一種人乳頭瘤病毒(hpv)分型檢測試劑盒的制作方法
【專利摘要】本實用新型涉及一種能對18種人乳頭瘤病毒(HPV)亞型進行分型和檢測的試劑盒，屬于生物【技術領域】。其包括盒體(1)、襯墊(2)、在襯墊(2)上設有數個容器孔，用于放置試管，試管中分別裝有緩沖液A(3)、MgCl2(4)、dNTP(5)、ddH2O(6)、HotstarTaq聚合酶(7)、正向引物(8)、反向引物(9)、緩沖液B(10)、SAP酶(11)、緩沖液C(12)、iPlex終止反應液(13)、iPlex酶(14)、延伸引物(15)。本實用新型可解決現有檢測方法不能分型、不能區分單獨感染和混合感染、假陽性高、準確率低以及通量低的缺陷，具有分型檢測結果快速、準確、靈敏度高并且通量高的優點。
【專利說明】一種人乳頭瘤病毒(HPV)分型檢測試劑盒

【技術領域】
[0001]本實用新型屬于生物【技術領域】，具體涉及到一種能用于分型和檢測18種人類乳頭瘤病毒(HPV)亞型的試劑盒，可以用于婦女人乳頭瘤病毒(HPV)感染的高通量篩查和宮頸癌等癌癥致病機理的研究。

【背景技術】
[0002]人乳頭瘤病毒(Human Papillomavirus,HPV)是一種嗜上皮病毒,感染人體皮膚及粘膜復層鱗狀上皮。HPV感染引起多種良性和惡性腫瘤。據估計，大約有5.2%的人患癌癥與HPV感染有關，包括 90-93 %的肛門癌，12-63 %的口咽癌，36-40 %的陰莖癌，40-51 %的會陰癌，40-64%的陰道癌和99.7%的宮頸癌等。到目前為止，已經確定的HPV亞型有100多種，按其潛在的致癌能力可分為高危型(High-risk，)即￥，包括即￥16、18、31、33、35、39、45、51、52、56、58、59、68、73 和 82、共 15 種；疑似高危型 HPV，包括 HPV26、53 和 66，共 3種；低危型仏0￥-1^81^，1^)冊￥，包括冊￥6、11、40、42、43、44、54、61、70、72、81 和 CP6108 等。
[0003]HPV是一種雙鏈閉環DNA病毒，含約8k左右堿基，編碼區編碼6個早期開放閱讀基因El、E2、E4、E5、E6和E7，以及2個晚期開放閱讀基因LI和L2。LI開發閱讀框是HPVDNA基因組內最保守的基因，常被用于HPV亞型的區分和鑒定。如果一個HPV的LlDNA序列與其它HPV的LlDNA序列有超過10%的差異，就被定義為另一種亞型。不同的HPV亞型感染后引起的疾病類型有很大的差別，例如高危型HPV感染后與宮頸癌的發生有密切關系，低危型HPV的感染常引起外生殖器的濕疣等良性病變。同一種高危型HPV的持續感染大大增加了被感染者罹患宮頸癌的機會，所以對HPV基因亞型的鑒定，其意義特別重大。
[0004]到目前為止，國內各家醫院的婦科檢查常采用美國FDA (Food and DrugAdministrat1n)批準的雜交捕獲法II (Hybrid Capture II, HC2)來檢查HPV的感染情況，但此方法只能檢測13種高危型HPV的存在與否，不能分型，不能區分單獨感染和混合感染，而且，該方法的技術過程是通過核酸雜交來進行的，因此結果常有大量的假陽性和準確率低的缺點，此外，HC2方法成本高，通量低，所以建立一種高通量、高準確率、能夠分型和價格低廉的HPV檢測和鑒定的方法勢在必行。
實用新型內容
[0005]本實用新型的目的是旨在解決現有HPV的檢測方法不能分型，準確率低，通量低和價格高的缺點，利用基質輔助激光解吸收/電離飛行時間質譜(MALD1-T0F-MS)系統檢測技術，開發一種人乳頭瘤病毒(HPV)分型檢測試劑盒
[0006]本實用新型所采用的技術方案為:建立一種人乳頭瘤病毒(HPV)分型檢測試劑盒，包括包括盒體(1)、襯墊(2)、在襯墊(2)上設有數個容器孔，用于放置試管，試管中分別裝有緩沖液 A(3)、MgCL2 (4)、dNTP(5)、ddH20(6)、HotstarTaq 聚合酶(7)、正向引物(8)、反向引物(9)、緩沖液B (10)、SAP酶(11)、緩沖液C (12)、iPLex終止反應液(13)、iPLex酶
(14)、延伸引物(15)。
