專利名稱：三肽類似物,其制備方法,含它們的藥物組合物及其用途的制作方法
技術領域：
本發明涉及具有抗腫瘤活性的三肽類似物，其制備方法，含它們的藥物組合物及它們在治療癌癥中的用途。
背景技術：
多肽類化合物是海洋生物活性成分之一，具有結構新穎，作用專一，活性顯著的特點。經過多年的探索和積累，發現海洋多肽類化合物的生物活性主要集中于抗腫瘤和抗真菌方面。它們常常含有結構特異的氨基酸或氨基酸衍生物，形成特殊的線狀或環狀結構，具有廣泛和強效的生物活性。Hemiasterlin是從自巴布亞新幾內亞海綿Cymbastela sp.中分離得到的抗有絲分裂三肽，具有很強的細胞毒性，它可能是通過抑制紡錘體微管動力學產生細胞毒性，從而引起細胞凋亡。
發明目的本發明的目的是尋找新的抗腫瘤多肽類化合物或其先導化合物。
發明簡述本發明人經研究現已發現式(I)的三肽類似物A-B-C(I)或其立體異構體具有良好的抗腫瘤活性，因此式(I)三肽類似物或其立體異構體有可能作為藥物用于治療癌癥。
本發明涉及式(I)三肽類似物或其立體異構體，其包括A-B-C(I)其中A為L-型或D-型芳香性天然或非天然氨基酸，芳香性部分選自有一個或多個取代基的吲哚環、苯環、萘環、蒽環、菲環、四氫喹啉環、四氫異喹啉環、苯并四氫異喹啉環，取代基包括但不限于鹵素、硝基、羥基、甲氧基、亞甲二氧基、氨基、胺甲基、N，N-二(C1-C4直鏈或支鏈烷基)胺甲基、C3-C7環胺甲基、C3-C7含氮、氧、硫雜原子的環胺甲基、磺酸甲基、磷酸酯甲基。氨基酸中的氨基部分可被取代，取代基包括但不限于C1-C4直鏈或支鏈烷基、C3-C7環烷基、各種氨基保護基，氨基保護基包括芐基、取代芐基、叔丁氧羰基、苯氧羰基、芐氧羰基、芴甲氧羰基、C1-C5羧酯基、C1-C4直鏈或支鏈烷基、C3-C7環烷基；B為選自Gly、Ala、Val、Leu、Nle、Ile、Pro、Tle、MeVal的天然或非天然親脂性氨基酸；C為C1-C4直鏈或支鏈烷基取代的γ-氨基丁酸、C1-C4直鏈或支鏈烷基取代的γ-氨基丁烯酸及其插烯同系物、一個或多個取代基的3-氨基苯甲酸、1-(C1-C4直鏈或支鏈烷基取代的3-氨基環己烯)甲酸，或為C1-C4直鏈或支鏈烷基取代的γ-氨基丁酸、C1-C4直鏈或支鏈烷基取代的γ-氨基丁烯酸及其插烯同系物、一個或多個取代基的3-氨基苯甲酸、1-(C1-C4直鏈或支鏈烷基取代的3-氨基環己烯)甲酸與天然或非天然親脂性氨基酸形成的二肽，氨基上的氫可被C1-C4直鏈或支鏈烷基取代或不被取代；苯環上的取代基包括但不限于鹵素、硝基、羥基、羧基、三氟甲基、亞甲二氧基、亞甲二硫基、C1-C6直鏈或支鏈烷基、C3-C7環烷基、C1-C5烷氧基、氨基、C1-C5酰胺基，親脂性氨基酸可為下列氨基酸Gly、Ala、Val、Leu、Nle、Ile、Pro、Tle、MeVal。
本發明涉及含至少一個式(I)三肽類似物或其立體異構體，及藥用載體或賦形劑的藥物組合物，A-B-C(I)其中A為L-型或D-型芳香性天然或非天然氨基酸，芳香性部分選自有一個或多個取代基的吲哚環、苯環、萘環、蒽環、菲環、四氫喹啉環、四氫異喹啉環、苯并四氫異喹啉環，取代基包括但不限于鹵素、硝基、羥基、甲氧基、亞甲二氧基、氨基、胺甲基、N，N-二(C1-C4直鏈或支鏈烷基)胺甲基、C3-C7環胺甲基、C3-C7含氮、氧、硫雜原子的環胺甲基、磺酸甲基、磷酸酯甲基。