 μ 1的10 μΜ 引物 4607S-IH (5，-AGAGGGTTGGACGTCTCCATAATACCA-3，（SEQ ID 勵(lì)：56))和72141?-呢 (5'-CAGGCCGCGCCCAGGCCGGCAAGGCTGGTG-3，（SEQ ID N0:57))，并且隨后加入去離子水以 使總量最終達(dá)到49. 5 μ 1。其后，向其中加入0· 5 μ I LA-Taq DNA Polymerase (Takara Bio Inc.)，并且執(zhí)行PCR。PCR執(zhí)行30個(gè)循環(huán)，其中每個(gè)循環(huán)由95°C、30秒，60°C、30秒和 72°C、2分30秒組成。將所得到的PCR產(chǎn)物指定為PCR產(chǎn)物編號(hào)34。pJ6/JFH-2. I A2217S (TI/MT/MK/NT)和純化的PCR產(chǎn)物編號(hào)34用限制酶通ο I和財(cái)/7 I進(jìn)行消化。通過瓊脂糖 凝膠電泳使每種HCV cDNA片段分級(jí)分離，并且隨后純化。使這2種DNA片段與Ligation Mix (Takara Bio Inc.)混合，并且使2種DNA片段彼此連接。將因而獲得的具有引起在 位置2217上的氨基酸置換A-S (對(duì)應(yīng)于如使用作為參考序列的SEQ ID NO :6的氨基酸 序列定義的在位置2218上的氨基酸置換A - S)、在位置2695上的T - I、在位置868上的 M - T、在位置405上的M - K、在位置417上的N - T和在位置1722上的I - V的核苷酸 置換的重組表達(dá)載體指定為PJ6/JFH-2. I A2217S (TI/MT/MK/NT/IV)。
[0200] 接下來，將通過逆轉(zhuǎn)錄由實(shí)施例13中獲得的感染系4A的HCV RNA制備的包含引起 在位置2204上的S -G突變的核苷酸置換的cDNA用作模板，加入LA-Taq DNA Polymerase 試劑盒（Takara Bio Inc.)附帶的10 μ 1的10 X緩沖液和4 μ 1的2 mMdNTP混合物，以 及各 1 μ? 的 10 μΜ 引物 6499S-NS (5'-TAAGACCTGCATGAACACCTGGCAGGGGAC-3，（SEQ ID N0:58))和3'X-8077R-IH(5'-ACATGATCTGCAGAGAGACCAGTTACGG-3'（SEQIDN0 :59))，并 且隨后加入去離子水以使總量最終達(dá)到49. 5 μ 1。其后，向其中加入0. 5 μ I LA-Taq DNA Polymerase(Takara Bio Inc·)，并且執(zhí)行PCR15PCR執(zhí)行30個(gè)循環(huán)，其中每個(gè)循環(huán)由95°C、 30秒，60°C、30秒和72°C、3分鐘組成。將PCR產(chǎn)物用作模板，加入LA-Taq DNA Polymerase 試劑盒（Takara Bio Inc.)附帶的10 μ 1的10 X緩沖液和4 μ 1的2 mMdNTP混合物，以 及各1 μ? 的 10 μΜ 引物 6698S-NS (5'-ATACCATCTCCAGAGTTCTTTTCCTGGGTA-3，（SEQ ID N0:60))和3'X-75R-2a(5'-TACGGCACCTCTCTGCAGTCA-3'（SEQIDN0 :61))，并且隨后加入 去離子水以使總量最終達(dá)到49. 5 μ 1。其后，向其中加入0· 5 μ I LA-Taq DNA Polymerase (Takara Bio Inc.)，并且執(zhí)行PCR15PCR執(zhí)行30個(gè)循環(huán)，其中每個(gè)循環(huán)由95°C、30秒，60°C、 30秒和72°C、2分30秒組成。將所得到的PCR產(chǎn)物指定為PCR產(chǎn)物編號(hào)35。