腺泡狀軟組織肉瘤的基因探針及其試劑盒應用的制作方法
【專利摘要】本發明涉及腺泡狀軟組織肉瘤的基因探針及其試劑盒應用。本發明基因探針選用的克隆片段分別是RP11-634L10、RP11-51H16和RP11-475F12組合，以及CTD-2311N12、RP11-416B14、CTD-2522M13、CTD-2312C1和CTD-2248C21組合。本發明克服了RT-PCR和細胞核型分析方法繁瑣且耗時及RNA降解以及很多其他因素均限制了RT-PCR的應用，且無法得到準確診斷，影響預后以及術后處理等缺陷。本發明準確率高、特異性高、成功率高，熒光信號強，操作簡捷，可應用在石蠟切片中，拓展了檢測標本的范圍，建立了準確可靠簡便診斷腺泡狀軟組織肉瘤的新方法，開創了利用FISH檢測腺泡狀軟組織肉瘤的先河。
【專利說明】腺泡狀軟組織肉瘤的基因探針及其試劑盒應用

【技術領域】
[0001]本發明屬于熒光原位雜交探針的應用領域，特別涉及腺泡狀軟組織肉瘤的基因探針及其試劑盒應用。

【背景技術】
[0002]腺泡狀軟組織肉瘤是一種起源不明，好發于兒童和青年的罕見惡性軟組織肉瘤，主要癥狀表現為緩慢生長的軟組織腫塊，現已明確腺泡狀軟組織肉瘤的腫瘤組織中存在特異性基因非平衡易位，即:der(17) t (X ；17) (pll.2 ；q25)，導致Xpll.2處TFE3端粒側基因經復制后易位至17q25，并與17q25ASPL基因的著絲粒側融合形成ASPL-TFE3融合基因。多數腺泡狀軟組織肉瘤患者在發現和治療后易出現遠處轉移，且對放化療不敏感，總體預后較差，5年、10年、20年生存率分別是60 %、38%、15 %，因此準確診斷對腺泡狀軟組織肉瘤患者的預后判斷及后續治療有相當重要的意義。
[0003]在本發明之前，腺泡狀軟組織肉瘤的診斷主要依靠組織病理學特征，光鏡下腫瘤排列成巣狀或腺泡狀，周圍常被寬窄不等的纖維性間隔包繞，瘤細胞呈圓形或多角形，胞質豐富呈半透明空泡狀或嗜伊紅顆粒狀，核大小不一，單核或雙核，核仁大而明顯，最具特征的胞漿內棒狀結晶體出現幾率只在20% -80%左右。組織形態典型的腺泡狀軟組織肉瘤較易診斷，部分腫瘤組織缺乏典型的形態學表現，則需要與副神經節瘤、顆粒細胞瘤、XP11.2易位/TFE3基因融合相關性腎癌和黑色素瘤等相鑒別，尤其是在少見發病部位、轉移灶、細針穿刺活檢組織較少的情況下更難以明確診斷。腺泡狀軟組織肉瘤形成ASPL-TFE3融合基因，導致TFE3蛋白的過表達，因此TFE3免疫組化檢測對腺泡狀軟組織肉瘤具有一定的特異性，但在其它腫瘤如XP11.2易位/TFE3基因融合相關性腎癌、顆粒細胞腫瘤、腎上腺皮質癌、血管周上皮樣細胞瘤和高級別粘液纖維肉瘤等組織中也會出現TFE3免疫組化的陽性結果，所以TFE3免疫組化只能作為診斷腺泡狀軟組織肉瘤的輔助依據。
[0004]對于腺泡狀軟組織肉瘤來說，其特異性的基因改變類型是其診斷的重要依據，只有RT-PCR和細胞核型分析才能較準確的達到診斷目的，但是進行核型分析就必須在切除腫瘤后將腫瘤細胞進行細胞培養至有絲分裂期后，利用G顯帶等技術對腫瘤細胞進行核型分析，這種方法繁瑣且耗時不適合在臨床工作中對于應用。同樣的，考慮到腺泡狀軟組織肉瘤的少見性以及PCR試驗流程的復雜性是無法常規利用RT-PCR對腺泡狀軟組織肉瘤組織進行ASPL-TFE3融合基因檢測的，而當懷疑腺泡狀軟組織肉瘤時只能從石蠟切片中提取RNA, RNA降解以及很多其他因素均限制了 RT-PCR的應用，且技術復雜不適合廣泛應用。
