一株擬暗球腔菌及其應用的制作方法
【專利摘要】本發明公開了一株擬暗球腔菌及其應用。所述擬暗球腔菌命名為擬暗球腔菌(Phaeosphaeriopsis sp.)LTC-9，保藏編號為CCTCC No.M 2014163。所述應用是該擬暗球腔菌在提高水稻或小麥耐鹽性中的應用。本發明首次發現擬暗球腔菌(Phaeosphaeriopsis sp.)LTC-9可以提高水稻和小麥對鹽脅迫的抵御能力，將LTC-9菌株與水稻苗建立共培養體系后，LTC-9菌株能顯著促進水稻苗在加鹽MS平板上的生長；將LTC-9菌株在營養液水培和土壤盆栽條件下與小麥苗建立共培養體系后，LTC-9菌株能顯著減緩或延遲鹽堿地中小麥的鹽害癥狀，同時大大增加了小麥的生物量累積。CCTCC No. M20141632014.04.25
【專利說明】一株擬暗球腔菌及其應用

【技術領域】
[0001] 本發明屬于微生物種質資源利用領域，具體涉及一株擬暗球腔菌及其應用。

【背景技術】
[0002] 鹽堿地土壤可分為鹽土和堿土，其中鹽土分布面積最大，對于大多數作物都有顯 著的減產影響。鹽堿土又稱鹽漬土，是指土壤含鹽量在〇. 2%以上，或者土壤膠體吸附一定 數量的交換性鈉，堿化度在20%以上，有害于作物正常生長的土壤。由于工業污染的增加， 灌溉農業的不合理發展和農藥化肥的濫用等，我國的次生鹽漬化土壤面積還在持續增加。 土壤鹽漬化是世界范圍內影響作物產量的主要非生物脅迫因子之一，嚴重影響作物產量。 大量鹽堿地和鹽漬化土壤的存在，使得相當大一部分農作物因受鹽害的影響而造成了 40% 以上的減產。
[0003]鹽脅迫是指土壤中鹽分含量過高，危害植物的正常生長。鹽脅迫從三個方面對 植物產生不良影響：一是滲透脅迫，對植物芽的生長產生抑制；二是離子毒害，抑制植物生 長，加速成熟葉片的衰老；三是營養虧缺，使作物不能有效吸收利用土壤中的養分。有學者 研究表明，在整個鹽脅迫時期，營養虧缺始終伴隨著滲透脅迫和離子毒害的存在。
[0004] 目前國內外鹽堿地的改良方法主要有水利工程措施、農業改良措施、生物改良措 施以及化學改良措施等。水利工程措施主要是指大水洗鹽；農業改良措施主要包括鋪沙蓋 土、客土換土、深挖埋綠肥、深耕翻土等；化學改良措施主要是添加土壤改良劑，目前常用的 主要有石膏、石灰石、磷石膏等；生物改良措施主要是種植耐鹽堿的植物如向日葵，甜菜、玉 米、大麥、大豆、棉花、高粱等，使鹽堿地在利用過程中得到改良。
[0005] 這些措施取得了一定的效果，但是往往花費巨大，需要很多時間比較長。此外，選 擇耐鹽品種也是利用鹽漬化土壤的重要途徑。
[0006] 水稻和小麥是世界上主要的糧食作物，世界上以這兩種作物為主食的人口超過了 70%。水稻和小麥對鹽分都比較敏感，土壤鹽堿化是鹽堿土區水稻和小麥生產穩定發展的 主要限制因素。目前，提高水稻和小麥的耐鹽性研究主要集中在耐鹽性品種的選育上，而目 前多數高產品種難以在鹽漬土壤中形成良好的經濟產量。
[0007] 近些年研究發現一些與植物互惠共生的真菌對提高植物的耐鹽性具有較好的效 果，不僅可以改善土壤狀況還可以增強植物的生長。因此，通過微生物與植物的共生來增強 植物的耐鹽性具有良好的應用前景。利用內生真菌提高大豆抗鹽性的研究也已經有了研究 報道，但內生真菌在提高水稻和小麥的耐鹽、抗鹽性上還沒有發表研究報告。


【發明內容】

[0008] 本發明提供了一株擬暗球腔菌，該菌株能夠提高水稻和小麥對鹽脅迫的耐受能 力。
