專利名稱：高效超聲波基因導入方法
技術領域：
本發明涉及基因工程中的基因導入方法，屬動植物遺傳工程。
植物基因工程的關鍵技術之一，是如何高效地將外源基因導入植物細胞，并再生出轉基因植株，用于作物品種改良，以培育高產、優質、抗病的新品種。目前，植物細胞的基因轉移有生物方法，化學方法和物理方法。比較常用的物理方法是電激基因轉移法。操作過程是將盛有細胞和DNA(脫氧核糖核酸)液的特制小容器置于電脈沖儀的正負電極之間，然后施加電脈沖。在高壓電脈沖的作用下，細胞膜因發生臨時性破裂而形成微小的孔洞，在其自動修復以前，溶液中的DNA分子會籍助濃度差通過孔洞擴散到細胞中，并最終進入細胞核內部，整合到受體細胞的染色體中。這種方法的優點是操作簡便，基因轉移效率較高以及無宿主范圍限制等，因此，電激法是動植物基因工程中較常用的基因轉移方法。缺點是在進行植物基因轉移時受體一般是原生質體，而原生質體培養再生出植株比較困難，特別對于有經濟意義的禾谷類作物更是如此，因此電激基因轉移法在植物基因轉移中受到了限制。
本發明的目的是提出一種新的物理方法轉移基因，即應用超聲波誘導基因轉移，此方法同時適用于動植物以及微生物的基因轉移。
本發明的內容是將生物材料(植物組織塊、植物懸浮細胞、動物細胞、微生物細胞等)與DNA溶液混合放入超聲小室中;再將超聲波引入超聲小室，作用于DNA溶液中的生物材料上。超聲波為連續或脈沖型，生物材料感受到的超聲波聲強為小于10W/cm2，頻率為小于5MHZ，作用時間為大于0.01秒。
超聲波誘導基因轉移的原理是，超聲波在液體中傳播時，能夠產生空化作用。所謂空化作用，就是液體中存在的一些微小氣泡，在超聲波的作用下發生共振并伴隨產生一系列物理現象。如空化作用發生時，在空化中心會產生局部的高溫高壓，使得細胞壁產生局部的穿孔，也使得細胞膜產生局部的和暫時的結構改變，即也造成一系列的穿孔效應，溶液中的DNA分子可以籍此擴散進入細胞。在高等植物的許多組織中，細胞間的通道里存在一些微小氣泡，這些氣泡在超聲作用下將成為空化中心，從而對周圍的細胞發生作用。由于這種氣泡是普遍存在的，這就使得大量細胞都能感受到超聲波的空化作用。
超聲波誘導基因轉移方法不受宿主范圍限制，而且可將外源基因直接導入帶壁的植物細胞，特別是植物體的組織塊中，由它們再生植株比從原生質體培養要容易得多。超聲波基因轉移方法同樣適用于動物的基因轉移和微生物的基因轉移，同時超聲波法導入基因還具有裝置簡單，操作方便等優點，在動植物基因工程中有廣泛的應用前景。
本發明的五個實施例為1.用聲強為0.5W/cm2及1.0W/cm2，頻率為800KHZ的脈沖超聲波，作用時間為30分鐘，實現將外源基因導入小麥幼穗誘導愈傷組織，獲短暫表達。
2.用聲強為0.5W/cm2，頻率為800KHZ的脈沖超聲波，作用時間30分鐘，實現將外源基因導入煙草葉塊，獲穩定表達。
3.用聲強為2.0W/cm2，頻率為800KHZ的連續超聲波，作用時間為30秒，將外源熒光物質鈣黃素導入衣藻細胞中。
4.用聲強為0.5W/cm2，頻率為800KHZ的脈沖超聲波，作用時間為15秒，將外源熒光物質鈣黃素導入紅細胞中。
5.用聲強為2.0W/cm2，頻率為800KHZ的脈沖超聲波，作用時間為10分鐘，將外源熒光物質鈣黃素導入酵母細胞中。
權利要求
1.一種高效超聲波基因導入方法，其特征在于基因導入的步驟為(1)將生物材料(植物組織塊、植物懸浮細胞、動物細胞或微生物細胞等與DNA溶液混合；(2)引入超聲波，作用于DNA溶液中的生物材料上。
2.如權利要求1所述的基因導入方法，其特征在于引入的超聲波為連續或脈沖超聲波，作用在生物材料上的超聲波聲強小于10W/cm2，頻率小于5MHZ，作用時間大于0.01秒。
3.如權利要求1所述的基因導入方法，其特征在于所述的生物材料為小麥幼穗誘導愈傷組織，引入的超聲波為脈沖超聲波，作用在衣藻細胞上的超聲波聲強為1.0W/cm2，頻率為800KHZ，作用時間為30分鐘。
4.如權利要求1所述的基因導入方法，其特征在于所述的生物材料為衣藻細胞，引入的超聲波為連續超聲波，作用在衣藻細胞上的超聲波聲強為2.0W/cm2，頻率為800KHZ，作用時間為30秒。
5.如權利要求1所述的基因導入方法，其特征在于所述的生物材料為紅細胞，引入的超聲波為脈沖超聲波，作用在紅細胞上的超聲波聲強為0.5W/cm2，頻率為800KHZ，作用時間為15秒。
6.如權利要求1所述的基因導入方法，其特征在于所述的生物材料為酵母細胞，引入的超聲波為脈沖超聲波，作用在酵母細胞上的超聲波聲強為2.0W/cm2，頻率為800KHZ，作用時間為10分鐘。
全文摘要
本發明涉及一種動植物基因工程中新的基因導入方法，即高效超聲波基因導入方法。本方法是將超聲波作用于DNA溶液中的生物材料上，由于超聲波使細胞膜產生局部和暫時的結構改變，溶液中的DNA分子可以藉此擴散進入細胞。超聲波誘導基因轉移方法不受宿主范圍限制，而且可將外源基因直接導入帶壁的植物細胞，特別是植物體的組織塊中，由它們再生植株比從原生質體培養要容易得多，超聲波法導入基因還具有裝置簡單，操作方便等優點，在動植物基因工程中有廣泛的應用前景。
文檔編號C12N15/87GK1056124SQ9110362
公開日1991年11月13日 申請日期1991年6月5日 優先權日1991年6月5日
發明者許寧, 趙南明, 章力建, 賈士榮 申請人:清華大學, 中國農業科學院生物技術研究中心