一種鑒別紅木及其制品的dna條形碼技術及其使用方法
【專利摘要】本發(fā)明公開一種鑒別紅木及其制品的DNA條形碼技術及其使用方法，采用合并紅木樣本實驗數(shù)據(jù)和目標植物的數(shù)據(jù)庫數(shù)據(jù)的策略構建高容量數(shù)據(jù)庫，對紅木樣本的DNA條形碼序列進行測序，將測序序列合并Genbank數(shù)據(jù)庫中已發(fā)表的同種序列，構建數(shù)據(jù)來源廣泛的紅木樹種DNA條形碼基因數(shù)據(jù)庫，并使用matK+rbcL基因作為紅木鑒定的目標DNA條形碼基因，同時使用基于頻率的局部比對算法的搜索工具法、基于Kimura-2-parameter概率的遺傳距離法和基于聚類分析的系統(tǒng)發(fā)生樹法設立鑒定的數(shù)據(jù)庫算法和判定規(guī)則；該鑒別紅木及其制品的DNA條形碼技術及其使用方法建立了準確、快捷的紅木種類DNA條形碼鑒別技術。
【專利說明】-種鑒別紅木及其制品的DNA條形碼技術及其使用方法

【技術領域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種鑒別紅木及其制品的DNA條形碼技術及其使用方法。

【背景技術】
[0002] 目前，盡管已有應用DNA條形碼技術進行植物鑒定的報道，并形成了一定的規(guī)范 性文件(高連明等，《關于植物DNA條形碼研究技術規(guī)范》，植物分類與資源學報2012,34 ( 6) : 592?606)，但是，如要將DNA條形碼技術應用于紅木的鑒定中，將面臨不同于常規(guī) 植物分類的突出難題： 問題一：建立DNA條形碼序列數(shù)據(jù)庫的數(shù)據(jù)來源問題。由于紅木是從消費角度命名 的俗稱類別，各種類之間不存在明確的物種親緣關系，且不同紅木品種的來源、珍稀程度存 在很大差別，很難同時收集到不同來源的全部33種紅木，且使得每一種類都具有足夠數(shù)量 用以建立數(shù)據(jù)庫的個體樣本，如全部使用紅木樣品基因測序結果建立數(shù)據(jù)庫，將面臨總體 樣本量過小和種間樣本量差距過大的問題，影響數(shù)據(jù)庫作為判定基礎的可信度；另一方面， GB/T18107-2000提供了每種紅木的拉丁種屬名稱，在Genbank等公共數(shù)據(jù)庫中，已有不少 這些種屬的基因序列資料，但是，紅木存在大量的同種異型現(xiàn)象，已發(fā)表的相關種屬的序列 信息很可能與紅木的序列并不完全匹配，如完全根據(jù)公共數(shù)據(jù)庫已發(fā)表的序列建立紅木的 DNA條形碼數(shù)據(jù)庫，則會面臨較大的錯判風險。因此，如何獲取并整合大量的紅木DNA條形 碼序列，建立容量充足、判定準確的DNA條形碼數(shù)據(jù)庫，將是將該技術應用于紅木及制品鑒 別的首要問題。
[0003] 問題二：植物DNA條形碼目標基因的選擇一直是該技術用于物種鑒別時影響可靠 性的關鍵影響因素。作為DNA條形碼鑒定的目標基因應具備較高的物種間多態(tài)性和物種內 遺傳穩(wěn)定性，從而在序列比對中表現(xiàn)出較強的物種區(qū)分能力。與動物的DNA條形碼普遍使 用coxl基因不同，目前尚未有一種理想的DNA條形碼基因或基因組合可區(qū)分所有的已知植 物。