[0007]在上述的分子生物學試劑中，緩沖液A(3)裝量為SOOyL5MgCL2G)的裝量為100 μ L ；dNTP(5)的裝量為 100 μ UddH2O (6)的裝量為 500 μ UHotstarTaq 聚合酶(7)的裝量為10 μ L、正向引物(8)的裝量為100 μ L、反向引物(9)的裝量為100 μ L、緩沖液B (10)的裝量為200 μ L、SAP酶(11)的裝量為10 μ L、緩沖液C (12)的裝量為200 μ L、iPLex終止反應液(13)的裝量為100 μ L、iPLex酶(14)的裝量為10 μ L、延伸引物(15)的裝量為100 μ L。
[0008]所述的襯墊設置在盒體內，襯墊上設有容器孔，用于放置裝有各種試劑或引物的試管，根據試管內的內容分三個單元。其中第一單元為PCR擴增單元，含有:緩沖液Α(3)、MgCl2 (4)、dNTP (5)、ddH20 (6)、HotstarTaq 聚合酶(7)、正向引物(8)、反向引物(9)。
[0009]其中正向引物(8)的序列為:
[0010]SEQ ID N0.1ACGTTGGATGTTTGTTACTGTGGTAGATACYAC
[0011]SEQ ID N0.3ACGTTGGATG ACACAACTGTGTTCACTAGC
[0012]其中反向引物(9)的序列為:
[0013]SEQ ID N0.2ACGTTGGATGGAAAAATAAACTGTAAATCATATTC
[0014]SEQ ID N0.4CGTTGGATG CAACTTCATCCACGTTCACC
[0015]其中SEQ ID N0.1 和 SEQ ID N0.2 用于擴增 HPV 的 DNA 片段，其中 SEQ ID N0.2和SEQ ID N0.4用于擴增人體細胞β-球蛋白的DNA片段。
[0016]所述的第二單元為SAP酶處理單元，主要是除去擴增產物中所含有的dNTPs試劑，包含有:緩沖液B (10)、SAP酶(I I)。第三單元為延伸反應單元，在延伸引物的3’端連接一個堿基，得到分子量各不相同的延伸產物，含有緩沖液C (12)、iPlex終止反應液(13)、iPlex酶(14)、延伸引物(15)，其中延伸引物(15)的序列分別為:
[0017]SEQ ID N0.5TGTGCTGCCATATCTACTT
[0018]SEQ ID N0.6CTGTGCTTCTACACAGTCTCCT
[0019]SEQ ID N0.7CCGCAGTACTAACCTTACCATTA
[0020]SEQ ID N0.8CAATTGCAAACAGTGATACT
[0021]SEQ ID N0.9AAAGAATATATAAGACATGT
[0022]SEQ ID N0.1OTACAAATATGTCTGTGTGTTC
[0023]SEQ ID N0.11GAGTCTTCCATACCTTCTAC
[0024]SEQ ID N0.12TAGACATGTGGAGGAATATG
[0025]SEQ ID N0.13ATTACCTGTGTTGATACTAC
[0026]SEQ ID N0.14CGGTTTCCCCAACATTTAC
[0027]SEQ I D N0.15CAAATTAAACAGTATGTTAG
[0028]SEQ ID N0.16GATACTACTAGAAGTAC
[0029]SEQ ID N0.17ATTATGCACTGAAGTAACTAAGGA
[0030]SEQ I D N0.18GCACCAATCTTTCTGTGTGTGC
[0031]SEQ ID N0.19TACCAGAAGCACCAACATGACTA
[0032]SEQ ID N0.20GGCATGTTGAGGAATATGATTT
[0033]SEQ ID N0.21CATGCAGAAGAGTTTGATTTA
[0034]SEQ ID N0.22GTACTAATTTAACCATTAGCACT
[0035]SEQ ID N0.23ACCTCAAACAGACACCATGG
[0036]所述延伸產物用飛行質譜(MALD1-T0F-MS)方法進行檢測，根據延伸產物分子量的大小來確定HPV的分型結果，同時采用人體細胞β-球蛋白作為內參即陽性對照，用ddH20 (6)作為陰性對照。