[0009]-株擬暗球腔菌，分類命名為擬暗球腔菌（Phaeosphaeriopsissp.)，株號為LTC-9,已于2014年4月25日保藏于位于中國武漢武漢大學的中國典型培養物保藏中心， 保藏編號為CCTCCNO.M2014163。
[0010] 本發明的擬暗球腔菌（Phaeosphaeriopsissp. )LTC-9具有如下形態特征：該菌 株在PDA平板上生長緩慢，25°C黑暗條件下培養7天，菌落直徑平均2. 6cm;初期菌落呈淺 黃色，后期逐漸呈暗黃色至棕色，菌落致密，氣生菌絲不發達，菌絲具隔膜，淡黃色，分生孢 子器、分生孢子未見。
[0011] 本發明還提供了一種含有所述擬暗球腔菌的菌劑。由于所述擬暗球腔菌不產孢， 因此所述菌劑采用所述擬暗球腔菌的菌絲制成。菌劑的劑型可以根據需要制成固體劑型或 液體劑型，若為液體劑型，作為優選，所述擬暗球腔菌菌絲的濃度為1?3g/L。根據使用場 合的差異，所述液體劑型可采用水（有土栽培）或Hoagland's營養液（無土栽培）配制。
[0012] 試驗表明，在鹽脅迫下，水培營養液或土壤中接種LTC-9菌株的小麥幼苗出現失 綠發黃、萎焉干枯等鹽害癥狀比對照組推遲、癥狀較輕、長勢更旺盛，說明LTC-9菌株可以 增強小麥幼苗對鹽脅迫的抵御能力。表現為IOOmMNaCl脅迫14天（營養液水培條件下）， 共培養有LTC-9菌株的小麥苗在株高、鮮重、干重上比對照組分別提高了 7. 8%、16. 7%、 14. 6 % ;250mMNaCl脅迫14天（土壤盆栽條件下），共培養有LTC-9菌株的小麥苗在株高、 鮮重和干重上比對照組分別增加了 41. 6%、17. 9%、10. 0%。
[0013] 因此，本發明還提供了所述擬暗球腔菌在提高小麥耐鹽性中的應用。所述應用包 括：在鹽堿地土壤中拌入所述擬暗球腔菌，然后將萌發的小麥種子播種于鹽堿地中；
[0014] 小麥種子在發芽生長過程中，所述擬暗球腔菌即自然地與小麥種子建立起了共生 關系。
[0015] 或者，所述應用包括：將小麥幼苗與所述擬暗球腔菌建立共培養體系，然后將共培 養體系轉移至鹽堿地中生長。
[0016] 小麥幼苗與LTC-9菌株的共培養體系可以在MS培養基平板上建立，也可以在水培 營養液中建立。在MS培養基平板上建立即是將小麥幼苗移栽至MS培養基平板上，然后挑 取LTC-9菌株的菌絲接種在小麥幼苗的根部附近，使LTC-9菌株與小麥幼苗共培養；在水培 營養液中建立即是將小麥幼苗轉移至含有LTC-9菌株的水培營養液中，進行共培養。共培 養完成后，將共生有LTC-9菌株的小麥幼苗轉移至鹽堿地中即可。
[0017] 由于小麥難以忍受長期的水?勞環境，因此在建立共培養體系時，優選在MS培養基 平板上建立共培養體系，然后再轉移至鹽堿地中。實際應用中，更優選為直接在鹽堿地土壤 中拌入所述莖點霉屬內生真菌，然后將萌發的小麥種子播種于鹽堿地中。
[0018] 試驗表明，LTC-9菌株在加鹽MS平板上可以穩定促進水稻幼苗生長，除在株高上 與對照有顯著差異外，共培養有LTC-9菌株的加鹽MS平板上，水稻幼苗的莖桿也顯著加 粗，葉片也相對較寬，表現出更好地生長態勢；表現為在200mMNaCl的鹽脅迫下，共培養有 LTC-9菌株的水稻苗在株高、鮮重和干重上比對照組平均提高了 8%、11. 1%和15. 3% ;說 明LTC-9菌株可以顯著增強水稻幼苗對鹽脅迫的抵御能力。
