本發明涉及飼料預混料，尤其涉及一種修復草魚綠肝病變的預混料，及該預混料的制備方法和其應用。
背景技術：
草魚是我國重要的淡水經濟養殖品種，年養殖產量占我國大宗淡水養殖品種之首。草魚肝臟屬于消化系統重要組成部分。草魚肝臟健康程度與消化系統的機能是否達到最佳具有直接的內在聯系，如果肝臟健康受損，草魚的各個階段料比或飼料轉化率都將受到不良的影響。
實踐發現，每年農歷節氣清明與白露前后，往往是服用驅蟲用藥、消毒用藥、化藥等操作最為頻繁的時段，也是草魚肝臟健康問題暴露非常明顯的時段，草魚肝臟健康問題其中之一就是以肝臟局部或大部分出現綠染為特征的病變，俗稱綠肝，表現為肝臟病變部位的肝組織紅潤色澤消褪，且逐漸被綠色漸進性取代。
草魚綠肝病變的發生機理，是在藥物、體質等因素的多重影響下，分布于肝組織之間的膽管發生不同程度的堵塞，造成肝臟膽管出現膽綠素淤積性擴張，當肝臟膽管壁細胞間隙疏松時，膽綠素隨之向肝組織滲透或進入肝血竇向毛細血管網擴散，并最終呈現肝臟局部或大部綠染的現象。
一般情況下，一旦發生草魚綠肝病變并持續，如果缺乏有效的修復方案，綠肝不僅會導致草魚消化機能減退，也會導致草魚體質抗病力下降，嚴重時還會成為草魚老三病的重要誘發因素。
技術實現要素：
在第一方面，本發明提供一種修復草魚綠肝病變的預混料，主要由以下重量份的組分制成：桑葉發酵液10-15份，杜仲葉發酵液10-25份，姜黃發酵液1-5份，豆粕40-60份、白芍發酵液1-7份。
本發明所述的一種修復草魚綠肝病變的預混料針對上述發病機理或相似發病機理的養殖魚類的綠肝病變具有良好的修復效果，特別是針對草魚綠肝病變。
本發明提供一種上述修復草魚綠肝病變的預混料，其中，桑葉發酵液、杜仲葉發酵液、姜黃發酵液和白芍發酵液為綠肝修復的關鍵功能成分；豆粕為液態組分的吸附載體，發揮填充劑功能。
在本發明的預混料中，姜黃發酵液和白芍發酵液對草魚肝組織中吞噬細胞具有良好的激活作用，一方面可以增強吞噬細胞對綠肝病變部位壞死肝細胞的清除；另一方面可為草魚肝細胞再生提供營養源，加快壞死肝組織的自我修復和綠肝癥狀的消除；鮮桑葉發酵液和杜仲葉發酵液對綠肝病變部位膽管細胞壁緊密連接具有良好的修復作用，有效緩解膽綠素外滲的問題，同時增強膽管在膽汁運輸過程的通暢性。
優選的，一種修復草魚綠肝病變的預混料，主要由以下重量份組分制備而成：桑葉發酵液10-15份，杜仲葉發酵液20-25份，姜黃發酵液3-5份，豆粕50-60份、白芍發酵液5-7份。
在一個優選的實施例中，一種修復草魚綠肝病變的預混料，主要由以下重量份的組分制成：桑葉發酵液15份，杜仲葉發酵液25份，姜黃發酵液5份，豆粕50份、白芍發酵液5份。
在另一個優選的實施例中，一種修復草魚綠肝病變的預混料，主要由以下重量份的組分制成：桑葉發酵液10份，杜仲葉發酵液20份，姜黃發酵液3份，豆粕60份、白芍發酵液7份。
優選的，所述桑葉發酵液由包含以下步驟的方法制備得到：將桑葉：水：芽孢液態培養基和枯草芽孢桿菌混合，37℃密閉培養至od值為3-4.5得到培養物，將培養物離心，收集的上清為桑葉發酵液；其中，桑葉(重量)：水(體積)：芽孢液態培養基(體積)的重量體積比1(重量)：4-8(體積)：1-3(體積)，枯草芽孢桿菌的加入量為每重量份桑葉加入1╳105cfu-3╳105cfu。
