專利名稱：肝再生增強因子基因轉染真核細胞的方法及應用的制作方法
技術領域：
本發明涉及肝再生增強因子基因轉染真核細胞的方法，具體涉及人肝再生增強因 子轉染真核細胞的方法，以及含人工轉染人肝再生增強因子基因的真核細胞的應用，屬于 生物工程的生產方法。
背景技術：
肝再生增強因子(Augmenter of liver regeneration, ALR)也稱肝細胞生長素 (HPO)，1994年被鑒定并從大鼠肝刺激物質(HSS)中純化得到，主要分布于肝臟、腎臟。ALR 是一種多肽調節因子，由125個氨基酸構成，相對分子量為15kDa，與含還原劑的SDS-PAGE 檢測結果一致。而從動物體內提純的天然ALR，經不含還原劑的SDS-PAGE分析，其分子 量約為30kDa，提示ALR在體內可能存在同源二聚體結構。ALR定位于16號染色體的 pl3. 31-pl3. 32，該基因包括3個外顯子和2個內含子。ALR是一種新型的細胞因子，與其他 的親肝細胞生長因子(如肝細胞生長因子干擾素-11等)在結構上無任何關系，但其編碼 區基因與酵母菌核基因(ERV1)有50%的同源性。HALR(人肝再生增強因子)的生物學活 性表現為在受到損傷的肝臟的修復過程中發揮重要的作用，保護肝臟，促進肝細胞再生，此 外ALR還參與多種與氧化還原有關的代謝活動。ALR能刺激肝細胞DNA合成，抑制肝NK細 胞活性，誘導肝線粒體基因表達，參與肝細胞再生，并具有免疫調控作用。目前有關ALR的 研究主要是其生物合成及其蛋白水平利用與開發的研究。基因轉染技術是采用一定的方法和途徑將外源基因分子，如DNA、RNA等導入感受 態細胞，并表達目的基因，產生特定功能的蛋白質分子。常用的表達系統主要分為兩類一 類是采用真核表達載體轉染DNA的瞬時表達系統或穩定表達系統；一類是采用病毒載體的 表達系統。病毒載體雖然具有高轉染率，能夠持續、穩定表達外源基因的特點，但由于病毒 載體需整合到轉染細胞的染色體中才能夠使外源基因得以表達，因此具有致癌、致畸的危 險，安全性較差。這一缺陷已成為限制病毒載體廣泛應用的主要原因。真核表達質粒是一 種核酸，它不同于病原體，在自然狀態下沒有感染性，以附加體的形式存在于被轉染的靶細 胞的胞體內，不被體外培養的細胞吸附，當細胞增殖時獨立的表達外源基因。它不需要整合 于轉染細胞的染色體內，因而具有安全性高的優點。生物人工肝(bioartificial liver, BAL)指應用生物材料肝細胞(人肝細胞、動 物肝細胞、人肝細胞系、基因轉化細胞等)構建體外灌流裝置替代衰竭的肝臟進行生物合 成及代謝的體外人工肝支持系統。生物反應器內肝細胞要在生物反應器中大量培養生長、 保持活性并維持足夠長的時間是構建生物人工肝的關鍵，故生物型人工肝細胞的來源及相 關研究是該研究領域的熱點問題。因此，提供一種人肝再生增強因子轉染真核細胞的方法，構建含人工轉染人肝再 生增強因子基因的真核細胞株，具有重要的意義和實用價值。

發明內容
本發明的目的在于提供人肝再生增強因子基因轉染真核細胞的方法，以及構建的 含人工轉染人肝再生增強因子基因的真核細胞株的應用。為實現上述目的，本發明采取以下技術方案一種人肝再生增強因子基因轉染真核細胞的方法，其步驟如下構建 pCDNA3. 1 (-)HALR質粒，同時進行IfepG2的培養及篩選；pcDNA3. 1 (-)HALR質粒轉染IfepG2 篩選后所得的肝腫瘤細胞系；然后對轉染的肝細胞系進行篩選，用有限稀釋法挑選生長迅 速的克隆，建立穩定的肝細胞系。