本發明涉及動物營養與飼料技術領域，具體涉及一種含抗菌肽的保育前期仔豬配合飼料及其制備方法，該飼料適用于仔豬斷奶2周后開始飼喂。
背景技術：
自然界中斷奶一般發生在仔豬3月齡左右。實際生產中，為了提高母豬的生產力和分娩舍的利用率、減少母體向仔豬垂直傳播，豬場通常選擇在仔豬3周齡左右斷奶。然而，此時仔豬消化系統尚未發育完善，胃酸分泌不足、消化器官體積和重量都比較小、各種消化酶活性較低。此外，早期斷奶仔豬尚未建立穩定的腸道微生物區系，菌群種類和數量易變化。未消化的營養物質進入后腸，可作為后腸微生物增殖的營養物質，從而促進微生物的大量繁殖，導致腸道微生態紊亂，最終導致仔豬腹瀉和疾病頻發。
過去人們一直認為，在動物日糧中添加低水平抗生素是預防疾病、提高動物胃腸道健康的有效措施，進而可以提高飼料轉化率及促進生長。然而動物飼料中長期大量使用抗生素，不僅會增加病原微生物耐藥性，還會造成動物腸道菌群紊亂、腸道屏障功能減弱、影響腸道的穩態從而破壞機體的先天免疫，最終降低動物生產性能。研究表明，常規性地殺死較弱的細菌，可導致較強的細菌存活下來并大肆增殖，產生人類無法控制的“超級細菌”。更為嚴重的是，動物飼料中長期大量添加抗生素，導致抗生素殘留增多、經由食品增加人類抗生素耐藥性，嚴重威脅人類健康并污染環境。故此，世界上許多發達國家都已經開始嚴格限制使用抗生素并提高畜產品檢測標準，研發高效新型抗生素替代品具有重要的科學意義和社會價值。抗菌肽(Antibacterial Peptides)，又叫抗微生物肽(Antimicrobial Peptides)或宿主防御肽(Host Defense Peptides)，是一類廣泛存在于自然界生物體中的小肽類物質，它是機體先天性免疫系統的重要組成部分。由于抗菌肽對細菌、真菌、寄生蟲、病毒、腫瘤細胞等廣泛的抑制作用，而且不易產生耐藥性，是眾多替代抗生素產品中的佼佼者，具有良好的應用前景。
技術實現要素：
本發明的目的是提供一種含抗菌肽的保育前期用仔豬配合飼料及其制備方法，解決為提高斷奶仔豬生產性能而大量添加抗生素的問題，進而保證豬肉食品安全和人類健康。
為了達到上述目的，本發明提供的技術方案為：
所述含抗菌肽的保育前期用仔豬配合飼料包括如下重量份的組分：
玉米50-53份、豆粕20-22份、膨化大豆6-8份、發酵豆粕3-6份、低蛋白乳清粉6-8份、進口魚粉1.5-3.5份、豆油1.5-3.5份、葡萄糖0.5-1.5份、磷酸氫鈣1-1.2份、檸檬酸鈣0.4-0.6份、賴氨酸0.4-0.6份、食鹽0.2-0.4份、氧化鋅0.1-0.2份、復合微量元素預混料0.1-0.2份、蛋氨酸0.03-0.1份、蘇氨酸0.02-0.05份、膽堿0.02-0.05份、復合多維預混料0.01-0.03份、米糠0.01-0.03份、抗氧化劑0.01-0.03份、菌絲霉素抗菌肽0.02-0.05份、天蠶素抗菌肽0.02-0.05份、植物精油復合物0.02-0.05份。
上述抗菌肽飼料的配制方法包括如下步驟：
(1)將玉米、豆粕、發酵豆粕、膨化大豆、進口魚粉、低蛋白乳清粉、葡萄糖、米糠分別粉碎，制備目標粒徑1000μm的各種粉體，控制粉體的平均粒徑為930—1000μm即為合格。適宜的粉碎粒度可顯著提高飼料的轉化率，減少動物糞便排泄量，提高動物的生產性能。通過粒度檢驗，保證飼料顆粒的均勻，促進仔豬消化。其余原料因其本身粒度已經小于1000μm，無需粉碎。