[0019] 因此，本發明還提供了所述擬暗球腔菌在提高水稻耐鹽性中的應用。所述應用包 括：將水稻幼苗與所述擬暗球腔菌建立共培養體系，然后將共培養體系轉移至鹽堿地中生 長。
[0020] 水稻幼苗與LTC-9菌株的共培養體系也可以在MS培養基平板上建立，也可以在水 培營養液中建立，建立方法與小麥相同。共培養完成后，將共生有LTC-9菌株的水稻幼苗轉 移至鹽堿地中即可。
[0021] 或者，所述應用包括：在育苗圃土壤中拌入所述擬暗球腔菌，然后將水稻種子播種 于育苗圃中，并在移栽期將育苗圃中長出的水稻幼苗移栽至鹽堿地中。
[0022] 上述兩種方法均適用于水稻的實際生產當中，但出于節約成本考慮，更優選為第 二種應用方式。
[0023] 與現有技術相比，本發明的有益效果為：
[0024] 本發明首次發現擬暗球腔菌（Phaeosphaeriopsissp. )LTC_9可以提高水稻和小 麥對鹽脅迫的抵御能力，試驗表明，將LTC-9菌株與水稻苗建立共培養體系后，LTC-9菌株 能顯著促進水稻苗在加鹽MS平板上的生長；將LTC-9菌株在營養液水培和土壤盆栽條件下 與小麥苗建立共培養體系后，LTC-9菌株能顯著減緩或延遲鹽堿地中小麥的鹽害癥狀，同時 大大增加了小麥的生物量累積。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0025] 圖Ia為菌株LTC-9在PDA平板上的生長狀態圖（正面）；
[0026] 圖Ib為菌株LTC-9在PDA平板上的生長狀態圖（反面）；
[0027] 圖2為實施例1中SE組和SC組的水稻苗在含有200mMNaCl的MS平板上生長兩 周的生長狀態對比圖；
[0028] 圖3為實施例2中SE組和SC組的水稻苗在含有100mM、150mM、200mMNaCl的水 培營養液中生長3天、6天、12天的生長狀態對比圖；
[0029] 圖4為實施例3的盆栽試驗中土壤的處理示意圖；
[0030] 圖5為實施例3中SE組和SC組的水稻苗在含有200mM、250mMNaCl的土壤中生長 7天、14天的生長狀態對比圖。

【具體實施方式】
[0031] 下面結合附圖和【具體實施方式】對本發明作進一步詳細說明。
[0032] 實施例1菌株LTC-9的分離純化和鑒定
[0033] I. 1培養基配制
[0034] 馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養基（potatodextroseagar,PDA):在馬鈴薯（去皮）200g、 葡萄糖20g、瓊脂20g中加蒸餾水定容至IOOOmL;然后進行常規的高溫滅菌（I. 1個大氣壓， 121°C下滅菌 20min)。
[0035]1. 2菌株LTC-9的分離純化
[0036] 本發明的Phaeosphaeriopsissp.LTC-9是按下列分離培養條件在實驗室中獲得 的，包括：
[0037] 在我國新疆阿克蘇地區鹽堿地中采集駱駝刺植物樣本，將植物樣本進行保鮮處理 后帶回實驗室中，用自來水將植物樣本沖洗干凈，去除表面的泥土及附屬物；在室溫條件下 晾干后置于超凈臺上，用剪刀或者解剖刀截取大小為2-3cm的組織小段；根據下列步驟對 組織小段進行表面消毒：經75%乙醇漂洗30s、無菌水沖洗3次、有效氯含量為1%次氯酸 鈉漂洗5-8min、無菌水沖洗3-5次；將消毒后的組織小段用無菌刀片切成0. 5cm長的組織 小塊后縱切；將縱切后的各組織小塊分別置于含有硫酸鏈霉素（lOOU/mL)和氨節青霉素 (100U/mL)的PDA平板上，每皿6塊，3次重復，于28°C恒溫培養3-7d。