[0037]本實用新型是充分利用基質輔助激光解吸收/電離飛行時間質譜(MALD1-T0F-MS)系統檢測核酸多態型SNP的原理，設計出不同大小分子量的引物及其產物，而且確保一個反應體系中的引物之間互不干擾。該實用新型建立了一個快速，簡便，成本低廉且高通量的HPV分型檢測試劑盒，該試劑盒準確度高，靈敏性好，能夠準確分型，且精準區分單感染和混合感染，具有很強的實用價值。
[0038]通過該試劑盒能檢測的HPV 亞型包括 HPV16、HPV18、HPV26、HPV31、HPV33、HPV35、HPV39、HPV45、HPV51、HPV52、HPV53、HPV56、HPV58、HPV59、HPV66、HPV68、HPV73 和 HPV82，共18種。
[0039]本實用新型適應于HPV感染的流行病學調查、高危型HPV亞型的分型和檢測，HPV與腫瘤發生相關性研究及宮頸癌甚至其它癌癥的發生和發展的機理研究。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0040]圖1是本實用新型的結構示意圖。

【具體實施方式】
[0041]以下結合實施例和附圖對本實用新型的【具體實施方式】進行詳細描述，所舉實例只用于解釋本實用新型，并非用于限制本實用新型的范圍。
[0042]實施例1:利用本實用新型試劑盒對HPV進行分型和檢測。
[0043]按常規方法提取并檢測DNA，然后用本實用新型所述試劑盒，對樣本中的HPV進行分型檢測，下面為檢測過程。
[0044]I)引物稀釋和DNA質檢
[0045]PCR擴增反應的引物稀釋至終濃度為0.5μ M ;根據稀釋公式，按照單堿基延伸引物的分子量將引物稀釋至終濃度為7-14μΜ之間。
[0046]紫外分光光度計SMA3000測定溶液中DNA的濃度和Α260/Α280比值，測量3次取平均值，濃度應在30ng/y L，A260/A280比值應該在1.7-2.0之間，合格的DNA置于4°C取用或-20°C保存。
[0047]2) PCR擴增反應
[0048]按下表配制PCR反應液(以I個樣本為例):
[0049]

【權利要求】
1.一種人乳頭瘤病毒(HPV)分型檢測試劑盒，其特征在于:包括盒體(I)、襯墊(2)、在襯墊(2)上設有數個容器孔，用于放置試管，試管中分別裝有緩沖液A(3)、MgCL2(4)、dNTP(5)、ddH20(6)、HotstarTaq聚合酶(7)、正向引物(8)、反向引物(9)、緩沖液B(10)、SAP酶(11)、緩沖液C (12)、iPLex終止反應液(13)、iPLex酶(14)、延伸引物(15)。
2.根據權利要求1所述的人乳頭瘤病毒(HPV)分型檢測試劑盒，其特征在于:所述的分子生物學試劑中，緩沖液A (3)裝量為200 μ L ；MgCL2 (4)的裝量為10yL ；dNTP(5)的裝量為100 μ UddH2O (6)的裝量為500 μ UHotstarTaq聚合酶(7)的裝量為10 μ L、正向引物(8)的裝量為100 μ L、反向引物(9)的裝量為100 μ L、緩沖液B (10)的裝量為200 μ L、SAP酶(11)的裝量為10yL、緩沖液C(12)的裝量為200 μ UiPLex終止反應液(13)的裝量為100 μ L、iPLex酶(14)的裝量為10 μ L、延伸引物(15)的裝量為100 μ L。
3.根據權利要求1所述的人乳頭瘤病毒(HPV)分型檢測試劑盒，其特征在于:能對HPV16、HPV18、HPV26、HPV31、HPV33、HPV35、HPV39、HPV45、HPV51、HPV52、HPV53、HPV56、HPV58、HPV59、HPV66、HPV68、HPV73 和 HPV82 共 18 種 HPV 亞型進行分型和檢測。
【文檔編號】C12Q1/68GK203923213SQ201420356334
【公開日】2014年11月5日 申請日期:2014年6月30日 優先權日:2014年6月30日
【發明者】葛世超, 張宇清, 趙旭平, 管清華 申請人:上海邃志生物科技有限公司