本發明涉及到一種以杜仲皮和杜仲葉的發酵提取液進行益生菌化培養所制得的保健食品及其制備方法，其可應用于老年膝關節滑膜炎和骨關節病變等疾病的保健和康復。

背景技術：

滑膜炎（英文名字synovitis）是一種多發性疾病，滑膜炎是由于微循環不暢造成的無菌性炎癥，造成分泌液失調，形成積液的一種關節病變；由于膝關節滑膜炎，廣泛位于肢體表面較淺部位，故遭受損傷和感染的機會較多，中青年患者主要是膝關節扭傷和多種關節內損傷而造成的，中老年患者，多繼發于膝關節關節炎，主要是因軟骨退變與骨質增生，產生機械性生物化學性刺激，激發膝關節滑膜水腫、滲出積液。

膝關節滑膜炎，主要癥狀以關節疼痛為主，伴有輕度腫脹、走路咯吱咯吱彈響，上下樓梯或用力時關節疼痛或有不適感，長時間行走關節有發燒發僵的感覺，疼痛加劇。目前針對膝關節滑膜炎的治療盡管有許多有效的治療方法；其中，中醫主要是外敷療法，推拿法，中醫膏藥療法，穿刺針灸治療。西醫主要采用激素、抽液、沖洗、抗生素；最新療法是向病灶部位注射透明質酸營養液。盡管如此，仍然還有許多患者不能治愈，長期忍受疼痛的折磨，影響患者正常生活，給工作帶來了很多麻煩，甚至心理上也蒙上了一層陰影，認為滑膜炎是一種不治之癥。

針對上述情況，本發明竭力為膝關節滑膜炎患者尋求一種替代品和替代康復技術；未料實驗樣品在初期臨床應用中，發現不但對膝關節滑膜炎患者有明顯效果，而且對骨質疏松癥患者，甚至對腰椎脊盤突出患者也出現了令患者滿意的效果。

技術實現要素：

本發明提供了一種以杜仲皮和杜仲葉的發酵提取液進行益生菌化培養所制得的保健食品及其制備方法，它通過篩選益生菌成員中的嗜酸乳桿菌和腸鏈球菌，加以科學配方和深層培養發酵，兩者優勢互補和雙向發酵，杜仲中純天然的營養成分和生物活性成分既滿足了益生菌生長繁殖的需求，其發酵的過程又進一步降解了杜仲自身營養和生物活性成分，從而起到益生菌健腸胃和杜仲強筋骨的保健功能。

本發明實現上述目的采用以下技術方案：

一種保健品及其制備方法，它采用杜仲皮和杜仲葉以1:2的重量比進行提取濃縮，然后添加蛋白胨、牛肉膏、葡萄糖、氯化鈉等營養物質制成相應的培養液，在培養液上接種益生菌進行發酵，最后對終端培養液進行干燥制得。

一種保健品及其制備方法，其具體工藝流程如下：

一、培養基的制備

1、一級、二級培養基的制備

原料：蛋白胨1-4%、牛肉膏0.1-0.5%、葡萄糖1-4%、氯化鈉0.1-0.5%、杜仲葉提取物1-4%、碳酸鈣1-2%、純凈水86-95.8%。以上配比均按照質量份配比進行稱量。

所述的杜仲杜仲葉提取物是將重量比為1:1的杜仲葉與純凈水浸潤后經純凈水提取，濃縮、噴霧干燥所得。

步驟：按上述配方準確稱量，并依次加入加熱容器內，再加入部分計量純凈水，加熱使物料全部溶解，用20%NaoH和2mol/l的HCI調整PH值6.5-6.8，最后補足剩余量的純凈水，攪拌均勻后仔細進行分裝，置于電熱壓力滅菌器滅菌，控制滅菌溫度115℃-121℃，滅菌時間25-30min，斜面試管滅菌后，及時趁熱擺好斜面，滅菌物料全部降至室溫后轉冰箱冷藏，供接種和轉種備用。

