專利名稱：惡性瘧原蟲新的抗原候選基因PfMAg的制作方法
技術領域：
本發明為一種惡性瘧原蟲新的抗原候選基因PfMAg的免疫保護作用，涉及生物醫學高技術中的基因的開發與應用領域。
瘧疾是當今世界上最致命的傳染病之一。全球每年約有3億到5億人感染，2百萬人死亡。其生活史可以簡單歸納如下當雌性按蚊叮咬宿主時，單核的子孢子從血循環侵入肝細胞，并在此發育為成熟的肝內期裂殖體。成熟的肝裂殖子從肝細胞內釋放入血，侵入紅細胞進行紅內期無性生殖，經過2至3天后發育為成熟的裂殖體，從每個感染紅細胞內可釋放6至30個裂殖子。這些裂殖子再侵入其它紅細胞，進行多輪擴增，導致大量的紅細胞被感染、破裂，裂殖子和瘧原蟲的代謝產物、殘余和變性的血紅蛋白以及紅細胞碎片等一并進入血流，刺激免疫細胞產生內源性熱源質，起周期性寒熱發作，并出現貧血及脾腫大。與此同時，少量裂殖子發育為有性期的雌、雄配子體，當宿主再次被蚊子叮咬后隨血液進入蚊體開始其生活史的蚊蟲期，生成下一代子孢子。瘧疾疫苗的研究工作已經開展了50多年，但因其生活史復雜，抗原具有多態性等特點，目前仍沒有高效的保護性抗原出現。惡性瘧原蟲肝內期和蚊期疫苗不能阻斷紅內期的感染，允許一部分原蟲進入紅細胞。雖然有證據表明，紅前期疫苗可以導致發病率的降低。但從流行病學分析，當紅前期疫苗在突變發生或免疫接種中止時，會造成大規模流行發生的危險；而紅內期疫苗直接針對瘧原蟲的致病階段，不會引起上述危險的發生。同時瘧原蟲在紅內期每一個復制周期，都會加強機體的免疫反應。目前紅內期疫苗的研究取得了一定的進展，其中紅內期重復序列多肽疫苗由于具有表位穩定，表位密度大，引起免疫反應強的特點，在瘧疾疫苗的研究中逐漸受到重視。
本發明的目的在于尋找和克隆惡性瘧原紅內期新的抗原候選基因。
本發明的內容是應用cDNA文庫篩選、DNA序列測定技術、分子克隆、聚合酶鏈式反應(PCR)、Western印跡雜交法，克隆惡性瘧原蟲紅內期新的抗原候選基因PfMAg，并用酶聯免疫吸附實驗(ELISA)及惡性瘧原蟲體外抑制實驗進行了免疫學分析。
該基因達到的技術指標為1.惡性瘧原蟲紅內期新的抗原候選基因PfMAg cDNA片段長1938bp，含有一個1767bp的完整的ORF，編碼589個氨基酸、分子量為65kD的蛋白質；編碼蛋白C末端存在14次10肽[(Q/K)T(D/E)E(I/L)(K/N)ND(H/N)I]的重復片段，該片段與鼠約氏瘧紅內期抗原PyAg-1 C末端有69％的相似性。(

圖1)2.惡性瘧原蟲紅內期新的抗原候選基因PfMAg其C端十肽重復片段重組蛋白在大腸桿菌BL21株中表達(圖2)，該重組蛋白與病人血清和正常人血清的反應有顯著差別(P＜0.05)，可識別病人血清(圖4)。
3.惡性瘧原蟲紅內期新的抗原候選基因PfMAg在紅內期裂殖體期特異表達(圖3)。
4.抗惡性瘧原蟲多克隆IgG在體外可抑制惡性瘧原蟲Dd2株和FCC1株的生長(圖5)。
本項發明的優點對篩選的惡性瘧原蟲紅內期新的抗原候選基因PfMAg進行免疫學的研究，為惡性瘧原蟲的免疫治療提供了新的保護性候選抗原。下面結合附圖對本發明做進一步詳細說明。
下劃線部分為C端10肽重復序列。圖2 重組的PfMAg重復十肽在大腸桿菌中的表達。
1，低分子量蛋白Marker；2，未誘導的含PfMAg C端10肽重復片段質粒的裂解物；3，誘導的含PfMAg C端10肽重復片段質粒的裂解物。箭頭所指為重組蛋白帶。圖3 Western印跡分析紅內期PfMAg基因的表達1，紅細胞對照；2，環狀體期感染紅細胞；3，裂殖體期感染紅細胞。箭頭所指為65kD PfMAg蛋白。圖4病人血清、正常人血清與重組蛋白的免疫反應曲線5抗PfMAg IgG的惡性瘧原蟲體外生長抑制曲線圖實施例1惡性瘧原蟲新的抗原候選基因PfMAg的克隆及序列分析1.M26-32單抗的制備M26-32為我研究室早期制備的單克隆抗體。用粗提的約氏瘧原蟲裂殖子腹腔注射免疫BALB/C小鼠，5周后用約氏瘧裂殖子加強免疫，融合前尾靜脈注射惡性瘧原蟲裂殖子。取其脾細胞與Sp2/0瘤細胞融合，獲得一種能產生抗瘧原蟲單克隆抗體M26-32的雜交瘤。雜交瘤細胞腹腔注射BALB/C