(2)按權利要求1所述的比例分別稱量大宗原料和小料，大宗原料為玉米、豆粕、發酵豆粕、膨化大豆、進口魚粉、低蛋白乳清粉、葡萄糖、豆油、磷酸氫鈣，其余為小料；
(3)將稱量好的大宗原料和小料混合，即得含抗菌肽的保育后期用仔豬配合飼料。
下面對本發明作進一步說明：
抗菌肽又稱抗微生物肽，是可以被細菌、植物、昆蟲、兩棲動物、哺乳動物等天然產生，并且具有天然免疫反應的生物活性分子，通過入侵病原微生物發揮細胞宿主防御作用。抗菌肽具有廣譜抗菌活性、低毒和低耐藥性，同時作為高等生物免疫調節劑被認為是一種未來具有前途和潛在的候選藥物，屬于環保型抗生素。
天蠶素是世界上第一個被發現的抗菌肽，瑞典科學家于1981年用蠟狀芽孢桿菌(Bacillus cereus)誘導惜古比天蠶(Hyalophora cecropia)產生了抗菌活性多肽物質，定名為Cecropin。本發明所應用的天蠶素抗菌肽具有廣譜抑菌作用，但是主要對革蘭氏陰性菌起作用，它具有如下結構特征：(1)由31-39個氨基酸殘基組成，分子量約為4KD，不含半胱氨酸，不能形成分子內二硫鍵。這種簡單的肽鏈結構便于進行化學合成或者基因工程表達，并保證產品穩定性。(2)有強堿性的N端，N末端區域富含親水堿性氨基酸殘基，可形成近乎完美的雙親螺旋結構,這將有利于天蠶素吸附到帶負電的細菌膜上。(3)C末端含較多的疏水性氨基酸殘基，可形成疏水螺旋，疏水性的尾部有利于抗菌肽插入細菌膜的雙層脂質膜中。且其C端被酰胺化，酰胺化對其抗菌活性具有重要作用。(4)分子的兩端各形成一個兩親性α螺旋，這種α螺旋是破壞、裂解細菌的主要結構。
菌絲霉素(Plectasin)是Mygind等研究小組于2005年通過篩查腐生子囊菌假黑盤菌(Pseudoplectania nigrella)分泌蛋白的cDNA庫，從中找出一些與無脊椎動物防御素序列高度相似的片段，并篩選分離出來的首例真菌防御素。它具有如下結構特征：(1)菌絲霉素是一類內源性、高度穩定、富含半胱氨酸的抗菌肽，其序列內一般有6-8個保守半胱氨酸形成3-4對二硫鍵。二硫鍵對數和連接方式在維持防御素結構和抗菌功能方面具有重要作用，本發明所用菌絲霉素通過分子改造技術形成鏈內二硫鍵來穩定其2條反向平行的β折疊片和1個α螺旋從而提高抑菌活性、增強穩定性。(2)菌絲霉素具有良好的鹽離子耐受能力，在生理鹽離子濃度下同樣具有殺菌活性。(3)此外，它還具有良好的pH值穩定性和熱穩定性，在pH值2.0-10.0范圍內，菌絲霉素對金黃色葡萄球菌均有抑菌活性；100℃熱處理1h后，亦能抵抗木瓜蛋白酶和胃蛋白酶的降解。(4)菌絲霉素與細胞壁前體物脂質II結合，導致細胞壁合成紊亂，破壞了細胞壁的完整結構，形成孔洞，內容物泄漏，整個細胞裂解死亡。體外實驗研究報道，菌絲霉素主要對G+(革蘭氏陽性菌)的幾個種類(包括鏈球菌屬、葡萄狀球菌屬、腸球菌屬、棒狀桿菌屬和桿狀菌屬)具有良好殺傷作用，尤其對肺炎鏈球菌(S.pneumoniae)的MIC僅為0.125mg/l，與萬古霉素和青霉素的殺菌速率相當。