其中，上述桑葉、水、芽孢液態培養基和枯草芽孢桿菌的混合沒有加入順序的限制，例如采用先將桑葉、水和芽孢液態培養基混合，再加入枯草芽孢桿菌。
進一步的，上述培養物離心優選在3000rpm離心，例如3000rpm離心10分鐘。
在一個優選的實施例中，一種桑葉發酵液，由包含以下步驟的方法制備得到：將桑葉：水：芽孢液態培養基按重量體積比1(重量)：4-6(體積)：1-1.5(體積)混合形成混合液，再按每重量份桑葉加入1.5╳105cfu-2.5╳105cfu枯草芽孢桿菌，37℃密閉培養至od值為3-4.5，將培養物離心去渣，收集的上清為桑葉發酵液。
在一個優選的實施例中，一種桑葉發酵液，由包含以下步驟的方法制備得到：將100重量份的桑葉、400體積份的水和100體積份的芽孢液態培養基混合，再按每重量份桑葉加入2╳105cfu枯草芽孢桿菌，37℃恒溫密閉培養至od值為3-4.5，將培養物3000rpm離心10分鐘去渣，收集到上清即為桑葉發酵液。
其中，所述芽孢液態培養基可以為市售的芽孢液態培養基，例如進口的bacillusmediumbase。
其中，所述枯草芽孢桿菌為兼性厭氧型枯草芽孢桿菌。
其中，所述桑葉為鮮桑葉，例如含水量≥80％的鮮桑葉，確保桑葉的新鮮度。
其中，上述桑葉發酵液制備中的水優選無菌蒸餾水。
優選的，所述杜仲葉發酵液由包含以下步驟的方法制備得到：將杜仲葉、水、芽孢液態培養基和枯草芽孢桿菌混合，37℃密閉培養至od值為3.3-4.5得到培養物，將培養物離心去渣，收集的上清為杜仲葉發酵液；其中，杜仲葉與水的重量體積比為1：4-12，水和芽孢液態培養基的體積比為1-3：1，枯草芽孢桿菌的加入量為每重量份杜仲葉加入3╳103cfu-4.5╳103cfu。
其中，上述杜仲葉、水、芽孢液態培養基和枯草芽孢桿菌的混合沒有加入順序的限制，例如采用先將杜仲葉、水和芽孢液態培養基混合，再加入枯草芽孢桿菌。
進一步的，上述培養物離心優選在3000rpm離心，例如3000rpm離心10分鐘。
在一個優選的實施例中，一種杜仲葉發酵液，由包含以下步驟的方法制備得到：將杜仲葉與水的按重量體積比1：9混合形成混合液，按水和芽孢液態培養基體積比3：1向混合液添加芽孢液態培養基，再按每重量份杜仲葉加入3.3╳103cfu枯草芽孢桿菌，37℃密閉培養至od值為3.8，將培養物3000rpm離心10分鐘，收集的上清為杜仲葉發酵液。
在一個優選的實施例中，一種杜仲葉發酵液，由包含以下步驟的方法制備得到：將杜仲葉與水的按重量體積比1：6混合形成混合液，按無水和芽孢液態培養基體積比2.6：1向混合液添加芽孢液態培養基，再按每重量份杜仲葉加入3╳103cfu枯草芽孢桿菌，37℃密閉培養至od值為3.5，將培養物3000rpm離心10分鐘，收集的上清為杜仲葉發酵液。
其中，所述杜仲葉為含水量≤10％的杜仲葉，含水量的控制有利于提高發酵轉化率。
其中，所述芽孢液態培養基可以為市售的芽孢液態培養基，例如進口的bacillusmediumbase。
其中，所述枯草芽孢桿菌為兼性厭氧型枯草芽孢桿菌。
其中，上述杜仲葉發酵液制備中的水優選無菌蒸餾水。
優選的，所述姜黃發酵液由包含以下步驟的方法制備得到：將姜黃、水、芽孢液態培養基和枯草芽孢桿菌混合，37℃密閉培養至od值為3-4.2得到培養物，將培養物離心，收集的上清為姜黃發酵液；其中，姜黃：水：芽孢液態培養基的重量體積比為1(重量)：9-15(體積)：3-5(體積)，枯草芽孢桿菌的加入量為每重量份姜黃加入1╳105cfu-4╳105cfu。
