專利名稱：分析物的透皮取樣法的制作方法
技術領域：
本發明一般涉及分析物的透皮提取與取樣領域。具體地說，本發明提供了一種在脂質體存在時用電穿孔法提取并取樣檢驗分析物的方法。
相關技術的討論對于控制疾病而言，精確測量諸如血液中的葡萄糖等分析物是十分重要的。例如，在注射胰島素前后適當監控血糖水平可以使糖尿病得到早期控制。
通常，監控血液分析物需要抽取血樣。然而，頻繁采血所帶來的疼痛和不便會使病人逃避監控程序。為克服這種侵入性技術帶來的問題，已經提出了幾種改進方案，其中就包括透皮提取分析物。
哺乳動物的皮膚是由兩層構成的，即表皮和真皮。表皮是由層狀鱗片角質化形成的上皮。表皮的最外層叫做角質層(SC)，它由大約20層扁平的、無細胞核的、充滿角質素的角質細胞構成，外面包圍著平均約8層脂雙層薄層。脂雙層主要含有膽固醇、游離的脂肪酸和神經酰胺。SC總的厚度大約為10微米至40微米，平均厚度為20微米(Chizmadzhev等，1995，Biophysical Journal，68749-765；Bouwstra等，1995，Pharmaceutical Research 11(12)1809-1814；Swartzendruber等，1989，Journal of Investigative Dermatology，92251-257)。SC層構成了皮膚的主要電阻(Rosendahl，1945，Acta Physiol.Scan.939)，同時它也是物質傳遞的主要屏障。因此，透皮提取的方法主要包括提高SC層通透性的技術。這類技術的實例有離子電滲技術、超聲波技術和真空技術。
離子電滲法要求使用含有氧化-還原物質的電極，同時還要使電流通過皮膚。直流電場被用來運送分子經附屬物或細胞間隙通過SC。然而，SC的不可通透性以及與離子電滲相關的副作用(如不可避免的皮膚損傷)限制了離子電滲法在透皮取樣中的應用。
真空技術已被用于透皮抽取流體以供取樣檢驗(美國專利第6,009,343號)。然而，角質層的不可通透性限制了這項技術的應用。
超聲波技術被認為能破壞角質層中角質形成細胞間的脂質層，因此它能改善皮膚的通透性。包括超聲波技術在內的方法在美國專利第4,767,402號；4,780,212號和5,115,805號中已有記錄。
另一種使皮膚暫時通透的方法是使用單一或復合的短時持續脈沖。這會穿過非導電性的SC建立一個穿過皮膚的占優勢的電壓梯度。如果電壓梯度超過了屏障擊穿電位，就會形成孔洞，根據所使用的脈沖電場和脈沖時間這些孔洞會重新封閉。(Hui，1995，Methods in Molecular Biology，第48卷Animal cell Electroporationand Electrofusion Protocols，J.A.Nickoloff，編輯Humana Press，第29-40頁)。在孔洞形成時，物質就可以穿過這一屏障進行輸遞(Powell等，1989，BiophysicalJournal 561163-1171；Prausnitz等，1993，Proc.Nat.Acad.Sci.，USA9010504-10508)。電穿孔法已被用于物質的輸遞，然而迄今為止它還沒有被用來提取與取樣檢驗像葡萄糖這類的身體分析物。
盡管脂質體已被用于局部透皮給藥用來改變藥效，但其機理仍然有爭議(Mezei，1988，Liposomes as drug carriers，Gregoriadis G.編輯，Wiley，NewYork)。有報道說，當對組織培養的小鼠皮膚表面用中性脂質體時，它會聚集在毛囊通道中(Li等，1992，In Vitro Cell Dev.Biol.28A679-681；Li等，1993，In VitroCell Dev.Biol.29A258-260)。基于以上幾點，脂質體在分析物的提取與取樣檢驗中的作用仍不清楚。而且，對于血液分析物的提取與分析還沒有什么快速有效的方法。因此，對分析物的提取與取樣檢驗仍要繼續研究以便找到監控與控制疾病癥狀的方法。
