的方法
【專利摘要】本發明提供一種用海藻酸鈣-殼聚糖固定磷脂酶A2的方法，采用物理包埋的方法來固定脂質酰基轉移酶（Lysomaxoil）。研究了海藻酸鈣濃度、殼聚糖濃度、鈣離子濃度、戊二醛濃度和交聯時間等不同固定化條件對脂質?；D移酶（Lysomaxoil）固定效率和催化效果的影響，并采用響應面的分析方法對所研究的因素進行優化。根據本發明中復合載體的包埋特性固定脂質?；D移酶（Lysomaxoil）,提高了酶在反應體系中的活性和穩定性,調節和控制酶的活性與選擇性，從而有利于酶的回收和產品的生產，最終得到的固定化酶活力回收率為80%，對于油脂精煉中的酶法脫膠工藝具有重要指導意義。
【專利說明】一種用海藻酸鈣-殼聚糖固定磷脂酶A2的方法
【技術領域】
[0001]本發明涉及一種用海藻酸鈣-殼聚糖固定磷脂酶A2的方法。
【背景技術】
[0002]本文所指脂質?；D移酶為一種磷脂酶A2 (PLA2)0 PLA2是一類能夠在磷脂甘油部分的Sn-2位點選擇性斷裂酯鍵的酶，其可將磷脂水解成一系列生物活性物質；本文所指脂質?；D移酶也可將留醇酯化為留醇酯。PLA2酶源來自豬胰腺，材料相對短缺，而且存在清真等宗教文化的接受問題，未推廣開；但本文所指脂質?；D移酶的來源為氣單包菌屬，不存在上述問題，易于推廣。在上世紀90年代,德國Lurgi公司最早將Enzymax工藝用于酶法脫膠工業生產，此工藝采用的酶就是穩定的PLA2，但是酶的消耗量很大，這樣酶的重復利用便急需開發。國內也有不少相關報道，現今用于脫膠的酶主要是Novozymes公司推出的 Lecitase 1L(PLA2), Lecitase Novo (PLA1)和 Lecitase Ultra(PLA1) ? 其中，豬膜臟來源的磷脂酶Lecitase 1L已不用于油脂脫膠,而被更具優勢的微生物來源的LysomaxOil(PLA2)所代替。
[0003]但是，游離的Lysomax oil (PLA2)價格昂貴，消耗量為 10ppm,是 Lecitase Ultra消耗量的兩倍，不易回收，而且對反應環境適應性差。而對于固定化磷脂酶A2來講，其有以下優勢:顆粒均勻且肉眼可見，易于將固定化酶、底物與產物分開，方便產物后續的純化；酶的溫度穩定性提高，最適PH值和最適溫度改變，對溫度和pH值適應范圍增大，對抑制劑和蛋白酶敏感性降低；可以增加產物的收率，即提高油產量和留醇酯的產量；可以重復使用多次；脂質酰基轉移酶反應條件更易得到控制；酶的使用效率高，使用成本低；相對游離酶而言，更適于產業化、連續化、自動化生產等。
[0004]制備固定化酶的方法主要有包埋、吸附、交聯法和共價鍵結合等，其中包埋法不需要化學修飾酶蛋白的氨基酸殘基，具有反應條件溫和、很少改變酶分子結構、酶活力損失小等優點。海藻酸鈣、殼聚糖是最為常見的包埋材料，因此可用其來作為固定化酶的載體。海藻酸鈣、殼聚糖可與戊二醛基形成SchifT氏堿，在膠囊表面形成一層致密的保護膜，可增加微膠囊球的強度。以海藻酸鈣-殼聚糖為包埋材料，戊二醛為交聯劑，將脂質?；D移酶固定化，最終選擇出最優的固定化條件。
【發明內容】