一種優選技術方案，其特征在于所述的構建p⑶NA3. 1(_)HALR質粒以后，還要進 行提取純化。一種優選技術方案，其特征在于所述的構建PCDNA3. 1㈠HALR質粒，包括如下步驟①相應抗生素的LB瓊脂平板的制備將含有1. 5%瓊脂的LB固體培養基加熱融 解，當培養基溫度降至40-60°C時，加入相應的抗生素(氨芐青霉素)至終濃度為100mg/l， 將25ml倒入直徑為90mm的培養皿中，室溫放置至凝固；②取待轉化的pcDNA3. 1 (-)HALR質粒1 y 1，無菌水稀釋至100 u 1，冰上備用；③將步驟②的稀釋質粒加到SO-lOOiU的感受態細胞DH5ci中并混勻，冰浴 20min,隨后室溫放置lOmin ；④加入400iU LB培養基，37°C，200rpm振蕩30min，加入步驟③的液體中，然后取 200 u 1鋪在步驟①制備好的含抗生素的LB瓊脂平板上；⑤將步驟④的平板置于室溫直至液體被吸收；⑥倒置平板，于37°C培養，12-16h后長出單克隆菌落。一種優選技術方案，其特征在于所述的IfepG2的培養，包括如下步驟(1)從液氮中取出IfepG2細胞凍存管、迅速置于37°C水浴使細胞快速融化；(2) lOOOrpm離心凍存管lmin，棄上清凍存液；(3)向凍存管中加入1ml含10% FBS (胎牛血清)的DMEM培養液，輕輕吹打重懸 細胞；(4)將細胞重懸至預裝10ml含10%FBS的DMEM培養液的75cm2培養瓶中，置37°C， 5% C02，飽和濕度的培養箱中培養，觀察生長狀態；(5)傳代取對數生長期H印G2細胞，倒掉DMEM培養液，用0. 02 % EDTA 2ml洗2 次；(6)0. 25%胰酶和0. 02% EDTA按1 1比例約2ml消化細胞l_3min，鏡下觀察細 胞圓縮偽足消失，加入約4ml含10% FBS的DMEM培養液終止消化。(7)輕輕吹打收集細胞，lOOOrpm離心lmin棄上清，以DMEM培養液重懸細胞，根據 細胞密度和實驗要求分種細胞。一種優選技術方案，其特征在于所述的IfepG2的篩選，包括如下步驟(1)將H印G2懸液采用有限稀釋法稀釋至極低的細胞濃度；培養液為MEM培養液 (含10% FBSU00U/ml青霉素、100U/ml鏈霉素、2mmol/L谷氨酰胺等)，將細胞懸液加至96 孔培養板中，平均每孔0. 3ml，在倒置相差顯微鏡下觀察，約1個細胞/孔，再置于37°C，5% C02，飽和濕度的培養箱中培養；；
(2)接種6h后，在倒置相差顯微鏡下觀察細胞的生長狀態，反復多次，篩選出幾株 生長旺盛的細胞克隆；然后用含80mg/l濃度的利多卡因的上述培養液進行進一步篩選，保 留一株生長旺盛、形態保持良好的細胞系，進行大量培養，再進行胰酶、EDTA消化，傳代后作 進一步功能鑒定。一種優選技術方案，其特征在于所述的pcDNA3. 1 (_) HALR質粒轉染H印G2篩選后 所得的肝腫瘤細胞系，采用VigoFect轉染試劑盒進行轉染。一種優選技術方案，其特征在于所述的pcDNA3. 1 (_) HALR質粒轉染H印G2篩選后 所得的肝腫瘤細胞系，包括如下步驟(1)取3 ii g的pcDNA3. 1 (-)ALR質粒，加入0. 