專利名稱：含有異體寡和/或多核糖核苷酸的藥物的制作方法
技術領域：
本發明涉及含有異體寡和/或多核糖核苷酸作為活性成分的藥物，此外涉及所述異體寡和/或多核糖核苷酸的用途，用于治療皰疹病毒感染和皮膚惡性腫瘤。
背景技術：
皰疹病毒科病毒是世界常見的病原體，大多數脊椎動物對其敏感。最重要的人皰疹病毒是單純性皰疹病毒1與2(HSV-1，HSV-2)、水痘帶狀皰疹病毒(VZV)和人巨細胞病毒(HCMV)。HSV導致免疫競爭性個體皮膚或黏膜病變，并且能夠以不同頻率復發。各種皰疹病毒是按照病變部位加以區分的，例如唇皰疹或生殖器皰疹等。
目前關于這類病毒的治療方法主要致力于病毒復制的抑制作用，例如阿昔洛韋是已知的病毒DNA聚合酶抑制劑。不過，病毒能夠隨著時間的推移變成阿昔洛韋耐藥性，特別是對單純性皰疹來說情況更是如此。另外，盡管常規藥物在急性病變的情況下能夠提供減輕效果，不過它們不能有效地預防復發。
在二十世紀六十年代后期和七十年代早期，在移植研究中發現，用異體異種核酸預處理的組織或弱抗原在各種免疫檢查方法中大大增加了抗體效價。在體外和體內研究中利用大量不同抗原都進一步確認了這些結果。不過，沒有跡象表明核酸、特別是異體來源的寡和/或多核糖核苷酸能夠適合于控制病毒感染。
與此同時，尤其是在美國，利用確定的合成的多與寡核苷酸、特別是核糖核苷酸進行了實驗，不過，由于體內毒性高，這些實驗沒有繼續下去。
因此，本發明的目的是提供適合于治療皰疹病毒感染以及惡性皮膚疾患的藥物。此外，本發明的目的是提供降低皮膚病變、特別是由病毒導致的病變復發率的藥物。
按照本發明，發明目的通過包含異體寡和/或多核糖核苷酸作為活性物質的藥物得以實現。
按照本發明，異體表示核糖核苷酸來源于不同于受治療者的生物，也就是這些寡和/或多核糖核苷酸不是來自所要給藥的同一生物。按照本發明所使用的異體寡和/或多核糖核苷酸優選地來自動物組織(例如牛組織、胎牛組織)、植物和單細胞生物，優選地來自酵母細胞(特別是釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae))。優選地使用在進化上盡可能遠離受治療生物的生物的寡和/或多核糖核苷酸。因而，在人用藥物中，優選地使用來自動物組織的RNA，或者特別優選地使用來自植物或單細胞生物的RNA，例如酵母。
本發明是基于利用RNA制劑所進行的皰疹感染研究的。在這一點上發現，將分離的異體RNA施用于唇單純性皰疹、播散性單純皰疹(Herpes Simplex cruris disseminata)和生殖器單純性皰疹患者的皮膚病變部位上，除了對病變本身的立即作用以外，另外還驚人地顯著降低多年頻繁復發患者的復發率。然后發現所述RNA對皮膚腫瘤也具有相似活性，例如基底細胞癌。
按照本發明所使用的寡和/或多核糖核苷酸是無毒的，本身是非抗原性的。
有效使用總RNA及其鹽和化合物的制劑是可能的。特別優選為tRNA。獲得按照本發明可以使用的RNA的特別優選的方式是苯酚萃取，具體是本文方法I和II所述方法。
每劑異體寡和/或多核糖核苷酸的有效量在每名患者中取決于各種因素，例如病變部位或受影響面積的大小和程度，以及給藥類型。每單位劑量的劑量范圍在0.1mg以上。每單位劑量的劑量下限優選為至少0.5mg，更優選為至少2mg，進而更優選為至少5mg；上限優選為5mg，更優選為20mg，進而更優選為10mg。
本發明的藥物優選地含有本質上為無水形式的異體寡和/或多核糖核苷酸，例如薄片、粉末、顆粒、軟膏等。不過，寡和/或多核糖核苷酸也可以溶解在水或另一種溶劑中。
另外，本發明的藥物可以包含生理學上可接受的載體、助劑、稀釋劑和/或添加劑和/或輔劑。
含有本發明異體寡和/或多核糖核苷酸的藥物組合物可以配制成用于口服的片劑、錠劑與咀嚼片、液體懸液、粉劑、顆粒劑、乳劑、硬或軟膠囊劑、糖漿劑或酏劑，或者用于緩慢釋放的緩釋劑型或滲透膠囊劑。
另一種具有特別有利作用的藥物劑型是由PEG混合物制成的無水軟膏劑。
給藥優選地是通過局部方式進行的，但是也可以通過口服、腸胃外、直腸或吸入。術語腸胃外在這里涉及皮下、靜脈內、肌內和胸骨內注射或輸注技術。