氨基酸中的氨基部分可被取代，取代基包括但不限于C1-C4直鏈或支鏈烷基、C3-C7環烷基、各種氨基保護基，氨基保護基包括芐基、取代芐基、叔丁氧羰基、苯氧羰基、芐氧羰基、芴甲氧羰基、C1-C5羧酯基、C1-C4直鏈或支鏈烷基、C3-C7環烷基；B為選自Gly、Ala、Val、Leu、Nle、Ile、Pro、Tle、MeVal的天然或非天然親脂性氨基酸；C為C1-C4直鏈或支鏈烷基取代的γ-氨基丁酸、C1-C4直鏈或支鏈烷基取代的γ-氨基丁烯酸及其插烯同系物、一個或多個取代基的3-氨基苯甲酸、1-(C1-C4直鏈或支鏈烷基取代的3-氨基環己烯)甲酸，或為C1-C4直鏈或支鏈烷基取代的γ-氨基丁酸、C1-C4直鏈或支鏈烷基取代的γ-氨基丁烯酸及其插烯同系物、一個或多個取代基的3-氨基苯甲酸、1-(C1-C4直鏈或支鏈烷基取代的3-氨基環己烯)甲酸與天然或非天然親脂性氨基酸形成的二肽，氨基上的氫可被C1-C4直鏈或支鏈烷基取代或不被取代；苯環上的取代基包括但不限于鹵素、硝基、羥基、羧基、三氟甲基、亞甲二氧基、亞甲二硫基、C1-C6直鏈或支鏈烷基、C3-C7環烷基、C1-C5烷氧基、氨基、C1-C5酰胺基，親脂性氨基酸可為下列氨基酸Gly、Ala、Val、Leu、Nle、Ile、Pro、Tle、MeVal。
本發明還涉及制備式(I)三肽類似物或其立體異構體的方法，其包括1)將化合物Boc-B-OH與C-OP在DMF-DCM，NMM，DCC-HOBt中反應，生成Boc-B-C-OP，其中B，C如上所述定義，P為C1-4烷基；2)將1)中所得產物在鹽酸/二氧六環中脫去氨基保護基，生成HCl·B-C-OP；3)將2)中產物HCl·B-C-OP與Boc-A-OH在DMF，DCM，NMM，DCC-HOBt中反應，生成Boc-A-B-C-OP；4)將3)中產物Boc-A-B-C-OP在氫氧化鋰/甲醇-四氫呋喃溶液中皂化，然后用檸檬酸酸化，生成Boc-A-B-C-OH；
5)將4)中產物Boc-A-B-C-OH如2)中所述進行反應，生成脫去氨基保護基的HCl·A-B-C-OH。
本發明還涉及式(I)三肽類似物或其立體異構體在制備用于治療癌癥的藥物中的用途。涉及的腫瘤細胞如成纖維細胞MRC5CV1、膀胱癌細胞T24、鼠白血病細胞L1210、鼠白血病細胞P388、人肺癌細胞A549、人結腸癌細胞HT29、人結腸癌細胞LOVO、猴腎成纖維細胞CV1、人乳腺癌細胞MCF7、人惡性膠質瘤/星形細胞瘤細胞U373、人卵巢癌細胞HEY、表皮樣瘤細胞系KB、黑素瘤細胞B16、MDA-MB-435乳腺癌細胞、HeLa S3子宮頸癌細胞、人紅白血病細胞K562、人卵巢癌細胞OVCA2780、人胃印戒癌細胞Kato-III等。
發明詳述術語“C1-4烷基”指含1-4個碳原子的直鏈或支鏈烷基，如甲基，乙基，丙基，異丙基，丁基，仲丁基，異丁基，叔丁基。
本發明所用術語“式(I)三肽類似物立體異構體”是指其相應的D-或L-立體構型。
在本發明中使用的縮寫具有下面的含義Ala-丙氨酸，Gly-甘氨酸，Ile-異亮氨酸，Nle-正亮氨酸，Tle-叔丁基甘氨酸，Leu-亮氨酸，Val-纈氨酸，MeVal-甲基纈氨酸，Phe-苯丙氨酸，Pro-脯氨酸，mAB-3-氨基苯甲酸，MAB-3-氨基-4-甲基苯甲酸，γ-Abu-γ-氨基丁酸，
BA-苯甲胺，BEA-苯乙胺，DEA-二乙胺，DCHA-二環己胺，Mpl-嗎啡啉，NMM-N-甲基嗎啡啉，Prd-哌啶，TEA-三乙胺，Thp-四氫吡咯，DCM-二氯甲烷，DMF-二甲基甲酰胺，DCC-二環己基碳二亞胺，HOBt-1-羥基苯并三唑，Boc-叔丁氧羰基，THF-四氫呋喃。