9 %氯化鈉的鹽水至300 yl，靜置 15min ；(2)3 u 1的VigoFect轉染試劑，加入0.9%氯化鈉的鹽水至300 iil，靜置5min ；(3)將稀釋后VigoFect試劑緩慢加入步驟①所得質粒溶液中，輕輕混勻，室溫靜 置 15min ；(4)將步驟(2)和步驟(3)所得溶液分別緩慢加入3ml細胞培養瓶中，37°C、5 % C02飽和濕度孵箱內培養；將穩定傳代的HepG2細胞貼壁生長在3ml細胞培養瓶中(37°C、 5% C02、飽和濕度，予含10% FBS的MEM液培養；轉染前24h將細胞按1 X 105個/孔濃度接 種于3ml培養瓶中，第二天細胞生長密度達70% ；轉染前lh更換新鮮的含FBS培養液；(5) 16_24h后用含10% FBS的新鮮MEM培養基給細胞換液繼續培養，24h后觀察細 胞的形態和活性變化。一種優選技術方案，其特征在于所述的對轉染的肝細胞系進行篩選，為采用 G418進行篩選。一種優選技術方案，其特征在于所述的對轉染的肝細胞系進行篩選，包括如下步 驟將轉染后的細胞，用含100 u g/L G418的培養液培養2周，然后再采用200 u g/L的G418 的培養液培養2周，最后用300 u g/L G418的培養液培養篩選，2個月后獲得高表達ALR的 肝細胞系。真核細胞系包括從HepG2細胞中篩選出來的具有較強利多卡因代謝的肝細胞系 等所有真核細胞。有益效果本發明的優點在于肝再生增強因子(Augmenter of liver regeneration, ALR) 是一種熱穩定、可促肝細胞增殖的細胞性因子，在體內肝臟、腎臟等組織廣泛存在，本發明 的人肝再生增強因子基因轉染真核細胞的方法，具有作為生物人工肝構建的開發的巨大潛 力，可利用基因工程技術大量生產，降低成本，應用于生物人工肝研究與臨床，這一研究在 國內外生物人工肝研究中未見報道。除此之外，轉染的肝細胞還可以促進肝細胞移植中移 植細胞的生長繁殖或有助于組織器官工程技術的發展等。下面通過附圖和具體實施方式
對本發明做進一步說明，但并不意味著對本發明保 護范圍的限制。


圖 1 是 pcDNA3. 1 (-) HALR 質粒結構圖2是pcDNA3. 1㈠HALR質粒的雙酶切后的電泳圖；圖3是轉染HALR基因前后細胞生長比較；圖4是轉染HALR基因細胞漿內熒光圖；圖5為細胞生長曲線的變化。
具體實施例方式實施例具體實施方法通過構建質粒p⑶NA3. 1 (-)HALR質粒，轉染H印G2篩選后所得的肝 腫瘤細胞系，然后用G418進行篩選，用有限稀釋法挑選生長迅速的克隆，建立穩定的肝細 胞系，觀察肝細胞活力與繁殖量。一、主要試劑的配置1、抗體稀釋液0. 1% TBST 10ml+0. 5g脫脂奶粉。2、MEM培養液使用前加入10% FBSU00U/ml青霉素、100U/ml鏈霉素、2mmol/L谷
氨酰胺等。3、電泳緩沖液-Tris-乙酸(TAE)貯存液(50 X) 242gTris堿+57. lml冰乙酸 +100ml 0. 5mol/LEDTA(pH8. 0)，去離子水定容至1000ml ；用49份去離子水加1份儲存液稀 釋成工作液(IX)。4,0. 8%瓊脂糖凝膠制備稱取0. 8g瓊脂糖溶解于1XTAE緩沖液100ml中，微波 爐加熱使其融化，冷卻至55°C時加入溴化乙錠EB至終濃度為0. 5 u g/ml。5、LB (Luria-Bertani)培養基配制900ml去離子水中溶解胰化蛋白胨10g，酵母 提取物5g，氯化鈉10g，搖動容器直至溶質溶解，用5mol/L NaOH調pH至7. 0，用去離子水定 容至1000ml。高壓蒸汽滅菌20分鐘。6、0. 25%胰酶0. 25g胰蛋白酶粉劑溶于100ml D-Hank，s液中，0. 22 y m濾器過 濾除菌，-20°C保存，經常使用的4°C保存，使用前加熱至37°C。7,0. 02% EDTA 0. 02gEDTA 粉劑溶于 100ml D-Hank，s 液中，0. 22 u m 濾器過濾除
