檢測桃潛隱花葉類病毒的nasba引物、試劑盒和方法
【專利摘要】本發明公開了一種檢測桃潛隱花葉類病毒的NASBA引物、試劑盒和方法，上游引物、下游引物的序列分別為 SEQ ID NO:1～2；NASBA擴增試劑盒，包括如下組分：（1）NASBA擴增反應液A；（2）NASBA擴增反應液B；檢測方法如下：1）樣品RNA的提取；2）進行PLMVd的NASBA擴增；3）電泳檢測。本發明適用于對桃潛隱花葉類病毒進行快速檢測確證，可廣泛應用于農業生產及環境中的疫情監控及進出口貿易中該類病毒的監測及檢測，操作極為簡便，所需樣品量小且對于模板RNA的質量要求較低。
【專利說明】檢測桃潛隱花葉類病毒的NASBA引物、試劑盒和方法
[0001]【技術領域】:
本發明涉及一種用于檢測桃潛隱花葉類病毒的NASBA引物、試劑盒和方法，屬于植物病原的檢測【技術領域】。
[0002]【背景技術】:
桃潛隱花葉類病毒{Peach latent mosaic viroid, PLMVd)屬于 Avsunviroidae 科，通常含338個左右核苷酸，無中央保守區。其在世界各地的桃栽培區均有發生，主要侵染桃、梨、李、杏等核果類果樹:PLMVd在許多的桃樹(Prunus persica)品種上為潛伏侵染，潛隱期可達5?7年，通常沒有明顯得葉部癥狀，但帶毒桃樹生長緩慢，樹勢衰退，抗性降低。感病品種染病后，在葉片上形成白色或黃色奶油狀的花葉(Peach calico)或印花狀病斑，褪綠斑駁(Peach blotch)，或者是在小葉上形成邊緣壞死的花葉癥狀(Peach mosaic)。病害發生于桃樹生長第二年，癥狀包括延遲4-6天長葉、開花、成熟；高溫時，花瓣出現紫色裂紋；果實不規則、扁狀、色澤暗淡，裂果；芽壞死；桃樹易早衰；有些強毒株系使葉片產生花葉、塊斑、雜色和壞死；還有的能導致莖痘斑和卷葉。可經嫁接和桃蚜傳染，隨無性繁殖材料遠距離傳播。據報道，在我國有的果園桃樹PLMVd發生較普遍，其造成的經濟損失相當嚴重。目前尚未有桃潛隱花葉類病毒的恒溫擴增方面的檢測技術的發明報道。因此，建立簡單實用的桃潛隱花葉類病毒新型檢測鑒定方法，對于提高桃潛隱花葉類病毒的檢疫檢驗效率、防止桃潛隱花葉類病毒的傳入、傳出，保護我國農業的安全生產，促進我國農產品的順利出口，具有十分重要的意義。植物類病毒由于不顯性侵染比較普遍，癥狀表現受環境溫度的影響較大，而且幾種鑒別植物對不同類病毒的反應癥狀相似，故難于應用生物測定的方法。由于類病毒不能產生任何蛋白質，所以也不能使用檢測病毒的電鏡、血清學方法。因此，選用分子生物學方法對桃潛隱花葉類病毒進行檢測。
[0003]NASBA (Nuleic and sequence based amplipicain, NASBA)即“核酸序列依賴性擴增”檢測技術是一種經典的恒溫擴增技術，適用于單鏈核糖核酸RNA —步擴增及檢測，已廣泛應用于人類及動植物病原的檢測與診斷。NASBA是由一對引物引導的，在含有T7 RNA聚合酶、RNAseH、反轉錄酶AMV、NTP、dNTP及需要使用的各種反應緩沖液所組成的標準反應體系中，通過連續均一的體外特異性酶促反應實現核苷酸序列的等溫擴增。
[0004]由于細胞壁中富含大量的多糖、酚類物質，植物病毒RNA的提取存在著穩定性差、重復性低、效率低等問題，加之在提取過程中RNA本身的自降解現象，病毒RNA的含量往往較低，對檢測方法的靈敏度和穩定性提出了較高要求。同時由于多糖等物質對于Taq聚合酶的抑制作用，限制了 RT-PCR技術在葡萄、草莓、糧谷類等多酚含量較高的植物病毒RNA檢測中的應用。由于NASBA技術的反轉錄過程被直接合并到擴增反應中，因此NASBA具備了適合于病原RNA的擴增、檢測的特點，最適合各種RNA樣品的分析，符合植物病毒檢疫的要求，鑒于桃潛隱花葉類病毒危害的嚴重性，加強環境中的的監控，提高檢測效率，對于有效控制桃潛隱花葉類病毒的傳播在現階段具有重要的實際意義。