根據本發明，本發明化合物的可藥用鹽包括其無機或有機酸鹽或堿鹽，其包括但不限于三氟醋酸鹽、鹽酸鹽、氫溴酸鹽、氫碘酸鹽、硝酸鹽、硫酸鹽、硫酸氫鹽、磷酸鹽、磷酸氫鹽、乙酸鹽、丙酸鹽、丁酸鹽、草酸鹽、三甲基乙酸鹽、己二酸鹽、藻酸鹽、乳酸鹽、檸檬酸鹽、酒石酸鹽、琥珀酸鹽、馬來酸鹽、富馬酸鹽、苦味酸鹽、天冬氨酸鹽、葡萄酸鹽、苯甲酸鹽、甲磺酸鹽、乙磺酸鹽、苯磺酸鹽、對甲苯磺酸鹽和雙羥萘酸鹽；堿鹽包括但不限于銨鹽、堿金屬鹽如鈉和鉀鹽、堿土金屬鹽如鈣和鎂鹽、有機堿鹽如二環己胺和N-甲基-D-葡糖胺鹽、以及氨基酸鹽如精氨酸和賴氨酸鹽。
根據本發明，式(I)三肽類似物或其立體異構體可按本領域已知方法、文獻方法或下面所示的反應路線1制備 反應路線1在反應路線1中，化合物Boc-B-OH(B如上所定義)與C-OP(C如上所定義，P為C1-4烷基，其可選自甲基，乙基，異丙基，丁基，仲丁基，異丁基，叔丁基，優選甲基和乙基)在DMF-DCM，NMM，DCC-HOBt中反應，生成Boc-B-C-OP。將Boc-B-C-OP經4摩爾鹽酸/二氧六環脫保護基，生成HCl·B-C-OP。將HCl·B-C-OP與Boc-A-OH(A如上所定義)在DMF-DCM，NMM，DCC-HOBt中反應，生成Boc-A-B-C-OP。將Boc-A-B-C-OP經1摩爾氫氧化鋰/甲醇-四氫呋喃皂化，生成Boc-A-B-C-OH。將Boc-A-B-C-OH經4摩爾鹽酸/二氧六環脫保護基，生成HCl·A-B-C-OH。
根據本發明，式(I)三肽類似物的立體異構體包括D-和/或L-構型。
根據本發明，式(I)三肽類似物及其立體異構體在人癌癥細胞篩選中顯示較好的抑制細胞生長的活性。
本發明涉及含有作為活性成分的有效劑量的至少一種式(I)三肽類似物和/或其立體異構體以及常規藥物賦形劑或輔劑的藥物組合物。通常本發明藥物組合物含有0.1～90％的式(I)三肽類似物和/或其立體異構體。藥物組合物可根據本領域已知的方法制備。用于此目的時，如果需要，可將式(I)三肽類似物和/或其立體異構體與一種或多種固體或液體藥物賦形劑和/或輔劑結合，制成可作為人用的適當的施用形式或劑量形式。
本發明式(I)三肽類似物及其立體異構體或含有它的藥物組合物可以單位劑量形式給藥，給藥途徑可為腸道或非腸道，如口服、肌肉、皮下、鼻腔、口腔粘膜、皮膚、腹膜或直腸等。給藥劑型例如片劑、膠囊、滴丸、氣霧劑、丸劑、粉劑、溶液劑、混懸劑、乳劑、顆粒劑、脂質體、透皮劑、口含片、栓劑、凍干粉針劑等。可以是普通制劑、緩釋制劑、控釋制劑及各種微粒給藥系統。為了將單位給藥劑型制成片劑，可以廣泛使用本領域公知的各種載體。關于載體的例子，如稀釋劑與吸收劑，如淀粉、糊精、乳糖、甘露醇、蔗糖、葡萄糖、硫酸鈣、氯化鈉、尿素、碳酸鈣、白陶土、微晶纖維素、硅酸鋁等；濕潤劑與粘合劑，如水、甘油、聚乙二醇、乙醇、丙醇、淀粉漿、糊精、糖漿、蜂蜜、葡萄糖溶液、阿拉伯膠漿、明膠漿、羧甲基纖維素鈉、紫膠、甲基纖維素、磷酸鉀、聚乙烯吡咯烷酮等；崩解劑，如干燥淀粉、海藻酸鹽、瓊脂粉、褐藻淀粉、碳酸氫鈉與枸櫞酸、碳酸鈣、聚氧乙烯山梨糖醇脂肪酸酯、十二烷基磺酸鈉、甲基纖維素、乙基纖維素等；崩解抑制劑，如蔗糖、三硬脂酸甘油酯、可可脂、氫化油等；吸收促進劑，如季銨鹽、十二烷基硫酸鈉等；潤滑劑，如滑石粉、二氧化硅、玉米淀粉、硬脂酸鹽、硼酸、液體石蠟、聚乙二醇等。還可以將片劑進一步制成包衣片，如糖包衣片、薄膜包衣片、腸溶包衣片，或雙層片和多層片。為了將給藥單元制成丸劑，可以廣泛使用本領域公知的各種載體。關于載體的例子是，例如稀釋劑與吸收劑，如葡萄糖、乳糖、淀粉、可可脂、氫化植物油、聚乙烯吡咯烷酮、Gelucire、高嶺土、滑石粉等；粘合劑如阿拉伯膠、黃蓍膠、明膠、乙醇、蜂蜜、米糊或面糊等；崩解劑，如瓊脂粉、干燥淀粉、海藻酸鹽、十二烷基磺酸鈉、甲基纖維素、乙基纖維素等。