菌，經常使用的4°C保存。使用時用lmol/L NaOH調節PH值至8.0。8、鼠抗人ALR單克隆抗體為廣州孔祥平教授惠贈。9、熒光素標記羊抗鼠抗體為解放軍302醫院傳染病研究所研制。10、真核轉染試劑威格拉斯生物技術有限公司生產的高效真核轉染試劑 (vigofect)。二、H印G2的培養及篩選1、HepG2的復蘇及培養1)從液氮中取出IfepG2細胞凍存管、迅速置于37°C水浴使細胞迅速融化；2) lOOOrpm離心凍存管lmin，棄上清凍存液；3)向凍存管中加入lml含10% FBS的DMEM培養液，輕輕吹打重懸細胞；4)將細胞重懸至預裝10ml含10%FBS的DMEM培養液的75cm2培養瓶中，置37°C， 5% C02，飽和濕度的培養箱中培養，觀察生長狀態；5)傳代取對數生長期H印G2細胞，倒掉DMEM培養液，用0. 02 % EDTA 2ml洗2 次；
6)0. 25%胰酶和0. 02% EDTA按1 1比例約2ml消化細胞l_3min，鏡下觀察細 胞圓縮偽足消失，加入約4ml含10% FBS的DMEM培養液終止消化；7)輕輕吹打收集細胞，lOOOrpm離心lmin棄上清，以DMEM培養液重懸細胞，根據 細胞密度和實驗要求分種細胞。2、IfepG2細胞的篩選(1)將H印G2懸液采用有限稀釋法稀釋至極低的細胞濃度；培養液為MEM培養液 (含10% FBSUOOU/ml青霉素、100U/ml鏈霉素、2mmol/L谷氨酰胺等)，將細胞懸液加至96 孔培養板中，平均每孔0. 3ml，在倒置相差顯微鏡下觀察，約1個細胞/孔，再置于37°C，5% C02，飽和濕度的培養箱中培養。(2)接種6h后，在倒置相差顯微鏡下觀察細胞的生長狀態，反復多次，篩選出幾株 生長旺盛的細胞克隆；然后用含80mg/l濃度的利多卡因的上述培養液進行進一步篩選，保 留一株生長旺盛、形態保持良好的細胞系，進行大量培養，再進行胰酶、EDTA消化，傳代后作 進一步功能鑒定。三、pcDNA3.1(_)HALR 質粒的鑒定1)質粒的構建pcDNA3. 1 (-)HALR質粒結構如圖1所示。2)轉化操作步驟①相應抗生素的LB瓊脂平板的制備將含有1. 5%瓊脂的LB固體培養基加熱融 解，當培養基溫度降至50°C左右時，加入相應的抗生素(氨芐青霉素)至終濃度為100mg/l 的，將25ml倒入直徑為90mm的培養皿中，室溫放置至凝固。②取待轉化的pcDNA3. 1 (-)HALR質粒1 ii 1，無菌水稀釋至100 u 1，冰上備用。③將步驟②的稀釋質粒加入到一管感受態細胞DH5 a (約80_100 u 1)中并混勻， 冰浴20min，隨后室溫放置lOmin。④加入400iU LB培養基，37°C，200rpm振蕩30min，加入步驟3的液體中，然后取 200 u 1鋪在步驟1制備好的含抗生素的LB瓊脂平板上。⑤將步驟4的平板置于室溫直至液體被吸收。⑥倒置平板，于37°C培養，12-16h后可長出單克隆菌落。3)質粒的提取純化(北京博大泰克公司，去內毒素小量質粒提取試劑盒)(1)挑取生長獨立、大而圓的單克隆菌落接種到5ml LB培養基中，37°C，200rpm過 夜振蕩培養。(2) lOOOOrpm離心lmin收集過夜培養的菌液，棄去上清并吸除剩余的培養液。