其中，上述姜黃、水、芽孢液態培養基和枯草芽孢桿菌的混合沒有加入順序的限制，例如采用先將姜黃、水和芽孢液態培養基混合，再加入枯草芽孢桿菌。
進一步的，上述培養物離心優選在3000rpm離心，例如3000rpm離心10分鐘。
在一個優選的實施例中，一種姜黃發酵液，由包含以下步驟的方法制備得到：水：芽孢液態培養基按重量體積比1(重量)：10-12(體積)：3-4(體積)混合，再按每重量份姜黃加入1╳105-3╳105cfu枯草芽孢桿菌，37℃密閉培養至od值為3-4.2得到培養物，將培養物3000rpm離心10分鐘，收集的上清為姜黃發酵液。
在一個優選的實施例中，一種姜黃發酵液，由包含以下步驟的方法制備得到：將100重量份的姜黃、1000體積份的水和300體積份的芽孢液態培養基混合，再加入105cfu/ml以上的枯草芽孢桿菌300體積份，37℃密閉培養至od值為3-4.2，將培養物3000rpm離心10分鐘去渣，收集到上清即為姜黃發酵液。
其中，所述芽孢液態培養基可以為市售的芽孢液態培養基，例如進口的bacillusmediumbase。
其中，所述枯草芽孢桿菌為兼性厭氧型枯草芽孢桿菌。
其中，所述姜黃為含水量在8％以下的姜黃，以保障獲得較高得量的姜黃素。
其中，上述姜黃發酵液制備中的水優選無菌蒸餾水。
優選的，所述白芍發酵液由包含以下步驟的方法制備得到：將白芍、水、芽孢液態培養基和枯草芽孢桿菌混合，37℃密閉培養至od值為3.5-4.8得到培養物，將培養物離心，收集的上清為白芍發酵液；其中，白芍：水：芽孢液態培養的重量體積比為1(重量)：3-8(體積)：0.5-5(體積)，枯草芽孢桿菌的加入量為每重量份白芍加入1╳106cfu-4╳106cfu。
其中，上述白芍、水、芽孢液態培養基和枯草芽孢桿菌的混合沒有加入順序的限制，例如采用先將白芍、水和芽孢液態培養基混合，再枯草芽孢桿菌。
進一步的，上述培養物離心優選在3000rpm離心，例如3000rpm離心10分鐘。
在一個優選的實施例中，一種白芍發酵液，由包含以下步驟的方法制備得到：將白芍：水：芽孢液態培養基按重量體積比1(重量)：3-5(體積)：0.5-2(體積)混合，再按每重量份白芍加入1╳106cfu-3╳106cfu枯草芽孢桿菌，37℃密閉培養至od值為3.5-4.2得到培養物，將培養物3000rpm離心10分鐘，收集的上清為白芍發酵液。
在一個優選的實施例中，一種白芍發酵液，由包含以下步驟的方法制備得到：將100重量份的白芍、300體積份的水和50體積份的芽孢液態培養基混合，再每重量份白芍加入106cfu/ml以上的枯草芽孢桿菌100體積份，37℃恒溫密閉培養96小時，將培養物3000rpm離心10分鐘去渣，收集到上清即為白芍發酵液。
其中，所述芽孢液態培養基可以為市售的芽孢液態培養基，例如進口的bacillusmediumbase。
其中，所述枯草芽孢桿菌為兼性厭氧型枯草芽孢桿菌。
其中，所述白芍為含水量在8％以下的白芍。
其中，上述白芍發酵液制備中的水優選無菌蒸餾水。