為了將給藥單元制成栓劑，可以廣泛使用本領域公知的各種載體。關于載體的例子是，例如聚乙二醇、卵磷脂、可可脂、高級醇、高級醇的酯、明膠、半合成甘油酯等。為了將給藥單元制成膠囊，將有效成分式(I)三肽類似物或其立體異構體與上述的各種載體混合，并將由此得到的混合物置于硬膠囊或軟膠囊中。也可將有效成分式(I)三肽類似物或其立體異構體制成微囊劑，混懸于水性介質中制成混懸劑，亦可裝入硬膠囊中或制成注射劑應用。為了將給藥單元制成注射用制劑，如溶液劑、乳劑、凍干粉針劑和混懸劑，可以使用本領域常用的所有稀釋劑，如水、乙醇、聚乙二醇、1，3-丙二醇、乙氧基化的異硬脂醇、多氧基化的異硬脂醇、聚氧乙烯山梨醇脂肪酸酯等。另外，為了制備等滲注射液，可以向注射用制劑中添加適量的氯化鈉、葡萄糖或甘油，此外，還可以添加常規的助溶劑、緩沖劑、pH調節劑等。
此外，如需要，也可以向藥物制劑中添加著色劑、防腐劑、香料、矯味劑、甜味劑或其它材料。
實施例下面的實例及生物活性實驗用來進一步說明本發明，但這并不意味著對本發明的任何限制。
實施例化合物熔點由RY-1型熔點儀測定，溫度未經校正；1H NMR圖譜由Bruker ARX 400型或US Varian Unity Inova 600型核磁儀測定；FAB質譜由Zabspect高分辨磁質譜儀測定；元素分析由CarloErba 1106型元素分析儀測定；紫外光譜由UV-260紫外可見分光光度計測定；紅外光譜由Magna IRTM 550紅外儀測定。實施例制備所用反應試劑均為商品化產品。
實施例1L-N-Ac-β-Nal-Val-mAB(QTP-007)N-乙酰-(2-萘甲基)丙氨酸乙酯的制備2-溴甲基萘的制備2-甲基萘71克(0.5mol)用400毫升四氯化碳溶解，加入N-溴代丁二酰亞胺(NBS)89克(0.5mol)，攪拌，NBS不溶解。假如偶氮二異丁腈2.5克，油浴緩慢加熱，～95℃時，反應液劇烈沸騰，上沖，立即停止加熱，水浴冷卻，反應立即緩和，繼續油浴加熱，液面上有泡沫狀物質懸浮。補加偶氮二異丁腈8.5克，回流3.5小時(98℃±3)。反應液于冰水浴中冷卻，濾除白色固體(丁二酰亞胺)，四氯化碳洗兩次。濾液濃縮，得黃色液體，冰浴，析出黃色結晶。濾集得淡黃色結晶78.2克(70.7％)，m.p.48～51℃。
N-乙酰-(2-萘甲基)丙二酸二乙酯的制備將鈉8.14(0.354mol)克在400毫升絕對無水乙醇中回流(98±3℃)，至鈉完全溶解。冷卻至室溫(為白色混濁液體)后，加入乙酰氨基丙二酸二乙酯76.9克(0.354mol)，攪拌溶解。加入2-溴甲基萘78.2克(0.354mol)，反應液中逐漸出現固體，油浴回流(100℃±3)3小時。減壓蒸出乙醇約300毫升后，于冰水浴條件下，加入500毫升水，立即有淡黃色固體析出。濾集結晶，水洗三次，室溫干燥，稱重得103.3克(81.7％)，m.p.123～125℃。TLC檢測石油醚-乙酸乙酯(3∶1)，Rf＝0.30。
N-乙酰-(2-萘甲基)丙二酸單乙酯的制備N-乙酰-(2-萘甲基)丙二酸二乙酯50.0克(0.14mol)，用450毫升乙醇溶解，室溫滴加6N氫氧化鈉30毫升，TLC監測至初始反應物消失(2.5小時)。冰水浴條件下，滴加6N鹽酸(～30毫升)調pH～3，得白色混懸液。濃縮得白色糊狀霧，加入420毫升水，抽濾，得白色粉狀固體，水洗四次，室溫干燥。稱重得35.82克(77.2％)。