[0005]這些限制導致了一些疑似腺泡狀軟組織肉瘤的患者無法得到準確診斷，影響臨床醫師對腺泡狀軟組織肉瘤患者預后以及術后處理。目前亟需一種可以快速、經濟、準確診斷腺泡狀軟組織肉瘤的方法。


【發明內容】

[0006]本發明的目的是針對上述診斷方法的缺陷，提供一種腺泡狀軟組織肉瘤的基因探針及其試劑盒應用。
[0007]本發明的技術方案是:
[0008]腺泡狀軟組織肉瘤的基因探針，其主要技術特征在于基因探針選用的克隆片段分別是 RP11-634L10、RP11-51H16 和 RP11-475F12 組合，以及 CTD-2311N12、RP11-416B14、CTD-2522M13、CTD-2312C1 和 CTD-2248C21 組合。
[0009]所述其中RP11-634L10、RP11-51H16和RP11-475F12組合是定位于17號染色體ASPL基因上，三者標記為相同的紅色熒光信號。
[0010]所述其中CTD-2311N12、RP11-416B14、CTD-2522M13、CTD-2312C1 和 CTD-2248C21組合是定位于X染色體TFE3基因上，均標記為相同的綠色熒光信號。
[0011]所述定位于17號染色體ASPL基因上的克隆片段，RP11-634L10、RP11-51H16和RP11-475F12這3個克隆片段之間必須完全覆蓋ASPL基因且相鄰克隆片段之間存在少量的片段重疊。
[0012]所述定位于X染色體TFE3基因上的克隆片段，CTD-2311N12、RPl 1-416B14、CTD-2522M13、CTD-2312C1和CTD-2248C21這5個的克隆片段組合必須完全覆蓋TFE3基因且同側相鄰的克隆片段之間存在少量的片段重疊或者相鄰之間相距不超過10Kb。
[0013]本發明的另一技術方案是:
[0014]腺泡狀軟組織肉瘤的基因探針試劑盒，該試劑盒由探針雜交液以及4'，6_ 二脒基-2-苯基吲哚復染劑組成，其主要技術特征在于:
[0015](I)定位于 17 號染色體 ASPL 基因上的 RP11-634L10、RP11_51H16 和 RP11-475F12組合，標記為紅色熒光信號；定位于X染色體TFE3基因上CTD-2311N12、RP11-416B14、CTD-2522M13、CTD-2312C1和CTD-2248C21組合，標記為綠色熒光信號；
[0016](2)探針雜交液是由所述探針與Human Cot_lDNA、雜交緩沖液、純化水按比例混合配置而成，需要_20°C避光冷凍保存；
[0017](3) 4'，6- 二脒基-2-苯基吲哚復染劑主要用于細胞核染色。
[0018]所述定位于17 號染色體 ASPL 基因上的 RP11-634L10、RP11-51H16 和 RP11-475F12組合，這3個克隆片段之間必須完全覆蓋ASPL基因且相鄰克隆片段之間存在少量的片段重疊，三者標記為相同的紅色熒光信號；定位于X染色體TFE3基因上CTD-2311N12、RP11-416B14、CTD-2522M13、CTD-2312C1 和 CTD-2248C21 組合，這 5 個的克隆片段組合必須完全覆蓋X染色體TFE3基因且同側相鄰的克隆片段之間存在少量的片段重疊或者相鄰之間相距不超過10Kb，將上述探針與Human Cot-1 DNA、雜交緩沖液、純化水按比例混合配置成探針雜交液。
[0019]本發明還有一種技術方案是:
[0020]腺泡狀軟組織肉瘤的基因探針試劑盒應用，其主要技術特征在于在診斷腺泡狀軟組織肉瘤中的應用。
[0021]本發明的優點和效果在于利用FISH技術檢測腺泡狀軟組織肉瘤中特有的ASPL-TFE3融合基因從而在基因水平診斷該腫瘤，該基因探針應用的準確率高、特異性高、成功率高，熒光信號強，操作簡捷，可應用在石蠟切片中，拓展了檢測標本的范圍，建立了準確可靠簡便診斷腺泡狀軟組織肉瘤的新方法，開創了利用FISH檢測腺泡狀軟組織肉瘤的先河。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0022]圖1—基因探針定位模式示意圖。
[0023]圖2-男性顆粒細胞癌陰性對照病例應用示意圖。
[0024]圖3-女性顆粒細胞癌陰性對照病例應用示意圖。
[0025]圖4——男性腺泡狀軟組織肉瘤應用示意圖。
[0026]圖5——女性腺泡狀軟組織肉瘤應用示意圖。
[0027]圖6——男性腺泡狀軟組織肉瘤應用示意圖。
[0028]圖7——女性腺泡狀軟組織肉瘤應用示意圖。

【具體實施方式】
[0029]本發明的技術思路是:
[0030]熒光原位雜交是利用標記有熒光素的探針特異性地與染色體和(或)基因位點相結合，通過熒光顯微鏡觀察熒光信號的類型，從而檢測染色體和相應基因變化的方法，具有安全、快速、經濟、靈敏度高、檢測信號強、雜交特異性高、能同時顯示多種顏色等優點，而且彌補了傳統方法對間期細胞、復雜核型細胞以及染色體微缺失無法診斷的缺陷。同時，熒光原位雜交技術可以應用于石蠟包埋的樣本上進行回顧性研究，大大降低了檢測對研究樣本的要求。基于近年來熒光原位雜交技術的快速發展，本發明根據熒光原位雜交的原理，提出了一種用于診斷腺泡狀軟組織肉瘤的基因探針及其試劑盒應用。
[0031]下面通過實施例對本發明作進一步的闡述。
[0032]本發明采用的基因探針不同于現有技術，且屬于首次應用FISH技術檢測腺泡狀軟組織肉瘤，是基于對腺泡狀軟組織肉瘤基因改變特點的研究以及對TFE3基因以及ASPL基因特異性的BAC克隆片段結合位點的的綜合分析篩選出的方案。
[0033]本發明中，ASPL基因上的BAC克隆片段為RP11-634L10(片段長度約為172Kb)、RP11-51H16片段長度約為166Kb)和RP11-475F12 (片段長度約為185Kb)的組合；TFE3基因上的BAC克隆片段為CTD-2311N12(片段長度約為210Kb)、RP11-416B14(片段長度約為182Kb)、CTD-2522M13 (片段長度約為182Kb)、CTD-2312C1 (片段長度約為210Kb)和CTD-2248C21(片段長度約為88Kb)的組合。這些片段均為細菌人工染色體克隆(BAC克隆)，其在人類染色體上的定位均已公開。
[0034]選擇兩組共8個克隆片段有以下幾點優勢:(I)多數克隆片段大小基本在最適宜的標記長度150-200Kb左右，這樣的克隆片段不僅彼此信號強度相似，而且不會出現因為克隆片段長短不一導致信號的強度差異較大；(2)同側相鄰片段之間存在少量序列重疊或者相距不超過10Kb，使得同種顏色信號相互連續，不會出現同側信號的斷裂以及單獨信號的出現，減少誤判的幾率；(3)兩組克隆片段均完整覆蓋所選基因，在腺泡狀軟組織肉瘤中可以形成單個融合信號。
[0035]BAC克隆片段標記熒光，便于使用熒光顯微鏡觀察，方便直觀，同時，若需要采用其他檢測技術也可以標記成與其對應的檢測標記物。