植物提取物是以植物為原料，經過一系列物理、化學提取過程，得到的由一種或多種天然活性成分組成的植物產品。植物提取物在歷史上一直作為人類的藥物或營養補充劑大量使用，有數千年歷史。近年來，植物提取物在養豬生產中替代抗生素方面的研究取得了良好效果。植物提取物中含有豐富的生物活性物質，包括麝香草酚、香芹酚、肉桂醛等，這些物質通過抑制有害微生物、調節免疫、抗氧化和調節代謝等作用促進豬的健康和生長。體外研究表明，植物提取物對于包括霉菌在內的多種病原菌具有抗菌作用,其主要抗菌的活性物質為酚醛化合物。
酚類物質如百里香酚、香芹酚、麝香草酚，這些含有酚類結構的成分都表現出較強的抗菌作用。酚類物質的抗菌性受其自身的構型和所含功能團的影響，其中羥基基團的作用很大，其數量和在酚環上的相對位置會影響酚類物質的抗菌性能，百里酚和香芹酚對革蘭氏陽性菌和革蘭氏陰性菌的抑菌效果不同，并且酚環上含有烷基或醋酸根都會增強酚類物質的抗菌活性，這些功能團可通過對琉基的氧化使蛋白質失活；與含琉基的化合物如膚氨酸發生競爭抑制或是直接抑制某些酶的正常生理機能,使病原菌代謝紊亂，新陳代謝得到抑制，最終達到抗菌目的。另外，植物提取物利用自身疏水性使細胞膜和線粒體上的磷脂結構分開，破壞細胞結構，增強細胞膜通透性，導致細胞內離子和其它物質的泄漏，最終導致細菌的死亡。
體外模擬小腸環境研究發現，4種植物添加劑對腸道大腸桿菌的抗菌性依次為：肉桂＞香芹酚＞麝香草酚＞丁香酚。肉桂醛具有易揮發、易氧化的特性，不易進行保藏。將肉桂醛與其他物質結合，能夠較易保存并增強抑菌效果。此外，體外抑菌實驗表明，肉桂醛對黃曲霉、煙曲霉和黑曲霉等都具有抑菌作用。肉桂醛對病原菌主要表現在提高宿主的防御性，抑制分生孢子萌發和形成，致使分生孢子發生消解，導致菌絲體形態產生異常，長時間干擾菌體生長。
制備方法的標準和詳細步驟如下：
(1)原料采購、驗收和檢驗：首先對配方所需各種原料制定原料采購標準，規定各營養指標的參數范圍；其次，貨比三家選擇有良好資質的供貨商進行原料質量和價格的綜合比較，再決定是否采購；然后，根據飼料原料采購標準，對采購的原料進行快速表觀檢驗和實驗室化學分析，快速表觀檢驗合格的可以接收，不合格則拒收；表觀檢驗合格的原料，繼續進行實驗室化學分析，合格的入庫，不合格的退貨。通過這一程序，嚴格控制原料質量。
(2)粉碎及粉碎粒度檢驗：將玉米、豆粕、發酵豆粕、膨化大豆、進口魚粉、低蛋白乳清粉、葡萄糖、米糠分別使用錘片式粉碎機進行粉碎，制備目標粒徑1000μm的各種粉體。粉碎后，用光學顯微鏡做粗略檢測，使所得到的粒徑基本接近目標粒徑。然后用激光粒度分析儀(NICOMPTM380型，美國)測定各種原料的平均粒徑，平均粒徑在930-1000μm即為合格。適宜的粉碎粒度可顯著提高飼料的轉化率，減少動物糞便排泄量，提高動物的生產性能。通過粒度檢驗，保證飼料顆粒的均勻，促進仔豬消化。其余原料因其本身粒度已經小于1000μm，無需粉碎。
(3)大宗原料的稱量：稱量工序一般包括兩個部分：一是預混料等添加量較小的原料稱量，二是大宗原料的稱量。為追求配料精度、節省人力，大宗原料通常采用自動稱量。按照重量組分，這些大宗原料使用最小分度值0.10kg的自動稱量裝置進行稱量。
(4)小料的稱量：小料由于添加量小、品種多、易結塊、易粘倉、易發生化學反應等原因，仍然采用手工稱量方式。按照重量組分，檸檬酸鈣、賴氨酸、食鹽、氧化鋅、微量元素預混料、蛋氨酸、蘇氨酸、膽堿、維生素預混料、米糠、抗氧化劑、抗菌肽和植物精油復合物等添加量低的小料使用最小分度值0.01kg的電子秤手動稱量。