N-乙酰-(2-萘甲基)丙氨酸乙酯的制備N-乙酰-(2-萘甲基)丙氨酸乙酯17.9克(0.054mol)用150毫升二氧六環溶解，油浴回流(108℃±3)3.5小時。反應液濃縮得黃色油狀液體，加入100毫升乙酸乙酯和100毫升水，振搖分液，乙酸乙酯層分別用飽和碳酸氫鈉、飽和氯化鈉洗兩次，乙酸乙酯層用無水硫酸鈉干燥。濾除干燥劑，濾液濃縮，得黃色油狀液體，放置，有結晶析出。濾集結晶，石油醚洗兩次，室溫干燥。稱重得12.7克(82.3％)，m.p.123～125℃。TLC檢測石油醚∶乙酸乙酯(1∶1)，Rf＝0.56。
拆分稱量N-乙酰-(2-萘甲基)丙氨酸乙酯11.0克(38.6mmol)，于研缽中研成細粉，混懸于280毫升水中(含氯化鈉2.0克)，水浴(37℃±1)，飽和碳酸氫鈉調pH7.60，溶液呈白色混懸狀。加入枯草桿菌蛋白酶A～2.0毫克，pH值迅速下降，用0.5N氫氧化鈉調pH7.60左右。2.5小時后，pH值下降緩慢，補加α-糜蛋白酶～5毫克，pH值迅速下降，繼續用0.5N氫氧化鈉調pH7.40左右。5.5小時后，pH值基本保持恒定，繼續攪拌1.0小時。反應液用乙酸乙酯萃取至紫外燈下(λ＝254nm)無吸收為止，乙酸乙酯層用飽和氯化鈉洗兩次，無水硫酸鈉干燥。濾除干燥劑，濾液濃縮，得無色塊狀結晶5.38克(97.8％)(D-N-乙酰-(2-萘甲基)丙氨酸乙酯)，m.p.149.0～149.5℃，[α]D25＝-11.8°(C＝2，MeOH∶DMF＝1∶2)；水層于冰水浴中用濃鹽酸調pH～2，滴加過程中不斷析出白色固體，濾集得白色針狀結晶3.85克(77.6％)(L-N-乙酰-(2-萘甲基)丙氨酸)，m.p.183～184.0℃，[α]D25＝+37.7°(C＝2，MeOH∶DMF＝1∶2)。
L-N-乙酰-(2-萘甲基)丙氨酸的1H NMR(DMSO)δ7.3～8.1(m，4H，Ar-H)，5.8(d，1H，-NHCO-)，4.9(t，1H，-CHCH2-)，3.5～3.7(m，2H，-CH2CH-)，2.0(s，3H，-COCH3)。
水解對上述所得(L)-N-乙酰-(2-萘甲基)丙氨酸、(D)-N-乙酰-(2-萘甲基)丙氨酸乙酯用6N鹽酸回流水解，得到(L)-(2-萘甲基)丙氨酸鹽酸鹽，[α]D25＝-8.0°(C＝2，1M HCl)；(D)-(2-萘甲基)丙氨酸鹽酸鹽，[α]D25＝+7.5°(C＝2，1M HCl)。
3-氨基苯甲酸甲酯鹽酸鹽的制備將無水甲醇30毫升用冰鹽浴冷卻至-10℃，滴加二氯亞砜7.8毫升，滴加過程中保持反應液內溫-8～-10℃，滴加完畢后，加入3-氨基苯甲酸4.1克(30毫摩爾)，室溫避光攪拌兩天，得到淺紫色透明溶液。減壓蒸去溶劑，得到淺紫色結晶。用無水乙醇-乙醚重結晶，得到類白色固體5.58克(99.2％)。TLC檢測氯仿-甲醇-醋酸(16∶1∶0.5)，Rf＝0.86，FAB-MS[M+H]+＝152，m.p.195.0～200℃。
L-N-Ac-β-Nal-Val-mAB(QTP-007)的制備將3-氨基苯甲酸甲酯鹽酸鹽3.75克(20mmol)，溶于20毫升二氯甲烷中，冰浴攪拌下加入N-甲基嗎啡啉2.22毫升(20mmol)，10分鐘后，加入Boc-Val-OH 4.35克(20mmol)，溶解。加入HOBt 2.84克(21mmol)的DMF溶液6ml，冰浴10分鐘后，加入DCC 4.33克(21mmol)。繼續保持冰浴2小時后，室溫反應12小時。濃縮，加入乙酸乙酯50毫升，水洗一次后，分別用10％檸檬酸、飽和碳酸氫鈉和飽和氯化鈉各洗三次，乙酸乙酯層用無水硫酸鈉干燥5小時。濾除干燥劑，濃縮濾液，得黃色油狀物。于冰水浴中，加入石油醚，刮出固體。取該固體0.35克(1mmol)，加入4M鹽酸/二氧六環約5毫升，溶解，室溫攪拌1小時。濃縮，得黃色油狀液體。