[0038] 分離的過程必須嚴格按照無菌操作的要求，分離的樣品每天觀察一次，連續觀察 一周。若發現有菌絲長出，及時用接種針或者滅過菌的牙簽小心的將菌絲邊緣連同少量培 養基一起挑出，轉接到新的PDA平板上，純化2-3次直至為單一菌落。
[0039] L3菌株LTC-9的鑒定
[0040] I. 3. 1形態鑒定
[0041] LTC-9經過分離純化后，接種到PDA培養基上，22°C培養7天。用挑針挑取少量菌 體，制成玻片，在顯微鏡下觀察，其形態特征為：
[0042] 該菌株在PDA平板上生長緩慢，25°C黑暗條件下培養7天，菌落直徑平均2. 6cm; 初期菌落成淺黃色，后期逐漸呈暗黃色至棕色，菌落致密，氣生菌絲不發達（圖Ia和圖lb)， 菌絲具隔膜，淡黃色，分生孢子器、分生孢子未見。
[0043] 1.3.2分子鑒定
[0044] 1. 3. 2. 1真菌基因組DNA的小量提取
[0045] 基因組DNA的提取方法如下：
[0046] ①利用無菌牙簽挑取內生真菌菌絲10?20mg置于I. 5mL無菌離心管中，加入 500μL提取緩沖液（1MKCl，100mMTris-HCl，IOmMEDTA，pH= 8.0)，放入少許石英砂（或 2粒磁珠），研磨儀研磨Imin(至菌絲粉碎）；
[0047] ②12000rpm離心lOmin，吸取上清至另一離心管中，棄沉淀；
[0048] ③加入等體積異丙醇；輕輕顛倒混勻后室溫靜置IOmin;
[0049] ④12000rpm離心lOmin，棄上清，將離心管倒置于吸水紙上干燥；
[0050] ?干燥后加入70%酒精80(^1^，12000印111離心21^11，輕輕倒去上清液；
[0051] ⑥在吸水紙上排干水分，37°C干燥15min，使乙醇充分揮發；
[0052] ⑦用50μLCldH2O或IXTEbuffer重懸沉淀，DNA樣品可置于4°C冰箱過夜。
[0053] L3. 2. 2.真菌ITSrDNA基因的PCR擴增
[0054] ①PCR擴增引物：
[0055] ITSl:5'-TCCGTAGGTGAACCTGCGC-3'
[0056] ITS4 :5'-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3' ；
[0057] ②PCR反應體系（50μL):
[0058] IOxPCRbuffer (with Mg2 ) 5μΙ. dNTP (25 mM) 0.5μ? ITSl(H^M) 2μL ITS4(l〇nM) 2μL DNA模板 2μ? Taq polymerase ().5μ? ddH20 38μ?；
[0059] ③PCR反應程序：
[0060] 94 °C 3min 94 0C 40s~ 570C 40s 35cycle 72 0C 40s_ 72 0CIOmin〇
[0061]I. 3. 2. 3PCR產物的回收純化：
[0062] PCR反應結束后，PCR產物經I%的瓊脂糖凝膠電泳檢測后，采用愛思進生物技術 公司的DNA凝膠純化試劑盒，按照試劑盒說明書的步驟進行，包括：
[0063] ①將50μLPCR產物全部加到1 %的瓊脂糖凝膠的點樣孔中，按5V/CM的電泳條件 電泳30min。
[0064] ②電泳結束后，在紫外燈下用刀片切取含目的DNA片段的凝膠，置于2mL離心管 中,稱重。