(3)加入250 ill細胞重懸液(Cell Resuspension Solution)旋渦震蕩以充分懸 浮細胞。(4)加入250 u 1細胞裂解液(Cell Lysis Solution)顛倒離心管4次以充分混 合，孵育至細胞懸浮液澄清，孵育時間不要超過5min。(5)加入10 ii 1堿性蛋白酶溶液(Alkaline Protease Solution)顛倒離心管4 次，室溫孵育5min。(6)加入350 u 1中和溶液(Neutralization Solution)并迅速顛倒離心管4次以 充分混合。(7)室溫將細胞裂解液以14000rpm速度離心lOmin。
(8)對于每一個樣品將一個離心柱插入一個2ml收集管中，將7步收集的澄清裂解 液轉移至離心柱中。(9)室溫以14000rpm速度離心上清液lmin，從收集管中取出離心管并棄去收集管 中的液體，將離心柱重新插入收集管中。(10)加入750 ill已用95%的酒精稀釋過的柱洗溶液(Wash Solution)，室溫以 14000rpm速度離心lmin，從收集管中取出離心管并棄去收集管中的液體，將離心柱重新插 入收集管中。(11)加入250 ill柱洗溶液重復清洗步驟，室溫以14000rpm速度離心2min。(12)將離心柱轉移至一個新的1.5ml消毒離心管中，加入100 ill無核酸酶的水以 洗脫質粒DNA，室溫14000rpm速度離心lmin。(13)取出離心柱，將純化所得的質粒DNA放于-20°C保存。測260/280值，測定質粒的濃度。
4)質粒的鑒定
(1)序列測定提取純化后質粒進行酶切鑒定，鑒定與預期結果相符后將標本送北京華大生物技術公司進行序列測定。
HALR片段的序列分析
ATGCGGACGCAGCAGAAGCGGGACACCAAGTTTAGGGAGGACTGCCCGCCGGATCGCGAGGAACTGGGC
CGCCACAGCTGGGCTGTCCTCCACACCCTGGCCGCCTACTACCCCGACCTGCCCACCCCAGAACAGCAG
CAAGACATGGCCCAGTTCATACATTTATTTTCTAAGTTTTACCCCTGTGAGGAGTGTGCTGAAGACCTA
AGAAAAAGGCTGTGCAGGAACCACCCAGACACCCGCACCCGGGCATGCTTCACACAGTGGCTGTGCCAC
CTGCACAATGAAGTGAACCGCAAGCTGGGCAAGCCTGACTTCGACTGCTCAAAAGTGGATGAGCGCTGG
CGCGACGGCTGGAAGGATGGCTCCTGTGACTAG
序列測定結果和HALR序列完全相符，參見序列表。
(2)雙酶切鑒定
去離子水 15 Pi
10 X Buffer L 2 u 1
重組質粒 liU 37°C酶切4h
Ecol I lu 1 0.8%瓊脂糖電泳分析鑒定
BamH I 1 u 1
雙酶切后的電泳圖如圖2所示，是pcDNA3. 1㈠HALR質粒的雙酶切后的電泳圖，
含ALR載體質粒經Ecol 1和BamHl雙酶切后的0. 8%瓊脂糖電泳照片。圖2中1為未酶切 的質粒；2為DNA Marke ；3為Ecol I單酶切；4為Ecol 1和BamHI雙酶切。結果說明經雙 酶切后，成功從質粒中切除片斷約378bp大小的片斷，與所需片斷相符。四、pcDNA3. 1(-)HALR質粒的轉染及肝細胞系的篩選穩定傳代的上述篩選出的H印G2細胞貼壁生長在3ml培養瓶中(37°C、5% C02、飽 和濕度)，培養液含10% FBS的DMEM液。按Vigofect轉染試劑盒操作要求，轉染前24h將細 胞按1 X 105個/孔濃度接種于3ml培養瓶中，第二天細胞生長密度達70 %。轉染前lh更換 新鮮的含FBS培養液。轉染共分3組，分別是質粒pcDNA3. 1(-)HALR組、空載體pcDNA3. 1(_) 組和空白對照組。