二氯甲烷溶解，冰浴攪拌下，加入N-甲基嗎啡啉0.11毫升(1mmol)，10分鐘后，加入L-N-乙酰-(1-萘甲基)丙氨酸0.26克(1mmol)，溶解。加入HOBt 0.14克(1.05mmol)的DMF溶液，冰浴10分鐘，加入DCC 0.22克(1.05mmol)。冰浴2小時后，室溫反應12小時。濃縮，加入乙酸乙酯10毫升，水洗后，分別用10％檸檬酸、飽和碳酸氫鈉和飽和氯化鈉各洗三次，乙酸乙酯層用無水硫酸鈉干燥5小時。濾除干燥劑，濃縮濾液，得黃色油狀物。加入石油醚20毫升，冰浴條件下研磨，得類白色固體。將此固體用甲醇-四氫呋喃5毫升溶解，冰水浴條件下，滴加1M氫氧化鋰，30分鐘后，室溫反應10小時。冰水浴中，滴加0.5M鹽酸水溶液，調節pH～3.0，乙酸乙酯提取三次(10毫升×3)，乙酸乙酯層用水、飽和氯化鈉洗兩次，用無水硫酸鈉干燥。濾除干燥劑，濃縮濾液，得到呈白色固體的標題化合物。ESI-MS[M+H]+＝476.3，純度95.0％。
依據與實施例相同或相似的方法制備得到了以下化合物L-N-Ac-β-Nal-Val-Val-mAB(QTP-001)分子量574.6純度95％L-N-Ac-α-Nal-Val-Val-mAB(QTP-002)分子量574.6純度95％L-N-Ac-β-Nal-Val-Leu-mAB(QTP-003)分子量588.6純度95％L-N-Ac-α-Nal-Leu-Leu-mAB(QTP-004)分子量602.6純度92％L-N-Ac-α-Nal-Pro-mAB(QTP-005)分子量473.3純度85％L-N-Ac-β-Nal-Leu-Val-mAB(QTP-006)分子量574.6純度92％L-N-Ac-β-Nal-Val-mAB(QTP-007)分子量475.3純度95％L-N-Ac-α-Nal-Val-mAB(QTP-008)分子量475.3純度92％L-N-Ac-β-Nal-Leu-mAB(QTP-009)分子量489.3純度90％L-N-Ac-α-Nal-Va1-Leu-mAB(QTP-010)分子量574.6純度91％L-N-Ac-α-Nal-Leu-mAB(QTP-011)分子量489.3純度88％L-N-Ac-β-Nal-Leu-Leu-mAB(QTP-012)分子量602.6純度85％L-N-Ac-α-Nal-Gly-mAB(QTP-025)分子量433.3純度98％L-N-Boc-(p-Mm)Phe-Pro-mAB HCl(QTP-026) 分子量616.8純度85％L-N-Boc-(p-Mm)Phe-Val-mAB HCl(QTP-027) 分子量618.8純度88％L-N-Boc-(p-Pym)Phe-Val-mAB HCl(QTP-028) 分子量602.8純度80％L-N-Boc-(p-DiEm)Phe-Val-mAB HCl(QTP-029) 分子量604.8純度80％D-N-Boc-(p-DiEm)Phe-Val-mAB HCl(QTP-030) 分子量604.8純度85％L-N-Boc-(p-DiMm)Phe-Gly-mAB HCl(QTP-031) 