一種快速鑒定灰葡萄孢菌對多菌靈抗性基因型f200y菌株的分子檢測方法
【專利摘要】本發明公開了一種對快速鑒定灰葡萄孢菌對多菌靈抗性基因型F200Y菌株的分子檢測方法，以基于環介導恒溫擴增技術(LAMP)建立起來的一種快速、便捷、特異性強、靈敏度高和成本低廉的分子檢測技術。該檢測方法通過在灰葡萄孢菌對多菌靈抗性基因型F200Y菌株的β微管蛋白上設計2對特異性引物，進行LAMP擴增，根據反應產物顏色判定是否為灰葡萄孢菌對多菌靈抗性基因型F200Y菌株。LAMP擴增產物顯示為天藍色，電泳圖譜呈梯狀條帶，有產物擴增，鑒定為灰葡萄孢菌對多菌靈的抗性基因型F200Y菌株；LAMP擴增產物顯示為紫色，電泳圖譜無條帶，無產物擴增，鑒定為灰葡萄孢菌對多菌靈的非抗性基因型F200Y菌株。本發明簡便、快速、成本低，對作物灰霉病的抗性風險評估及合理用藥具有重要的理論指導意義。
【專利說明】一種快速鑒定灰葡萄孢菌對多菌靈抗性基因型F200Y菌株 的分子檢測方法

【技術領域】
[0001] 本發明是基于環介導恒溫擴增技術（loop-mediated isothermal amplification， LAMP)對灰葡萄孢菌的多菌靈抗性基因型F200Y菌株的快速分子鑒定方法，屬于生物學領 域中分子生物學的檢測方法。

【背景技術】
[0002] 灰霉病是一類由灰葡萄孢（Botrytis cinerea)引起的植物真菌病害，可危害200 多種蔬菜、果樹以及觀賞性植物等重要的經濟作物，該病的發生可引起植物幼苗、果實及貯 藏器官的猝倒、落葉、花腐、爛果及爛窯，造成嚴重的經濟損失。近年來，隨著保護地蔬菜生 產的發展，加重了灰霉病的發生和流行。目前由于作物種質資源缺少高抗灰霉病的品種，采 用化學藥劑是控制灰霉病最有效方便的途徑之一。多年來，灰霉病主要采用苯并咪唑類殺 菌劑或以這類藥劑為主的復配劑進行防治。但是隨著使用年限的增長的使用劑量的增加， 田間逐漸產生了抗藥性群體，從而導致該病防效顯著下降。經過多年的研究，南京農業大學 殺菌劑生物學實驗室發現灰葡萄孢菌對多菌靈的抗藥性菌株主要是由灰葡萄孢菌β-微 管蛋白基因（BC1G_00122)突變造成，該基因編碼第198位或200位氨基酸密碼子的突變 可引起灰葡萄孢菌對多菌靈抗藥性的產生，其中198位氨基酸的突變可引起灰葡萄孢菌對 多菌靈表現高水平抗性，200位氨基酸的突變可導致灰葡萄孢菌對多菌靈表現中等水平抗 性。200位氨基酸突變基因型為TTC - TAC，即苯丙氨酸（Phe，F)-絡氨酸（Tyr，Y)，簡寫 為 F200Y。
[0003] 傳統的鑒定方法需要分離培養病原菌，然后在含藥培養基上培養，再根據藥劑對 菌絲生長的抑制作用進行鑒別，該方法鑒定周期長，從分離到鑒定長達1周，甚至數周，且 在病原菌培養過程中存在雜菌污染。近年來，隨著病原抗性基因型的鑒定，PCR技術得到了 廣泛的應用，該技術需要昂貴的試驗儀器和繁瑣的電泳過程，在鑒定過程中還需要接觸大 量有毒有害試劑，對實驗操作人員存在較大的安全隱患，并且鑒定時長達數小時。為了克服 這些缺點，一種基于環介導恒溫擴增技術（LAMP)在灰葡萄孢菌對多菌靈的抗性基因型的 鑒定上受到一定的關注。
[0004] 環介導恒溫擴增反應（LAMP)是2000年由日本學者Notomi等發明的一種新穎的 恒溫核酸體外擴增技術，廣泛應用于動物、植物等疾病的基因診斷。該技術原理是：利用一 套（4種）特異性引物，在一種高活性鏈置換DNA聚合酶的作用下引起自循環鏈置換反應， 60?65 °C范圍60min內，大量合成目標DNA的同時伴隨有副產物--白色的焦磷酸鎂沉淀 產生。羥基萘酚藍（HNB)是一種金屬離子指示劑，根據反應液中鎂離子的變化而呈現出不 同的顏色，陰性（沒有擴增出產物）時為紫色，陽性（有產物擴增）時為天藍色。LAMP方 法的最大特點就是實現恒溫擴增，不需要循環儀等昂貴的儀器；擴增反應極快，一般在1小 時內完成；擴增產生的產物量大，通過肉眼即可判定結果，不需要繁瑣的電泳過程；靈敏度 高、特異性強；操作簡便、快捷，極適于病原突變基因型的快速鑒定。
[0005] 本發明在抗藥性機制研究的基礎上，基于LAMP技術能快速、準確鑒定灰葡萄孢菌 對多菌靈的抗性基因型F200Y。該鑒定方法具有簡單、快速、成本低，靈敏性高等特點，能大 大提高檢測效率，對灰霉病的抗藥性治理及抗藥性流行預警具有重要的現實意義。然而，經 檢索目前國內外尚未有灰葡萄孢菌對多菌靈抗性基因型F200Y的LAMP快速分子鑒定的相 關報道。