[0065] ③按照Img凝膠加入3mL的DE-A緩沖液的標準，加入DE-A緩沖液到收集凝膠的 2mL離心管中，75°C保溫lOmin，期間振蕩數次，至完全融化。
[0066] ④加入0· 5倍DE-A體積的DE-B緩沖液，混合均勻。
[0067] ⑤將DNA制備管放入2mL離心管中，將混合液轉移到DNA制備管中，12000rpm離心 Imin,棄上清。
[0068] ⑥將DNA制備管放回2mL離心管中，加500μL緩沖液Wl，12000rpm離心30s。
[0069] ⑦將DNA制備管放回2mL離心管中，加700μL緩沖液W2,12000rpm離心30s。
[0070] ⑧重復步驟⑦一次。
[0071] ⑨將DNA制備管放回2mL離心管中，12000rpm離心2min。以排干膜上洗滌液；
[0072] ⑩將DNA制備管放回2mL離心管中，加50μL的ddH20,IOOOOrpm離心lmin，洗脫 DNA置-20°C下保存。
[0073] 1. 3. 2. 4基因的測序和序列分析
[0074] 經電泳檢測后的已經純化回收的目的DNA片段送至上海生工用ABIPRISMA377型 自動測序儀進行測序。測序結果經過嚴格核對后，得到如SEQIDNo. 1所示的長度為518bp 的DNA片段序列。
[0075] 在NCBI網站上，將測得的核苷酸序列用BLAST在GenBank數據庫中查找和比對同 源或相似的核苷酸序列。根據同源序列的數據庫注釋，再結合菌株的形態結構來判斷所研 究菌株的種屬。經過BLAST比對，該序列與登錄號為KF251186. 1的序列覆蓋率96%，相似 度達到100%。這個序列都是來自Phaeosphaeriopsissp.的ITSrDNA。
[0076] 對LTC-9菌株進行了如下保藏：生物材料樣品名稱：擬暗球腔菌 (Phaeosphaeriopsissp. )LTC_9 ;保藏單位：中國典型培養物保藏中心；保藏地址：中國武 漢武漢大學；保藏日期：2014年4月25日；保藏編號為：CCTCCNO.M2014163。
[0077] 同時經過檢索，關于Phaeosphaeriopsissp.真菌在提高植物耐鹽性方面的應用 并沒有相關的報道。
[0078] 實施例2LTC-9提高水稻苗耐鹽性效果的試驗
[0079] 2· 1培養基配制
[0080] ①馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養基（potatodextroseagar,PDA):同實施例1。
[0081] ②MS培養基：硝酸鉀1900mg/L，硝酸銨1650mg/L，硫酸鎂370mg/L，磷酸二氫 鉀170mg/L，氯化興440mg/L，硫酸猛22. 3mg/L，硫酸鋅8. 6mg/L，硼酸6. 2mg/L，碘化鉀 0· 83mg/L，鑰酸鈉(λ 25mg/L，硫酸銅(λ 025mg/L，氯化鈷(λ 025mg/L，硫酸亞鐵27. 8mg/L， Na2EDTA37. 3mg/L，甘氨酸2. Omg/L，鹽酸硫胺素(λ lmg/L，鹽酸批卩多醇(λ 5mg/L，煙酸(λ 5mg/ L，肌醇100mg/L，30g蔗糖，瓊脂粉7g，H2O定容至IL ;ρΗ值5· 6-5. 8。
[0082] 2· 2菌株LTC-9的培養
[0083] 用無菌的牙簽挑取菌株LTC-9的菌絲塊置于PDA培養基平板上，封口膜封口后置 于恒溫生化培養箱中，25°C黑暗條件下培養一周。