2、三級、四級培養基的制備

原料：杜仲葉、杜仲皮、蛋白胨、牛肉膏、葡萄糖、氯化鈉、碳酸鈣、純凈水。

步驟：

1）原料的預處理，將杜仲皮進行炮制破碎成1-2厘米大小的碎片；以及采摘于每年降霜之前的新鮮杜仲葉經瞬間高溫或太陽暴曬，殺青除酶驗收合格后裝袋備用；

2）分別稱重杜仲皮一份，杜仲葉兩份，置于兩個不銹鋼容器內分別按1：1之比，加入純凈水進行浸潤，杜仲皮浸潤8小時，杜仲葉浸潤2小時；

3）提取：將浸潤好的杜仲葉轉移至提取濃縮機機組中的提取罐，再按1：6和1：4的比例加純凈水進行兩次提取，第一次設定提取溫度70℃-80℃，提取時間1小時，第二次設置提取溫度為70℃-80℃，提取時間1小時；

將浸潤好的杜仲皮轉移至提取罐，按1:4和1:3的比例加入純凈水進行兩次加熱提取；第一次設定提取溫度98℃-100℃，提取時間1小時，第二次設定提取溫度98℃-100℃，提取時間1小時，合并兩次提取液并與杜仲葉提取液均勻混合；

4）將上述均勻混合的提取液通過提取濃縮機機組中下設的過濾器轉移至濃縮灌，啟動真空減壓濃縮裝置，設定濃縮溫度65℃-75℃，真空度0.06-0.08MPa，濃縮液比重控制1.10-1.12；

（5）杜仲葉和杜仲皮提取濃縮液，培養基的配方和制備步驟：收集上述比重1.10-1.12的提取液，準確計量總體積，置于不銹鋼加熱容器，依次加入蛋白胨1-2%，牛肉膏0.1-0.2%，氯化鈉0.1-0.2%，葡萄糖1-2%，待蛋白胨、牛肉膏、氯化鈉，葡萄糖全部溶解后，用20%NaoH和2Hcl調整PH值6.5-6.8，最后加入0.5-1.0%的碳酸鈣，密封后設定滅菌溫度115~121℃，滅菌時間28~30min，滅菌后降溫至37℃±2℃。

二、益生菌接種

所采用的益生菌為嗜酸乳桿菌或腸鏈球菌。

將菌種從斜面菌種轉至一級培養基，并依次轉至二級、三級、四級培養基以擴大生產，所述的一級培養基和二級培養基的培養溫度均為37℃±2℃，培養時間均為22-24小時；所述的三級培養基和四級培養基的培養溫度為37℃-39℃，培養時間為18-20小時。

當培養基內發酵液的終端PH為3.8~4.2時，即可將發酵液轉移至下一環節。

三、干燥

1、噴霧干燥

將上述發酵好的發酵液接通干燥機組的蠕動泵，設定進風溫度160~180℃，出風溫度65~75℃，及時收集干粉，密封冷藏保存供質檢壓片灌裝膠囊備用。

2、冷凍干燥

將發酵好的發酵液，在凈化環境中，分裝凍干盤，開機在-30℃以下的溫度下預凍120分鐘，然后進行一次升華，解析干燥后化霜出料，密封冷藏保存供質檢壓片灌裝膠囊備用。

本發明采用上述技術方案具有以下有益效果：

將益生菌接種到杜仲皮和杜仲葉提取液中，其豐富的礦物質，氨基酸、碳水化合物含量，既滿足了益生菌生長繁殖的需要，杜仲皮葉中的生物活性成分木脂醇類，苯丙素類，環烯醚萜類，黃酮類，多種次生代謝物，得到進一步降解，更有利于人體吸收，發酵過程中新產生的可溶性乳酸鈣和甘露聚糖肽，增強了膝關節滑膜炎和骨關節病變患者消炎和補鈣的作用；雙向發酵的結果更加突顯了杜仲強筋骨、修復軟骨組織的功能和益生菌調整腸道菌平衡，抑制腸道腐敗菌生長確保人體胃腸道良好的健康狀態，為人體各器官、骨骼的正常發揮和穩定起到良好康復和保健作用。