pJ6/JFH-2. 1 A2217S (TI/MT/MK/NT/IV)和純化的PCR產(chǎn)物編號(hào)35用限制酶財(cái)/7 I和/?/ 1進(jìn)行消化。 通過瓊脂糖凝膠電泳使每種HCV cDNA片段分級(jí)分離，并且隨后純化。使這2種DNA片段與 Ligation Mix (Takara Bio Inc.)混合，并且使2種DNA片段彼此連接。將因而獲得的具 有引起在位置2217上的氨基酸置換A -S (對(duì)應(yīng)于如使用作為參考序列的SEQ ID NO :6 的氨基酸序列定義的在位置2218上的氨基酸置換A - S)、在位置2695上的T - I、在位置 868上的M - T、在位置405上的M - K、在位置417上的N - T、在位置1722上的I - V和 在位置2204上的S - G的核苷酸置換的重組表達(dá)載體指定為pJ6/JFH-2. I A2217S (TI/ MT/MK/NT/IV/SG)。
[0201] 接下來，將通過逆轉(zhuǎn)錄由實(shí)施例13中獲得的感染系4A的HCV RNA制備的包含引起 在位置1642上的T - A突變的核苷酸置換的cDNA用作模板，加入LA-Taq DNA Polymerase 試劑盒（Takara Bio Inc.)附帶的10 μ 1的10 X緩沖液和4 μ 1的2 mMdNTP混合物，以 及各 1 μ 1 的 10 μ M 引物 4547S-2a (5,-AAGTGTGACGAGCTCGCGG-3'（SEQ ID NO :62))和 7677R-IH(5'-TATGACATGGAGCAGCACAC-3'（SEQ ID NO :63))，并且隨后加入去離子水以使總 量最終達(dá)到 49. 5 μ 1。其后，向其中加入 0· 5 μ I Phusion DNA Polymerase(FINNZYMES), 并且執(zhí)行PCR。PCR執(zhí)行30個(gè)循環(huán)，其中每個(gè)循環(huán)由95°C、30秒，60°C、30秒和72°C、3分鐘 組成。將PCR產(chǎn)物用作模板，加入LA-Taq DNA Polymerase試劑盒（Takara Bio Inc.)附 帶的10 μ 1的10 X緩沖液和4 μ 1的2 mM dNTP混合物，以及各1 μ 1的10 μ M引物 4607S-IH(5'-AGAGGGTTGGACGTCTCCATAATACCA-3'（SEQIDN0:64)^P7214R-NS(5'-CAG GCCGCGCCCAGGCCGGCMGGCTGGTG-3'（SEQ ID NO :65))，并且隨后加入去離子水以使總量最終 達(dá)到 49. 5 μ 1。其后，向其中加入 0· 5 μ I LA-Taq DNA Polymerase (Takara Bio Inc.)， 并且執(zhí)行PCR。PCR執(zhí)行30個(gè)循環(huán)，其中每個(gè)循環(huán)由95°C、30秒，60°C、30秒和72°C、2分30 秒組成。將所得到的PCR產(chǎn)物指定為PCR產(chǎn)物編號(hào)36。pJ6/JFH-2. I A2217S (TI/MT/MK/ NT/IV/SG)和純化的PCR產(chǎn)物編號(hào)36用限制酶通〇 I進(jìn)行消化。通過瓊脂糖凝膠電泳使每 種HCV cDNA片段分級(jí)分離，并且隨后純化。使這2種DNA片段與Ligation Mix (Takara Bio Inc.)混合，并且使2種DNA片段彼此連接。將因而獲得的具有引起在位置2217上的 氨基酸置換A - S (對(duì)應(yīng)于如使用作為參考序列的SEQ ID NO :6的氨基酸序列定義的在位 置2218上的氨基酸置換A - S)、在位置2695上的T - I、在位置868上的M - T、在位置 405上的M - K、在位置417上的N - T、在位置1722上的I - V、在位置2204上的S - G 和在位置1642上的T - A的核苷酸置換的重組表達(dá)載體指定為pJ6/JFH-2. I A2217S(TI/ MT/MK/NT/IV/SG/TA)。