國際生命條形碼聯(lián)盟（Consortium for the Barcode of Life, CB0L)從引物通用性、 序列質量、區(qū)分物種的能力三方面開展了植物DNA條形碼候選基因的篩選（Hollingsworth etal·，2011)并得到了 7個候選的植物質體基因，分別是matK, rbcL, rpoB和rpoCl四 個編碼基因以及atpF-atpH, trnH-psbA和psbK-psbl三個非編碼基因（CB0L plant working group, 2009)。2011年，中國植物條形碼組織提出將轉錄間隔區(qū)的核核糖體（ITS) 基因加入到種子植物的鑒別條形碼候選基因中（China Plant BOL Group et al.，2011)。 但是，這些基因在用于植物DNA條形碼標記時，在對不同種屬的區(qū)分度、引物設計難度等方 面各有利弊，因此，在各類紅木的鑒定中，何種基因或基因組合最為有效，也是本發(fā)明須重 點解決的關鍵問題。
[0004] 問題三：DNA條形碼數(shù)據(jù)庫構建的算法和未知樣本的判別標準問題。在獲得用于 建立DNA條形碼數(shù)據(jù)庫的所有目標基因序列后，經(jīng)過序列的整理，一般有3種基于不同算法 的生物信息學方法可建立相應的數(shù)據(jù)庫并提供未知序列的查詢和判別，分別是基于頻率的 局部比對算法的搜索工具（BLAST)法、基于Kimura-2-parameter ( K2P)概率的遺傳距離 法和基于聚類分析的系統(tǒng)發(fā)生樹法。這三種方法數(shù)據(jù)處理的原理不同，因而進行判別時的 準確性和適用范圍都有所差異。即使對于其中的任意一種方法，分析時所采用的參數(shù)不同， 其結果也有出現(xiàn)差異的可能。因此，要對紅木這一特定的無明確親緣關系的植物群體中不 同種類的樣本進行準確鑒別，采取何種數(shù)據(jù)庫構建和序列分析方法將至關重要，這需要在 獲取序列信息的基礎上，通過摸索不同參數(shù)并驗證大量已知樣本，才能確保方法的準確度 和實用價值。


【發(fā)明內容】

[0005] 本發(fā)明要解決的技術問題是提供一種建立了準確、快捷的紅木種類DNA條形碼鑒 別技術，從重點解決上述三大難點問題出發(fā)，首先研究確定最佳的DNA條形碼目標基因組 合，同時創(chuàng)新數(shù)據(jù)庫序列來源和構建方法，并驗證其鑒別的準確性的鑒別紅木及其制品的 DNA條形碼技術。
[0006] 為解決上述問題，本發(fā)明采用如下技術方案： 一種鑒別紅木及其制品的DNA條形碼技術，采用合并紅木樣本實驗數(shù)據(jù)和目標植物的 數(shù)據(jù)庫數(shù)據(jù)的策略構建高容量數(shù)據(jù)庫：對紅木樣本的DNA條形碼序列進行測序，將測序序 列合并Genbank數(shù)據(jù)庫中已發(fā)表的同種序列，構建數(shù)據(jù)來源廣泛的紅木樹種DNA條形碼基 因數(shù)據(jù)庫，并使用matK+rbcL基因作為紅木鑒定的目標DNA條形碼基因，同時使用基于頻 率的局部比對算法的搜索工具法、基于Kimura-2-parameter概率的遺傳距離法和基于聚 類分析的系統(tǒng)發(fā)生樹法設立鑒定的數(shù)據(jù)庫算法和判定規(guī)則，全面提高鑒定的準確性和可信 度。
[0007] 本發(fā)明要解決的另一技術問題是提供一種鑒別紅木及其制品的DNA條形碼技術 的使用方法， 為解決上述技術問題，本發(fā)明采用如下技術方案：包括以下步驟： 1) 紅木樣本的收集與驗證； 2) 樣本基因組DNA的提取； 3) 目標DNA條形碼基因片段的擴增、純化與測序； 4) 相關數(shù)據(jù)庫序列的查詢； 5) 序列的編輯、比對、質量核查，整合不同來源的序列數(shù)據(jù)； 6) 數(shù)據(jù)庫的構建與判定參數(shù)的確認； 7) 數(shù)據(jù)庫判定準確性驗證； 8) 未知樣品的鑒定。