本發明的預混料利用獨特的活菌發酵技術，對桑葉、杜仲葉、姜黃和白芍這四種植物進行生物發酵，獲得的發酵產物富含多種活性肽、氨基酸、維生素、微量元素，對綠肝病變部位膽管的疏通具有顯著的調節作用，能有效的修復綠肝病變的癥狀；對魚體和養殖環境不產生殘留，具有綠色安全環保的優點。
在第二方面，本發明提供一種制備上述修復草魚綠肝病變的預混料的方法，所述方法包括以下步驟：將所述組分混合得到混合物，在30-40℃下烘干至混合物的水分含量為8-10％，并可選地粉碎至80-120目篩內，得到預混料。
在一個優選的制備上述修復草魚綠肝病變的預混料的實施例中，該方法包括以下步驟：將所述組分混合得到混合物，在30-35℃下烘干至混合物的水分含量為8-10％，并粉碎至100-120目篩內，得到預混料。
在一個優選的制備上述修復草魚綠肝病變的預混料的實施例中，該方法包括以下步驟：將所述組分混合得到混合物，在30℃下烘干至混合物的水分含量為10％，并粉碎至120目篩內，得到預混料。
在第三方面，本發明還提供一種上述修復草魚綠肝病變的預混料的應用，用于預防性修復草魚綠肝病變和/或用于治療性修復草魚綠肝病變。
其中，所述預混料用于預防性修復草魚綠肝病變時，按重量百分比1-1.5％添加于飼料中，優選連續使用7-15天為一周期。
其中，所述預混料用于治療性修復草魚綠肝病變時，按重量百分比1.5-2.5％添加于飼料中，優選連續使用7-15天為一周期。
與現有的草魚飼料中添加的常規預混料相比，本發明利用獨特的發酵方法，使天然植物中有效活性成分充分釋放，對草魚綠肝病變部位膽管的疏通具有顯著的調節作用，能有效的修復綠肝病變的癥狀，對草魚綠肝病變的修復率可以達到90％以上。
具體實施方式
以下結合具體實施例對本發明進行進一步說明。
實施例1
一種修復草魚綠肝病變的預混料，由以下重量份的組分制備得到：桑葉發酵液15份，杜仲葉發酵液25份，姜黃發酵液5份，豆粕50份、白芍發酵液5份。
其中，桑葉發酵液由以下步驟的方法制備得到：將桑葉：無菌蒸餾水：芽孢液態培養基按重量體積比1(重量)：4-6(體積)：1-1.5(體積)混合形成混合液，再按每重量份桑葉加入1.5╳105cfu-2.5╳105cfu枯草芽孢桿菌，37℃密閉培養至od值為3-4.5，將培養物離心去渣，收集的上清為桑葉發酵液。
其中，杜仲葉發酵液由以下步驟的方法制備得到：將杜仲葉與無菌蒸餾水的按重量體積比1：6混合形成混合液，按無菌蒸餾水和芽孢液態培養基體積比2.6：1向混合液添加芽孢液態培養基，再按每重量份杜仲葉加入3╳103cfu枯草芽孢桿菌，37℃密閉培養至od值為3.5，將培養物3000rpm離心10分鐘，收集的上清為杜仲葉發酵液。
其中，姜黃發酵液由以下步驟的方法制備得到：將100重量份的姜黃、1000體積份的水和300重量份的芽孢液態培養基混合，再加入105cfu/ml以上的枯草芽孢桿菌300體積份，37℃密閉培養至od值為3-4.2得到培養物，將培養物3000rpm離心10分鐘去渣，收集到上清即為姜黃發酵液。
其中，白芍發酵液由以下步驟的方法制備得到：將白芍：無菌蒸餾水：芽孢液態培養基按重量體積比1(重量)：3-5(體積)：0.5-2(體積)混合，再按每重量份白芍加入1╳106cfu-3╳106cfu枯草芽孢桿菌，37℃密閉培養至od值為3.5-4.2得到培養物，將培養物3000rpm離心10分鐘，收集的上清為白芍發酵液。