發明概述本發明提供了一種分析物透皮取樣檢驗的方法。本方法包括，使皮膚與含有負電荷脂類的脂質體接觸以形成局部通透的皮膚區域，再在通透的皮膚上施加電脈沖。然后在通透區域進行吸液，收集胞外液。所收集的液體可以用來檢測所需分析物的存在情況。
帶負電荷的脂類可以和其它的帶負電或不帶電的脂類混合以形成對本發明有用的脂質體組合物。因此，在一個優選的實施方案中，脂質體是由帶負電荷的磷脂二油酰磷脂酰甘油(DOPG)與不帶電荷的二油酰磷脂酰膽堿(DOPC)形成的。
附圖簡述

圖1顯示了施加10、20、30分鐘負脈沖進行電穿孔以及10分鐘沒有脈沖以后通過豬SC的葡萄糖的遷移量。SC分別經DOPGDOPC脂質體處理(■)和不處理(●)。
圖2顯示了穿過豬SC的葡萄糖的提取物。SC分別經DOPGDOPC脂質體處理(■)和不處理(●)。在施加10、20、30分鐘脈沖后及脈沖停止10分鐘后分別測量葡萄糖的遷移量。
圖3顯示了施加1次(◆)、2次(■)、60次(●)和180次(▲)100V、持續時間為1毫秒的脈沖后小鼠皮膚的電阻恢復情況。
圖4顯示了施加1次(◆)、2次(■)、60次(●)和180次(▲)100V、持續時間為1毫秒的脈沖后小鼠皮膚的電阻恢復情況。其中，脂質體被添加到面對皮膚外表面的室中。
圖5顯示了施加15次200V、持續施加為1毫秒的脈沖進行電穿孔后，穿過小鼠皮膚提取到的總的葡萄糖。
圖6是提取的葡萄糖與血糖之間關系的圖示。提取的葡萄糖是在脂質體存在并施加電脈沖后收集于負極的液體中測得的。
發明詳述本發明提供了一種分析物的透皮提取并取樣檢驗方法。這個方法包括通過使用脂質體和電穿孔法以使皮膚的某一區域通透。再通過通透區域吸取胞外液，此胞外液可用于所需分析物的檢測及定量。
盡管從通透的皮膚中提取的任何分析物都可定量，但葡萄糖是一種有特別的臨床和治療價值的分析物。其它的分析物包括(但不局限于)電解質，比如鈉、鉀、鈣；毒素；治療及藥理學藥劑；濫用藥；氨基酸；血內氣體；脂類，比如膽固醇；激素，比如胰島素；酶；抗體；細胞因子以及其它生物相關分子。提取之后，可用任何標準的化學、物理、酶學和/或光學方法對提取物進行檢測與定量。
本發明的方法包括施加一次或多次電脈沖并使皮膚與脂質體接觸以使其通透，然后進行吸液以收集胞外液。對本發明有用的脂質體含有帶負電荷的脂類。這些脂類的合適的例子包括磷脂酰甘油(包括二油酰磷脂酰甘油(DOPG))、磷脂酰絲氨酸、二磷脂酰甘油(心磷脂)以及游離脂肪酸。與其它帶負電的脂類或中性脂類混合的帶負電荷的脂類可以單獨使用。在一個實施方案中，帶有負電荷的脂類DOPG與不帶電荷的二油酰磷脂酰膽堿(DOPC)混合形成脂質體。
脂質體與皮膚的某一區域接觸。需要時，可以削薄皮膚以更好的進行電接觸。為提高電接觸還可以使用導電凝膠。為使脂質體與皮膚接觸，可將其加進電極的貯液槽中，或者也可以不依賴電極而直接與皮膚接觸。比較合適的帶有貯液槽的電極是標準皮膚電極。合適的皮膚電極系統是銀/氯化銀系統。市場上有皮膚電極，例如來自IVM公司(Healdsburg，CA)。然后進行電穿孔。一個正電極和一個貯液槽中含有脂質體組合物的負電極被安置到皮膚的合適區域上。可用任何一種市場上存在的標準脈沖發生裝置在電極間產生電勢。優選的穿過每個皮膚通路電勢降為約30V-約180V，最好是約80V-約100V。這里使用的“皮膚通路”一詞是指電極下的區域，通過這一區域，在施加電脈沖時電流可以在電極與其下的組織之間通過。電脈沖可以是單個或多個，透化過程可以持續1秒鐘到幾分鐘。脈沖的持續時間優選1毫秒，但可以持續10微秒到10毫秒。精通這一技術領域的人員將意識到，在施加電脈沖時脂質體不必與皮膚接觸。脂質體可先施加在皮膚上一段時間，接著在同一區域加電脈沖。
