一種可在線滅菌的水平旋轉式生物反應器的制造方法
【專利摘要】本發明提供一種可在線滅菌的水平旋轉式生物反應器，其結構合理，設計巧妙，既能模擬微重力環境，又可實現在線滅菌，是一種全新的水平旋轉式生物反應器系統。本發明的可在線滅菌的水平旋轉式生物反應器，包括旋轉機體、反應器、培養基外循環系統和控制系統；旋轉機體包括電機、旋轉軸、軸承座、軸承、密封圈、進出液管和底座；旋轉軸套裝在軸承座內，電機直接與旋轉軸一端連接，旋轉軸另一端連接反應器，軸承座與底座連接在一起，用于固定整個反應器，旋轉軸水平設置。
【專利說明】一種可在線滅菌的水平旋轉式生物反應器
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【技術領域】： 本發明涉及生物工程領域中的生物反應器，具體講為一種可在線滅菌的用于體外培養 細胞、組織等生物體的水平旋轉式生物反應器。
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【背景技術】： 生物反應器是使細胞大規模培養得以實現的裝置。從發展的角度看，20世紀40年代生 物反應器所發生的重大變革源于人們將化學反應器的知識移植到發酵工業，開發了機械攪 拌式生物反應器，從而使得純種大規模培養成為可能。70年代發展起來的基因工程、細胞工 程技術，使發酵工程不單純是天然微生物，而擴展到基因工程菌、動物和植物細胞的培養， 同時對生物反應器提出了新的要求，形成了生物反應工程"四傳(動量、質量、熱量、信息）一 反(生物反應動力學)"的結構框架。近幾十年來，由于生物工程和組織工程學的發展，相應 的生物反應器水平也在不斷提高，用于組織工程化培養的生物反應器已越來越接近于生物 體內環境的培養條件。
[0003] 模擬微重力培養是一種新興的培養技術，可用于組織工程、細胞培養等多個領域。 水平旋轉式生物反應器可以模擬微重力環境，具有充分的氧和營養物質交換、三維立體結 構、極低的剪切力和獨特的流體力學特征等優點。從而改善離體細胞的培養條件，使在普通 條件下只能呈二維貼壁生長的哺乳動物細胞表現出三維增殖與細胞分化，這類分化的細胞 團可進一步形成有功能的組織塊。以美國航空航天局（NASA)發明的旋轉式細胞培養系統 (RCCS)為代表的水平旋轉式生物反應器被廣泛應用于生命科學領域，但其在消毒滅菌時或 用高壓鍋蒸汽滅菌法，或用乙醇浸泡法消毒，操作復雜、時間長，且容易消毒不徹底，特別是 大規模化生產更顯不足。
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【發明內容】
： 本發明提供一種可在線滅菌的水平旋轉式生物反應器，其結構合理，設計巧妙，既能模 擬微重力環境，又可實現在線滅菌，是一種全新的水平旋轉式生物反應器系統，且容積不受 限制，可大規模進行細胞或組織培養。
[0005] 本發明的具體技術方案如下： 一種可在線滅菌的水平旋轉式生物反應器，包括旋轉機體、反應器、培養基外循環系統 和控制系統；旋轉機體包括電機、旋轉軸、軸承座、軸承、密封圈、進出液管和底座；旋轉軸 套裝在軸承座內，電機直接與旋轉軸一端連接，旋轉軸另一端連接反應器，軸承座與底座連 接在一起，用于固定整個反應器，旋轉軸水平設置。