[0036]本發明的作用:
[0037]本發明根據腺泡狀軟組織肉瘤的基因易位的特點，利用熒光原位雜交原理，在TFE3基因和ASPL基因處分別使用不同色熒光標記的基因探針，通過檢測石蠟包埋組織切片上的融合或者分離信號，判斷腫瘤組織ASPL-TFE3基因是否發生特定的基因非平衡易位融合，提高了診斷準確率，為判斷患者預后和術后輔助治療提供準確的信息和指導。在探針設計完成后，將其應用于已經明確診斷的腺泡狀軟組織肉瘤的檢測，根據我們的實驗結果，該探針應用的準確率高、特異性高、成功率高，實驗信號強，操作簡單快捷，尤其是可在石蠟切片中應用，拓展了檢測標本的范圍，為準確診斷腺泡狀軟組織肉瘤提供了新的方法及工具。
[0038]實施例1:
[0039]步驟1:基因探針的制備:
[0040]通過http://genome, ucsc.edu/查找X染色體TFE3基因和ASPL基因對應的細菌人工染色體(BAC克隆)，分別選擇相應的BAC克隆片段，控制同側所選BAC克隆片段完整覆蓋相對于基因，而同側片段相互之間有一定序列的重疊。按上述要求選取ASPL基因上的 BAC 克隆片段為 RPll-634L10(chrl7:79796813_79969288，片段長度約為 172Kb)、RPll-51H16(chrl7:79931578-80097452,片段長度約為 166Kb)和 RP11-475F12 (chrl7:80032268-80216871，片段長度約為185Kb)的組合；TFE3基因上的BAC克隆片段為CTD-2311N12(chrX:48713289-48923401，片段長度約為 210Kb)、CTD-2522M13 (chrX:48420425-48602847，片段長度約為 182Kb)、RP11-416B14(chrX:48580872-48763198,片段長度約為 182Kb)、CTD-2312Cl(chrX:48959513-49170367,片段長度約為 210Kb)、CTD-2248C21 (chrX:49154756-49242991,片段長度約為 88Kb)。并在 http://projects.tcag.ca/cg1-b i n/efi sh/index.cgi對所選取的BAC克隆進行特異性分析，明確所選BAC片段在染色體上的特異性。本發明中的基因探針定位模式如圖1所示。從Invitrogen公司購置相應的BAC克隆，將BAC克隆培養后提取質粒，利用缺口平移法，將ASPL基因的3個BAC克隆片段用Tetramethylrhodamine-5-dUTP標記為紅色熒光，將TFE3基因的BAC克隆片段用Fluorescein-12-dUTP標記為綠色熒光，兩端顏色可以互換。為了檢測構建克隆的正確性，分別將每個標記熒光信號的克隆片段單獨在細胞滴片(由健康人體的外周血細胞經過培養，秋水仙素處理，低滲，固定后得到含大量有絲分裂細胞的懸液制成)上進行雜交定位實驗，在有絲分裂中期細胞上觀察克隆片段在染色體上的定位。上述10組克隆片段分別經過驗證，均能準確定位于ASPL基因和TFE3基因上，最后將標記好的克隆片段提純后與Human Cot_lDNA、雜交緩沖液、純化水按比例配置成探針雜交液，_20°C避光冷凍保存。
[0041]下一步，將制備的探針采用熒光原位雜交的方法，在已臨床診斷為腺泡狀軟組織肉瘤和顆粒細胞癌中驗證其診斷效果。
[0042]步驟2:熒光原位雜交過程:
[0043](I)組織切片預處理:將先前準備的腫瘤組織切片在65±1°C恒溫箱烤片過夜，取出后放入二甲苯浸泡30mi η,再放入無水乙醇浸泡1min。接著放入100 %、85 %、70 %梯度乙醇和純化水中復水各3min，放入純化水中100±5°C煮片20min。切片取出晾干后，在樣本區域滴加10ul胃蛋白酶液，消化5mi η。迅速放入2X SSC溶液中洗滌5min，最后放入室溫的70%、85%、100%梯度乙醇依次脫水各3min，取出晾干。(2)組織切片與探針共變性:加10 μ I的探針雜交液至干燥22x22mm蓋玻片上，將步驟(I)處理過的組織切片樣本面朝下蓋在蓋玻片上，反轉后輕壓蓋玻片使雜交液均勻分布，用橡皮膠水沿蓋玻片邊緣封片。將玻片放在85 土 1°C的熱臺上變性5min，迅速放入預熱的雜交盒中，37 土 1°C避光孵育過夜。
(3)雜交后洗滌及復染:在37±1°C的水浴箱中，預熱2xSSC溶液、0.1 % NP_40/2xSSC溶液。將步驟(2)處理過的組織切片去除橡皮膠水和蓋玻片，放入2xSSC溶液中洗滌lOmin，再放Λ0.1% NP-40/2xSSC溶液中洗滌5min，然后室溫下70%乙醇脫水3min，暗處晾干。滴加10 μ I DAPI復染劑至另一張干燥的22x22mm蓋玻片上，將先前晾干的組織切片樣本面朝下，使目標區域接觸蓋玻片，反轉后輕壓蓋玻片去除氣泡，暗處存放待觀察。
[0044]結果判定:
[0045]暗室中用Olympus BX51熒光顯微鏡DAPI/FIFC/TexasRed三色濾光鏡激發，在100倍物鏡下觀察FISH熒光信號，用Imstar公司提供的FISH分析軟件分析圖像，評估整個切片的探針雜交情況。
[0046]使用熒光顯微鏡可以觀察到兩種信號類型:(I)紅綠分離信號:在未發生TFE3基因與ASPL基因易位的腫瘤組織中，由于X染色體與17號染色體相距較遠，則分別染色體上分別標記紅綠信號獨立出現，紅綠信號的數量取決于細胞核內X染色體及17號染色體數目，正常女性由于兩條X染色體和2條17號染色體，就會出現2個紅色信號+2個綠色信號，而男性只出現2個紅色信號+1個綠合信號；(2)單融合信號:當發生腺泡狀軟組織肉瘤中TFE3端粒側基因與17號染色體ASPL基因端粒側發生非平衡易位時，X染色體結構沒有任何變化，而新的17號染色體則由ASPL基因著絲粒側與易位而來的TFE3端粒側基因構成，由于紅綠信號標記覆蓋了 TFE3基因和ASPL基因的全段，所以易位后使得標記了紅色信號的ASPL基因著絲粒側與標記了綠色信號的TFE3端粒側基因在位置上相毗鄰，形成紅綠連續信號或者黃色信號(紅綠雙色疊加的效果)。女性腺泡狀軟組織肉瘤患者可出現I個融合信號+1紅色信號+2個綠色信號，分別代表在該細胞核內I條17號常染色體上的ASPL基因和經復制而來的X染色體上TFE3基因發生了非平衡易位融合，同時保留了 2條正常的X染色體和I條正常17號染色體。男性患者會出現I個融合信號+1個綠色信號+1紅色信號，分別代表該細胞核內I條17號常染色體上的ASPL基因和經復制而來的TFE3基因發生了非平衡易位融合以及I條正常的X染色體和I條正常17號染色體。
[0047]每一張切片在細胞核染色清晰、雜交信號較強的區域中至少觀察到100個互不重疊的細胞核且有明確FISH信號才能判定FISH檢測有效。超過20%的腫瘤細胞核出現融合信號，判定為ASPL-TFE3非平衡易位FISH檢測陽性，可以診斷為腺泡狀軟組織肉瘤；只出現紅綠分離信號或者信號未達到閾值，則判定為ASPL-TFE3非平衡易位FISH檢測陰性，不能診斷為腺泡狀軟組織肉瘤。