克隆到 pJ6/JFH-2.1 A2217S (TI/MT/MK/NT/IV/SG/TA)內(nèi)的突變型 HCV全基因組序列J6/JFH-2. I A2217S (TI/MT/MK/NT/IV/SG/TA)的核苷酸序列顯示于SEQ ID NO :86中，并且由該核苷酸序列編碼的HCV病毒前體蛋白質(zhì)的氨基酸序列顯示于SEQ ID NO :97中。因此，在感染系4A中發(fā)現(xiàn)的所有氨基酸突變都引入由J6/JFH-2. I A2217S(TI/ MT/MK/NT/IV/SG/TA)編碼的突變型前體蛋白質(zhì)內(nèi)。
[0202] 如下制備感染系4B的所有突變已引入其內(nèi)的病毒。首先，將通過逆轉(zhuǎn)錄由實(shí) 施例13中獲得的感染系4B的HCV RNA制備的包含在位置356上的M - V和在位置626 上的V -G突變的cDNA用作模板，加入LA-Taq DNA Polymerase試劑盒（Takara Bio Inc.)附帶的10 μ 1的10 X緩沖液和4 μ 1的2 mM dNTP混合物，以及各1 μ 1的 10 μΜ 引物 44S-IH (5, -CTGTGAGGAACTACTGTCTT-3，（SEQ ID NO:66))和 3189R-IH (5'-CCAGTCCACCTGCCAAGG-3，（SEQ ID NO:67))，并且隨后加入去離子水以使總量最終達(dá) 到 49.5 μ 1。其后，向其中加入 0.5 μ I LA-Taq DNA Polymerase (Takara Bio Inc.)， 并且執(zhí)行PCR。PCR執(zhí)行30個(gè)循環(huán)，其中每個(gè)循環(huán)由95 °C、30秒，60°C、30秒和72 °C、 3分鐘組成。將PCR產(chǎn)物用作模板，加入LA-Taq DNA Polymerase試劑盒（Takara Bio Inc.)附帶的10 μ 1的10 X緩沖液和4 μ 1的2 mM dNTP混合物，以及各1 μ 1的 10 μ M 引物 63S-Con. 1 (5, -TTCACGCAGAAAGCGTCTAG-3'（SEQ ID NO :68))和 2445R-2a (5'-TCCACGATGTTTTGGTGGAG-3，（SEQ ID N0:69))，并且隨后加入去離子水以使總量最終 達(dá)到 49. 5 μ 1。其后，向其中加入 0· 5 μ I LA-Taq DNA Polymerase (Takara Bio Inc.)， 并且執(zhí)行PCR。PCR執(zhí)行30個(gè)循環(huán)，其中每個(gè)循環(huán)由95°C、30秒，60°C、30秒和72°C、2分 30秒組成。將所得到的PCR產(chǎn)物指定為PCR產(chǎn)物編號(hào)37。pJ6/JFH-2. I A2217S (AT/CS/ TI/LP)和純化的PCR產(chǎn)物編號(hào)37用限制酶fciw I和5於I進(jìn)行消化。通過瓊脂糖凝膠 電泳使每種HCV cDNA片段分級(jí)分離，并且隨后純化。使這2種DNA片段與Ligation Mix (Takara Bio Inc.)混合，并且使2種DNA片段彼此連接。將因而獲得的具有引起在位置 2217上的氨基酸置換A - S (對(duì)應(yīng)于如使用作為參考序列的SEQ ID NO :6的氨基酸序列定 義的在位置2218上的氨基酸置換A - S)、在位置148上的A - T、在位置2219上的C - S、 在位置2695上的T - I、在位置3016上的L - P、在位置356上的M - V和在位置626上 的V - G)的核苷酸置換的重組表達(dá)載體指定為pJ6/JFH-2. I A2217S (AT/CS/TI/LP/MV/ VG)。