關于局部用藥，優選地將總RNA或tRNA粉劑或PEG軟膏劑(即無水形式)施用于受影響的部位；在粉劑的情況下，酌情可以將皮膚略微濕潤，優選地在空氣中自然干燥。
本發明的優選實施方式是用于治療由皰疹病毒所導致的疾患的藥物，它還減少這些疾患復發的頻率。本發明的藥物特別優選地用于治療由單純性皰疹病毒和帶狀皰疹(VZV)所導致的病變，例如由唇單純性皰疹(唇的皰疹)和生殖器單純性皰疹所導致的病變和復發。
本發明的異體寡和/或多核糖核苷酸和藥物同樣適合于治療皮膚惡性腫瘤，例如基底細胞癌。
本發明進一步涉及所述異體寡和/或多核糖核苷酸的用途，用于制備治療皰疹病毒疾患和皮膚腫瘤的藥物。
在病變或復發的情況下，均優選盡可能早地進行治療，一次的用藥就已經減少復發的頻率。
除了用本發明的異體寡和/或多核糖核苷酸治療人以外，以這種方式治療溫血動物也是可能的，例如馬、牛、羊等。
下列實施例和實驗結果進一步闡述本發明。
實施例實施例1按照本發明可用的寡和/或多核糖核苷酸的制備有關文獻描述了大量獲得核酸、核苷酸和核苷的方法，它們是任何具有相關經驗的人員已知的。這里優選地采用兩種略作改動的方法，二者都是基于酚處理的，方法I用于獲得總RNA(Georgiev，G.P.和Mantieva，V.L.《生物化學與生物物理學學報》61，153(1962))，方法II用于獲得tRNA(Bauer，S.等《生物技術與生物工程》15，1081(1973))。兩種方法都適合于相對大量地萃取。
方法I在Waring混合機內，將啤酒酵母(釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae))在緩沖液(A)(0.001M EDTA，0.01M Tris-HCl緩沖液，pH5-6.25％蔗糖，0.5％ SDS(十二烷基硫酸鈉)，0.3％脫氧氯酸鈉)中的15％懸液在10℃和3000rpm下均化3分鐘。將組織勻漿與相同體積的溶液(B)(80％重結晶苯酚的緩沖液(A)溶液，0.1％8-羥基喹啉，1.2％二碳酸二乙酯)混合，然后在60℃下緩慢攪拌30分鐘。所有緩沖溶液都是用預先與膨潤土攪拌的去離子水制備的。
然后將酚處理后的組織勻漿在室溫(約20℃)和10000g下離心15分鐘。移取水相，棄去苯酚和中間相。將水相與相同體積的溶液(B)氯仿/異戊醇(96∶4)的1∶1混合物混合，如上所述進行萃取。將水相用一半體積的二乙醚萃取三次，目的是除去殘留的苯酚。調整溶液至含2％乙酸鈉，用2.5體積的無水乙醇沉淀出RNA。
在0℃和5000rpm下離心移取沉淀出來的RNA，溶于冰冷的0.01MTris-HCl緩沖液，pH7.0和0.001M MgCl2。向溶液中加入電泳純的胰腺DNA酶(4g/ml)，在22℃下恒溫3小時，降解可能存在的DNA。將蛋白質殘余物、DNA酶和RNA酶用鏈霉蛋白酶(10μg/ml)在37℃下消化3小時。在此期間，鏈霉蛋白酶也通過自我消化所破壞。如上所述在60℃下用溶液(B)萃取RNA溶液，溫和攪拌20分鐘，離心分離各相，移取水相，用二乙醚萃取。加入乙酸鈉(最終濃度2％)后，用2.5體積乙醇沉淀出RNA，離心移取。將沉淀溶于冷的2％乙酸鈉，用2.5體積乙醇沉淀，在-20℃醇混合物中保持過夜。然后離心移取沉淀，用75％乙醇洗滌兩次，用無水乙醇洗滌兩次，用二乙醚洗滌兩次。在烘箱內干燥后，得到散裝的干燥RNA，在室溫下貯存在深色玻璃容器內。
方法II本方法也適合于萃取大量酵母(數千克)。
在冷室內，在四倍量緩沖液(A)(見上方法I)中均化給定重量的酵母。向組織勻漿中加入40％ v/v苯酚溶液(B)和5％ w/v由去離子水制成的冰立方體，將混合物攪拌30分鐘。吸濾移取上清液，然后酚處理兩次，如方法I下所述。將水性上清液收集在一個容器內，其中含有DEAE-纖維素懸液(約10％ w/v，Whatman DE-22)，相當于所收集上清液體積的一半。攪拌30分鐘，使DEAE懸液保持混懸狀態。然后使DEAE沉降一小時。吸濾移取上清液。在此期間，將中間相和苯酚相與等量溶液(C)(83％去離子水，15％ w/v冰立方體，2％乙酸鎂濃縮液(0.5M乙酸鎂的0.25巰基乙醇溶液))攪拌30分鐘兩次，然后分離70-80分鐘。將含水上清液轉移到含有DEAE的容器內，然后再次攪拌，使之沉降。吸濾移取上清液，如上將DEAE先用溶液C洗滌兩次，再用溶液(D)洗滌(2體積乙酸鎂濃縮液，2體積NaCl濃縮液(3.75M NaCl水溶液)，0.2體積Tris-HCl濃縮液(2.5M Tris-HCl，pH7.5水溶液)，96體積水)。