[0005]
【發明內容】
:
本發明要解決的技術問題是提供一種用于檢測桃潛隱花葉類病毒的NASBA引物，試劑盒和方法。其主要原理是利用一對引物引導，在含有T7 RNA聚合酶、RNAseH、反轉錄酶AMV、NTP,dNTP及需要使用的各種反應緩沖液所組成的標準反應體系中，通過連續均一的體外特異性酶促反應實現核苷酸序列的等溫擴增NASBA。經過循環反復，使RNA不斷擴增，對樣品中的桃潛隱花葉類病毒進行準確的檢測。
[0006]本發明的實現，首先依據桃潛隱花葉類病毒全基因組序列設計特異性引物；再提取待測樣品的核糖核酸(RNA)，然后分別以特異性引物進行NASBA擴增；用瓊脂糖凝膠電泳對擴增產物進行檢測，最后根據NASBA擴增結果來判定樣品中是否含有桃潛隱花葉類病毒。
[0007]本發明用于檢測桃潛隱花葉類病毒的NASBA引物，其引物序列分別為SEQ IDNO:1 ?2。
[0008]SEQ ID NO:1:
NA-Pl:5’ -aattctaatacgactcactatagggagGAGTGATGACCTCTCAGCCC-3’
SEQ ID NO:2:
NA-P2:5，-aattctaatacgactcactatagggagTTCTACGGCGGTACCTGGAT-3 ’
本發明提供的檢測桃潛隱花葉類病毒的NASBA擴增試劑盒，包括如下組分:
(I)NASBA擴增反應液A:
每25 μ L包括 10XAMV buffer 2.5 μ 1,6.25mmol /L NTPs 3 μ L，10 mmol /L dNTPs
1.5 yL, 10 μπιο? /L 引物 NA-P1、NA-P2 各 0.5 μ L，.雙蒸水 9 yL。
[0009]其中緩沖液為含40 mmol /L PH8.5 Tris_HCL，70 mmol /L KCL，12 mmol /LMgCL2，5 mmol /L DTT 緩沖液。
[0010](2) NASBA 擴增反應液 B:
0.5 U RNaseH, 32 U T7RNA 聚合酶，6.4 U AMV 反轉錄酶，2 μ L DMS0，0.1 μ LI mo I/L 二硫蘇糖醇，0.25 μ L 10 mg /mL BSA，20 U RNA 酶抑制劑。
[0011](3) NASBA 擴增程序:
將待檢樣品RNA 3 μ L加入14 μ L反應液Α，在DNA擴增儀或水浴鍋上65 °C溫浴5min，立即轉入41°C溫浴5 min，迅速加入4 μ L反應液B，41°C溫育2 h，4 °C終止反應；
(4)NASBA擴增產物鑒定
反應產物用5%的瓊脂糖凝膠電泳，紫外燈下觀察結果并進行判定。
[0012]本發明還提供了一種檢測桃潛隱花葉類病毒的NASBA的方法，按如下的步驟進行:
I)樣品RNA的提取
A、取0.1 g樣品，加液氮研磨成粉末狀，將研磨物迅速移入1.5 mL離心管中，加入I mLTrizol Reagent，顛倒混勾，2°C ~8°C，12000 g，離心 lOmin。
[0013]B、取上清，15°C~30°C，放置5min ;加入0.2 mL氯仿，用手劇烈震蕩(勿渦旋振蕩)，15s。15°C ~30°C，放置 2min~3min ;2°C ~8°C，12000 g，離心 15min。
[0014]C、吸取600 μ?的上層水相，勿擾動中間相和下層相。加500 μ L異丙醇混合上清液，15°C ~30°C，放置 lOmin。2°C ~8°C，12000 g，離心 lOmin。