[0005]本發明是為了解決酶法脫膠過程中，游離磷脂酶A2消耗量大且不易回收的問題，而提出的用海藻酸鈣-殼聚糖固定化脂質?；D移酶(Lysomax oil)的方法，而且至今脂質酰基轉移酶(Lysomax oil)固定化的方法及其應用仍未見報道。用海藻酸鈣-殼聚糖復合載體固定化脂質?；D移酶(Lysomax oil)的方法通過以下步驟實現:一、脂質酰基轉移酶(Lysomax oil)的固定化；二、固定化酶酶活力的測定；三、測定酶活力進而計算酶活回收率；四、固定化條件的優化:分別在海藻酸鈣濃度0.1%?5.0%，殼聚糖濃度為0.1%?5.0%,氯化鈣濃度為0.lmol/L?2.0 mol/L,戊二醛濃度為0.1%?1.0%,交聯時間為3tTl0h的條件下，通過測定固定化酶活力回收率得到最佳的固定化條件；五、采用響應面法進行分析討論最終確定最佳固定化條件。
[0006]采用海藻酸|丐-殼聚糖作為載體固定化脂質?；D移酶(Lysomax oil),海藻酸鈣-殼聚糖作為載體，不需要化學修飾酶蛋白的氨基酸殘基，具有反應條件溫和、很少改變酶分子結構、酶活力損失小等優點；此外，海藻酸鈣-殼聚糖固定化脂質?；D移酶(Lysomax oil)最終得到的固定化酶微球機械強度好，酶的回收率可以達到80%，對于油脂精煉中的酶法脫膠工藝具有重要指導意義。
【具體實施方式】
[0007]【具體實施方式】一:用海藻酸I丐-殼聚糖固定化脂質酰基轉移酶(Lysomax oil)的方法通過以下步驟實現:一、固定化脂質酰基轉移酶(Lysomax oil)的制備:稱取一定量的海藻酸鈣在40°C水浴中保溫溶解，同時稱取一定量的殼聚糖在5%的醋酸溶液于40°C水浴中保溫溶解，再向完全溶解的殼聚糖醋酸溶液中加入一定量的CaCl2溶液，充分混勻。用移液槍準確移取Iml稀釋10倍的酶液于一定濃度的1mL海藻酸鈣溶液中，攪拌均勻。靜止一段時間后，用滅菌后的1mL注射器吸入上述混合液，以約5滴/s注入一定濃度的1mL殼聚糖醋酸溶液、CaCl2混合溶液中，以轉速180r/min攪拌,形成光滑的微膠囊球,再加入一定濃度戊二醛，同時快速攪拌，將其置于4°C環境固定化一定時間，將微膠囊以pH 8.0 NaHC03、
0.lmol/L NaCl、0.1 mol/L pH5.5 NaAc>pH % 8.0 Tris-HCl 順序洗漆后，然后進行冷凍干燥；二、固定化酶酶活力的測定；三、測定酶活力進而計算酶活回收率；四、固定化條件的優化:分別在海藻酸鈣濃度0.1%?5.0%，殼聚糖濃度為0.1%?5.0%，氯化鈣濃度為0.1mol/L?2.0 mol/L,戍二醒濃度為0.1%?1.0%,交聯時間為3h?1h的條件下,通過測定固定化酶活力回收率得到最佳的固定化條件；五、采用響應面法進行分析討論最終確定最佳固定化條件。
[0008]【具體實施方式】二:本實施方式與【具體實施方式】一的不同點在于步驟四中將濃度為
1.5%?2.5%的海藻酸鈣在40°C水浴中保溫溶解的條件下進行脂質酰基轉移酶(Lysomaxoil)的固定化。其它步驟與【具體實施方式】一相同。
[0009]【具體實施方式】三:本實施方式與【具體實施方式】一的不同點在于步驟四中將濃度為
1.5%?2.5%的殼聚糖在5.0%的醋酸溶液于40°C水浴中保溫溶解的條件下進行脂質酰基轉移酶(Lysomax oil)的固定化。其它步驟與【具體實施方式】一相同。
[0010]【具體實施方式】四:本實施方式與【具體實施方式】一的不同點在于步驟四中向完全溶解的殼聚糖醋酸溶液中加入濃度為0.lmol/L^0.3mol/L的CaCl2溶液，對脂質酰基轉移酶(Lysomax oil)進行固定化。其它步驟與【具體實施方式】一相同。