[0203] 接下來，將通過逆轉(zhuǎn)錄由實(shí)施例13中獲得的感染系4B的HCV RNA制備的包含引起 在位置1687上的I - V突變和在位置1767上的K - R突變的核苷酸置換的cDNA用作模板， 加入Phusion DNA Polymerase試劑盒（FINNZYMES)附帶的 10 μ 1 的 10 X 緩沖液和 4 μ 1 的 2 mM dNTP 混合物，以及各 1 μ 1 的 10 μ M 引物 4593S-2a( 5 ' -CTGTGGCATACTACAGAGG-3 ' (SEQIDN0:70))和 5970R-2a(5，-TTCTCGCCAGACATGATCTT-3'（SEQIDN0:71))，并且 隨后加入去離子水以使總量最終達(dá)到49. 5 μ?。其后，向其中加入0.5 μ? LA-Taq DNA Polymerase(Takara Bio Inc·)，并且執(zhí)行PCR15PCR執(zhí)行35個(gè)循環(huán)，其中每個(gè)循環(huán)由98°C、 10秒，55°C、15秒和72°C、20秒組成。將PCR產(chǎn)物用作模板，加入Phusion High-Fidelity DNA Polymerase 試劑盒（FINNZYMES)附帶的 10 μ 1 的 10 X 緩沖液和 4 μ 1 的 2 mM dNTP 混合物，以及各1 μ 1 的10 μΜ引物4607S-IH(5'-AGAGGGTTGGACGTCTCCATAATACCA-3'（SEQ IDN0:72))和5970R-2a(5'-TTCTCGCCAGACATGATCTT-3'（SEQIDN0 :73))，并且隨后加入去 離子水以使總量最終達(dá)到49. 5 μ 1。其后，向其中加入0· 5 μ I Phusion DNA Polymerase (FINNZYMES)，并且執(zhí)行PCR。PCR執(zhí)行30個(gè)循環(huán)，其中每個(gè)循環(huán)由98°C、10秒，55°C、15秒和 72°C、20秒組成。將所得到的PCR產(chǎn)物插入pGEM-T Easy載體內(nèi)。隨后將質(zhì)粒用作模板，加入 LA-Taq DNA Polymerase試劑盒（Takara Bio Inc.)附帶的10 μ 1 的10 X 緩沖液和4 μ 1 的 2 mM dNTP 混合物，以及各 1 μ 1 的 10 μ M 引物 4547S-2a( 5 ' -AAGTGTGACGAGCTCGCGG-3 ' (SEQIDN0:74))和 7677R-IH(5，-TATGACATGGAGCAGCACAC-3，（SEQIDN0:75))，并且 隨后加入去離子水以使總量最終達(dá)到49. 5 μ?。其后，向其中加入0.5 μ? LA-Taq DNA Polymerase(Takara Bio Inc.)，并且執(zhí)行PCR。PCR執(zhí)行30個(gè)循環(huán)，其中每個(gè)循環(huán)由98°C、 30秒，60°C、30秒和72°C、3分鐘組成。將PCR產(chǎn)物用作模板，加入LA-Taq DNA Polymerase 試劑盒（Takara Bio Inc.)附帶的10 μ 1的10 X緩沖液和4 μ 1的2 mM dNTP混合物， 以及各lμl的10μM引物 4607S-IH(5'-AGAGGGTTGGACGTCTCCATAATACCA-3'（SEQID N0:76))和7214R-NS(5'-CAGGCCGCGCCCAGGCCGGCAAGGCTGGTG-3'（SEQIDN0 :77))，并且 隨后加入去離子水以使總量最終達(dá)到49. 5 μ?。