本發明的一個實施方案中，在皮膚表面的暴露區域使用電極裝置可對特殊的分子進行透皮取樣和提取。此電極裝置可以含有一個裝脂類制劑的貯液槽、施加電脈沖的電極、以及一個為通過皮膚提取自全身液體的分子準備的收集室。可以用面-點脈沖發生器(bench-tip pulse generator)或小型便攜發生器使電極裝置產生電脈沖。為檢測/定量提取分子的數量，可以用一個獨立的裝置，也可與取樣檢驗電極裝置集成使用。檢測裝置可用已被精通這一領域的人員所知的標準技術來校正。
在脂質體存在時施加電脈沖使一皮膚區域可通透后，就可在通透區域進行吸液了。通透化作用后為獲得胞外液而進行吸液時，可簡單地用與收集室相連的標準移液管。也可使用標準吸液泵。約50-約250毫米汞柱的壓力對提取液體來說是足夠的。在一個實施方案中，負電極自身可以和取液裝置連結。吸液可以通過一個小的真空泵進行。也可以在負電極的貯液槽中放一吸收物來吸液。從貯液槽中取出吸收物，然后就可以檢測吸收物中存在的分析物了。通過一系列的標準對原始數據進行校準就可以估計出血液或組織中分析物的水平了。
任何吸收物都可用于本發明。合適的物質有(但不局限于)棉花、濾紙、吸收凝膠以及任何可以保存含水液體的物質。
本發明將由以下的實施例來證明，這些實施例只是為了闡述這一發明而不是對本發明進行限制。
實施例1這一實施例說明了本發明中所用的脂類制劑和脂質體的制備方法。任何帶有負電荷的脂類都可以用來制備脂質體。這些帶負電的脂類可與其它帶負電或不帶電的脂類混合。將溶于氯仿的脂類按所需比例混合。氮氣下干燥溶液并將溶液置于真空中以除去殘留的溶劑。然后通過漩渦使干的脂類分散在合適的緩沖液中。在這一實施例中，帶有負電的二油酰磷脂酰甘油與不帶電的二油酰磷脂酰膽堿以約1∶1的摩爾比例混合，并用強漩渦讓它們分散在緩沖液中，這樣就可以形成脂質體。
實施例2這一實施例說明用本發明的方法可以使葡萄糖分析物穿過角質層。角質層是用以下方法熱處理豬皮獲得的將新鮮的豬皮用鋁箔包裹并放在60℃的水浴中。大約5分鐘后，就可以用手將SC從其它的皮膚組織中輕輕剝離。分離的SC可以用在垂直擴散室中(如購自Crown Glass公司，Sommerville，NJ生產的產品)。這種簡單的裝置被廣泛接受作為皮膚的模型系統。上室被當做皮膚的外表面而下室被看成是緊貼著SC的皮膚。將鉑絲作為電極，一個放在上室，另一個放在下室。通過脈沖發生器可以在SC上產生電脈沖。
實施例1中制得的脂類制劑被置于上室(受體室)，并施加10分鐘的負脈沖(375V，脈沖時間為1毫秒，脈沖重復頻率為1Hz)。然后將溶于緩沖液中的葡萄糖加到下室(供體室)中。在緊接著的10分鐘內不施加脈沖。從上室取出一份緩沖液。然后再施加10、20和30分鐘的脈沖，并在第10、20、30分鐘的時候從上室取出同樣量的緩沖液以測定移動至上室的葡萄糖的量。脈沖結束10分鐘后再從上室取出一份緩沖液。在對照試驗中，在僅有緩沖液(沒有脂類)時先在SC上施加10分鐘脈沖，再將葡萄糖加到下室中并施加三次脈沖，每次均為10分鐘。
在不同時刻測量取出液中遷移至上室的葡萄糖的量。用葡糖計可以測量葡萄糖的水平。結果顯示在圖1中。當用脂類制劑處理SC后葡萄糖的遷移量有明顯的提高。由于葡萄糖不帶電荷，實驗和對照測量中葡萄糖的遷移都是在施加脈沖時以及脈沖后由通過SC的擴散產生的。
這一實施方案的另一圖例中，在葡萄糖被加到SC供體側的同時用脂類制劑處理SC的受體側。結果顯示在圖2中。同樣，當用脂類處理SC后從供體室到受體室的葡萄糖的遷移量較之只使用緩沖液時也有提高。因此，當用脂類制劑處理SC后葡萄糖分子的遷移量有明顯的提高。