[0011]【具體實施方式】五:本實施方式與【具體實施方式】一的不同點在于步驟四中向形成的光滑微膠囊球的混合溶液中加入濃度為0.29ΓΟ.4%的戊二醛，對脂質?；D移酶(Lysomaxoil)進行固定化。其它步驟與【具體實施方式】一相同。
[0012]【具體實施方式】六:本實施方式與【具體實施方式】一的不同點在于步驟四中交聯時間6tT8h，對脂質?；D移酶(Lysomax oil)進行固定化。其它步驟與【具體實施方式】一相同。
[0013]【具體實施方式】七:本實施方式與【具體實施方式】一的不同點在于步驟五中采用響應面分析法進一步分析最佳固定化條件。其它步驟與【具體實施方式】一相同。
【權利要求】
1.一種用海藻酸鈣-殼聚糖固定磷脂酶A2的方法，其特征在于用海藻酸鈣-殼聚糖復合載體固定脂質酰基轉移酶通過以下步驟實現: 步驟一:在40°C水浴中分別保溫溶解濃度為0.19Γ5.0%的海藻酸鈣，同時稱取一定量的殼聚糖在5%的醋酸溶液于40°C水浴中保溫溶解，再向完全溶解的殼聚糖醋酸溶液中加入一定量的CaCl2溶液，充分混勻，用移液槍準確移取Iml稀釋10倍的酶液于一定濃度的1mL海藻酸鈣溶液中，攪拌均勻；靜止一段時間后，用滅菌后的1mL注射器吸入上述混合液，以約5滴/s注入一定濃度的1mL殼聚糖醋酸溶液、CaCl2混合溶液中，以轉速180r/min攪拌，形成光滑的微膠囊球，再加入一定濃度戊二醛，同時快速攪拌，將其置于4°C環境固定化一定時間；將微膠囊以 ρΗ8.0 NaHCO3^0.lmol/L NaCl、0.lmol/L ρΗ5.5 NaAc、pH8.0Tris-HCl順序洗滌后，然后進行冷凍干燥，制得的固定化酶進行酶活力測定分析，確定海藻酸鈣濃度； 步驟二:選擇殼聚糖濃度分別為0.19Γ5.0%，過程同步驟一，確定殼聚糖濃度； 步驟三:選擇氯化鈣濃度分別為0.lmol/Π.0 mol/L,過程同步驟一，確定氯化鈣濃度； 步驟四:選擇戊二醛濃度分別為0.1%?1.0%，過程同步驟一，確定戊二醛濃度； 步驟五:選擇交聯時間分別為2tTl0h，過程同步驟一，確定交聯時間。
2.根據權利要求1所述的一種用海藻酸鈣-殼聚糖固定化脂質酰基轉移酶的方法，其特征在于步驟一中將濃度為1.59Γ2.5%的海藻酸鈣在40°C水浴中保溫溶解。
3.根據權利要求1所述的一種用海藻酸鈣-殼聚糖固定化脂質?；D移酶的方法，其特征在于步驟二中將濃度為1.59Γ2.5%的殼聚糖在5%的醋酸溶液于40°C水浴中保溫溶解。
4.根據權利要求1所述的一種用海藻酸鈣-殼聚糖固定化脂質?；D移酶的方法，其特征在于步驟三中向完全溶解的殼聚糖醋酸溶液中加入濃度為0.lmol/L^0.3mol/L的CaCl2溶液。
5.根據權利要求1所述的一種用海藻酸鈣-殼聚糖固定化脂質?；D移酶的方法，其特征在于步驟四中向形成的光滑微膠囊球的混合溶液中加入濃度為0.29Π).4%的戊二醛。
6.根據權利要求1所述的一種用海藻酸鈣-殼聚糖固定化脂質?；D移酶的方法，其特征在于步驟五中交聯時間6tT8h。
7.根據權利要求1所述的一種用海藻酸鈣-殼聚糖固定化脂質?；D移酶的方法，其特征在于以固定化酶活力回收率為響應值，采用響應面法進行分析討論最終確定最佳固定化條件，且酶活回收率可以達到80%。
【文檔編號】C12N11/10GK104263715SQ201410497999
【公開日】2015年1月7日 申請日期:2014年9月26日 優先權日:2014年9月26日
【發明者】江連洲, 于殿宇, 張春艷, 宋玉卿, 王俊國, 鄒小雨 申請人:東北農業大學