轉染按照試劑盒說明操作，具體如下①取3iig的pcDNA3. 1 (-)HALR質粒，加入0. 9 %氯化鈉的鹽水至300 yl，靜置 15min,②取3iil的VigoFect轉染試劑，加入0. 9%氯化鈉的鹽水至300iil，靜置5min，③將稀釋后VigoFect試劑緩慢加入步驟①所得質粒溶液中，輕輕混勻，室溫靜置 15min，④將步驟②和步驟③所得溶液分別緩慢加入3ml細胞培養瓶中，空白對照組不加 質粒。37°C、5% 0)2飽和濕度孵箱內培養，⑤16-24h后用含10% FBS的新鮮MEM培養基給細胞換液繼續培養，24h后觀察細 胞的形態和活性變化。 上述轉化后的細胞，用含100、200、3001^/1的6418逐步(含1001^/1 G418 的培養液培養2周，然后再采用200 u g/L的G418的培養液培養2周，最后予300 u g/LG418 的培養液培養)篩選，2個月后獲得能較高表達HALR的肝細胞系。圖3是轉染HALR基因前后細胞生長比較，經篩選克隆后肝細胞系的形態見圖3中 左圖；轉染HALR后肝細胞系的形態見圖3中右圖。可見肝細胞形態保持穩定，轉染HALR質 粒的肝細胞胞漿中顆粒豐富，形態規則，生長旺盛。五、間接免疫熒光檢測ALR在真核細胞中的表達(1)首先將明確是能較高表達ALR的肝細胞系培養在玻片培養管中，48h后觀測細 胞的形態，如果細胞生長至70-80%，即可取出，放入-20度的丙酮中過夜固定。(2)取出肝細胞玻片，0.9%生理鹽水沖洗，加入按1 80濃度的鼠抗人ALR單克 隆抗體，37°C作用30min，然后用O.Olmol/L PH 7. 2的PBS洗兩次，lOmin后用吸水紙吸取 或吹風機吹干液體。(3)再滴加入熒光素標記羊抗鼠抗體(二抗)，同上步驟，37°C染色30min，生理鹽 水洗2次，甘油或中性樹膠封固，再熒光顯微鏡下觀察并照片，如圖4所示。圖4是轉染HALR 基因細胞漿內熒光圖，可見細胞胞漿中可見大量發出熒光標志的物質，即為轉染的人ALR， 細胞系表達人ALR較強，表明轉染成功。六、HALR轉染前后肝細胞系的生長與增殖測定①取單層培養的兩種肝細胞系(轉染前肝細胞系，轉染HALR的細胞系)。棄培養 液，D-Hanks液洗2次，消化并收集細胞(方法同傳代培養)；②用紅細胞計數板計數(臺盼藍染色細胞活度> 90% )后，分別用普通細胞培養 液調整細胞密度為1 x 105個細胞/ml，以每孔200 u 1接種于7個96孔培養板中，每組6孔， 置入37°C、5% C02、飽和濕度孵箱內培養。③每日分別用普通細胞培養液和換液。④于接種后第1-7天每天取出一塊培養板用MTT法測細胞的光吸收值(A45CI)。⑤具體方法每孔加5mg/ml MTT溶液20iil，37°C、5% C02、飽和濕度孵箱內繼 續孵育4h后，小心吸棄孔內上清液，D-Hanks液輕洗3次，每孔加入二甲亞砜150 yl，振 蕩lOmin使沉淀充分溶解后，選擇450nm波長，在酶聯免疫檢測儀上測定各孔的光吸收值