小鼠，產生的腹水作為下一步免疫篩庫的一抗。
2.紅內期cDNA文庫的篩選利用Promega公司Protoblot Immunoscreening System，按其說明書對惡性瘧原蟲Dd2株紅內期cDNAλZAP文庫進行篩選。一抗為M26-32腹水(1∶500倍稀釋)，二抗為堿性磷酸酶聯的羊抗鼠IgG(1∶7500倍稀釋)。經兩次篩選，獲得陽性克隆后，送于大連寶生物公司進行序列測定。
3.PfMAg cDNA 5’末端的快速擴增根據測序得到的陽性克隆的序列，設計三段引物RACE15’TACGCATATTTCCTGCTCTAATAC3’；RACE25’GTATTAAGCTTATATCATTTATATC3’；RACE35’GGAAAACATTTTGATATTATGCTGGC3’.安照5′RACE System for Rapid Amplification of cDNA Ends(GIBICOL公司，貨號CAT.NO.18374-058)試劑盒說明書，利用上述引物，擴增PfMAg cDNA’末端，得到的片段送于送于大連寶生物公司進行序列測定。
4.PfMAg cDNA片段序列與編碼氨基酸的分析利用WINSTAR軟件分析、拼接，得到惡性瘧原蟲紅內期新的抗原候選基因PfMAg cDNA片段長1938bp，含有一個1767bp的完整的ORF，編碼589個氨基酸、分子量為65kD的蛋白質。在編碼蛋白C末端存在14次10肽[(Q/K)T(D/E)E(I/L)(K/N)ND(H/N)I]的重復片段。利用BLASTP程序在GenBank分析該片段與鼠約氏瘧紅內期抗原PypAg-1(GenBankNUMBERAF103869)C末端有69％的相似性。(圖1)實施例2PfMAg C端重復10肽免疫血清的制備及純化1.PfMAg C端重復10肽的亞克隆根據PfMAg C端1381bp到1938bp序列設計引物上游5′CCATGGATGTGAAAGAAAGTAACACTC3’，包含NcoI位點(下劃線)，下游5′GGATCCGAGATATTACTATATATTTTGTATGG3’，包含BamH I位點(下劃線)。用此對引物經PCR從PfMAg cDNA克隆中擴增得到657bp片段。將此片段經Nco I、BamH I酶切后，亞克隆于大腸桿菌表達載體pET30a(Novagen)。正確的克隆轉化大腸桿菌BL21株，經37℃ IPTG誘導3小時，得到PfMAg C端重復10肽融合重組蛋白。(圖2)。2.重組蛋白的純化及免疫血清的制備與純化重組蛋白根據Novagen產品說明書進行純化。100μg的純化蛋白免疫兔子，每兩周加強一次，共加強4次。免疫血清經兩次硫酸胺沉淀后，過DEAE-52柱純化得到IgG.實施例3PfMAg基因紅內期特異性表達1.惡性瘧原蟲紅內期特異性全蛋白的制備惡性瘧原蟲Dd2紅內期(紅內期瘧原蟲可分為環狀滋養體、成熟滋養體、裂殖體和裂殖子階段)蟲株經5％山梨醇處理兩次后，48小時和72小時分別取相同體積的紅細胞，用等體積SDS電泳上樣緩沖液100℃煮沸5分鐘，用同樣體積的紅細胞作為陰性對照。2.Western印跡分析惡性瘧原蟲PfMAg基因紅內期的特異性表達等體積的惡性瘧原蟲紅內期全蛋白經SDS-PAGE電泳后，轉移于PVDF膜上(Roche公司)，用BM化學發光試劑盒(Roche公司)檢測，以1∶500上述免疫血清作為第一抗體。