[0006] 所述旋轉軸上至少設有二個L型孔，各L型孔一端沿旋轉軸軸向引出，另一端由 旋轉軸側壁徑向引出；軸承座上設有與旋轉軸側壁開孔的位置相對應的進液孔和出液孔， 在軸承座內與進液孔和出液孔兩側相對應的位置安裝有多個密封圈，且在相鄰兩密封圈之 間留有間隙，與軸形成檢漏腔，檢漏腔下部在軸承座上鉆有檢漏孔，用于檢查密封圈是否泄 漏，軸承座上的進液孔和出液孔上可裝有進液管或出液管，用于連接外循環系統； 所述反應器與旋轉機體上旋轉軸連接，反應器包括連接軸和設于連接軸外圍的至少三 個環形室，該連接軸與旋轉軸通過法蘭連接，（或者還有一種可行的連接方式為在連接軸中 心鉆有通孔，插入螺栓與旋轉軸中心的螺紋孔固定）；該連接軸上至少設有兩個L型孔與旋 轉軸L型孔位置相對應，且連接軸上至少有一個L型孔連通至進液腔，一個L型孔連通至回 液腔； 所述反應器的環形室由連接軸、外圈、墻板以及中間的微孔隔板圍成，并至少形成中間 一個培養室和兩端一個進液腔、一個回液腔，培養室的外圈上還開有三個孔：一個排氣孔、 一個進料/收獲孔、一個取樣/疏水孔。
[0007] 本發明的進一步設計在于： 反應器與旋轉機體的連接采用法蘭式或螺栓式連接方式，旋轉軸與反應器連接軸相對 應的L型孔的相接面上設有0型圈密封，并由定位銷定位。
[0008] 反應器培養室外圈上開有排氣孔，排氣孔內嵌有過濾器，過濾器被孔蓋壓住密封， 過濾器與孔蓋中間形成氣泡陷阱，孔蓋上裝有直通閥。
[0009] 反應器培養室外圈上開有進料/收獲孔，并裝有堵頭。
[0010] 反應器培養室外圈上開有取樣/疏水孔，并連接有三通閥，分別連通取樣口和疏 水閥。
[0011] 排氣孔和進料/收獲孔在培養室外壁的一側（且兩孔沿同一水平直線分布)，取樣 /疏水孔在培養室外壁另一側，相差180°。本發明中，反應器內部連接軸上分別套裝有若 干微孔板。并至少形成三個環形室，中間環形室為培養室，兩側環形室分別為進液腔和回液 腔。中間微孔板上設有均勻分布的微孔，其形狀可以是圓形、方形、矩形、菱形等任意形狀， 以起到阻擋培養物(如細胞、微載體等）跑出培養室外的作用。培養室外圈上還裝有排氣接 頭、進料/收獲接頭和取樣/疏水接頭。 本發明相比現有技術具有如下優點： 1、相比現有的微重力生物反應器及模擬水平旋轉式生物反應器受結構上和某些材料 不能耐高溫的局限，均不能做到在線滅菌，本發明裝置既能模擬微重力環境，又可實現在線 滅菌，并具有在線取樣、在線灌流生產、在線參數檢測及控制等功能，且容積不受限制，可大 規模進行細胞或組織培養。
[0012] 2、本發明裝置帶有自檢其密封性功能，即旋轉的反應器是一個密閉的空間，滅菌 時蒸汽的進入均通過軸承座上進、出液管進入旋轉軸內部和連接軸內部的長孔到達反應器 內，旋轉軸與軸承座間的密封圈若磨損，則會有液體從檢漏孔流出，此時便需要更換對應檢 漏孔位置處的密封圈，從而保障了本發明裝置的安全性。
[0013] 3、本發明裝置的獨特性還在于反應器內部的2個中間微孔板設置使得反應器具 有內部物質交換充分，無死腔，出口不會堵塞，細胞均勻懸浮并保持在微重力狀態下三維生 長的特點。
[0014] 4、帶有營養物質(如氨基酸、葡萄糖等）和氧氣的培養基首先通過旋轉軸和連接軸 長孔進入進液腔，反應器的旋轉增加了物質的混合效果，使得灌注均勻，無死腔。再經微孔 板上的微孔流入培養室，減緩液體流速，使細胞均勻的懸浮在培養室內三維生長。廢液從回 液腔中連接軸上的出口孔中排出，不會有出口被堵塞的現象。灌流方向從左至右或者從右 至左不受限制。
[0015]

【專利附圖】

【附圖說明】： 圖1為本發明中旋轉體的結構示意圖。
[0016] 圖2為本發明中反應器的結構示意圖。
[0017] 圖3為本發明的總裝圖。
[0018] 圖中：1-電機；2-軸承座；3-旋轉軸；4-連接軸；5-培養室；6-進液腔；7-回液 腔；8-軸承；9-密封圈；10-進液孔；11-出液孔；12-檢漏腔；13-檢漏孔；14-0型密封圈； 15-底座；16-進樣/收獲孔；17-直通閥(排氣孔);18-取樣/疏水孔；19-墻板；20-外圈； 21-微孔隔板；22-三通閥；23-法蘭；24-螺栓。
[0019] 實施例一： 如圖1-圖3所示，本發明的可在線滅菌的水平旋轉式生物反應器，包括旋轉機體、反應 器、培養基外循環系統和控制系統。