[0015]D、去除上清液，沉淀中加入I mL 75%乙醇，洗滌；2°C ~8°C，7500 g，離心5min。
[0016]E、去除上清液，沉淀自然干燥后，將其溶于30 UL -50 μ L無RNase的水中，即為待檢模板RNA。
[0017]2)進行桃潛隱花葉類病毒的NASBA擴增
A.在裝有14μ L環介導等溫擴增反應液A的反應管中加入3 μ L待檢模板RNA，
B.在DNA擴增儀或水浴鍋上65°C溫浴5min,立即轉入41°C溫浴5 min，；
C.在反應管中迅速加入4μ L反應液B;
D.于41°C溫育2h ；
E.將金屬浴調到4°C中止反應，3 min后取出；
3)電泳檢測
取3 g瓊脂糖，于100 mL電泳緩沖液中加熱，充分溶化，加入溴化乙錠貯存液至終濃度為0.5 mg/mL，制膠，在電泳槽中加入電泳緩沖液，使液面剛剛沒過凝膠；將3 mL?6 mLPCR擴增產物分別和適量加樣緩沖液混合，點樣；9 V/cm恒壓電泳，直至溴酚藍指示劑迀移至凝膠中部；紫外檢測儀下觀察電泳結果并記錄。如果擴增片段為163 bp，說明待檢病毒是桃潛隱花葉類病毒，如果沒有出現163 bp擴增片段，則說明待檢病毒不是桃潛隱花葉類病毒。
[0018]本發明根據桃潛隱花葉類病毒的序列高度保守區的設計了兩個特異性內引物，該保守基因序列為具有桃潛隱花葉類病毒的不同株系所共有，以保證從株系的水平上檢測不同來源的桃潛隱花葉類病毒的可靠性。本發明適用于對桃潛隱花葉類病毒進行快速檢測確證，可廣泛應用于生產和環境中的病害監控、進出口貿易中該病毒的確證。
[0019]與現有技術相比，本發明的有益效果包括:
第一，便捷性。該發明在進行恒溫擴增時，不需要昂貴的核酸擴增反應裝置，整個過程始終在42 °C進行，無需熱循環儀，僅I個普通的恒溫水浴鍋就可完成。
[0020]第二，精確度高。該發明酶循環反應的循環數少，不需高溫變性步驟，相對于RT-PCR錯配率較低，更適于檢測和定量特異RNA。
[0021]第三，靈敏度高。該發明比起PCR技術，能用較少的循環便擴增出大量的目的基因，保證了檢測的高敏感性，是PCR技術靈敏度的10倍。
[0022]第四，縮短周期。由于反轉錄過程被直接合并到擴增反應中，PCR大約需要20輪循環才能擴增16倍，而NASBA只需循環4~5輪即可達到10 6倍。
[0023]第五，降低了對植物RNA模板的質量要求。由于細胞壁中富含大量的多糖、酚類物質，植物病毒RNA的提取存在著穩定性差、重復性低、效率低等問題，加之在提取過程中RNA本身的自降解現象，病毒RNA的含量往往較低，對檢測方法的靈敏度和穩定性提出了較高要求。由于該發明針對的模板是RNA，反應的產物也是RNA，反應的結果不受環境中DNA的影響。即使存在外來的雙鏈DNA污染，但由于其不具備T7啟動子序列，不可能被擴增，其次，該反應只在42 °C恒溫條件下進行，不需高溫變性步驟，所以NASBA反應流程不會受到外來雙鏈DNA的污染，因此對于模板純度和質量要求較低。
[0024]【專利附圖】

【附圖說明】:
圖1為本發明對病株樣品中NASBA擴增圖譜。其中M:ssRNA Ladder marker ；1:健康葡萄；2:桃潛隱花葉類病毒感病材料。
[0025]圖2為本發明的特異性結果圖。其中M:ssRNA Ladder marker ;1:桃潛隱花葉類病毒；2:啤酒花矮化類病毒；3:梨泡狀潰瘍類病毒；4:蘋果繡果類病毒；5:蘋果莖痘病毒。