【發明內容】

[0006] 本發明的目的是對已有的灰葡萄孢菌對多菌靈抗性菌株的鑒定方法中存在費時、 費力、成本高、準確性低的缺點，提供一種簡便、快速、省時省力、靈敏度高、檢測成本低的鑒 定灰葡萄孢菌對多菌靈抗性基因型F200Y的分子檢測方法。
[0007] 本發明所述的快速鑒定灰葡萄孢菌對多菌靈抗性基因型F200Y菌株的分子生物 學方法，步驟是：
[0008] (1)在灰葡萄孢菌的β微管蛋白基因（BC1G_00122)上包括200位氨基酸的序列 設計LAMP引物，分別以敏感菌株及抗性基因型F200Y菌株的基因組DNA為模板，利用所述 的LAMP引物在恒溫條件下，進行LAMP擴增，其中：所述的LAMP引物分別是：
[0009] LAMP反應所用的外引物對：
[0010] F3 ：ATCGCCAAAGGTTTCCGATA
[0011] B3 ：AGGTGGTAACACCGGACAT
[0012] LAMP反應所用的內引物對（含錯配堿基）：
[0013] FIP ：T @ GGTCTCGTCAGAGTTCTCAACCAGTTGTCGAGCCATATAACGCA
[0014] BIP ：TGCATGAGAACCTTGAAGCTCAGCGACGGCGGAAACCAAGTG
[0015] (2)對上述LAMP擴增產物觀察其顏色變化，并在3. 0 %瓊脂糖凝膠電泳上分離，觀 察擴增結果；
[0016] (3)鑒定是否為多菌靈抗性基因型F200Y的灰葡萄孢菌株；LAMP擴增產物顯示天 藍色，電泳圖譜應為梯狀條帶，判定為抗性基因型F200Y的灰葡萄孢菌株；擴增產物為紫 色，電泳圖譜無條帶擴增，判定為非抗性基因型F200Y的灰葡萄孢菌株。
[0017] 其中：
[0018] 步驟⑴所述的LAMP總體積優選為10 μ L :
[0019]

【權利要求】
1. 一種基于LAMP技術快速鑒定灰葡萄孢菌對多菌靈抗性基因型F200Y菌株的分子檢 測方法，步驟是： (1) 運用兩對特異性引物對待測樣品的基因組DNA進行LAMP恒溫擴增，其中所述的兩 對特異性引物的堿基序列分別是： LAMP反應所用的外引物對： F3：ATCGCCAAAGGTTTCCGATA B3：AGGTGGTAACACCGGACAT LAMP反應所用的內引物對： FIP：TgiGGTCTCGTCAGAGTTCTCAACCAGTTGTCGAGCCATATAACGCA BIP：TGCATGAGAACCTTGAAGCTCAGCGACGGCGGAAACCAAGTG (2) 對上述LAMP擴增產物觀察其顏色變化，并在3.O%瓊脂糖凝膠電泳上分離，觀察擴 增結果； (3) 鑒定是否為多菌靈抗性基因型F200Y的灰葡萄孢菌株；LAMP擴增產物顯示天藍色， 電泳圖譜應為梯狀條帶，判定為抗性基因型F200Y的灰葡萄孢菌株；擴增產物為紫色，電泳 圖譜無條帶擴增，判定為非抗性基因型F200Y的灰葡萄孢菌株。
2. 根據權利要求1所述快速鑒定灰葡萄孢菌對多菌靈抗性基因型F200Y菌株的分子檢 測方法，其特征在于：步驟（1)所述的LAMP總體積優選為10μL: DNA聚合酶8UVL 0.25 μ? 10χThermoPol Buffer 1.0 μ? MgC^ 25mM 1.6 μ? dNTP IOmM 0.8 μ? FIP 40 μΜ 0.4 pL BIP 40 μΜ 0.4μ? F3 10 μΜ 0.4 μΕ Β3 10 μΜ 0.4μ? 甜菜堿8 M LOuL HNB 2.5 mM 0.8 μ? 基因組DNA 0.4μ? 無菌ddH2〇 2.55 μ?^。
3. 根據權利要求1所述快速鑒定灰葡萄孢菌對多菌靈抗性基因型F200Y菌株的分子檢 測方法，其特征在于：步驟（1)所述的LAMP反應參數優選為60°C45min，80°ClOmin。
【文檔編號】C12Q1/04GK104313177SQ201410646783
【公開日】2015年1月28日 申請日期:2014年11月11日 優先權日:2014年11月11日
【發明者】段亞冰, 周明國, 楊瑩, 張曉柯, 王建新 申請人:南京農業大學