然后將DEAE-纖維素上柱，柱子底部是封閉的。以下所有步驟都是在4℃冷室內進行的。將柱子用12倍柱內容物量的溶液(D)洗滌，流速1.4l/h(僅受重力作用)。然后用溶液(E)(2體積乙酸鎂濃縮液，0.2體積Tris-HCl濃縮液，14體積NaCl濃縮液，84體積水，最終NaCl濃度0.525M，洗脫tRNA，流速3l/h。合并含有超過35 A260nm單位/ml的部分，用1.5體積乙醇沉淀。進一步的操作同方法I。
或者，將最終的沉淀溶于水中，冷凍干燥。
這種方法的一個變例是原料的普通酚處理用異丙醇使粗tRNA從上相中沉淀出來。離心后，將沉淀用乙酸鈉緩沖液提取，經過DEAE-纖維素色譜分離。用乙酸鈉/氯化鈉進行梯度洗脫，這是本領域生化技術人員已知的。見上，借助商的測量確定適合的部分，合并。用乙醇沉淀tRNA，如上將沉淀溶解，優選地冷凍干燥。
采用下列測定法分析總RNA和tRNA的純度，并鑒定之。
蛋白質根據Lowry，O.H.等(《生物化學雜志》193，265(1951))并通過A260/A280≌2，DNA根據Dische(《微量化學》8，4(1930))，總RNA根據Mejbaum(《生理學與化學》258，117(1939))，tRNA和氨基酸結構單元的定量測定根據Sprinzl和Sternbach(《酶學方法》59，182(1979))，毒性根據M.Noeldner(私人交流)，體外熱原的缺乏根據DAB 1997(LAL測定法)，體內熱原的缺乏根據Ph.Eur./DAB 1997確定。
分析結果(總RNA和tRNA的性質，十次試驗的平均值)吸光度A260/A280≌1.94-2.0C、H、N分析C 32.6732.42H 5.22 5.20N 2.29 2.00各種總RNA和tRNA的對應值。
UV與IR光譜UV與IR光譜因生物物質而異，它們幾乎相同但不完全相同。
分子量來自酵母的總RNA和tRNA≌平均22000-27000道爾頓，因不同制劑而異；蛋白質 DNA(總含量)2.3％ neg.釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)的總RNA1.9％ neg.釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)的tRNA0.9％ neg.牛來源的總RNA平均為一般普通的質量。提高純度沒有引起治療作用顯著提高，與更高的成本不相稱。
關于tRNA的氨基酸結構單元，10次分析的平均值賴氨酸69-85 pMol/A260單位Phe 41-55Ser 39-50Val 77-90這些平均值因不同批次酵母而異，在所述范圍內變化。
毒性小鼠急性毒性試驗動物 NMRI小鼠，雄性，Janvier，法國給藥 尾靜脈內觀察期 24小時隨機樣本數 最高濃度下n＝10測定物質 a.牛總RNAb.來自啤酒酵母(釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae))的tRNA溶劑 0.9％NaCl水p.i.溶液結果直至1g/kg/10ml i.v.的最大劑量，試驗所用動物顯示在24小時觀察期內沒有任何突出特征。
熱原的缺乏A、如前文所述，總RNA和tRNA的熱原含量是根據DAB 1997(LAL試驗)用內毒素的體外測定法測定的，也是根據Ph.Eur./DAB 1997用兔子測定的。