[0048]結果:
[0049]我們對10例腺泡狀軟組織肉瘤和顆粒細胞癌標本利用該基因探針進行檢測，其中5例已經確診為腺泡狀軟組織肉瘤、5例顆粒細胞癌。如果患者病理切片出現融合信號并達到熒光原位雜交診斷陽性標準，即診斷為腺泡狀軟組織肉瘤。5例腺泡狀軟組織肉瘤中全部均出現信號并達到陽性閾值，ASPL-TFE3非平衡易位FISH檢測陽性，符合腺泡狀軟組織肉瘤的診斷；而顆粒細胞癌組織切片均未檢測出分離信號，判斷為陰性。圖2為男性顆粒細胞癌陰性對照病例，在腫瘤組織細胞核內見2個紅色信號+1個綠色信號，分別代表2條未發生ASPL與TFE3基因平衡易位的17號染色體和I條正常的X染色體；圖3為女性顆粒細胞癌陰性對照病例，在腫瘤組織細胞核內見2個紅色信號+2個綠色信號，代表2條未發生ASPL與TFE3基因平衡易位的17號染色體和2條正常的X染色體；圖4為男性腺泡狀軟組織肉瘤病例，在腫瘤組織細胞核內見I個融合信號+1個紅色信號+1個綠色信號，I個融合信號代表在17號染色體發生了 ASPL與TFE3基因非平衡易位，I個紅色信號代表細胞內還有I條未發生易位的17號常染色體，I個綠色信號代表I條正常的X染色體；圖5為女性腺泡狀軟組織肉瘤病例，在腫瘤組織細胞核內見I個融合信號+1個紅色信號+2個綠色信號，代表在17號染色體發生了 ASPL與TFE3基因非平衡易位，同時還保留I條正常的17號染色體以及2條正常的X染色體；圖6為男性腺泡狀軟組織肉瘤，在腫瘤組織細胞核內見I個融合信號+1個紅色信號+1個綠色信號，分別代表在17號染色體發生ASPL與TFE3基因非平衡易位，以及I條未發生易位的17號染色體和I條X染色體；圖7為女性腺泡狀軟組織肉瘤，在腫瘤組織細胞核內見I個融合信號+1個紅色信號+2個綠色信號，分別代表發生ASPL與TFE3基因非平衡易位的17號染色體，以及I條正常的17號常染色體和2條正常的X染色體。
[0050]評價:
[0051]利用FISH技術，自主設計基因探針檢測腺泡狀軟組織肉瘤是國內首次應用。在我們設計的基因探針上所用克隆片段大小相對一致，每一種克隆片段標記信號強度較相似，同側標記的探針信號不出現間斷，信號強度較一般探針強，特異性高，充分考慮到應用于診斷試劑以及制備成診斷試劑盒時的探針的可靠性和有效性，符合應用于臨床診斷的要求。利用熒光原位雜交技術，使用基因探針診斷腺泡狀軟組織肉瘤具有準確、快速、經濟且成功率高的特性，極大的優化了腺泡狀軟組織肉瘤的診斷方法。從附圖2-3中可以看出利用該探針檢測所有的顆粒細胞癌FISH結果均是陰性，而在附圖4-7中顯示該探針檢測腺泡狀軟組織肉瘤的腫瘤組織切片中均成功進行FISH檢測，出現信號，同時FISH檢測結果與典型的病理診斷結果一致。實驗結果顯示本發明在特異性強及敏感性高的優勢，同時該探針雜交成功率高，信號清晰，亮度高，符合制備成診斷試劑盒的要求。
[0052]實施例2:腺泡狀軟組織肉瘤診斷試劑盒
[0053]腺泡狀軟組織肉瘤的基因探針試劑盒，該試劑盒由探針雜交液以及4'，6_ 二脒基-2-苯基吲哚復染劑組成，其特征在于:
[0054](I)定位于 17 號染色體 ASPL 基因上的 RP11-634L10、RP11-51H16 和 RP11-475F12組合，標記為紅色熒光信號；定位于X染色體TFE3基因上CTD-2311N12、RP11-416B14、CTD-2522M13、CTD-2312C1和CTD-2248C21組合，標記為綠色熒光信號；
