一種美國白蛾天蠶素a基因及其表達蛋白和應用的制作方法
【專利摘要】本發明公開了一種美國白蛾天蠶素A基因及其表達蛋白和應用。該美國白蛾天蠶素A基因的DNA序列如SEQIDNO.1所示，氨基酸序列如SEQIDNO.2所示。本發明首次從美國白蛾中克隆的天蠶素A基因的cDNA全長序列，并獲得其表達蛋白，依據該蛋白序列，首次用化學方法合成C末端酰胺化的美國白蛾天蠶素A抗菌肽，采用瓊脂糖孔穴擴散法測定合成抗菌肽美國白蛾天蠶素A抗菌肽對大腸桿菌E.coliK12D31和農桿菌AgrobacteriumEHA105的抗菌活性，具有很強的抗細菌活性，在抑菌中具有廣泛的應用前景。
【專利說明】—種美國白蛾天蠶素A基因及其表達蛋白和應用

【技術領域】
[0001]本發明屬于基因工程【技術領域】，具體涉及一種美國白蛾天蠶素A (Cecropin A)基因及其表達蛋白和應用。

【背景技術】
[0002]抗菌肽是一類具有廣譜高效殺菌活性的多肽類物質，是自然界中特別是昆蟲非特異性免疫系統的一個必不可少的組成部分。1972年，瑞典科學家Boman等最早從天蠶蛹中發現抗菌肽cecropins，接著又從各種不同動物(哺乳類、兩棲類等)和植株內分離得到了抗菌肽，此外部分細菌也能產生抗菌肽。隨著研究的不斷深入，發現部分抗菌肽還對某些致病真菌、病原蟲、病毒甚至腫瘤細胞具有顯著的殺傷作用，是一類具有重要潛在應用價值的活性物質。抗菌肽具有不同于傳統抗生素的獨特抗菌機制，但對機體無毒副作用、無殘留，這為解決細菌對傳統抗生素日益增強的問題提供新思路。
[0003]根據GenBank、EMBL和DDBJ國際三大主要核酸序列數據庫搜索結果得知，目前惜古比天蠶、家蠶Cecropin A cDNA已被克隆,并分別已在GenBank數據庫中申請了序列號，而美國白蛾Cecropin A的cDNA還未被克隆出來,關于美國白蛾Cecropin A基因的研究在整個國內外還處于完全空白狀態。


【發明內容】

[0004]發明目的:針對現有技術中存在的不足，本發明的目的是提供一種美國白蛾天蠶素A基因。本發明的另一目的是提供上述美國白蛾天蠶素A基因的表達蛋白。本發明還有一目的是提供上述美國白蛾天蠶素A基因的應用。
[0005]技術方案:為了實現上述發明目的，本發明采用的技術方案為:
一種美國白蛾天蠶素A基因，其DNA序列如SEQ ID N0.1所示。
[0006]所述的美國白蛾天蠶素A基因的表達蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID N0.2所示。
[0007]所述的美國白蛾天蠶素A基因在抗細菌活性中的應用。
[0008]所述的美國白蛾天蠶素A基因的表達蛋白在抗細菌活性中的應用。
[0009]一種美國白蛾天蠶素A抗菌肽，所述的美國白蛾天蠶素A抗菌肽的多肽序列為美國白蛾天蠶素A基因的表達蛋白序列的一部分，具體序列為:RWKIFKKIERVGQNVRDGIIKAGPAIQVLGTAKALGK。
[0010]所述的美國白蛾天蠶素A抗菌肽在抗細菌活性中的應用。
[0011]有益效果:與現有技術相比，本發明首次從美國白蛾中克隆的天蠶素A基因的cDNA全長序列，并獲得其表達蛋白，依據該蛋白序列，首次用化學方法合成C末端酰胺化的美國白蛾天蠶素A抗菌肽，采用瓊脂糖孔穴擴散法測定合成美國白蛾天蠶素A抗菌肽對大腸桿菌E.coli K12D31和農桿菌Agrobacterium EHA105的抗菌活性，具有很強的抗細菌活性，在抑菌中具有廣泛的應用前景。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0012]圖1是美國白蛾天蠶素A抗菌肽對大腸桿菌的抗菌活性結果圖；
圖2是美國白蛾天蠶素A抗菌肽對農桿菌的抗菌活性結果圖。