[0026]圖3為本發明的敏感性結果圖。其中M: ssRNA Ladder marker ； 1-7: 1X10'I X 10' I X 10' I X 10' I X 10' I X 1(Γ6、I X l(T7ng/ μ L，桃潛隱花葉類病毒感病材料總RNA0
[0027]圖4為本發明實施例4的實際樣品檢測圖。其中M: ssRNA Ladder marker ；1~20:實際樣品；其中 1、2、3:雨花露桃(S1、S2、S3) ;4、5、6:南水梨(S4、S5、S6) ;8、9、10、11、12、13:大久保桃(S8、S9、S10、S11、S12、S13):雪花梨 S10、S14、S16、S19 ;7、9、14:黃金梨(S7、S9、S14)0

【具體實施方式】
[0028]為了更充分地解釋本發明的實施方法，提供了用于檢測桃潛隱花葉類病毒NASBA試劑盒的實施實例。這些實施實例僅僅是解釋，而不是限制本發明的范圍。其中反轉錄聚合酶 AMV、RNaseH、RNase inhibitor、T7 RNA 聚合酶、dNTP、ssRNA marker、rNTP 均購于 NEWENGLAND B1LAB公司；PCR擴增試劑、DNA marker及等均購于北京天根公司。
[0029]實施例1 I材料
1.1病毒
桃潛隱花葉類病毒為中國檢科院提供，桃潛隱花葉類病毒{Peach latent mosaicviroid, PLMVd)、啤酒花矮化類病毒(/?/? stunt vroid, HSVd)、蘋果繡果類病毒(Applescar skid viroid, ASSVd)、梨泡狀潰瘍類病毒(/fear Blister Canker Viroid, PBCVd) >>蘋果莖痘病毒(々少stem pitting virus, ASPV)由本實驗室保存。
[0030]1.2 試劑
反轉錄聚合酶 AMV、RNaseH、RNase inhibitor、T7 RNA 聚合酶、dNTP、ssRNA marker、rNTP均購于NEW ENGLAND B1LAB公司；PCR擴增試劑、DNA marker及等均購于北京天根公司；
1.3引物
根據NCBI核酸序列數據庫中桃潛隱花葉類病毒的基因全長序列(登錄號AY685181.1)，在保證擴增的兼并性和通用性的前提下通過比較分析桃潛隱花葉類病毒高度保守區，設計5’端帶有T7啟動子序列NASBA反應引物(NA_P1、NA_P2)，設計完成后將引物在數據庫的Primer-Blast模塊下進行比對驗證。
[0031]2 方法
2.1病毒RNA的提取
取0.1 g樣品，加液氮研磨成粉末狀，將研磨物迅速移入1.5 mL離心管中，加入I mLTrizol Reagent，顛倒混勾，2°C ~8°C，12000 g，離心 lOmin。取上清，15°C ~30°C，放置 5min ；加入0.2 1^氯仿，用手劇烈震蕩(勿渦旋振蕩)，158。15°0~30°0，放置21^11~31^11 ；2°C~8°C,12000 g，離心15min。小心吸取為600 PL的上層水相，勿擾動中間相和下層相。加500 μ L異丙醇混合上清液，15°C~30°C，放置lOmin。2°C ~8°C，12000 g，離心lOmin。去除上清液，沉淀中加入I mL 75%乙醇，洗滌；2°0~8°0，7500 g，離心5min。去除上清液，沉淀自然干燥后，將其溶于30 UL -50 μ L無RNase的水中，即為待檢模板RNA。
[0032]2.2 NASBA 擴增體系 A.在裝有14μ L環介導等溫擴增反應液A的反應管中加入3 μ L待檢模板RNA，
B.在DNA擴增儀或水浴鍋上65°C溫浴5min,立即轉入41°C溫浴5 min，；
C.在反應管中迅速加入4μ L反應液B;
D.于41°C溫育2h ；