[0055](2)探針雜交液是由所述探針與Human Cot-1 DNA、雜交緩沖液、純化水按比例混合配置而成，需要-20°C避光冷凍保存；
[0056](3)4' ,6- 二脒基-2-苯基吲哚復染劑主要用于細胞核染色。
[0057](4)腺泡狀軟組織肉瘤的基因探針試劑盒所述的定位于17號染色體ASPL基因上的RP11-634L10、RP11-51H16和RP11-475F12組合，這3個克隆片段之間必須完全覆蓋ASPL基因且相鄰克隆片段之間存在少量的片段重疊，三者標記為相同的紅色熒光信號；定位于 X 染色體 TFE3 基因上 CTD-2311N12、RP11-416B14、CTD-2522M13、CTD-2312C1 和CTD-2248C21組合，這5個的克隆片段組合必須完全覆蓋X染色體TFE3基因且同側相鄰的克隆片段之間存在少量的片段重疊或者相鄰之間相距不超過10Kb。將上述探針與HumanCot-1DNA、雜交緩沖液、純化水按比例混合配置成探針雜交液。
[0058]本發明所述的檢測試劑盒使用方法如下:
[0059]1.將包含腫瘤組織的樣本經10%中性福爾馬林固定，石蠟包埋后制備成3um組織切片；
[0060]2.將切片置于65±1°C恒溫箱烤片過夜，取出后放入二甲苯浸泡30min，再放入無水乙醇浸泡lOmin。接著放入100%、85%、70%梯度乙醇和純化水中復水各3mi n，再放入純化水中100 ±5 °C煮片20min ；
[0061]3.取出晾干后，在樣本區域滴加10ul胃蛋白酶反應液，消化5min，迅速放入2XSSC洗滌5min，最后放入室溫70%、85%、100%梯度乙醇依次脫水各3mi n，取出晾干；
[0062]4.加10 μ I本發明的探針雜交液至干燥22x22mm蓋玻片上，將樣本片翻轉，使樣本朝下，迅速蓋上，反轉后輕壓蓋玻片使雜交液均勻分布，用橡皮膠水沿蓋玻片邊緣封片，完全覆蓋蓋玻片與載玻片接觸的邊緣；
[0063]5.將玻片放在85±1°C的熱臺上，變性5min，迅速將玻片放入預熱的雜交盒中，避光，37± I°C孵育過夜；
[0064]6.將2xSSC溶液、0.1 % NP_40/2xSSC溶液放入37± I °C的水浴中進行預熱，去除切片上的橡皮膠水和蓋玻片，將玻片放入2xSSC溶液中洗滌lOmin，再轉入0.1%NP-40/2xSSC溶液中洗滌5min ;然后室溫70%乙醇脫水3min ；
[0065]7.取出玻片在暗處晾干后，滴加10 μ I DAPI復染劑至干燥的22x22mm蓋玻片上，反轉樣本片，使蓋玻片載玻片的目標區域接觸，反轉后輕壓，避免產生氣泡，在暗處存放，使用熒光顯微鏡觀察熒光信號。每一張切片在細胞核染色清晰、雜交信號較強的區域中至少觀察到100個互不重疊的細胞核且有明確FISH信號才能判定FISH檢測有效。當判定為有效FIS H檢測的切片中，紅綠信號單獨出現或者信號未達到2 O %的閾值，則判定為ASPL-TFE3非平衡易位FISH檢測陰性，不能可以診斷為腺泡狀軟組織肉瘤；當判定為有效FISH檢測的切片中，有超過20%的腫瘤細胞核出現融合信號，則判定為ASPL-TFE3非平衡易位FISH檢測陽性，可以診斷為腺泡狀軟組織肉瘤。
【權利要求】