【具體實施方式】
[0013]下面結合具體實施例對本發明做進一步的解釋。
[0014]在本發明中所使用的術語，除非有另外說明，一般具有本領域普通技術人員通常理解的含義。在以下的實施例中，未詳細描述的各種過程和方法是本領域中公知的常規方法。所用到的引物，均在首次出現時標明，其后所用相同引物，均以首次標明的內容相同。以下實施例中使用的美國白蛾由徐州林業站提供。
[0015]實施例1 克隆 Cecropin A cDNA 1、提取美國白蛾總RNA。
[0016]應用RNA抽提試劑(TIANGEN)按照其操作手冊提取美國白蛾蛹脂肪體的總RNA，并通過甲醛變性瓊脂糖凝膠電泳鑒定其純度，大于95%，紫外分光光度計測定其濃度為720ng/^L，滿足使用需求。
[0017]2、采用Transgen cDNA逆轉錄試劑盒轉錄為第一鏈cDNA。
[0018]I)引物設計:根據NCBI惜古比天蠶,家蠶及果蠅Cecropin A序列比對設計兼并引物:
Cec-Al:5’ - ATGAATTTCNCAANAATNNTNTNCTTCGT -3’，
Cec-A2:5’ _ NTATTTNCNAANGNTTTTNCNGTACCCAG -3'
[0019]2)逆轉錄:在DEPC處理的1.5mL Eppendorf管中依次加入總RNA抽提物3 μ L，Oligo d (T)18 (0.5 μ g/ μ L)1 μ L, 2 X TS React1n Mix 10 μ L, DEPC 水 5 μ L，TransScriptRT/RI Enzyme Mix I μ L ;42°C孵育 30min, 85°C加熱 5min 失活 TransScript RT。將得到的cDNA分裝后-20°C保存。
[0020]3) PCR:利用逆轉錄所得模板進行PCR,體系為25 μ L, 10 μ mol/L上、下游引物(上游引物:5’ - ATGAATTTCTCAAGAATTTTATTCTTC-3’，下游引物:5’ - TTATTTTCCT AATGCTTTTGCGGTAC-3，)各 I μ L，2.5mmol/L dNTP 2 μ L, 1XDreamTaq buffer 2.5 μ L, cDNA 模板
1.5 μ L，DreamTaq 酶 0.3 μ LjPddH2O 16.7 μ L0 反應程序為:94°C 5min, (94 °C 30s, 58 °C30s, 72°C Imin)，30個循環，最后72°C延伸1min。反應完成后將產物于1%瓊脂糖凝膠中電泳分離，用膠回收試劑盒回收得到DNA條帶,克隆入pMD19-T載體,經含Amp抗生素(50mg/mL)的瓊脂糖平板篩選轉化子，挑出陽性克隆送往上海英駿測序公司進行堿基序列測定，得到192bp的片段,將該序列與惜古比天蠶和家蠶Cecropin A比對,具有很高的同源相似性，因此確定該序列為美國白蛾Cecropin A cDNA,序列全長如SEQ ID N0.1所不,共440堿基，其中1-58號堿基為該基因的5’UTR非編碼區，59-247號堿基是該基因的全長編碼序列ORF區，翻譯63個氨基酸(從137-247號堿基是該基因的功能區，翻譯37個氨基酸)，248-250為終止密碼子序列，251-440號堿基為該基因的3’ UTR非編碼區。所表達的蛋白序列如SEQID N0.2所示，共63個氨基酸，為基因的ORF區表達產物。