其后，向其中加入0.5 μ? LA-Taq DNA Polymerase(Takara Bio Inc·)，并且執(zhí)行PCR15PCR執(zhí)行30個(gè)循環(huán)，其中每個(gè)循環(huán)由95°C、 30秒，60°C、30秒和72°C、2分30秒組成。將因而獲得的PCR產(chǎn)物指定為PCR產(chǎn)物編號(hào)38。 PJ6/JFH-2.1 A2217S (AT/CS/TI/LP/MV/VG)和純化的 PCR 產(chǎn)物編號(hào) 39 用限制酶通ο I 進(jìn) 行消化。通過瓊脂糖凝膠電泳使每種HCV cDNA片段分級(jí)分離，并且隨后純化。使這2種 DNA片段與Ligation Mix (Takara Bio Inc.)混合，并且使2種DNA片段彼此連接。將因 而獲得的具有引起在位置2217上的氨基酸置換A - S (對(duì)應(yīng)于如使用作為參考序列的SEQ ID NO :6的氨基酸序列定義的在位置2218上的氨基酸置換A - S)、在位置148上的A - T、 在位置2219上的C - S、在位置2695上的T - I、在位置3016上的L - P、在位置356上 的M - V、在位置626上的V - G、在位置329上的T - S、在位置1687上的I - V和在位置 1767上的K - R的核苷酸置換的重組表達(dá)載體指定為pJ6/JFH-2. I A2217S(AT/CS/TI/LP/ MV/VG/IV/KR)。克隆到 pJ6/JFH-2. I A2217S(AT/CS/TI/LP/MV/VG/IV/KR)內(nèi)的突變型 HCV 全基因組序列J6/JFH-2. I A2217S (AT/CS/TI/LP/MV/VG/IV/KR)的核苷酸序列顯示于SEQ ID NO :87中，并且由該核苷酸序列編碼的HCV病毒前體蛋白質(zhì)的氨基酸序列顯示于SEQ ID N0:98中。因此，在感染系4B中發(fā)現(xiàn)的所有氨基酸突變都引入由J6/JFH-2. I A2217S(AT/ CS/TI/LP/MV/VG/IV/KR)編碼的突變型前體蛋白質(zhì)內(nèi)。
[0204] (實(shí)施例15)關(guān)于得自JFH-2. I A2218S RNA復(fù)制細(xì)胞的傳代培養(yǎng)的核苷酸序列的 突變分析 以0. 03的moi (感染復(fù)數(shù)）用Huh-7細(xì)胞（JFH-2. I A2218S HCV RNA已引入其內(nèi)的 Huh-7細(xì)胞，其包含在實(shí)施例8中獲得的具有高感染效價(jià)的JFH-2. I A2218S HCV顆粒）的 培養(yǎng)上清液感染新鮮的未感染的Huh-7細(xì)胞。對(duì)受感染細(xì)胞進(jìn)行傳代培養(yǎng)，直至培養(yǎng)上清 液中核心蛋白質(zhì)的量和感染效價(jià)分別達(dá)到1，〇〇〇 fm〇l/L和1,000 ffu/ml或更多。用包 含病毒的培養(yǎng)上清液的感染并使受感染細(xì)胞的傳代培養(yǎng)重復(fù)3 - 4次，并且隨后對(duì)于培養(yǎng) 上清液中包含的HCV RNA進(jìn)行序列分析。采用2個(gè)感染系，并且將其分別指定為D3和D4。 首先，從感染系D3和D4的包含JFH-2. I A2218S HCV顆粒的Huh-7細(xì)胞的每種培養(yǎng)上清液 中提取RNA，并且隨后通過RT-PCR擴(kuò)增其中包含的HCV RNA。將隨機(jī)引物（6聚體，Takara Bio Inc.)用于擴(kuò)增。將擴(kuò)增產(chǎn)物克隆到測序克隆載體內(nèi)，并且隨后通過常規(guī)方法實(shí)施序列 分析。