制備該預混料的方法為：將各組分進行充分混合，接著置于30℃持續烘干至混合物水份含量≤10％時，將混合物過120目粉碎機進行粉碎，獲得的粉碎物即為預混料。
實施例2
一種修復草魚綠肝病變的預混料，由以下重量份的組分制備得到：桑葉發酵液10份，杜仲葉發酵液20份，姜黃發酵液3份，豆粕60份、白芍發酵液7份。
其中，桑葉發酵液由以下步驟的方法制備得到：將100重量份的桑葉、400體積份的水和100體積份的芽孢液態培養基混合，再按每重量份桑葉加入2╳105cfu枯草芽孢桿菌，37℃恒溫密閉培養至od值為3-4.5，將培養物3000rpm離心10分鐘去渣，收集到上清即為桑葉發酵液。
其中，杜仲葉發酵液由以下步驟的方法制備得到：將杜仲葉與無菌蒸餾水的按重量體積比1：9混合形成混合液，按無菌蒸餾水和芽孢液態培養基體積比3：1向混合液添加芽孢液態培養基，再按每重量份杜仲葉加入3.3╳103cfu枯草芽孢桿菌，37℃密閉培養至od值為3.8，將培養物3000rpm離心10分鐘，收集的上清為杜仲葉發酵液。
其中，姜黃發酵液由以下步驟的方法制備得到：無菌蒸餾水：芽孢液態培養基按重量體積比1(重量)：10-12(體積)：3-4(體積)混合，再按每重量份姜黃加入1╳105-3╳105cfu枯草芽孢桿菌，37℃密閉培養至od值為3-4.2得到培養物，將培養物3000rpm離心10分鐘，收集的上清為姜黃發酵液。
其中，白芍發酵液，由以下步驟的方法制備得到：將100重量份的白芍、300體積份的水和50體積份的芽孢液態培養基混合，再每重量份白芍加入106cfu/ml以上的枯草芽孢桿菌100體積份，37℃恒溫密閉培養96小時，將培養物3000rpm離心10分鐘去渣，收集到上清即為白芍發酵液。
制備該預混料的方法為：將各組分進行充分混合，接著置于30℃持續烘干至混合物水份含量≤10％時，將混合物過120目粉碎機進行粉碎，獲得的粉碎物即為預混料。
試驗例1本發明預混料對草魚綠肝病變的預防性修復效果評估
市售的草魚膨化顆粒飼料產品，作為本實驗例的基礎飼料，基礎飼料產品營養成分主要：蛋白30％、脂肪8％、粗纖維12％、粗灰分16％、賴氨酸2.8％。
(1)預混料添加劑量組設定
以市售飼料產品為基礎載體，分別向基礎載體添加不同量的實施例1制備的預混料的組作為試驗組，同時分別設定預混料中桑葉發酵液、杜仲葉發酵液、姜黃發酵液和白芍發酵液單獨缺失時的預混料按不同量添加作為平行對照組，其中以不添加預混料為空白對照組。試驗組設置詳細信息見表1：
表1：不同試驗組設置信息表
注：組別中所對應的缺成分預混料配方以實施例1制備的預混料配方為基礎配方，所缺成分的配比量以等重量面粉進行替換。
(2)試驗分組與管理
選擇63g±5g的健康草魚，從5500尾草魚中隨機挑選4800尾，隨機分為16組，其中每組下設3個平行，各組分別投喂上述16種飼料。試驗周期24天。試驗期間，各組草魚均按2-2.5％的日均投餌率進行投喂，一日三餐定時定點投喂。
(3)綠肝病變的預防性修復效果評估