分子量571.3純度85％L-N-Ac-β-Nal-Val-Val-MAB(QTP-032)分子量588.6純度90％L-N-Ac-α-Nal-Val-Val-MAB(QTP-033)分子量588.6純度90％L-N-Ac-β-Nal-Val-Leu-MAB(QTP-034)分子量616.6純度85％L-N-Ac-α-Nal-Pro-MAB(QTP-035)分子量487.3純度85％L-N-Ac-β-Nal-Val-MAB(QTP-036)分子量489.3純度90％L-N-Ac-α-Nal-Val-MAB(QTP-037)分子量489.3純度92％L-N-Ac-β-Nal-Leu-MAB(QTP-038)分子量503.3純度85％L-N-Ac-α-Nal-Leu-MAB(QTP-039)分子量503.3純度85％L-N-Ac-α-Nal-Gly-MAB(QTP-040)分子量447.3純度95％L-N-Boc-(p-Mm)Phe-Pro-MAB HCl(QTP-041)分子量630.8純度80％L-N-Boc-(p-Pym)Phe-Val-MAB HCl(QTP-042)分子量616.8純度85％D-N-Boc-(p-DiEm)Phe-Val-MAB HCl(QTP-043)分子量630.8純度85％L-N-Boc-(p-DiMm)Phe-Gly-MAB HCl(QTP-044)分子量585.3純度85％L-N-Boc-(p-Chfm)Phe-Pro-MAB HCl(QTP-045)分子量580.3純度80％L-N-Ac-α-Nal-Gly-ABE(QTP-046)分子量445.3純度95％L-N-Boc-Tic-Tle-ABE(QTP-047)分子量473.6純度90％實施例2L-N-Boc-(p-Mm)Phe-Pro-(m)Abu(QTP-024)L-N-Boc-(對-嗎啉甲基)苯丙氨酸鹽酸鹽的制備將L-N-Ac-PheOEt白色結晶10克(43.5毫摩爾)溶于80毫升氯甲醚中，冰水浴控制反應液內溫0℃，加入新炒制的氯化鋅25克(180毫摩爾)，攪拌，使氯化鋅分散均勻。保持反應液內溫0℃，反應50小時。減壓抽盡溶劑后，冰水浴條件下加入水100毫升，乙酸乙酯萃取(25毫升×4)液合并后，分別用飽和碳酸氫鈉、飽和氯化鈉、水洗三次，乙酸乙酯層用無水硫酸鈉進行干燥。濾除干燥劑，濾液濃縮，得到淡黃色油狀液體。加入少量乙醚，于冰水浴中析出白色針狀結晶。取該結晶1.0克(3.52毫摩爾)，無水乙醇3.5毫升溶解，加入嗎啡啉0.70毫升(7.04毫摩爾)，室溫反應過夜。濾除固體，濃縮濾液，加入水10毫升，乙酸乙酯萃取(10毫升×3)，乙酸乙酯層分別用水、飽和氯化鈉洗兩次，無水硫酸鈉干燥。濾除干燥劑，濾液濃縮，得到無色粘稠液體，放置后析出白色固體。m.p.78～81℃。該白色固體用6M鹽酸水溶液回流6小時，濃縮，得到白色固體。取該白色固體0.34克(1.0毫摩爾)，用水-二氧六環(1∶1)10毫升溶解，加入碳酸鉀0.30克(2.2毫摩爾)，溶解，加入叔丁氧酐0.24克(1.1毫摩爾)。室溫反應22小時。濃縮反應液，加入水10毫升，乙醚萃取(10毫升×4)。水相于冰水浴條件下，用檸檬酸酸化至pH～2.0，用正丁醇萃取(15毫升×4)，正丁醇層用水洗兩次，濃縮，得到油狀液體，加入乙醚，冰水浴條件下刮出固體，[α]D25＝+17.5°(C＝0.6，95％EtOH)。元素分析(％)C 56.54，H 7.67，N 6.72。ESI-MS[M+H]+＝365。
4-氨基丁酸甲酯鹽酸鹽的制備將無水甲醇50毫升用冰鹽浴冷卻至-10℃，滴加二氯亞砜13毫升，滴加過程中保持反應液內溫-8～-10℃，滴加完畢后，加入3-氨基苯甲酸5.16克(50毫摩爾)，室溫攪拌兩天，得到無色透明溶液。減壓蒸去溶劑，得到白色結晶。用無水乙醇-乙醚重結晶，得到白色固體7.63克(99.3％)，m.p.73～75℃，FAB-MS[M+H]+＝118。
L-N-Boc-(p-Mm)Phe-Pro-(m)Abu(QTP-024)的制備
