一種利用外周血分離培養免疫細胞的方法
【專利摘要】本發明公開了一種利用外周血分離培養免疫細胞的方法。包括：將外周血在2000rpm、4℃條件下離心10min，收集上層血漿，配制成含血漿的無血清培養基；加入Ficoll分離液，離心；吸取白膜層，洗滌，即得到PBMC；在PBMC中加入無血清培養基，接種于無血清培養基，并添加20～300U/mL IL-2和5～50ng/mL IL-15；培養第13～15天，收集免疫細胞。本發明調整了離心時間、離心轉速和離心溫度，不僅能較大量的獲得血漿，并能保證血漿中蛋白含量的穩定和活性因子成分的不缺失。
【專利說明】一種利用外周血分離培養免疫細胞的方法

【技術領域】
[0001] 本發明涉及一種免疫細胞的培養方法，具體涉及一種利用外周血分離培養免疫細 胞的方法。

【背景技術】
[0002] 細胞免疫治療療法是采集人體自身免疫細胞，經過體外培養，使其數量成千倍增 多，靶向性殺傷功能增強，然后再回輸到人體來殺滅血液及組織中的病原體、癌細胞、突變 的細胞，打破免疫耐受，激活和增強機體的免疫能力，兼顧治療和保健的雙重功效。目前主 要的細胞免疫治療療法包括細胞因子誘導的殺傷細胞（CIK)療法、樹突狀細胞（DC)療法、 DC-CIK細胞療法、自然殺傷細胞（NK)療法、DC-T細胞療法等。
[0003]目前免疫細胞主要通過無血清培養基進行培養，但是臨床上規定使用的無血清培 養基需要添加一定濃度的自體血漿才能達到很好的擴增培養的效果。血漿是血液的重要組 成部分，人體中自體血漿的最大含量為血液體積的55%，故盡可能的得到最大量的自體血 漿是目前免疫細胞擴增培養的關鍵。


【發明內容】

[0004] 現有技術的離心時間短或離心力過低導致外周血血漿分離得到的血漿量少，離 心時間長或離心力過高會使得下層血細胞活率低，從而導致下層PBMC誘導培養得到的免 疫細胞量少。另外，血漿少，同等自體血漿濃度的免疫細胞培養基較少，最終培養獲得的細 胞總量較少。本發明提供一種新的人自體血漿獲得方法。離心的轉速為2000rpm、時間為 lOmin、溫度4°C，在該條件下收集血漿并不影響下層血細胞的活率，并可在免疫細胞培養中 獲得更多的免疫細胞總量。
[0005] 在常規免疫細胞培養中，除獲得上層血漿外，下層細胞需經分離后獲得外周血單 個核細胞（PBMC)，再經誘導、擴增得到NK、NKT、CIK等免疫細胞。因此本發明通過優化血漿 的收集條件，可獲得更多的血漿，保證血漿的白蛋白的含量和活性因子，下層PBMC經誘導 培養獲得更多的免疫細胞（NK/NKT/CIK等）。
[0006] 本發明通過優化離心速度、離心溫度與離心時間，找到最佳的血漿收集的離心條 件，獲得更大的血漿量，同時也保證分離后較高的細胞活率，而且血漿蛋白及血漿中的活性 因子的含量均未減少。
[0007] 本發明目的通過以下技術方案來實現：
[0008] 一種利用外周血分離培養的免疫細胞的方法，包括以下步驟：
[0009] (1)將外周血在2000rpm、4°C條件下離心lOmin，收集上層血衆，配制成含血衆的 無血清培養基，其中血漿的質量百分數為5% ;
[0010] (2)將下層血細胞和生理鹽水按照體積比1:2?2:1混合后，加入Ficoll分離液， 混合液與Ficoll分離液的體積比為1:2?2:1，離心力為700g，離心20?40min ;
[0011] ⑶吸取白膜層，洗絳，即得到PBMC ;
[0012] (4)在PBMC中加入無血清培養基，使細胞密度為5 X IO5?20 X 10 5/ml，重懸細胞 沉淀，接種于無血清培養基，并添加20?300U/mL IL-2和5?50ng/mL IL-15 ;
[0013] (5)當細胞密度大于2 X 106/ml時，添加無血清培養基，使細胞密度保持為5-105/ ml ?I X IOfVml，補加 20 ?300U/mL IL-2 和 5 ?50ng/mL IL-15 ;培養第 13 ?15 天，收集 免疫細胞。
[0014] 步驟（3)所述洗滌是用生理鹽水洗滌兩次。
[0015] 步驟（3)所述白膜層在離心后的上清液從上往下數的第二層，。
[0016] 本發明相對于現有技術所具有的優點及有益效果。
[0017] 1.在現有外周血血漿分離方案中，采用常溫下3000rpm的離心速度分離血漿，在 獲得大量血漿的同時，下層細胞有很大一部分受損，影響后續免疫細胞的培養。本發明調整 了離心時間、離心轉速和離心溫度，不僅能較大量的獲得血漿，并能保證血漿中蛋白含量的 穩定和活性因子成分的不缺失；
[0018] 2.在免疫細胞培養方案中，目前部分采用含胎牛血清的無血清培養基進行培養， 胎牛血清培養屬于動物血清，可能導致動物源性病原體的污染。所以，本發明通過優化血漿 分離條件，得到足夠量的高純度的自體血漿用于培養免疫細胞，規避了使用動物血清所帶 來的風險。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0019] 圖1是NKT細胞100的形態圖；
[0020] 圖2是NKT細胞的流式檢測；
[0021] 圖3是NKT細胞的生長曲線。