實施例3這一實施方案證明，電脈沖時脂質體的存在可以提高整個皮膚的通透性。為證明這一實施方案，以新切的、完整的、薄的小鼠皮膚為模型，研究當脂質體存在與不存在時，施加可變數目的電脈沖后通透性的變化。測量皮膚電阻值以作為皮膚通透性的指標。測量施加電脈沖時皮膚電阻的下降以及脈沖結束后電阻的恢復。皮膚的電阻值持續低于基值(施加脈沖前的值)的這段時間被看做是由于施加電脈沖而使皮膚保持通透的時間。
使用垂直擴散室并用前述的方法施加電脈沖。將切下的完整的薄的小鼠皮膚放在兩個含水室之間作為屏障。兩室都充滿了緩沖液(10mM Tris，100mM NaCl，1mMEDTA，pH＝8.0)。為研究添加的脂質體的作用，在面對皮膚外表面的室中加入脂質體組合物。在皮膚兩側的室中都放入鉑絲電極。用標準脈沖發生器(AVTECH，AVK-G1-RPCIC1型)產生電脈沖。用交流脈沖發生器測量電阻，并測量通過皮膚以及通過和皮膚串聯排列的已知電阻的電壓降。
結果顯示在圖3中。例如，未加脂質體時，對照小鼠皮膚在1或2個脈沖后約5分鐘內恢復基礎阻值。若對皮膚施加60至180個脈沖其阻值只會部分恢復。60次脈沖以后皮膚恢復了約40％的初始電阻，而180次脈沖后電阻在20分鐘內沒有恢復。
當在面對皮膚外表面的緩沖液中添加脂質體時(圖4)，即便只施加了一次脈沖皮膚也沒有恢復到它的初始電阻值(80％恢復)。兩次脈沖后皮膚恢復到約50％初始電阻值。60和180次脈沖后電阻的恢復與對照皮膚(沒有脂質體)的情況類似。這一結果證明脂質體的添加可以降低施加電脈沖時的電阻。
實施例4這一實施方案證明，用本發明的方法可以提高所有動物的葡萄糖的提取量。用一對市場上可買到的電極在實驗小鼠(CD-1品系，Charles River提供)裸露的背部皮膚上施加電脈沖，并測量其全身的葡萄糖水平。此電極裝置含有一位于小貯液杯(直徑1cm，深5mm)內的Ag/AgCl電極。杯中裝滿了被單獨的緩沖液或加了脂質體的緩沖液浸透的棉絮。通過這一浸透了緩沖液的棉絮可以在電極和皮膚之間建立電接觸。小鼠被麻醉并將其背部的毛去除以暴露其裸露的皮膚。在整個實驗中小鼠保持麻醉狀態。將電極裝置放在動物的背部并用膠布粘牢。其中的一個電極保持接地電勢，在另一個電極上用脈沖發生器(Velonex，345型)施加負脈沖(200V交流，脈沖時間1毫秒)。這相當于通過每一個皮膚通路有100V的電壓降。在電極上每隔1毫秒施加一次脈沖，總共施加15次。第三個電極(這個電極沒有與脈沖發生器相連)被放在靠近前兩個電極的地方，用來測量通過完整皮膚的葡萄糖的被動擴散。施加脈沖后，將這個電極移去并換上充滿干棉絮且有一定真空度的吸杯。施加脈沖后讓吸杯在皮膚上保留10分鐘。取出來自于電極和吸杯的棉絮并用葡糖測定試劑(Trinder試劑，Sigma Diagnostics)分析其中的葡萄糖。根據每一種動物的血糖測量值標準化葡糖測量值。
將電極和吸杯中的棉絮取出并將它們放在測定試劑中，這樣就可以測得從負電極、收集電極和接地電極下的皮膚中以及與它們相對應的吸杯中提取的葡萄糖的總量。用分光光度法，將實驗樣品的吸收值與用已知量的葡萄糖獲得的標準曲線進行比較就可以算出葡萄糖的含量。
如圖5所示，沒有脂質體時，從三種電極(收集、接地和負電極)下的皮膚中提取的葡萄糖的量基本相同。當脂質體存在時，從負電極下提取的葡萄糖量大約是收集電極和接地電極的兩倍。這些結果證明，本發明的方法可以用來提取和定量測定身體分析物。
這一實施方案的另一圖例中，確定了提取的葡萄糖與血糖水平的關系。提取的葡萄糖是在上述負電極位點處獲得的液體中測得的。同時收集血液樣品并用標準方法測量血糖。如圖6所示，提取的葡萄糖與血糖水平之間有一線性關系(相關系數是0.996)。這些結果證明，本發明的方法可以用來確定個體身體中分析物的水平。
前面所描述的特定的實施方案只是為了闡述而不是用來限定。從本發明的教導中，那些精通這一技術的人員應該認識到，這些方法在不背離本發明精神的條件下是可以修改的。