當試驗第1-7天，各組連續投喂對應的試驗料。試驗第8-12天通過拌飼內服的方法，向各試驗組投喂飼料中按35mg/kg魚體重·每天，將有效含量2％的吡喹酮與市售飼料充分混合，陰干保存，按飽食投喂連續給藥5天，停止給藥。試驗第13-15天連續三天不投料，對養殖草魚形成饑餓脅迫。上述試驗操作是基于生產實踐經驗，模擬多因素疊加誘發草魚綠肝病變的。試驗第16-23天，連續8天投喂各試驗組對應的試驗料。試驗第24天時，對各個試驗組進行同步剖解，暴露肝臟并拍照，若肝臟出現局部性輕微綠染的形態，則認定為輕度綠肝病變；若肝臟出現局部性較深綠染的形態，則認定為中度綠肝病變；若肝臟出現大部或全部綠染的形態，則認定為重度綠肝病變。根據各組試驗結束時草魚綠肝數量的多少統計綠肝病變發生率和修復率，其計算公式如下。
綠肝病變發生率(％)＝認定符合綠肝病變的草魚數量/同組試驗草魚總數量╳100
試驗第24天時，各組草魚經同步剖解現場確認，以對照組草魚輕度綠肝病變、中度綠肝病變和重度綠肝病變發生率為基準，統計的各組草魚不同程度的綠肝病變發生率和修復率如表2。
表2：
從表2可以看出，當作為空白對照的市售基礎飼料中沒有添加本發明的預混料時，內服藥物與饑餓脅迫誘發的草魚綠肝病變發生率有所不同，輕度、中度和重度綠肝病變分別達到54％、4％、3％。當基礎飼料中添加實施例1制備的預混料時，首先，0.5％、1.0％、1.5％三個添加劑量組草魚輕度、中度和重度綠肝病變預防性修復率與預混料添加劑量高低呈正相關；其次，與空白對照組相比，本發明預混料添加0.5％時，對草魚綠肝病變發生率具有良好預防性修復效果，且當預混料添加劑量增加至1.5％時，其對草魚綠肝病變的預防性修復效果更顯著；由此說明，隨著實施例1制備的預混料在推薦劑量范圍內使用劑量的上升，高添加劑量組草魚不同程度綠肝病變的預防性修復率均具有良好的使用效果；以空白對照組草魚不同程度綠肝病變發生率為參照，本預混料的使用對輕度綠肝病變預防性修復率為72-96％，對中度和重度的綠肝病變預防性修復率最高分別為100％與100％。
當基礎飼料中分別添加缺失桑葉發酵液、缺失杜仲葉發酵液、缺失姜黃發酵液和缺失白芍發酵液的本發明預混料時，對應組分缺失的0.5％、1.0％和1.5％三個劑量組草魚綠肝修復率與添加劑量呈正相關，即隨著添加劑量的上升，綠肝發生率呈相關性下降變化，且三個劑量組草魚綠肝發生率明顯較空白對照組的降低，但其發生率仍明顯高于對應組分零缺失的本發明預混料。由此說明，當本發明預混料中對應組分缺失時，雖然通過調整添加劑量可以提高對應組分缺失的預混料的綠肝預防性修復效果，但其預防性修復效果仍然達不到本發明預混料對應用使用劑量的綠肝修復效果。可見，桑葉發酵液、杜仲葉發酵液、姜黃發酵液和白芍發酵液任一組分對本發明中其他成分在預防性修復草魚綠肝病變時具有協同增效作用，并且，桑葉發酵液、杜仲葉發酵液、姜黃發酵液和白芍發酵液是預防性修復草魚綠肝病變的關鍵功能成分。
試驗例2本發明預混料對草魚綠肝病變的治療性修復效果評估
市售的草魚膨化顆粒飼料產品，作為本實驗例的基礎飼料，基礎飼料產品營養成分主要為：蛋白30％、脂肪8％、粗纖維12％、粗灰分16％、賴氨酸2.8％。
(1)預混料添加劑量組設定
以市售飼料產品為基礎載體，分別向載體添加不同量的實施例2制備的預混料的組作為試驗組，同時分別設定預混料中桑葉發酵液、杜仲葉發酵液、姜黃發酵液和白芍發酵液單獨缺失時的預混料按不同量添加作為平行對照組，其中以不添加預混料的組作為空白對照組。試驗組設置詳細信息見表3：
表3：不同試驗組設置信息表
注：組別中所對應的缺成分預混料配方以實施例2制備的預混料配方為基礎配方，所缺成分的配比量以等重量面粉進行替換。
(2)試驗分組與管理