[0020] 旋轉機體包括電機1、旋轉軸3、軸承座2、軸承8、密封圈、進出液管和底座15 ;旋 轉軸3套裝在軸承座2內，電機1直接與旋轉軸3 -端連接，旋轉軸3另一端連接反應器， 軸承座2與底座15連接在一起，用于固定整個反應器，旋轉軸3水平設置。
[0021] 本發明旋轉軸2上設有二個L型孔，兩L型孔一端沿旋轉軸軸向引出，另一端由旋 轉軸側壁徑向引出；軸承座2上設有與旋轉軸側壁開孔的位置相對應的進液孔10和出液孔 11，在軸承座內與進液孔10和出液孔11兩側相對應的位置安裝有多個密封圈(如密封圈9， 進液孔10兩側各設一個密封圈；出液孔11兩側各設一個密封圈)，且在相鄰兩密封圈(如進 液孔10右側的密封圈與出液孔11左側的密封圈)之間留有間隙，與軸形成檢漏腔12,檢漏 腔12下部在軸承座上鉆有檢漏孔13,用于檢查密封圈是否泄漏，軸承座上的進液孔和出液 孔上可裝有進液管或出液管，用于連接外循環系統； 反應器與旋轉機體中的旋轉軸連接，反應器包括連接軸4和設于連接軸外圍的三個環 形室，該連接軸4與旋轉軸3通過法蘭連接，（或者還有一種可行的連接方式為在連接軸中 心鉆有通孔，插入螺栓與旋轉軸中心的螺紋孔固定);該連接軸上設有兩個L型孔，與旋轉軸 L型孔位置相對應，且有一個L型孔連通至進液腔，一個L型孔連通至回液腔； 反應器的環形室由連接軸4、外圈20、墻板19以及中間的微孔隔板21圍成，并在形成 中間一個培養室5和兩端的一個進液腔6、一個回液腔7，培養室的外圈上還開有三個孔： 一個排氣孔、一個進料/收獲孔16、一個取樣/疏水孔18。
[0022] 該反應器與旋轉機體的連接采用法蘭式或螺栓式連接方式，旋轉軸與反應器連接 軸相對應的L型孔的相接面上設有由0型圈密封并由定位銷定位。
[0023] 本例中，反應器與旋轉軸采用法蘭連接，法蘭23與旋轉軸3采用一體式結構，法蘭 23與反應器之間通過螺栓24連接為一體。
[0024] 反應器培養室外圈上開有排氣孔，排氣孔內嵌有過濾器，過濾器被孔蓋壓住密封， 過濾器與孔蓋中間形成氣泡陷阱，孔蓋上裝有直通閥17。
[0025] 反應器培養室外圈上的進料/收獲孔16上還裝有堵頭。
[0026] 反應器培養室外圈上的取樣/疏水孔連接有三通閥，分別連通取樣口和疏水閥。
[0027] 實施例二： 該反應器還包括PC控制系統和培養基外循環系統，其培養基外循環系統如圖3所示， 培養基外循環系統的進、排口分別與旋轉軸上的L型孔相連。
[0028] 本發明的反應器容器與旋轉機體的安裝有如下兩種方法： 清洗干凈反應器，先將二個〇型密封圈裝在旋轉軸2個L型孔的端面上，將反應器的定 位銷對準旋轉軸上的定位孔，兩法蘭用螺釘旋緊固定，此時旋轉軸上的二個流道與反應器 上的二個流道經0型圈已經密封在一起了。
[0029] 清洗干凈反應器，先將二個0型密封圈裝在旋轉軸2個L型孔的端面上，然后將反 應器的定位銷對準旋轉軸上的定位孔，裝上螺栓，用螺母將反應器牢牢地固定在旋轉軸上， 此時旋轉軸上的二個流道與反應器上的二個流道經〇型圈已經密封在一起了。
[0030] 本發明的SIP (在線滅菌）工作過程如下： 安裝完反應器容器，啟動電機將裝有疏水器的閥門旋轉到最下方，此時反應器上的排 氣口和進料口在最上方，蒸汽通過組合閥門連接至軸承座上的二個進、出液口，打開排氣口 上的排氣閥及取樣/疏水口上的疏水閥，在進料/收獲口上裝上堵頭，開啟蒸汽，待蒸汽充 滿反應器內部，排氣閥有蒸汽冒出時，關閉排氣閥門，蒸汽對流道及反應器進行121°c滅菌 30分鐘，冷凝水通過反應器上的疏水閥排出。