[0205] 作為結(jié)果，在感染系D3的情況下，發(fā)現(xiàn)引起在7個(gè)位置上的氨基酸置換的核苷酸 置換：在處于結(jié)構(gòu)區(qū)中的E2區(qū)中的1個(gè)位置(在位置414上的I - T);以及在處于非結(jié)構(gòu)區(qū) 中的NS3區(qū)中的2個(gè)位置(在位置1510上的E - Q和在位置1617上的R - Q)、NS5A區(qū)中的 3個(gè)位置(在位置2006上的K - Q、在位置2233上的A - V和在位置2234上的N - S);和 NS5B區(qū)中的1個(gè)位置(在位置2695上的T - I)。此外，在感染系D4的情況下，發(fā)現(xiàn)引起在 9個(gè)位置上的氨基酸置換的核苷酸置換：在處于結(jié)構(gòu)區(qū)中的E2區(qū)中的1個(gè)位置(在位置387 上的V - G);以及在處于非結(jié)構(gòu)區(qū)中的NS2區(qū)中的1個(gè)位置(在位置828上的V - A)、NS3 區(qū)中的2個(gè)位置(在位置1225上的R - Q和在位置1283上的R - G)、NS4B區(qū)中的1個(gè)位 置(在位置1883上的V - A)、NS5A區(qū)中的3個(gè)位置(在位置2206上的S - A、在位置2279 上的K - N和在位置2441上的C - R)、和NS5B區(qū)中的2個(gè)位置(在位置2695上的T - I)。
[0206] (實(shí)施例16)突變型J6/JFH-2. I A2217S HCV RNA已引入其內(nèi)的細(xì)胞的HCV顆粒 生產(chǎn)能力的評(píng)估 使用實(shí)施例 14 中構(gòu)建的表達(dá)載體 pJ6/JFH-2. I A2217S、pJ6/JFH-2. I A2217S (CS)、 PJ6/JFH-2.1 A2217S (LP)、pJ6/JFH-2.1 A2217S (TI)、pJ6/JFH-2.1 A2217S (AT)、pJ6/ JFH-2.1 A2217S (CS/LP)、pJ6/JFH-2.1 A2217S (CS/TI)、pJ6/JFH-2.1 A2217S (TI/LP)、 PJ6/JFH-2. I A2217S (CS/TI/LP)、pJ6/JFH-2. I A2217S (AT/CS/TI/LP)、pJ6/JFH-2. I A2217S (TI/MT/MK/NT/IV/SG/TA)和 pJ6/JFH-2.1 A2217S (AT/CS/TI/LP/MV/VG/IV/KR)， 通過類似于實(shí)施例2中那些的技術(shù)制備HCV全基因組RNA (突變型HCV全基因組RNA)。將 因而獲得的HCV全基因組RNAs各自通過電穿孔引入Huh7細(xì)胞內(nèi)。其后，在培養(yǎng)基(含10% 胎牛血清的Dulbecco改良Eagle培養(yǎng)基（DMEM))中傳代培養(yǎng)細(xì)胞時(shí)，使用HCV抗原ELISA 測試試劑盒（Ortho Clinical Diagnostics)隨著時(shí)間過去定量培養(yǎng)上清液中包含的HCV核 心蛋白質(zhì)，以證實(shí)HCV顆粒的產(chǎn)生（圖12)。
[0207] 作為結(jié)果，證實(shí)當(dāng)將在7或8個(gè)位置上的上述氨基酸突變獨(dú)立地引入J6/JFH-2. 1 A2217S基因組序列內(nèi)時(shí)，RNA在RNA引入其內(nèi)的細(xì)胞中有效自我復(fù)制，并且病毒在復(fù)制起始 后的短時(shí)間段內(nèi)分泌到培養(yǎng)上清液內(nèi)。