選擇63g±5g的健康草魚，從5500尾草魚中隨機挑選4800尾，隨機分為16組，其中每組下設3個平行，各組分別投喂上述16種飼料。試驗周期22天。試驗期間，各組草魚均按2.0-2.5％的日均投餌率進行投喂，一日三餐定時定點投喂。
(3)綠肝病變病理模型的構建
基于生產實踐經驗，模擬多因素疊加誘發草魚綠肝病變的。當試驗第1-8天，連續8天不投喂飼料，對養殖草魚形成饑餓脅迫。試驗第9-13天，以拌飼內服的方式，將有效含量2％的吡喹酮與市售飼料充分混合制成藥餌，確保所投藥餌中藥物攝入劑量達到35mg/kg魚體重·每天。試驗第14-21天連續8天投喂各試驗組對應的試驗料。
(4)綠肝病變的治療性修復效果評估
試驗第22天時，對各個試驗組進行同步剖解，暴露肝臟并拍照，若肝臟出現局部性輕微綠染的形態，則認定為輕度綠肝病變；若肝臟出現局部性較深綠染的形態，則認定為中度綠肝病變；若肝臟出現大部或全部綠染的形態，則認定為重度綠肝病變。根據各組試驗結束時草魚綠肝數量的多少統計綠肝病變發生率和修復率，其計算公式如下。
綠肝病變發生率(％)＝認定符合綠肝病變的草魚數量/同組試驗草魚總數量╳100
試驗第22天時，各組草魚經同步剖解現場確認，各組草魚不同程度的綠肝病變發生率和修復率如表4。
表4：
從表4可以看出，當作為空白對照的市售基礎飼料中沒有添加本發明的預混料時，內服藥物與饑餓脅迫誘發的草魚綠肝病變發生率有所不同，輕度、中度和重度綠肝病變分別達到64％、5％、7％。當基礎飼料中添加實施例2制備的預混料時，首先，1.5％、2.0％、2.5％三個添加劑量組草魚輕度、中度和重度綠肝病變治療性修復率與預混料添加劑量高低呈正相關；其次，與空白對照組相比，本發明預混料添加1.5％時，對草魚綠肝病變發生率具有良好治療性修復效果，且當預混料添加劑量增加至2.5％時，其對草魚綠肝病變的治療性修復效果更顯著；由此說明，隨著實施例2制備的預混料在推薦劑量范圍內使用劑量的上升，高添加劑量組草魚不同程度綠肝病變的治療性修復率均具有良好的使用效果；以空白對照組草魚不同程度綠肝病變發生率為參照，本預混料的使用對輕度綠肝病變修復率為61-94％，對中度和重度的綠肝病變治療性修復率最高分別為100％與100％。
當基礎飼料中分別添加缺失桑葉發酵液、缺失杜仲葉發酵液、缺失姜黃發酵液和缺失白芍發酵液的本發明預混料時，對應組分缺失的1.5％、2.0％和2.5％三個劑量組草魚綠肝修復率與添加劑量呈正相關，即隨著添加劑量的上升，綠肝發生率呈相關性下降變化，且三個劑量組草魚綠肝發生率明顯較空白對照組的降低，但其發生率仍明顯高于對應組分零缺失的本發明預混料。由此說明，當本發明預混料中對應組分缺失時，雖然通過調整添加劑量可以提高對應組分缺失的預混料的綠肝治療性修復效果，但其治療性修復效果仍然達不到本發明預混料對應用使用劑量的綠肝治療性修復效果。可見，桑葉發酵液、杜仲葉發酵液、姜黃發酵液和白芍發酵液任一組分對本發明中其他成分在治療性修復草魚綠肝病變時具有協同增效作用，并且，桑葉發酵液、杜仲葉發酵液、姜黃發酵液和白芍發酵液是治療性修復草魚綠肝病變的關鍵功能成分。
以上所述，僅為本發明的較佳的具體實施例，但本發明的保護范圍并不局限于此，任何熟悉本技術領域的技術人員在本發明揭露的技術范圍內，根據本發明的技術方案及其構思加以等同替換或改變，都應涵蓋在本發明的保護范圍內。