1、總RNA內毒素標準EC5變形細胞溶胞產物-標稱靈敏度0.06EU/ml-實測靈敏度0.06EU/ml試驗溶液100mg RNA的20ml水-LAL溶液(0.5％)結果用水-LAL按1∶5稀釋的0.5％試驗溶液的內毒素含量＜0.03EU/ml2、tRNA內毒素標準EC5變形細胞溶胞產物-標稱靈敏度0.06EU/ml-實測靈敏度0.06EU/ml試驗溶液100mg RNA的20ml水-LAL溶液(0.5％)結果用水-LAL按1∶10稀釋的0.5％試驗溶液的內毒素含量＜0.03EU/mlB、根據Ph.Eur./DAB 1997的體內熱原缺乏試驗1、總RNA試驗溶液1％測定物質的無熱原水p.i.溶液劑量1.0ml/動物動物3只兔子，符合DAB 1997結果3只兔子的溫度差異之和為1.05℃，因而熱原是不可檢出的。
2、tRNA試驗溶液1％測定物質的無熱原水p.i.溶液劑量1.0ml/動物動物2次6只兔子，符合DAB 1997結果 a.6只兔子的溫度差異之和5.40℃b.6只兔子的溫度差異之和4.10℃，熱原可檢出實施例2本發明物質功效的檢測70名患者中，40名患有I型單純性皰疹(唇皰疹)，30名患有II型單純性皰疹(生殖器皰疹)，都頻繁復發，用總RNA治療。RNA來自牛胎組織的提取物，肝臟除外。將粉狀RNA施用于略微濕潤的病變部位，用量5至10mg，取決于病變部位的大小，自然干燥。所有患者均觀察1年。
5名患者沒有復發，7名患者不能被分析，因為順應性不足。所有其他原來每年總有若干次復發的患者顯示復發顯著減少。借助非參數Mann-Whitney U檢驗進行評價。結果的顯著性為p＜0.001(SPSS，Npar，Mann-Whitney U檢驗)。
在觀察期為1年的雙盲研究中，如上用牛總RNA或者用來自啤酒酵母的tRNA試驗了兩組各100名患者，他們患有唇單純性皰疹和生殖器單純性皰疹，每年復發4次以上。一年后用程序SPSS，Npar檢驗Mann-Whitney和χ2檢驗進行評價。
與安慰劑給藥的患者相比，復發的減少是非常顯著的在兩種情況下均為p＜0.001。兩種RNA之間的差異不大。
這些結果證明了所述RNA在患者中的用途，特別是在若干年內都觀察到沒有任何副作用或中毒癥狀。
在將所述物質施用于同時患有面基底細胞癌的面單純性皰疹患者時，發現所述基底細胞癌減弱了。因此，本發明藥物的適應癥也包括惡性腫瘤。
權利要求
1.藥物，特別是用于治療皰疹病毒感染和/或皮膚腫瘤，其特征在于它包含異體寡和/或多核糖核苷酸作為活性物質。
2.如權利要求1所要求保護的藥物，其特征在于它另外包含生理學上可接受的載體、助劑、稀釋劑和/或添加劑。
3.如權利要求1或2所要求保護的藥物，其特征在于該活性物質包含來自動物組織、植物和/或單細胞生物的寡和/或多核糖核苷酸。
4.如權利要求3所要求保護的藥物，其特征在于該活性物質包含來自酵母細胞的寡和/或多核糖核苷酸。
5.如任意前述權利要求所要求保護的藥物，其特征在于該活性物質包含異體tRNA。
6.如任意前述權利要求所要求保護的藥物，其特征在于該活性物質包含通過苯酚萃取所得到的異體寡和/或多核糖核苷酸。
7.如任意前述權利要求所要求保護的藥物，其特征在于該異體寡和/或多核糖核苷酸來源于進化上遠離受治療生物的生物。
8.如任意前述權利要求所要求保護的藥物，其特征在于該寡和/或多核糖核苷酸是以無水形式存在的。
9.如任意前述權利要求所要求保護的藥物，其特征在于它是以適合于局部給藥的形式存在的。
10.異體寡和/或多核糖核苷酸的用途，用于治療皰疹病毒感染和/或皮膚腫瘤。
11.如權利要求10所要求保護的用途，用于治療由單純性皰疹病毒和/或水痘帶狀皰疹病毒導致的皮膚和/或黏膜病變。
12.如權利要求10所要求保護的用途，用于治療基底細胞癌。
13.異體寡和/或多核糖核苷酸的用途，用于制備治療皰疹病毒感染和/或皮膚腫瘤的藥物。
14.皰疹病毒感染和/或皮膚腫瘤的治療方法，其特征在于將每單位劑量的有效量為0.1mg及以上的異體寡和/或多核糖核苷酸對需要這種治療的患者或動物給藥。
全文摘要
本發明涉及含有異體寡和/或多核糖核苷酸作為有效組分的藥物。本發明進一步涉及所述異體寡和/或多核糖核苷酸的用途,用于治療皰疹病毒感染和皮膚腫瘤。
文檔編號A61K31/70GK1371282SQ00812122
公開日2002年9月25日 申請日期2000年8月24日 優先權日1999年8月27日
發明者塞恩菲爾德·胡戈 申請人:塞恩菲爾德·胡戈