附圖說明

圖1為質量檢測結果的相關表格。

圖2為患者使用本品的效果的相關記錄。

具體實施方式

下面結合具體實施例對本發明做進一步說明。

Ⅰ型凍干品實施例1

益生菌斜面和一級試管，二級三角瓶發酵種子液的制備：（含檢測Ⅰ型產品活性益生菌含量用的培養基）

1、益生菌空白培養基的制備：配制總體積2000mL。稱取蛋白胨20g，牛肉膏10g，氯化鈉6g，杜仲葉提取物20g，乳糖20g，碳酸鈣1.0%（斜面和檢測活菌培養基另加營養瓊脂1.5%-2.0%）。依次將除碳酸鈣外的上述配方用料準確稱量置一加熱容器內，先加入1500mL純凈水，加熱溶解后，用20%NaoH和2mol/l的HCI溶液調整PH6.5-6.8，補充剩余純凈水至總體積為2000mL攪拌均勻，分裝斜面試管6mL/支×8支，一級試管9mL/支×8支，二級三角瓶175mL/只×8支，剩余400mL，分裝檢測產品活菌用培養基；100mL/只×4瓶，每瓶另加營養瓊脂1.5g和碳酸鈣（輕質）1g。分裝畢后分別加塞包紥，置電熱蒸汽滅菌器，設定滅菌溫度115-118℃，滅菌時間25min，除8支斜面趁熱擺好斜面，待其余滅菌物品降至室溫后一起置冰箱冷藏備用。

2、益生菌斜面菌種和1-2級發酵培養基的制備（該步操作均在潔凈區內超凈工作臺進行）；取原始益生菌菌種（源于中國微生物菌種保藏中心）1支→轉2支一級空白液體試管→置恒溫培養箱→37±2℃活性培養22-24小時→再從活化后的一級試管液體培養基中使用接種環劃線于空白斜面培養管中→37℃±2℃培養22-24小時觀察生長良好的斜面→轉接于一級空白試管液體培養基中37℃±2℃培養22-24小時觀察生長良好的一級試管培養基轉接于二級三角瓶空白培養基中→37℃±2℃培養22-24小時最后將二級發酵培養基，作為預先準備好種子液接種于后續的5000ml三級圓底燒瓶3000ml和四級50L不銹鋼發酵罐30L滅菌后的空白培養基中。

3、5000mL三級圓底燒瓶（3000ml）培養基的制備：

①分別稱取杜仲皮1.5kg，杜仲葉3kg并分別按1:1的比例，加純凈水浸潤杜仲皮浸潤8小時，杜仲葉浸潤2小時；

②將上述浸潤過的杜仲葉和杜仲皮分別按1:6和1:4比例加純凈水進行兩次提取，杜仲葉設定提取溫度70-80℃,提取時間1:00小時；

③合并上述杜仲皮和杜仲葉的提取液經真空減壓過濾器轉移至減壓濃縮罐，設真空度0.06~0.08Mpa，設定濃縮溫度65~75℃，濃縮總體積約為8000ml，比重為1.10-1.12；

④收集上述濃縮液置一潔凈的不銹鋼加熱容器內，趁熱補充蛋白胨90g，牛肉膏9g，氯化鈉9g，葡萄糖90g，加熱溶解后，用20%NaoH和2mol/l的HCI調整PH6.5~6.8，最后補充純凈水總體積為9000ml，仔細分裝于5000ml的潔凈圓底燒瓶中，每只瓶分裝3000ml，再分別往每瓶中加輕質碳酸鈣30g，密封加塞置電熱蒸汽滅菌器通電加熱10min后關閉排氣閥，設定滅菌溫度118~121℃，滅菌時間30min后，排氣減壓歸零，配戴石棉手套打開電熱滅菌器上蓋，輕輕將3只圓底燒瓶轉移至超凈工作臺，降至室溫后，按照無菌操作程序，將3支二級三角瓶（每瓶175ml）發酵好的種子液，分別接種于3只三級圓底燒瓶中，及時將沉淀瓶底的碳酸鈣均勻搖起即可轉移至自動恒溫培養搖床，設定培養溫度37~39℃，搖擺頻率105~115/min，培養發酵16-18小時，觀察瓶底碳酸鈣幾乎完全消失，發酵液顏色由深變淺及氣味微香，即可轉冷凍干燥機組進行冷凍干燥。3只圓底燒瓶總體積9000ml，均勻分裝于10只不銹鋼凍干盤中，每盤約900ml。