[0084] 2. 3水稻種子的萌發
[0085] 將水稻種子脫殼后，選取飽滿無損傷的種子置于無菌的三角瓶中，經無菌水沖洗2 次，依次用70%的酒精表面消毒5min，2%(活性氯的含量）的次氯酸鈉滅菌10min，無菌 水多次沖洗至種子不發黃為止；表面消毒完成后，將水稻種子置于1/2MS培養基平板上，于 30°C、黑暗條件下萌發3-4天，備用。
[0086] 2. 4平皿上的共培養
[0087] 采用13X13cm的一次性塑料方皿，選取長勢相同，大小一致水稻幼苗用于共培 養。
[0088] 移入水稻幼苗前，向每方皿中倒入大約75mL MS培養基，冷卻凝固后用預先滅菌的 載玻片切去2/5(由圖2可見，在寬度2/5處用滅菌的載玻片插入培養基中，切斷培養基，然 后用這個載玻片將2/5的培養基挑出，為水稻幼苗的生長留出空間），留出空白供水稻莖葉 的生長；培養基處理好后，將水稻幼苗轉移至MS培養基上，使根部舒展，每個方皿中放入6 株水稻苗；移入水稻苗后，用滅菌的牙簽挑取菌株LTC-9的菌絲，點在水稻苗根部下方附近 與水稻共培養；
[0089] 設以下四種處理組：①水稻苗在MS平板上的生長（CC組）；②水稻苗與內生真菌 在MS平板上的共培養（CE組）；③水稻苗在加鹽MS平板上的生長（SC組）；④水稻苗與內 生真菌在加鹽MS平板上的共培養（SE組），每種處理3個重復；培養皿封口后置于光照培 養箱中（25°C、16h光照80μmm-2sec-l與22°C、8h黑暗）堅立培養。
[0090] 共培養兩周后觀察水稻的生長狀況，并按照上述步驟重復進行3次共培養。試驗 發現，LTC-9菌株在加鹽MS平板上可以穩定促進水稻生長，在株高上與對照有顯著差異外， 水稻苗的莖桿也顯著加粗，葉片也相對較寬，表現出更好地生長態勢（圖2)。
[0091] 對SC組和SE組水稻苗的株高、根長、鮮重、干重等數據進行了統計，統計結果見表 Io
[0092] 表I200mMNaCl的鹽脅迫下SC組和SE組水稻苗的生長指標比較
[0093]

【權利要求】
1. 一株擬暗球腔菌，其特征在于，命名為擬暗球腔菌（Phaeosphaeriopsis sp. ) LTC-9， 保藏編號為 CCTCC N〇.M2014163。
2. -種含有如權利要求1所述擬暗球腔菌的菌劑。
3. 如權利要求2所述的菌劑，其特征在于，采用所述擬暗球腔菌的菌絲制成。
4. 如權利要求3所述的菌劑，其特征在于，所述擬暗球腔菌菌絲的濃度為1?3g/L。
5. 如權利要求1所述擬暗球腔菌在提高小麥耐鹽性中的應用。
6. 如權利要求5所述的應用，其特征在于，包括：在鹽堿地土壤中拌入所述擬暗球腔 菌，然后將萌發的小麥種子播種于鹽堿地中； 或者，將小麥幼苗與所述擬暗球腔菌建立共培養體系，然后將共培養體系轉移至鹽堿 地中生長。
7. 如權利要求1所述擬暗球腔菌在提高水稻耐鹽性中的應用。
8. 如權利要求7所述的應用，其特征在于，包括：將水稻幼苗與所述擬暗球腔菌建立共 培養體系，然后將共培養體系轉移至鹽堿地中生長； 或者，在育苗圃土壤中拌入所述擬暗球腔菌，然后將水稻種子播種于育苗圃中，并在移 栽期將育苗圃中長出的水稻幼苗移栽至鹽堿地中。
【文檔編號】C12N1/14GK104263654SQ201410447121
【公開日】2015年1月7日 申請日期:2014年9月4日 優先權日:2014年5月21日
【發明者】王洪凱, 陳亞平, 林福呈 申請人:浙江大學