E.將金屬浴調到4°C中止反應，3 min后取出；
2.3電泳檢測
取3 g瓊脂糖，于100 mL電泳緩沖液中加熱，充分溶化，加入溴化乙錠貯存液至終濃度為0.5 mg/mL，制膠，在電泳槽中加入電泳緩沖液，使液面剛剛沒過凝膠；將3 mL?6 mLPCR擴增產物分別和適量加樣緩沖液混合，點樣；9 V/cm恒壓電泳，直至溴酚藍指示劑迀移至凝膠中部；紫外檢測儀下觀察電泳結果并記錄。預期產物大小為163 bp ο見圖1。
[0033]實施例2特異性實驗
1、提取桃潛隱花葉類病毒、啤酒花矮化類病毒、梨泡狀潰瘍類病毒、桃潛隱花葉病毒、蘋果莖痘病毒的RNA，使用NASBA方法進行檢測。
[0034]2、病毒RNA的提取
取0.1 g樣品，加液氮研磨成粉末狀，將研磨物迅速移入1.5 mL離心管中，加入I mLTrizol Reagent，顛倒混勾，2°C ~8°C，12000 g，離心 lOmin。取上清，15°C ~30°C，放置 5min ；加入0.2 1^氯仿，用手劇烈震蕩(勿渦旋振蕩)，158。15°0~30°0，放置21^11~31^11 ；2°C~8°C,12000 g，離心15min。小心吸取為600 PL的上層水相，勿擾動中間相和下層相。加500 μ L異丙醇混合上清液，15°C~30°C，放置lOmin。2°C ~8°C，12000 g，離心lOmin。去除上清液，沉淀中加入I mL 75%乙醇，洗滌；2°0~8°0，7500 g，離心5min。去除上清液，沉淀自然干燥后，將其溶于30 UL -50 μ L無RNase的水中，即為待檢模板RNA。
[0035]3、擴增反應
Α、在裝有14 μ L環介導等溫擴增反應液A的反應管中加入3 μ L待檢模板RNA，
B.在DNA擴增儀或水浴鍋上65°C溫浴5min,立即轉入41°C溫浴5 min，；
C.在反應管中迅速加入4μ L反應液B;
D.于41°C溫育2h ；
E.將金屬浴調到4°C中止反應，3 min后取出；
4、NASBA產物電泳檢測
取3 g瓊脂糖，于100 mL電泳緩沖液中加熱，充分溶化，加入溴化乙錠貯存液至終濃度為0.5 mg/mL，制膠，在電泳槽中加入電泳緩沖液，使液面剛剛沒過凝膠；將3 mL?6 mLPCR擴增產物分別和適量加樣緩沖液混合，點樣；9 V/cm恒壓電泳，直至溴酚藍指示劑迀移至凝膠中部；紫外檢測儀下觀察電泳結果并記錄。電泳結果顯示，同時使用NASBA方法進行檢測蘋果繡果類病毒、啤酒花矮化類病毒、梨泡狀潰瘍類病毒、桃潛隱花葉病毒、蘋果莖痘病毒的RNA，只有桃潛隱花葉類病毒得到預期163 bp的擴增產物(見圖2)。
[0036]實施例3敏感性實驗
1、用DEPC水將桃潛隱花葉類病毒RNA模板液向下做10倍梯度稀釋，依次為I X 10'I X 10' I X 10' I X 10' I X 10' I X 10' I X l(T7ng/ μ L，各取 2 μ L 為模板分別進行NASBA擴增反應。。
[0037]2、病毒RNA的提取取0.1 g樣品，加液氮研磨成粉末狀，將研磨物迅速移入1.5 mL離心管中，加入I mLTrizol Reagent，顛倒混勾，2°C ~8°C，12000 g，離心 lOmin。取上清，15°C ~30°C，放置 5min ；加入0.2 1^氯仿，用手劇烈震蕩(勿渦旋振蕩)，158。15°0~30°0，放置21^11~31^11 ；2°C~8°C,12000 g，離心15min。小心吸取為600 PL的上層水相，勿擾動中間相和下層相。加500 μ L異丙醇混合上清液，15°C~30°C，放置lOmin。2°C ~8°C，12000 g，離心lOmin。去除上清液，沉淀中加入I mL 75%乙醇，洗滌；2°0~8°0，7500 g，離心5min。去除上清液，沉淀自然干燥后，將其溶于30 UL -50 μ L無RNase的水中，即為待檢模板RNA。