設定冷凍干燥機相關參數，-30℃以下預凍120分鐘→一次升華→解析干燥→停機化霜出料→密封冷藏保存。供質檢和壓制片劑灌裝膠囊備用。

Ⅰ型凍干品實施例2：

1、分別稱取杜仲皮5kg，杜仲葉10kg，并分別按1:1的比例加入純凈水進行浸潤，杜仲皮浸潤8小時，杜仲葉浸潤2小時。

2、將上述浸潤過的杜仲葉和杜仲皮，分別按1:6和1:4的比例加入純凈水分別進行兩次提取，杜仲葉設定提取溫度75~80，提取時間1小時，杜仲皮提取溫度90~100℃，提取時間1:30小時，合并杜仲葉和杜仲皮兩次的提取液，經真空減壓過濾器轉移至減壓濃縮罐，設定真空度0.06~0.08Mpa設定濃縮溫度65~75℃濃縮至總體積約為28L比重1.10-1.12轉移至50L不銹鋼種子發酵罐。

3、打開種子罐加料口轉入混合提取濃縮液，趁熱補充蛋白胨300g，牛肉膏30g，氯化鈉30g，葡萄糖300g，啟動攪拌加熱溶解，用20%NaoH和2mol/l的HCI調整PH6.5~6.8，最后補充純凈水至總體積為30L再往罐內加入碳酸鈣300g，封閉加料口，啟動電加熱，設定滅菌溫度118~121℃，滅菌時間30min后，打開冷卻水閥門，將罐內溫度降至37℃~39℃時，打開接種口，點燃酒精火圈，接種預先準備好的三級圓底燒瓶益生菌發酵種子液3000ml（接種量為10%）迅速關閉接種口，設定發酵起止時間，設定培養發酵溫度37~39℃，發酵時間18~20小時。發酵液PH3.8~4.2時，觀察發酵液顏色由深變淺，氣味微香，即判定發酵終點及時轉移冷凍干燥機組進行冷凍干燥并設定相關參數，-30℃以下預凍120分鐘→一次升華→解析干燥→停機化霜出料，密封冷藏，保存供檢測和壓制片灌裝膠囊劑備用。

Ⅱ型干燥品實施例1

三級圓底燒瓶培養基的制備（圓底燒瓶規格短頸5000ml）

每只圓底燒瓶實際配制容量為3000ml，共配制3只，總體積為9000ml。

1、分別稱取杜仲皮1.5kg，杜仲葉3kg，并分別按1:1的比例，加純凈水浸潤，杜仲皮浸潤8小時，杜仲葉浸潤2小時；

2、將上述浸潤過的杜仲葉和杜仲皮，分別按1:6和1:4的比例加純凈水，分別分兩次進行提取，杜仲葉設定提取溫度65~75℃，提取時間1小時。杜仲皮設定的提取溫度98~100℃，提取時間1:30小時；

3、合并上述杜仲葉和杜仲皮兩次的提取液，經真空過濾器，轉移至減壓濃縮罐，設定真空度0.06~0.08Mpa設定濃縮溫度65~75℃，濃縮至總體積約8000ml時，比重為1.10~1.12；