(A450)，⑥記錄結果，并以時間為橫軸、光吸收值為縱軸繪制細胞生長曲線，如圖5所示。轉染HALR質粒的肝細胞生長較未轉染的肝細胞生長旺盛，生長速度明顯增快，在細胞培養 前4天尤為突出。第一天轉染與未轉染HALR質粒的肝細胞的A450值分別為0. 224和0.314。 第二天轉染與未轉染HALR質粒的肝細胞的A450值分別為0. 318和0. 409。有顯著性差別。七、利多卡因轉化實驗細胞單層培養72小時后，在培養液中加入80mg/L的利多卡因，繼續培養肝細胞24 小時，每8小時留取培養液標本用四級桿氣質聯用儀Trance/DSQII檢測利多卡因濃度。利多卡因轉化實驗結果單層培養肝細胞72h后，在培養液中加入80mg/L的利多 卡因，8小時后利多卡因濃度平均56. 40mg/L, 16小時后濃度平均為31. 26mg/L, 24小時后濃 度平均為9. 26mg/L。采用有限稀釋法從人肝細胞系H印G2細胞中篩選出來的肝細胞系，生長比較旺 盛，而且由一定的利多卡因代謝功能，經轉染人肝細胞再生增強因子后，再經多濃度G418 篩選，細胞形態、功能保持良好，對其在生物人工肝研究和/或體外人ALR的生產有一定的 現實意義。本發明利用基因工程技術生產肝再生增強因子，然后轉染真核細胞，促進真核細 胞的生長繁殖，在作為生物人工肝生物反應器細胞生長促進劑或體內肝細胞移植等領域具 有很大的應用前景。序列表<110>中國人民解放軍第三零二醫院<120>肝再生增強因子基因轉染真核細胞的方法及應用<130><160>1<170>PatentIn version 3. 3<210>1<211>378<212>DNA<213>HALR片段的核苷酸序列<400>1atgcggacgc agcagaagcg ggacaccaag tttagggagg actgcccgcc ggatcgcgag 60gaactgggcc gccacagctg ggctgtcctc cacaccctgg ccgcctacta ccccgacctg 120cccaccccag aacagcagca agacatggcc cagttcatac atttattttc taagttttac 180ccctgtgagg agtgtgctga agacctaaga aaaaggctgt gcaggaacca cccagacacc 240cgcacccggg catgcttcac acagtggctg tgccacctgc acaatgaagt gaaccgcaag 300ctgggcaagc ctgacttcga ctgctcaaaa gtggatgagc gctggcgcga cggctggaag 360gatggctcct gtgactag 378
權利要求
一種人肝再生增強因子基因轉染真核細胞的方法，其步驟如下構建pCDNA3.1(-)HALR質粒；進行HepG2的培養及篩選，得肝細胞系；pcDNA3.1(-)HALR質粒轉染HepG2篩選后所得的肝細胞系；然后對轉染的肝細胞系進行篩選；用有限稀釋法挑選生長迅速的克隆，建立穩定的ALR肝細胞系。
2.根據權利要求1所述的人肝再生增強因子基因轉染真核細胞的方法，其特征在于 所述的構建P⑶NA3. 1 (-)HALR質粒以后，還要進行提取純化。