[0008] 本發(fā)明的有益效果是：首先，本發(fā)明建立可快速查詢的紅木種類DNA條形碼數(shù)據(jù) 庫，可對未知的紅木樣本進行快速鑒定，相比于傳統(tǒng)的木材切片顯微觀察、對比圖譜進行鑒 定的方法，可大大提高鑒定效率，提高檢測的通量和準確性，將鑒定時間從1-2天縮短為半 天左右，并減少對于操作人員經(jīng)驗的依賴性，可廣泛適用于具備分子生物學實驗室的木材 鑒定與產(chǎn)品檢驗機構，在滿足消費者需求的同時，提升檢測機構的技術平臺和水平，創(chuàng)造更 好的經(jīng)濟效益和社會效益。同時，本發(fā)明應用matK和rbcL條形碼基因的組合，創(chuàng)新性地將 樣本測序所得序列與數(shù)據(jù)庫已有序列合并建立數(shù)據(jù)庫，最大限度地增加了紅木數(shù)據(jù)庫的容 量，加之同時使用3種算法進行鑒定，其鑒定的可靠性和準確性也大大優(yōu)于常規(guī)的DNA條形 碼方法。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0009] 圖1為本發(fā)明一種鑒別紅木及其制品的DNA條形碼技術及其使用方法的A部分紅 木樣本rbcL條形碼基因擴增電泳圖。
[0010] 圖2為本發(fā)明一種鑒別紅木及其制品的DNA條形碼技術及其使用方法的典型DNA 條形碼序列測序圖譜。
[0011] 圖3為本發(fā)明一種鑒別紅木及其制品的DNA條形碼技術及其使用方法的三種紅木 DNA條形碼數(shù)據(jù)庫操作與判定截圖。

【具體實施方式】
[0012] 一種鑒別紅木及其制品的DNA條形碼技術，采用合并紅木樣本實驗數(shù)據(jù)和目標植 物的數(shù)據(jù)庫數(shù)據(jù)的策略構建高容量數(shù)據(jù)庫：對紅木樣本的DNA條形碼序列進行測序，將測 序序列合并Genbank數(shù)據(jù)庫中已發(fā)表的同種序列，構建數(shù)據(jù)來源廣泛的紅木樹種DNA條形 碼基因數(shù)據(jù)庫，并使用matK+rbcL基因作為紅木鑒定的目標DNA條形碼基因，同時使用基于 頻率的局部比對算法的搜索工具法、基于Kimura-2-parameter概率的遺傳距離法和基于 聚類分析的系統(tǒng)發(fā)生樹法設立鑒定的數(shù)據(jù)庫算法和判定規(guī)則，全面提高鑒定的準確性和可 信度。
[0013] 參閱圖1所示，以18個紅木樣本DNA作為模板，用rbcL特異引物進行PCR擴增， 除2號樣本外，各樣本均獲得單一明亮的條帶，產(chǎn)物大小均為750bp。B.部分紅木樣本matK 條形碼基因擴增電泳圖，以15個紅木樣本DNA作為模板，用matK特異引物進行PCR擴增， 各樣本均獲得單一的擴增條帶，產(chǎn)物大小均為930bp。
[0014] 參閱圖2所示，測序峰明顯，重疊峰較少，測序樣本純度高。
[0015] 參閱圖3所示，A采用離線BLAST程序構建數(shù)據(jù)庫。將未知序列進行BLAST查詢， 查詢結果中相似度大于98%物種，可以被視為未知樣本所屬物種；B計算未知序列與數(shù)據(jù)庫 中已知序列的遺傳距離，若未知序列與某一種內各個體間的遺傳距離小于該種最大種內距 離并同時大于最小種間距離時，可以將未知樣本鑒定到種；C將未知序列與數(shù)據(jù)庫中已有 的序列進行聚類分析，構建NJ親緣關系樹。