[0038]3、擴增反應
Α、在裝有14 μ L環介導等溫擴增反應液A的反應管中加入3 μ L待檢模板RNA，
B.在DNA擴增儀或水浴鍋上65°C溫浴5min,立即轉入41°C溫浴5 min，；
C.在反應管中迅速加入4μ L反應液B;
D.于41°C溫育2h ；
E.將金屬浴調到4°C中止反應，3 min后取出；
4、NASBA產物電泳檢測
取3 g瓊脂糖，于100 mL電泳緩沖液中加熱，充分溶化，加入溴化乙錠貯存液至終濃度為0.5 mg/mL，制膠，在電泳槽中加入電泳緩沖液，使液面剛剛沒過凝膠；將3 mL?6 mLPCR擴增產物分別和適量加樣緩沖液混合，點樣；9 V/cm恒壓電泳，直至溴酚藍指示劑迀移至凝膠中部；紫外檢測儀下觀察電泳結果并記錄。NASBA產物鑒定:電泳結果顯示，桃潛隱花葉類病毒使用NASBA方法能夠得到10_4稀釋倍數的模板(見圖3)。
[0039]實施例4實際樣品檢測及對比實驗
將從湖北、山東采集的具有典型花葉癥狀或沒有癥狀的葉片樣品及實驗室留樣(出口臺灣梨接穗)14份，雨花露桃(S1、S2、S3)、南水梨(S4、S5、S6)、大久保桃(S8、S9、S10、S11、S12、S13)、黃金梨(S7、S9、S14)分別采用NASBA、RT-PCR進行檢測，比較兩種方法的效果，以進一步評估NASBA方法的可靠性。
[0040]1、實際樣品NASBA檢測 I)病毒RNA的提取
取0.1 g樣品，加液氮研磨成粉末狀，將研磨物迅速移入1.5 mL離心管中，加入I mLTrizol Reagent，顛倒混勾，2°C ~8°C，12000 g，離心 10 min。取上清，15°C ~30°C，放置 5min;加入0.2 mL氯仿，用手劇烈震蕩(勿渦旋振蕩)，15s。15°C ~30°C，放置2 min~3 min ；2°C~8°C, 12000 g，離心15 min。小心吸取為600 PL的上層水相，勿擾動中間相和下層相。加 500 “1^異丙醇混合上清液，15°0~30°0，放置10 min。2°C ~8°C，12000 g，離心 10 min。去除上清液，沉淀中加入I mL 75%乙醇，洗滌；2°0~8°0，7500 g，離心5 min。去除上清液，沉淀自然干燥后，將其溶于30 UL -50 μ L無RNase的水中，即為待檢模板RNA。
[0041]2)擴增反應
Α、在裝有14 μ L環介導等溫擴增反應液A的反應管中加入3 μ L待檢模板RNA，
B.在DNA擴增儀或水浴鍋上65°C溫浴5min,立即轉入41°C溫浴5 min，；
C.在反應管中迅速加入4μ L反應液B;
D.于41°C溫育2h ；
E.將金屬浴調到4°C中止反應，3 min后取出； 3) NASBA產物鑒定
紫外檢測儀下觀察電泳結果并記錄，電泳結果顯示，在14份樣品中7份樣品為陽性，其他樣品為陰性(見圖4)。
[0042]2、PCR 擴增
I)方法:普通RT-PCR反應條件為50 °C反轉錄30 min ；94 °C預變性2 min; 94 °C 30S，53 0C 30 S，72 °C 30 S，循環反應 35 次；65 °C延伸 10 min。
[0043]2)瓊脂糖凝膠電泳結果:在14份樣品中，7份為陽性，其余7份樣品為陰性。
[0044]結論:利用上述NASBA和PCR方法同時檢測實際樣品，兩種方法的符合率100%，但NASBA對設備要求更低，便捷性更高。