3.根據權利要求1所述的人肝再生增強因子基因轉染真核細胞的方法，其特征在于 所述的構建P⑶NA3. 1 (-) HALR質粒，包括如下步驟①相應抗生素的LB瓊脂平板的制備將含有1.5%瓊脂的LB固體培養基加熱融解，當 培養基溫度降至40-60°C時，加入相應的抗生素氨芐青霉素至終濃度為100mg/l，將25ml倒 入直徑為90mm的培養皿中，室溫放置至凝固；②取待轉化的pcDNA3.1(-)HALR質粒1μ 1，無菌水稀釋至100 μ 1，冰上備用；③將步驟②的稀釋質粒加到80-100μ 1的感受態細胞DH5 α中并混勻，冰浴20min，隨 后室溫放置IOmin ；④加入400μ 1 LB培養基，37 °C，200rpm振蕩30min，加入步驟③的液體中，然后取 200 μ 1鋪在步驟①制備好的含抗生素的LB瓊脂平板上；⑤將步驟④的平板置于室溫直至液體被吸收；⑥倒置平板，于37°C培養，12-16h后長出單克隆菌落。
4.根據權利要求1所述的人肝再生增強因子基因轉染真核細胞的方法，其特征在于 所述的轉染為采用VigoFect轉染試劑盒進行轉染。
5.根據權利要求1-4任一項所述的人肝再生增強因子基因轉染真核細胞的方法，其特 征在于所述的轉染的具體步驟如下(1)取3μ g的pcDNA3. 1㈠ALR質粒，加入0.9%氯化鈉的鹽水至300 μ 1,靜置15min ；(2)3μ 1的VigoFect轉染試劑，加入0. 9%氯化鈉的鹽水至300 μ 1，靜置5min ；(3)將稀釋后VigoFect試劑緩慢加入步驟①所得質粒溶液中，輕輕混勻，室溫靜置 15min ；(4)將步驟(2)和步驟(3)所得溶液分別緩慢加入3ml細胞培養瓶中，37°0、5%0)2飽 和濕度孵箱內培養；將穩定傳代的IfepG2細胞貼壁生長在3ml細胞培養瓶中37°C、5% CO2, 飽和濕度，予含10% FBS的MEM液培養；轉染前24h將細胞按1 X IO5個/孔濃度接種于3ml 培養瓶中，第二天細胞生長密度達70% ；轉染前Ih更換新鮮的含FBS培養液；(5)16-24h后用含10% FBS的新鮮MEM培養基給細胞換液繼續培養，24h后觀察細胞的 形態和活性變化。
6.根據權利要求1所述的人肝再生增強因子基因轉染真核細胞的方法，其特征在于 所述的對轉染的肝細胞系進行篩選，為采用G418進行篩選。
7.根據權利要求6所述的人肝再生增強因子基因轉染真核細胞的方法，其特征在于 所述的采用G418進行篩選的步驟如下將轉染后的細胞，用含100μ g/L G418的培養液培 養2周，然后再采用200 μ g/L的G418的培養液培養2周，最后用300μ g/LG418的培養液 培養篩選，2個月后獲得高表達ALR的肝細胞系。
8.根據權利要求1所述方法建立的含人工轉染人肝再生增強因子基因的真核細胞株在生物人工肝和體外人ALR的生產中的應用
全文摘要
本發明涉及一種人肝再生增強因子轉染真核細胞的方法，屬于生物工程的生產方法，包括構建pCDNA3.1(-)HALR質粒，進行HepG2的培養及篩選；pcDNA3.1(-)HALR質粒轉染HepG2篩選后所得的肝腫瘤細胞系；然后對轉染的肝細胞系進行篩選，用有限稀釋法挑選生長迅速的克隆，建立穩定的肝細胞系。本發明的人肝再生增強因子轉染真核細胞的方法，具有作為生物人工肝構建的開發的巨大潛力，可利用基因工程技術大量生產，降低成本，應用于生物人工肝研究與臨床。除此之外，轉染的肝細胞還有可能促進肝細胞移植中移植細胞的生長繁殖或有助于組織器官工程技術的發展等。
文檔編號C12R1/91GK101845457SQ200910080850
公開日2010年9月29日 申請日期2009年3月24日 優先權日2009年3月24日
發明者劉鴻凌, 游紹莉, 王業東, 王志杰, 胡燕, 貌盼勇, 辛紹杰 申請人:中國人民解放軍第三〇二醫院