(5)混合：將稱量好的小料和大宗原料在混合機內混合10min。粉碎粒度越均勻，混合時間越長，均勻度越好。要求配合飼料混合均勻度變異系數≤10％。參照GB/T 5918-2008飼料產品混合均勻度的測定，每半年進行一次混合均勻度檢驗。
(6)打包：混合均勻后的飼料，由自動打包機完成稱重、裝袋、封包。產品包裝為20kg/袋。
(7)配料精度要求控制在0.1％之內。舉例來說，如果混合機容量是1000kg，那么設計配制1000kg飼料，配料完成后最終配料量合格范圍是999-1001kg。
本發明的抗菌肽飼料可以獲得和抗生素組同樣的飼料報酬和成活率，并對仔豬的代謝、機體組織蛋白沉積和免疫功能沒有任何影響，同時具有促進仔豬生長的潛力。這對保證仔豬生長和腸道健康，保障人類食品安全具有重要的經濟價值和社會價值。
具體實施方式
實施例1
玉米53份、豆粕20份、膨化大豆6份、發酵豆粕3份、低蛋白乳清粉6份、進口魚粉3.5份、豆油3.5份、葡萄糖1.5份、磷酸氫鈣1.2份、檸檬酸鈣0.6份、賴氨酸0.6份、食鹽0.4份、氧化鋅0.2份、復合微量元素預混料0.1份、蛋氨酸0.1份、蘇氨酸0.05份、膽堿0.05份、復合多維預混料0.03份、米糠0.03份、抗氧化劑0.03份、菌絲霉素抗菌肽0.05份、天蠶素抗菌肽0.05份、植物精油復合物0.05份。
上述抗菌肽飼料的配制方法包括如下步驟：
(1)原料采購、驗收和檢驗：首先對配方所需各種原料參照原料采購標準進行采購；原料送貨后表觀檢驗合格的接收，不合格的拒收；化學分析合格的入庫，不合格的退貨。
(2)粉碎及粉碎粒度檢驗：將玉米、豆粕、發酵豆粕、膨化大豆、進口魚粉、低蛋白乳清粉、葡萄糖、米糠分別使用錘片式粉碎機進行粉碎，制備目標粒徑1000μm的各種粉體。粉碎后，用光學顯微鏡做粗略檢測，使所得到的粒徑基本接近目標粒徑。然后用激光粒度分析儀(NICOMPTM380型，美國)測定各種原料的平均粒徑，平均粒徑在930-1000μm即為合格。
(3)大宗原料的稱量：使用最小分度值0.10kg的自動稱量裝置,按照重量組分，稱量玉米53份、豆粕20份、膨化大豆6份、發酵豆粕3份、低蛋白乳清粉6份、進口魚粉3.5份、豆油3.5份、葡萄糖1.5份、磷酸氫鈣1.2份。
(4)小料的稱量：按照重量組分，使用最小分度值0.01kg的電子秤手動稱量檸檬酸鈣0.6份、賴氨酸0.6份、食鹽0.4份、氧化鋅0.2份、復合微量元素預混料0.1份、蛋氨酸0.1份、蘇氨酸0.05份、膽堿0.05份、復合多維預混料0.03份、米糠0.03份、抗氧化劑0.03份、菌絲霉素抗菌肽0.05份、天蠶素抗菌肽0.05份、植物精油復合物0.05份。
(5)混合：將稱量好的大宗原料和小料在混合機內混合10mim。
(6)打包：混合均勻后的飼料，由自動打包機完成稱重、裝袋、封包。產品包裝按20kg/袋。
(7)配料精度要求控制在0.1％之內。舉例來說，如果配制100份的飼料，那么配料完成后最終配料量合格范圍應為99-101份。
實施例2