[0016] 一種鑒別紅木及其制品的DNA條形碼技術的使用方法，包括以下步驟： 1) 紅木樣本的收集與驗證：從研究所、木材企業(yè)、檢測機構等多個途徑收集國家標準中 界定的各紅木品種，使得每個品種均獲得多個不同來源的樣本，應用傳統(tǒng)的顯微切片觀察 法處理樣本，并根據(jù)《木材鑒別方法通則》確定樣品的真實性，建立包含多個來源個體的紅 木標準樣本庫； 2) 樣本基因組DNA的提取：經(jīng)充分的文獻查詢，對木材中DNA的提取方法主要有改良 的十六烷基三甲基溴化銨CTAB法及植物DNA提取試劑盒，通常采用Qiagen DNeasy Plant Mini試劑盒，比較兩種方法的效率，確定使用Qiagen DNeasy Plant Mini試劑盒提取每個 樣本的基因組總DNA，將搜集到的木材樣本表面消毒，切成薄片，用冷凍球磨儀磨成粉末，取 2〇mg粉末按試劑盒使用說明提取DNA ; 3) 目標DNA條形碼基因片段的擴增、純化與測序：針對葉綠體基因，通過查閱文獻，挑 選出7個候選條形碼基因片段，經(jīng)篩選比較，選擇擴增效率高的通用引物，以前一步驟提取 的DNA為模板,分別擴增matK和rbcL基因的條形碼序列，反應體系為25 μ L ,其中包括 12. 5 μ L premix Taq, 0· 5 μ L 10 μ M 正、反向引物，IOOng 模板 DNA 和 ddH20 ; 擴增條件為：95 °C預變性3 min，30個循環(huán)的95 °C 30 s、51 °C 30 s、72 °C 40 s， 最后72 °C延伸7 min ; 參閱圖I所示，擴增產(chǎn)物的質量通過凝膠電泳檢驗；挑選有單一清晰目標條帶的樣本； 參閱圖2所示將擴增獲得的目標條帶純化后進行雙向測序，測序結果作為建立數(shù)據(jù)庫 的備選序列； 4) 相關數(shù)據(jù)庫序列的查詢：參閱下方表1所示，根據(jù)GB/T18107-2000中列出的各種紅 木樹種的拉丁名稱，在Genbank數(shù)據(jù)庫中搜索已發(fā)表的matK和rbcL基因條形碼序列，增加 進入數(shù)據(jù)庫備選序列的相應物種中； 5) 序列的編輯、比對、質量核查，整合不同來源的序列數(shù)據(jù)：將每個紅木物種來自測序 和已有數(shù)據(jù)庫的matK和rbcL基因條形碼序列混合，分別使用DNAstar序列編輯軟件進行 編輯、比對與質量核查，將種內與其他樣本的最小序列差異超過5%的序列舍棄，每個紅木 物種至少有5個以上來源不同的序列； 6) 數(shù)據(jù)庫的構建與判定參數(shù)的確認：分別使用離線BLAST程序、MEGA5. 0軟件的遺傳距 離計算功能、MEGA5. 0的NJ樹聚類分析功能的算法構建各品種matK和rbcL基因條形碼序 列數(shù)據(jù)庫，均采用系統(tǒng)默認的參數(shù)設置，當要對未知序列進行判定時，均使用matK+rbcL基 因條形碼進行判定，設定規(guī)則如下： (1) 當使用離線BLAST數(shù)據(jù)庫時，將未知序列作為被查詢序列進行BLAST查詢，當查詢 報告中與之相似度最高的均為同一物種的數(shù)據(jù)庫內所有序列、且與之相似度最低的該物種 樣本間相似度大于98%，該未知樣本可被判定為屬于該紅木物種； (2) 當使用MEGA5. 