[0208] 產(chǎn)業(yè)應(yīng)用性 使用從暴發(fā)性丙型肝炎患者中分離的基因型2a的HCV基因組制備的根據(jù)本發(fā)明的HCV 復(fù)制子、HCV復(fù)制子引入其內(nèi)的復(fù)制子復(fù)制細(xì)胞、使用HCV復(fù)制子用于在培養(yǎng)細(xì)胞系統(tǒng)中產(chǎn) 生感染性HCV顆粒的方法、和通過該方法獲得的感染性HCV顆粒作為用于評(píng)估抑制HCV復(fù) 制和HCV感染的分子的系統(tǒng)是有用的。本發(fā)明可以提供具有顯著高于迄今獲得的HCV亞基 因組復(fù)制子RNA的自我復(fù)制能力的HCV亞基因組復(fù)制子RNA和全基因組復(fù)制子RNA。這些 復(fù)制子RNAs可以特別方便地用于篩選抑制HCV復(fù)制的抗HCV藥劑或用于闡明HCV復(fù)制機(jī)制 的研究。此外，本發(fā)明的HCV全基因組復(fù)制子RNA具有高于迄今獲得的HCV全基因組復(fù)制 子RNA的HCV顆粒生產(chǎn)能力，從而使得它可以用于構(gòu)建用于以高水平有效產(chǎn)生HCV顆粒的 系統(tǒng)，具有感染性的HCV顆粒可以由該系統(tǒng)在體外大量制備。此外，根據(jù)本發(fā)明的HCV復(fù)制 子和感染性HCV顆粒對(duì)于用作HCV疫苗或抗原用于制備抗HCV抗體也是有用的。使用根據(jù) 本發(fā)明的多突變型復(fù)制子用于產(chǎn)生HCV病毒顆粒的方法對(duì)于在短時(shí)間段內(nèi)在體外產(chǎn)生HCV 病毒顆粒也是非常有用的。
[0209] 序列表單獨(dú)文本（free text) SEQ ID NOS :1、2、11-13 和 16-87 是合成 DNAs。
[0210] SEQ ID NOS :88-98 是合成多肽。
【權(quán)利要求】
1. 核酸，其包括在SEQ ID NO :12所示的核苷酸序列中引起氨基酸置換的核苷酸置換， 并且其中所述氨基酸置換是： 土）]?4051(、財(cái)171'、]\18681'、1'14624、11722￥、522046和126951，如使用作為參考序列的5￡0 ID NO :88中所示的氨基酸序列定義的；或 ii) A148T、M356V、V626G、I1687V、K1767R、C2219S、T2695I 和 L3016P，如使用作為參考 序列的SEQ ID NO :88中所不的氣基酸序列定義的。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1的核酸，其編碼SEQ ID NO :97或98中所示的氨基酸序列。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1的核酸，其包含SEQ ID NO :86或87中所示的核苷酸序列。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1-3中任一項(xiàng)的核酸，其為全基因組復(fù)制子RNA。
5. 表達(dá)載體，其中根據(jù)權(quán)利要求1-3中任一項(xiàng)的核酸在啟動(dòng)子下游可操作地連接。
6. 轉(zhuǎn)化細(xì)胞，其通過向細(xì)胞中引入根據(jù)權(quán)利要求4的全基因組復(fù)制子RNA獲得。
7. 轉(zhuǎn)化細(xì)胞，其通過向細(xì)胞中引入根據(jù)權(quán)利要求5的表達(dá)載體獲得。
8. 丙型肝炎病毒顆粒，其通過培養(yǎng)根據(jù)權(quán)利要求6的轉(zhuǎn)化細(xì)胞獲得。
9. 丙型肝炎病毒顆粒，其通過培養(yǎng)根據(jù)權(quán)利要求7的轉(zhuǎn)化細(xì)胞獲得。
【文檔編號(hào)】C12N5/10GK104313038SQ201410405909
【公開日】2015年1月28日 申請(qǐng)日期:2009年12月25日 優(yōu)先權(quán)日:2008年12月26日
【發(fā)明者】脅田隆字, 伊達(dá)朋子, 高橋仁 申請(qǐng)人:東麗株式會(huì)社, 日本國立感染癥研究所, 公益財(cái)團(tuán)法人東京都醫(yī)學(xué)綜合研究所