4、收集上述濃縮液置潔凈的不銹鋼加熱容器內，趁熱補充蛋白胨90g，牛肉膏9g，氯化鈉9g，加熱溶解后用20%NaoH和2mol/l的HCI溶液調整PH6.5~6.8，最后補充純凈水總體積為9000ml，仔細分裝于3只5000ml的潔凈圓底燒瓶中，每只分裝3000ml，再分別往瓶中加輕質碳酸鈣30g，密封加塞，置電熱蒸汽滅菌器通電加熱排氣10min后，關閉排氣閥，設定滅菌溫度118~121℃，滅菌時間30min，排氣歸零，配戴石棉手套打開電熱滅菌器上蓋輕輕將3只圓底燒瓶轉移至超凈工作臺，降至室溫后，按照無菌操作程序，將3只預先準備好的二級三角瓶（每瓶175ml/只）發酵好的種子液，分別接種于3只圓底燒瓶中，及時將沉淀在瓶底的輕質碳酸鈣均勻搖起，即可轉移至自動恒溫培養搖床，設定培養溫度37~39℃，搖擺頻率105~110/min，培養發酵16~18小時，觀察瓶底碳酸鈣幾乎完全消失，發酵液顏色由深變淺，氣味微香，即可轉入噴霧干燥機組進行噴霧干燥，接通噴霧干燥與圓底燒瓶之間的管道，啟動蠕動泵，設定干燥機組操作程序并設定進風溫度160~180℃，出風溫度65~75℃及時收集噴霧干燥干燥品密封冷藏保存，供檢測和壓制片劑灌裝膠囊備用。

Ⅱ型干燥品實施例2

1、分別稱取杜仲皮5kg，杜仲葉10kg，并分別按1:1的比例加入純凈水進行浸潤，杜仲皮浸潤8小時，杜仲葉浸潤2小時；

2、將上述浸潤過的杜仲葉和杜仲皮，分別按1:6和1:4的比例加入純凈水，分別進行二次提取，杜仲葉設定提取溫度75~80℃，提取時間1小時。杜仲皮提取溫度98~100℃，提取時間1:30小時，合并杜仲葉和杜仲皮兩次提取液，經真空減壓過濾器轉移至減壓濃縮罐，設定真空度0.06~0.08Mpa，設定濃縮溫度65~75℃，濃縮至總體積28L左右，比重1.10-1.12。轉移至50L不銹鋼種子發酵罐；

3、打開種子罐加料口，趁混合提取液尚熱補充蛋白胨300g，牛肉膏30g，氯化鈉30g，葡萄糖300g，啟動攪拌，加熱溶解，用20%NaoH和2mol/l的HCI溶液調整PH6.5~6.8，最后補充純凈水至總體積為30L再往罐內加入碳酸鈣300g，封閉加料口，啟動電加熱，設定滅菌溫度118~121℃，滅菌時間30min后，打開夾套冷卻水閥門，使罐內溫度降至37~38℃時，打開接種口，點燃酒精火圈，接種預先準備好的三級圓底燒瓶益生菌發酵種子液3000ml（接種量為10%）迅速關閉接種口，設定發酵起止時間，培養發酵溫度37~38℃，發酵時間18~20小時，發酵液PH值3.8~4.2時，觀察發酵液顏色由深變淺，氣味微香，即轉入噴霧干燥機組進行噴霧操作程序，設定進風溫度160~180℃，出風溫度65~75℃，收集噴霧干燥，干燥品密封冷藏保存，供檢測和壓制片劑灌裝膠囊備用。

對以上實施例所生產產品的質量檢測結果如圖1所示

本品的實際使用效果如圖2所示。

本發明源于藥食同源的草本植物，杜仲獨特的營養和生物活性成分，通過篩選益生菌成員中的嗜酸乳桿菌和腸鏈球菌，加以科學配方和深層培養發酵，兩者優勢互補和雙向發酵的結果，杜仲中純天然的營養成分和生物活性成分，既滿足了益生菌生長繁殖的需求，其發酵的過程又進一步降解了杜仲自身營養和生物活性成分，從而使益生菌健腸胃和杜仲強筋骨的保健功能，得到進一步的提升體現了正本清源回歸天然的食療理念。

經初期臨床使用，尤其是對中老年膝關節滑膜炎、骨質疏松和骨關節病變等患者的食用效果，取得了比較理想的效果。