[0031] 反應器SIP結束后，關閉疏水閥上的閥門，打開排氣閥，關閉組合閥上的蒸汽端閥 門，打開與外循環系統連接的進液閥門，啟動蠕動泵，新鮮培養基從進液口被泵入反應器培 養室中，反應器中的氣體經過濾器排出，直到反應器中培養基加滿，氣泡清除干凈，然后關 閉排氣口手閥，啟動電機，讓反應器旋轉，培養基經罐外循環，待溫度、pH、D0達到工藝要求 穩定一段時間，然后加載體接種進行細胞培養。
[0032] 如圖所示，生物反應器運作時，電機通過旋轉軸帶動生物反應器沿水平軸徑向同 心旋轉，可以實現微重力環境，利于培養物三維生長。培養基通過進液孔，進入旋轉軸及 反應器連接軸上的L型流道，進入進液腔，然后經微孔板流入培養室，再經微孔板進入回液 腔，最后反應器連接軸及旋轉軸上的L型流道流出出液孔進入外循環系統構成灌流循環回 路，在外循環系統中分別設有pH、D0、葡萄糖、溫度等在線檢測儀，培養基廢液排出口，新 鮮培養基添加口，排氣口，四氣體進氣口，蠕動泵，過濾器。控制系統根據在線檢測數據自動 添加新鮮培養基、葡萄糖、氨基酸、調節四氣體進氣比例等以滿足細胞培養所需的養分、pH 和D0,排出廢液。若旋轉軸與軸承座間的密封圈磨損，則會有液體從檢漏孔流出，此時便需 要更換對應檢漏孔位置處的密封圈，從而保障了本發明裝置的安全性。
【權利要求】
1. 一種可在線滅菌的水平旋轉式生物反應器，包括旋轉機體、反應器、培養基外循環系 統和控制系統，其特征是：旋轉機體包括電機、旋轉軸、軸承座、軸承、密封圈、進出液管和底 座；旋轉軸套裝在軸承座內，電機直接與旋轉軸一端連接，旋轉軸另一端連接反應器，軸承 座與底座連接在一起，用于固定整個反應器，旋轉軸水平設置； 所述旋轉軸上至少設有二個L型孔，各L型孔一端沿旋轉軸軸向引出，另一端由旋轉軸 側壁徑向引出；軸承座上設有與旋轉軸側壁開孔的位置相對應的進液孔和出液孔，在軸承 座內與進液孔和出液孔兩側相對應的位置安裝有多個密封圈，且在相鄰兩密封圈之間留有 間隙，與軸形成檢漏腔，檢漏腔下部在軸承座上鉆有檢漏孔，用于檢查密封圈是否泄漏，軸 承座上的進液孔和出液孔上可裝有進液管或出液管，用于連接外循環系統； 所述反應器與旋轉機體中的旋轉軸連接，反應器包括連接軸和設于連接軸外圍的至少 三個環形室，該連接軸上至少設有兩個L型孔與旋轉軸L型孔位置相對應，且連接軸上至少 有一個L型孔連通至進液腔，一個L型孔連通至回液腔； 所述反應器的環形室由連接軸、外圈、墻板以及中間的微孔隔板圍成，并至少形成中間 一個培養室和兩端一個進液腔、一個回液腔，培養室的外圈上還開有三個孔：一個排氣孔、 一個進料/收獲孔、一個取樣/疏水孔。
2. 根據權利要求1所述可在線滅菌的水平旋轉式生物反應器，其特征是，反應器與旋 轉機體的連接采用法蘭式或螺栓式連接方式。
3. 根據權利要求1所述可在線滅菌的水平旋轉式生物反應器，其特征是，旋轉軸與反 應器連接軸相對應的L型孔的相接面上設有0型圈密封并由定位銷定位。
4. 根據權利要求1所述可在線滅菌的水平旋轉式生物反應器，其特征是，反應器培養 室外圈上開有排氣孔，排氣孔上內嵌有過濾器，過濾器被孔蓋壓住密封，過濾器與孔蓋中間 形成氣泡陷阱，孔蓋上裝有直通閥。
5. 根據權利要求1所述可在線滅菌的水平旋轉式生物反應器，其特征是，反應器外圈 上開有進料/收獲孔，并裝有堵頭。
6. 根據權利要求1所述可在線滅菌的水平旋轉式生物反應器，其特征是，反應器外圈 上還開有取樣/疏水孔，并連接有三通閥，分別連通取樣口和疏水閥。
7. 根據權利要求1、4、5或6所述可在線滅菌的水平旋轉式生物反應器，其特征是，排氣 孔和進料/收獲孔在培養室外壁的同一側，且兩孔沿同一水平直線分布，取樣/疏水孔在培 養室外壁另一側，相差180°。
【文檔編號】C12M1/36GK104195043SQ201410462410
【公開日】2014年12月10日 申請日期:2014年9月11日 優先權日:2014年9月11日
【發明者】朱學仁, 朱羚 申請人:南京比瑞生物科技有限公司