權利要求
1.一種測量個體內分析物的方法，它包括以下步驟a.將個體的皮膚區域與含有負電荷脂類的脂質體組合物接觸；b.在已和脂質體組合物接觸的皮膚區域上使用至少一次電脈沖；c.在已施加電脈沖的所述皮膚區域中進行吸液，提取來自個體的液體；d.測量提取液中的分析物，同時e.使提取液中的分析物水平與個體身體中分析物的水平相關。
2.根據權利要求1所述的方法，其中脂質體組合物含有二油酰磷脂酰甘油。
3.根據權利要求2所述的方法，其中脂質體組合物還含有二油酰磷脂酰膽堿。
4.根據權利要求3所述的方法，其中二油酰磷脂酰甘油與二油酰磷脂酰膽堿的比例約為1∶1。
5.根據權利要求1所述的方法，其中分析物是葡萄糖。
6.根據權利要求1所述的方法，其中電脈沖的脈沖時間約為10微秒至10毫秒，通過每一個皮膚通路的電壓降約為30至180V。
7.一種測量個體身體中分析物的方法，它包括以下步驟(a)在脂質體組合物存在時對個體的皮膚區域使用至少一次電脈沖，其中脂質體組合物含有帶負電荷的脂類。(b)在所述皮膚區域進行吸液，提取來自個體的液體；(c)測量提取液中的分析物，同時(d)使提取液中的分析物水平與個體身體中分析物的水平相關。
8.根據權利要求7所述的方法，其中脂質體組合物含有二油酰磷脂酰甘油。
9.根據權利要求8所述的方法，其中脂質體組合物還含有二油酰磷脂酰膽堿。
10.根據權利要求9所述的方法，其中二油酰磷脂酰甘油與二油酰磷脂酰膽堿的比例約為1∶1。
11.根據權利要求7所述的方法，其中分析物是葡萄糖。
12.根據權利要求7所述的方法，其中電脈沖的脈沖時間約為10微秒至10毫秒，通過每一個皮膚通路的電壓降約為30至180V。
13.一種通過個體皮膚提取胞外液的方法，它包括以下步驟(a)在皮膚上放置一個負電極和一個正電極，其中負電極含有一個貯液槽，其中貯液槽中含有帶負電荷脂類的脂質體組合物；(b)通過電極施加至少一次電脈沖；(c)在已施加電脈沖的皮膚區域進行吸液，提取來自個體的液體。
14.根據權利要求13所述的方法，其中脂質體組合物含有二油酰磷脂酰甘油。
15.根據權利要求14所述的方法，其中脂質體組合物還含有二油酰磷脂酰膽堿。
16.根據權利要求15所述的方法，其中二油酰磷脂酰甘油與二油酰磷脂酰膽堿的比例約為1∶1。
17.根據權利要求13所述的方法，其中電脈沖的脈沖時間約為10微秒至10毫秒，通過每一個皮膚通路的電壓降約為30至180V。
18.一種檢測個體身體中分析物存在情況的方法，它包括以下步驟a.使個體的皮膚區域與含有負電荷脂類的脂質體組合物接觸；b.在已和脂質體組合物接觸的皮膚區域內至少使用一次電脈沖；c.在已施加電脈沖的上述皮膚區域進行吸液，提取來自個體的液體；d.檢測提取液中分析物的存在情況，其中提取液中分析物的存在是個體中存在分析物的指示。
19.根據權利要求18所述的方法，其中脂質體組合物含有二油酰磷脂酰甘油。
20.根據權利要求19所述的方法，其中脂質體組合物還含有二油酰磷脂酰膽堿。
21.根據權利要求20所述的方法，其中二油酰磷脂酰甘油與二油酰磷脂酰膽堿的比例約為1∶1。
22.根據權利要求18所述的方法，其中電脈沖的脈沖時間約為10微秒至10毫秒，通過每一個皮膚通路的電壓降約為30至180V。
全文摘要
本發明提供了一種對個體身體內的分析物進行透皮提取和測量的方法，它包括在含有負電荷脂類的脂質體存在時用電穿孔法使皮膚通透，以及用吸液的方法通過通透皮膚提取胞外液。提取的胞外液中的分析物可以定量。
文檔編號A61B5/145GK1404373SQ01805465
公開日2003年3月19日 申請日期2001年2月26日 優先權日2000年2月25日
發明者A·森, S·W·慧, 趙雅麗 申請人:健康研究股份有限公司