[0045]目前，桃潛隱花葉類病毒是我國較為普遍、危害最為嚴重的桃類病毒病，引起的病害往往與病毒病易混淆。本發明的應用將有助于在諸多形態相近的病原癥狀中實現桃潛隱花葉類病毒的快速鑒別。本發明可應用于桃、梨幼苗的培育過程中，通過對類病毒的快速高效檢測，可以確保脫毒梨的質量和增產效果。本發明可對桃潛隱花葉類病毒進行特異性鑒定，可應用于桃、梨種苗的進出口檢疫、國內地區間調運以及病害調查。
【權利要求】
1.檢測桃潛隱花葉類病毒的NASBA擴增引物，其上游引物、下游引物的序列分別為SEQID NO:1 ?2。
2.一種檢測桃潛隱花葉類病毒的NASBA擴增試劑盒，包括如下組分: (1)NASBA擴增反應液A:
每25 μ L包括 1XAMV buffer 2.5 μ 1,6.25mmol /L NTPs 3 μ L，10 mmol /L dNTPs1.5 yL, 10 μ mo I /L 引物 NA-Pl、NA-P2 各 0.5 yL，雙蒸水 9 Ml; 其中緩沖液為含 40 mmol /L PH8.5 Tris-HCL, 70 mmol /LKCL，12 mmol /L MgCL2，5mmol /L DTT 緩沖液； (2)NASBA擴增反應液B: 0.5 U RNaseH, 32 U T7RNA 聚合酶，6.4 U AMV 反轉錄酶，2 μ L DMS0，0.1 μ LI mo I/L 二硫蘇糖醇，0.25 μ L 10 mg /mL BSA，20 U RNA 酶抑制劑。
3.檢測桃潛隱花葉類病毒的NASBA方法，包括下列步驟: 1)樣品RNA的提取 A、取0.1 g樣品，加液氮研磨成粉末狀，將研磨物迅速移入1.5 mL離心管中，加入I mLTrizol Reagent，顛倒混勾，2°C ~8°C，12000 g，離心 1min ; B、取上清，150C~30°C，放置5min ;加入0.2 mL氯仿，用手劇烈震蕩，不要渦旋振蕩，15s ；15°C ~30°C，放置 2min~3min ；2°C ~8°C, 12000 g，離心 15min ； C、吸取600PL的上層水相，勿擾動中間相和下層相，加500 UL異丙醇混合上清液，15°C ~30°C，放置 10min，2°C ~8°C, 12000 g，離心 1min ； D、去除上清液，沉淀中加入ImL 75%乙醇，洗滌；2°C ~8°C，7500 g，離心5min; E、去除上清液，沉淀自然干燥后，將其溶于30UL -50 μ L無RNase的水中，即為待檢模板RNA ； 2)進行PLMVd的NASBA擴增 Α、在裝有14 μ L環介導等溫擴增反應液A的反應管中加入3 μ L待檢模板RNA ； B.在DNA擴增儀或水浴鍋上65°C溫浴5min，立即轉入41°C溫浴5 min ； C.在反應管中迅速加入4μ L反應液B; D.于41°C溫育2h ； E.將金屬浴調到4°C中止反應，3 min后取出； 3)電泳檢測 取3 g瓊脂糖，于100 mL電泳緩沖液中加熱，充分溶化，加入溴化乙錠貯存液至終濃度為0.5 mg/mL，制膠，在電泳槽中加入電泳緩沖液，使液面剛剛沒過凝膠；將3 mL?6 mLPCR擴增產物分別和適量加樣緩沖液混合，點樣；9 V/cm恒壓電泳，直至溴酚藍指示劑迀移至凝膠中部；紫外檢測儀下觀察電泳結果并記錄。
【文檔編號】C12Q1/70GK104498633SQ201410831330
【公開日】2015年4月8日 申請日期:2014年12月29日 優先權日:2014年12月29日
【發明者】吳興海, 張成標, 魏曉棠, 張云霞, 宋濤, 趙麗青, 王簡, 尼秀媚 申請人:山東出入境檢驗檢疫局檢驗檢疫技術中心