結果證明僅紅內期裂殖體期有65KD特異表達帶(圖3)。實施例4ELISA檢測病人血清與重組蛋白的免疫反應以PfMAg C端重復10肽的重組蛋白包板，以惡性瘧病人血清、正常人血清為一抗(1∶200)，各取樣本14個，以HRP標記的羊抗人IgG(1∶20000)為二抗，進行酶聯免疫吸附實驗。經顯色，讀取各孔OD值。將惡性瘧病人OD值與正常人OD值進行分析比較，用EPI5.0軟件包進行分析，得到P＜0.05，兩個群體OD值有顯著差異，即病人血清與重組蛋白的免疫反應顯著高于正常人(圖4)。實施例5惡性瘧原蟲的體外抑制1.正常人單核細胞的分離從正常中國成年人體內取全血，以肝素抗凝。全血經Ficoll-Hypaque密度梯度離心后，分離到單個核細胞。將細胞用RPMI1640不完全培養基(Gibico公司)重懸，37℃，5％CO2孵箱孵育90分鐘，洗去未粘附的細胞，貼壁的細胞用NSE染色(Sigma公司)確認其中單核細胞數。2.惡性瘧原蟲體外抑制實驗以兩次5％山梨醇處理的惡性瘧原蟲Dd2蟲株和FCC1蟲株作為實驗蟲株，起始蟲血率為1％。在96孔培養板上設計如下實驗(1)抗PfMAg重復十肽IgG；(2)抗PfMAg重復十肽IgG，單核細胞；(3)正常兔IgG；(4)正常兔IgG，單核細胞；(5)單核細胞。其中每孔中總體積為200μl，紅細胞與單核細胞比為200∶1，IgG濃度為原始IgG濃度的5％，10％，20％。5％CO2，5％O2，90％N2，37℃培養48小時后計數蟲血率。結果顯示，與對照相比，抗PfMAg IgG在一定濃度能有效抑制惡性瘧原蟲的生長(圖5)。這種抑制與單核細胞的存在無關，說明抗PfMAg重復十肽IgG的抑制作用發生在裂殖子侵染階段。
本發明表明抗PfMAg重復十肽IgG在體外可有效抑制惡性瘧原蟲的生長，據此其可作為保護性候選抗原，應用于惡性瘧原蟲的免疫治療。
權利要求
1.本發明涉及惡性瘧原蟲新抗原候選基因PfMAg，其特征在于1)該基因cDNA片段長1938bp，含有一個1767bp的完整的ORF，編碼589個氨基酸，分子量為65kD的蛋白質；2)C末端存在14次10肽[(Q/K)T(D/E)E(I/L)(K/N)ND(H/N)I]的重復片段。
2.根據權利要求1所述之惡性瘧原蟲抗原候選基因PfMAg，其特征在于在紅內期裂殖體期特異表達。
3.根據權利要求1、2所述之惡性瘧原蟲抗原候選基因PfMAg，其特征在于大腸桿菌表達的C端重復片段的融合蛋白，可以識別惡性瘧疾病人血清。
4.根據權利要求1、2所述之惡性瘧原蟲抗原候選基因PfMAg，其特征在于大腸桿菌表達的C端重復片段的融合蛋白段免疫產生的多克隆IgG，在體外可以抑制惡性瘧原蟲的生長。
5.根據權利1、2、3、4所述之惡性瘧原蟲抗原候選基因PfMAg，其特征在于可作為保護性候選靶抗原，用于瘧疾的免疫治療。
全文摘要
本發明涉及惡性瘧原蟲抗原候選基因PfMAg,包括其互補脫氧核糖核酸(cDNA)序列和編碼蛋白質的氨基酸序列。該基因在惡性瘧原蟲紅內期裂殖體期特異表達,其編碼蛋白C末端存在14個[(Q/K)T(D/E)E(I/L)(K/N)ND(H/N)I]重復多肽。該重復多肽可以識別瘧疾病人血清,其免疫兔產生的多抗,在體外可抑制兩株紅內期惡性瘧原蟲的生長,可作為惡性瘧原蟲免疫治療的候選靶抗原。
文檔編號A61P33/06GK1377968SQ0111025
公開日2002年11月6日 申請日期2001年4月4日 優先權日2001年4月4日
發明者王恒, 路妍, 李會良 申請人:中國醫學科學院基礎醫學研究所