【具體實施方式】
[0022] 本發明提供的人自體血漿獲得方法如下：
[0023] (1)醫用抗凝管采集血樣，8支，5ml/支，共40ml。
[0024] (2)將40mL外周血置于2-8°C恒溫運輸箱中，30min內送至細胞中心，細胞中心接 收外周血，登記好相關信息
[0025] 將抗凝管中的外周血轉移到15mL離心管中，分4組，每組IOml外周血，分別進行 不同離心條件下的血漿分離，如下表1，并檢測血漿蛋白濃度（酶聯免疫試劑盒）、后續分離 PBMC量和細胞活率，結果如下表2、表3和表4。
[0026] 表1不同離心條件下的血漿分離
[0027]

【權利要求】
1. 一種利用外周血分離培養免疫細胞的方法，其特征在于，包括以下步驟： (1) 將外周血在2000rpm、4°C條件下離心lOmin，收集上層血衆，配制成含血衆的無血 清培養基，其中血漿的質量百分數為5% ; (2) 將下層血細胞和生理鹽水按照體積比1:2?2:1混合后，加入Ficoll分離液，混合 液與Ficoll分離液的體積比為1:2?2:1，離心力為700g，離心20?40min ; ⑶吸取白膜層，洗絳，即得到PBMC; (4) 在PBMC中加入無血清培養基，使細胞密度為5 X 105?20 X 10 5/ml，重懸細胞沉淀， 接種于無血清培養基，并添加20?300U/mL IL-2和5?50ng/mL IL-15 ; (5) 當細胞密度大于2 X 106/ml時，添加無血清培養基，使細胞密度保持為5-105/ml? 1 X 106/ml，補加20?300U/mL IL-2和5?50ng/mL IL-15 ;培養第13?15天，收集免疫 細胞。
2. 根據權利要求1所述的方法，其特征在于，步驟（3)所述洗滌是用生理鹽水洗滌兩 次。
3. 根據權利要求1所述的方法，其特征在于，步驟（3)所述白膜層在離心后的上清液的 從上往下數的第二層。
【文檔編號】C12N5/078GK104480069SQ201410718862
【公開日】2015年4月1日 申請日期:2014年11月28日 優先權日:2014年11月28日
【發明者】陳海佳, 王一飛, 葛嘯虎, 應杰, 羅二梅, 王小燕 申請人:廣州賽萊拉干細胞科技股份有限公司