[0021]實施例2
根據實施例1所獲得的美國白蛾天蠶素A蛋白序列，體外合成美國白蛾天蠶素A抗菌肽的多肽序列(N端一C端):RWKIFKKIERVGQNVRDGIIKAGPAIQVLGTAKALGK，主要具體過程如下:
首先將一個氨基被封閉基團保護的氨基酸共價連接在固相載體上。在三氟乙酸的作用下，脫掉氨基的保護基，這樣第一個氨基酸就接到了固相載體上了。然后氨基被封閉的第二個氨基酸的羧基通過N, N ' - 二環己基碳二亞胺(DCC, Dicyclohexylcarbodiimide)活化，羧基被DCC活化的第二個氨基酸再與已接在固相載體的第一個氨基酸的氨基反應形成肽鍵，這樣在固相載體上就生成了一個帶有保護基的二肽。
[0022]重復上述肽鍵形成反應，使肽鏈從C端向N端生長，直至達到所需要的肽鏈長度。最后脫去保護基X，用HF水解肽鏈和固相載體之間的酯鍵，就得到了合成好的肽，并且C末端酰胺化，以每管I毫克分裝。純度用HPLC分析高達95%以上。
[0023]利用0.9%NaCl 溶液倍比稀釋分別配成 lmg/mL,0.5mg/mL,0.25mg/mL,0.125mg/mL, 0.0625mg/mL, 0.03125mg/mL, 0.01563mg/mL, 0.00781mg/mL 濃度的美國白蛾天香素 A 抗菌肽溶液。
[0024]I)抗大腸桿菌疋co7iK12D31活性鑒定
檢測采用瓊脂糖孔穴擴散法測定合成美國白蛾天蠶素A抗菌肽對大腸桿菌E.co7iK12D31的抗菌活性。接種K12D31于液體LB培養基，37°C 200rpm培養至對數生長期，按1%菌量加至融化的LB瓊脂糖培養基中(35-50°C )，混勻后按1mL/皿鋪于無菌一次性平皿。凝固后，在無菌條件下打孔，加入待測的樣品后置于37°C培養箱8小時，觀察抑菌活性，結果見圖1，具有很強的抗菌活性。
[0025]2)抗農桿菌活性鑒定
采用瓊脂糖孔穴擴散法測定合成抗菌肽美國白蛾天蠶素A對農桿菌Agrobac teriumEM 1 5的抗菌活性。接種EHA105于液體LB培養基，28°C 200rpm培養至對數生長期，按1%菌量加至融化的LB瓊脂糖培養基中(35-50°C )，混勻后按1mL/皿鋪于無菌一次性平皿。凝固后，在無菌條件下打孔，加入待測的樣品后置于28°C培養箱16小時，觀察抑菌活性，結果見圖2，具有很強的抗菌活性。
【權利要求】
1.一種美國白蛾天蠶素A基因，其DNA序列如SEQ ID N0.1所示。
2.權利要求1所述的美國白蛾天蠶素A基因的表達蛋白，其氨基酸序列如SEQID N0.2所示。
3.權利要求1所述的美國白蛾天蠶素A基因在抗細菌活性中的應用。
4.權利要求2所述的美國白蛾天蠶素A基因的表達蛋白在抗細菌活性中的應用。
5.一種美國白蛾天蠶素A抗菌肽，其特征在于:所述的美國白蛾天蠶素A抗菌肽的多肽序列為美國白蛾天蠶素A基因的表達蛋白序列的一部分，具體序列為:RffKIFKKIERVGQNVRDGIIKAGPAIQVLGTAKALGKo
6.權利要求5所述的美國白蛾抗菌肽-天蠶素A在抗細菌活性中的應用。
【文檔編號】C12N15/12GK104357452SQ201410616987
【公開日】2015年2月18日 申請日期:2014年11月6日 優先權日:2014年11月6日
【發明者】諸葛強, 張嘉鑫, 武小龍, 王曉立, 潘惠新, 尹佟明 申請人:南京林業大學