玉米50份、豆粕22份、膨化大豆8份、發酵豆粕6份、低蛋白乳清粉8份、進口魚粉1.5份、豆油1.5份、葡萄糖0.5份、磷酸氫鈣1份、檸檬酸鈣0.4份、賴氨酸0.4份、食鹽0.4份、氧化鋅0.1份、復合微量元素預混料0.2份、蛋氨酸0.03份、蘇氨酸0.02份、膽堿0.02份、復合多維預混料0.01份、米糠0.01份、抗氧化劑0.01份、菌絲霉素抗菌肽0.02份、天蠶素抗菌肽0.02份、植物精油復合物0.02份。
上述抗菌肽飼料的配制方法包括如下步驟：
(1)原料采購、驗收和檢驗：首先對配方所需各種原料參照原料采購標準進行采購；原料送貨后表觀檢驗合格的接收，不合格的拒收；化學分析合格的入庫，不合格的退貨。
(2)粉碎及粉碎粒度檢驗：將玉米、豆粕、發酵豆粕、膨化大豆、進口魚粉、低蛋白乳清粉、葡萄糖、米糠分別使用錘片式粉碎機進行粉碎，制備目標粒徑1000μm的各種粉體。粉碎后，用光學顯微鏡做粗略檢測，使所得到的粒徑基本接近目標粒徑。然后用激光粒度分析儀(NICOMPTM380型，美國)測定各種原料的平均粒徑，平均粒徑在930-1000μm即為合格。
(3)大宗原料的稱量：使用最小分度值0.10kg的自動稱量裝置,按照重量組分，稱量玉米50份、豆粕22份、膨化大豆8份、發酵豆粕6份、低蛋白乳清粉8份、進口魚粉1.5份、豆油1.5份、磷酸氫鈣1份。
(4)小料的稱量：按照重量組分，使用最小分度值0.01kg的電子秤手動稱量葡萄糖0.5份、檸檬酸鈣0.4份、賴氨酸0.4份、食鹽0.4份、氧化鋅0.1份、復合微量元素預混料0.2份、蛋氨酸0.03份、蘇氨酸0.02份、膽堿0.02份、復合多維預混料0.01份、米糠0.01份、抗氧化劑0.01份、菌絲霉素抗菌肽0.02份、天蠶素抗菌肽0.02份、植物精油復合物0.02份。
(5)混合：將稱量好的大宗原料和小料在混合機內混合10mim。
(6)打包：混合均勻后的飼料，由自動打包機完成稱重、裝袋、封包。產品包裝按20kg/袋。
(7)配料精度要求控制在0.1％之內。舉例來說，如果配制100份的飼料，那么配料完成后最終配料量合格范圍應為99-101份。
實驗地點：中國科學院亞熱帶農業生態研究所(湖南省長沙市)
實驗時間：2016年7月-2016年8月
動物實驗設計(見表1)：選用體況健康良好、體重大小接近、已經斷奶2周的“杜×長×大”三元雜交豬仔豬42頭進行實驗，初始體重為11.30kg左右、公母各半隨機分成3個組，無抗生素組14個重復、抗生素組14個重復、替代抗生素組14個重復，采用單欄飼喂，每個重復1頭豬。無抗生素組為負對照組，飼喂基礎日糧沒有添加任何抗生素；抗生素組為正對照組，飼喂基礎日糧+抗生素；替代抗生素組為實驗組，飼喂基礎日糧+抗菌肽和植物精油提取物。試驗全期11d。
表1
試驗豬只日常護理：按照豬場規定免疫和驅蟲。試驗在全封閉豬舍內進行，仔豬飼養于半漏縫地扳上，控制溫度30-32℃，自由采食和飲水，每天喂4次(時間分別為7:30、11:30、15:30和19:30)，每次飼喂前觀察飼槽中有無余料進行適當調整以保障其自由采食，自由飲水。試驗期內每天上午、下午各打掃圈舍1次。
測定指標及方法
生長性能的測定
兩個階段分別在開始和結束期以重復為單位進行稱重，并統計飼料消耗量，計算平均日采食量、平均日增重和料重比以及腹瀉率和腹瀉指數。
平均日采食量：從試驗期開始，