0軟件的遺傳距離計算功能時，當未知樣本序列與數(shù)據(jù)庫某一物種1 的所有個體間的遺傳距離均在物種1的最大種內距離以內，同時，該物種序列與其他物種2 所有個體之間的遺傳距離均在物種1與物種2最小種間距離之外，該未知樣本可被判定為 屬于該紅木物種； (3) 當使用MEGA5. 0的NJ樹聚類分析功能時，數(shù)據(jù)庫的表現(xiàn)形式為NJ系統(tǒng)發(fā)生樹，將 未知樣本序列代入該樹，根據(jù)系統(tǒng)默認的聚類分析算法，如未知樣本聚類于某一物種，該未 知樣本即可被判定為屬于該紅木物種，三種紅木DNA條形碼數(shù)據(jù)庫操作與判定截圖見附圖 3 ； 7) 數(shù)據(jù)庫判定準確性驗證：針對上述應用不同算法和判定規(guī)則的3個數(shù)據(jù)庫，為驗證 每個數(shù)據(jù)庫的判定準確性，采取自驗證的方法，分別將數(shù)據(jù)庫中的每一個樣本的序列單獨 提出，將剩下的所有序列組成數(shù)據(jù)庫，將提出的序列作為被查詢序列代入去除其本身的數(shù) 據(jù)庫，對比判定結果與其真實種類，驗證并比較各個數(shù)據(jù)庫對紅木物種鑒定的準確性； 結果表明，通過這種自驗證的方法，3個不同算法、不同判定規(guī)則數(shù)據(jù)庫的判定準確率 均達到100%，均可用于紅木樹種及樣本的鑒定； 8) 未知樣品的鑒定：當需要對未知紅木樹種或紅木制品進行種類鑒定時，按照前述方 法提取未知樣本DNA，擴增測序得到matK和rbcL條形碼基因序列，以之作為被查詢序列，代 入上述3個數(shù)據(jù)庫之一進行檢索，即可判別該樣本是否屬于某一種類紅木； 現(xiàn)共進行了 61個未知樹種的鑒別，成功率達100% ;對39份紅木制品進行鑒別時，有22 份提取出可擴增的DNA，這22份的鑒定成功率也達到100%。
[0017]表 1 :

【權利要求】
1. 一種鑒別紅木及其制品的DNA條形碼技術，其特征在于：采用合并紅木樣本實驗數(shù) 據(jù)和目標植物的數(shù)據(jù)庫數(shù)據(jù)的策略構建高容量數(shù)據(jù)庫，對紅木樣本的DNA條形碼序列進行 測序，將測序序列合并Genbank數(shù)據(jù)庫中已發(fā)表的同種序列，構建數(shù)據(jù)來源廣泛的紅木樹 種DNA條形碼基因數(shù)據(jù)庫，并使用matK+rbcL基因作為紅木鑒定的目標DNA條形碼基因，同 時使用基于頻率的局部比對算法的搜索工具法、基于Kimura-2-parameter概率的遺傳距 離法和基于聚類分析的系統(tǒng)發(fā)生樹法設立鑒定的數(shù)據(jù)庫算法和判定規(guī)則。
2. -種如權利要求1所述的鑒別紅木及其制品的DNA條形碼技術的使用方法，其特征 在于，包括以下步驟： 1) 紅木樣本的收集與驗證； 2) 樣本基因組DNA的提取； 3) 目標DNA條形碼基因片段的擴增、純化與測序； 4) 相關數(shù)據(jù)庫序列的查詢； 5) 序列的編輯、比對、質量核查，整合不同來源的序列數(shù)據(jù)； 6) 數(shù)據(jù)庫的構建與判定參數(shù)的確認； 7) 數(shù)據(jù)庫判定準確性驗證； 8) 未知樣品的鑒定。
【文檔編號】C12Q1/68GK104404131SQ201410473826
【公開日】2015年3月11日 申請日期:2014年9月17日 優(yōu)先權日:2014年9月17日
【發(fā)明者】張馳, 方昕, 邱皓璞, 李寧, 王金磚, 劉彬 申請人:南京市產(chǎn)品質量監(jiān)督檢驗院