1.腺泡狀軟組織肉瘤的基因探針，其特征在于基因探針選用的克隆片段分別是 RP11-634L10、RP11-51H16 和 RP11-475F12 組合，以及 CTD-2311N12、RP11-416B14、CTD-2522M13、CTD-2312C1 和 CTD-2248C21 組合。
2.根據權利要求1所述的腺泡狀軟組織肉瘤的基因探針，其特征在于其中RP11-634L10、RP11-51H16和RP11-475F12組合是定位于17號染色體ASPL基因上，三者標記為相同的紅色熒光信號。
3.根據權利要求1所述的腺泡狀軟組織肉瘤的基因探針，其特征在于其中CTD-2311N12、RP11-416B14、CTD-2522M13、CTD-2312C1 和 CTD-2248C21 組合是定位于 X 染色體TFE3基因上，均標記為相同的綠色熒光信號。
4.根據權利要求2所述的腺泡狀軟組織肉瘤的基因探針，其特征在于定位于17號染色體ASPL基因上的克隆片段，RP11-634L10、RP11-51H16和RP11-475F12這3個克隆片段之間必須完全覆蓋ASPL基因且相鄰克隆片段之間存在少量的片段重疊。
5.根據權利要求3所述的腺泡狀軟組織肉瘤的基因探針，其特征在于定位于X染色體 TFE3 基因上的克隆片段，CTD-2311N12、RP11-416B14、CTD-2522M13、CTD-2312C1 和CTD-2248C21這5個的克隆片段組合必須完全覆蓋TFE3基因且同側相鄰的克隆片段之間存在少量的片段重疊或者相鄰之間相距不超過10Kb。
6.腺泡狀軟組織肉瘤的基因探針試劑盒，其特征在于該試劑盒由探針雜交液以及4! ,6- 二脒基-2-苯基吲哚復染劑組成: (1)定位于17 號染色體 ASPL 基因上的 RP11-634L10、RP11-51H16 和 RP11-475F12組合，標記為紅色熒光信號；定位于X染色體TFE3基因上CTD-2311N12、RP11-416B14、CTD-2522M13、CTD-2312C1和CTD-2248C21組合，標記為綠色熒光信號； (2)探針雜交液是由所述探針與HumanCot-1 DNA、雜交緩沖液、純化水按比例混合配置而成，需要_20°C避光冷凍保存； (3)4',6- 二脒基-2-苯基吲哚復染劑主要用于細胞核染色。
7.根據權利要求6所述的腺泡狀軟組織肉瘤的基因探針試劑盒，其特征在于:定位于17號染色體ASPL基因上的RP11-634L10、RP11-51H16和RP11-475F12組合，這3個克隆片段之間必須完全覆蓋ASPL基因且相鄰克隆片段之間存在少量的片段重疊，三者標記為相同的紅色熒光信號；定位于X染色體TFE3基因上CTD-2311N12、RP11-416B14、CTD-2522M13、CTD-2312C1和CTD-2248C21組合，這5個的克隆片段組合必須完全覆蓋X染色體TFE3基因且同側相鄰的克隆片段之間存在少量的片段重疊或者相鄰之間相距不超過10Kb，將上述探針與Human Cot-1 DNA、雜交緩沖液、純化水按比例混合配置成探針雜交液。
8.腺泡狀軟組織肉瘤的基因探針試劑盒應用，其特征在于在應用于診斷腺泡狀軟組織肉瘤。
【文檔編號】C12N15/11GK104313023SQ201410638014
【公開日】2015年1月28日 申請日期:2014年11月10日 優先權日:2014年11月10日
【發明者】甘衛東, 陳顯成, 樊祥山, 屈峰, 曾浩, 郭宏騫 申請人:南京大學醫學院附屬鼓樓醫院