記錄各個處理組每天的飼料消耗量及豬的頭數，到試驗結束時計算：平均日采食量＝每天采食量*實驗豬頭數/實驗天數；平均日增重:從試驗期開始，記錄每頭豬的初始體重并記錄豬只數，求出平均始重；試驗結束時每頭豬稱重并計算出平均末重，(末期體重-初始體重)/(試驗豬頭數*天數＝平均日增重。料重比＝平均日采食量/平均日增重。
腹瀉率：實驗期內，記錄每處理組每天的仔豬腹瀉頭次數和腹瀉分數，計算仔豬腹瀉率，公式為：腹瀉率＝試驗期內所有仔豬腹瀉頭次數/(試驗的天數×試驗豬只頭數)×100％；腹瀉指數＝試驗期內所有仔豬腹瀉評分之和/(試驗的天數×試驗豬只頭數)。腹瀉評分標準見表2，生長性能和腹瀉情況結果見表3：
表2
表3
飼養實驗結果表明：實驗末期仔豬平均體重和日增重，負對照組<實驗組<正對照組；腹瀉指數和腹瀉率正對照組<負對照組<實驗組；成活率和發病率，正對照組和實驗組死亡率都是零，而負對照組實驗過程中有7.14％仔豬死亡，另有28.57％的發病率，實驗組僅有7.14％發病率。斷奶仔豬生長過程中，發生疾病會增加治療成本、影響仔豬生長速度或成為僵豬(生長極度緩慢，只吃飼料不長體重)，嚴重的導致仔豬死亡。綜合仔豬飼料回報率、死亡率、發病率，考慮到治療成本，數據表明使用抗菌肽替代抗生素是可行的。盡管在末期體重和日增重上仍有進步空間，然而就目前的科技水平而言，在抗生素替代已成為全球趨勢的背景下，抗菌肽不失為一個良好的選擇。并且，我們需要注意的是，過去人們嚴重依賴抗生素解決所有問題的時代已經過去，替代抗生素不僅僅只依賴抗菌肽或者其他飼料添加劑，而是要求好的飼料配方、優秀的原料品質控制流程、合理的飼料加工工藝、悉心的飼養管理等一系列綜合措施完美配合。
血清生化指標、免疫指標等測定結果見表4：
表4
正常情況下,動物血糖濃度相對恒定。血糖是動物機體主要的能量來源,動物機體主要通過腸道吸收獲取葡萄糖。血糖含量能在一定程度上反映動物機體糖代謝功能是否正常。血清總蛋白的主要作用是參與營養物質的轉運、保持組織蛋白的動態平衡、維持血液的pH值等。血清總蛋白的濃度能有效地反映機體蛋白質合成代謝的強弱,血清總蛋白濃度升高說明機體向組織蛋白沉積的方向進行,能促進組織器官的生長和發育。免疫球蛋白主要存在于血清中,它能與外來的特異性抗原起免疫反應而保護機體。免疫球蛋白IgG和IgM是血液中主要的一類抗體,免疫球蛋白IgG、IgA和IgM含量的高低可在一定程度上反映動物的免疫性能。生長激素的主要生理功能是促進神經組織以外的所有其他組織生長；促進機體合成代謝和蛋白質合成；促進脂肪分解。胰島素樣生長因子-1是一類多功能細胞增殖調控因子。在細胞的分化、增殖、個體的生長發育中具有重要的促進作用。
本實驗，保育仔豬血清中葡萄糖含量、總蛋白含量、血清IgG和IgM含量及胰島素樣生長因子-1含量，各組基本在同一范圍，說明飼料中添加抗菌肽和植物精油提取物替代抗生素對保育仔豬的代謝、機體組織蛋白沉積和免疫功能沒有影響。實驗組生長激素含量高于對照組和負對照組，說明抗菌肽添加在仔豬飼料中，具有促進仔豬生長的潛力。
綜上所述，與抗生素組比較，保育仔豬日糧中添加抗菌肽和植物精油提取物替代抗生素，可以獲得和抗生素組一樣的飼料回報率和成活率，血清生化指標分析顯示添加抗菌肽替代抗生素對仔豬的代謝、機體組織蛋白沉積和免疫功能沒有影響，并且具有促進仔豬生長的潛力。