將4-氨基丁酸甲酯鹽酸鹽1.54克(10mmol)，溶于10毫升二氯甲烷中，冰浴攪拌下加入N-甲基嗎啡啉1.11毫升(10mmol)，10分鐘后，加入Boc-Pro-OH 2.17克(10mmol)，溶解。加入HOBt 1.42克(10.5mmol)的DMF溶液2ml，冰浴10分鐘后，加入DCC 2.21克(10.5mmol)。繼續保持冰浴2小時后，室溫反應12小時。濃縮，加入乙酸乙酯20毫升，水洗一次后，分別用10％檸檬酸、飽和碳酸氫鈉和飽和氯化鈉各洗三次，乙酸乙酯層用無水硫酸鈉干燥5小時。濾除干燥劑，濃縮濾液，得黃色油狀物。于冰水浴中，加入石油醚，刮出固體2.4克(76.3％)。取該固體0.32克(1mmol)，加入4M鹽酸/二氧六環約5毫升，溶解，室溫攪拌1小時。濃縮，得黃色油狀液體。二氯甲烷溶解，冰浴攪拌下，加入N-甲基嗎啡啉0.22毫升(2mmol)，10分鐘后，加入L-N-Boc-(對-嗎啉甲基)苯丙氨酸鹽酸鹽0.40克(1mmol)，溶解。加入HOBt 0.14克(1.05mmol)的DMF溶液，冰浴10分鐘，加入DCC 0.22克(1.05mmol)。冰浴2小時后，室溫反應12小時。濃縮，加入乙酸乙酯10毫升，水洗后，分別用10％檸檬酸、飽和碳酸氫鈉和飽和氯化鈉各洗三次，乙酸乙酯層用無水硫酸鈉干燥5小時。濾除干燥劑，濃縮濾液，得黃色油狀物。加入石油醚20毫升，冰浴條件下研磨，得類白色固體。將此固體用甲醇-四氫呋喃5毫升溶解，冰水浴條件下，滴加1M氫氧化鈉，30分鐘后，室溫反應3小時。冰水浴中，滴加0.5M鹽酸水溶液，調節pH～3.0，正丁醇提取三次(10毫升×3)，正丁醇層用水、飽和氯化鈉洗兩次，濃縮，得到白色固體。ESI-MS[M+]＝546，純度88％。
依據與實施例2相同或相似的方法制備得到了以下化合物L-N-Ac-α-NAla-Val-Abu(QTP-013)分子量441.4 純度98％L-N-Ac-β-NAla-Val-Abu(QTP-014)分子量441.4 純度95％L-N-Ac-α-NAla-Val-Val-Abu(QTP-015)分子量540.7 純度90％L-N-Ac-β-NAla-Val-Val-Abu(QTP-016)分子量540.7 純度90％L-N-Ac-α-NAla-Val-Leu-Abu(QTP-017)分子量554.7 純度95％L-N-Ac-β-NAla-Val-Leu-Abu(QTP-018)分子量554.7 純度90％L-N-Ac-α-NAla-Leu-Val-Abu(QTP-019)分子量554.7 純度95％L-N-Ac-β-NAla-Leu-Val-Abu(QTP-020)分子量554.7 純度95％L-N-Ac-α-NAla-Leu-Leu-Abu(QTP-021)分子量568.7 純度90％L-N-Ac-β-NAla-Leu-Leu-Abu(QTP-022)分子量568.7 純度95％L-N-Ac-α-Nal-Pro-Abu(QTP-023)分子量439.4 純度88％L-N-Boc-(p-Mm)Phe-Pro-(m)Abu HCl(QTP-024)分子量650.7 純度85％L-N-Boc-Phe-Tle-(m)Abu(QTP-048)分子量463.8 純度95％L-N-Boc-(p-Chf)Phe-Val-Abu(QTP-049)分子量484.3 純度90％L-N-Boc-Tic-Tle-Abu(QTP-050)分子量475.6 純度95％其余各化合物可依據上述方法和途徑制備而成。
實施例3MTT顯色法檢測體外抗癌活性。
腫瘤細胞懸液的制備取傳代培養72小時的K562、OVCA2780、Kato-III細胞株，用0.4％臺盼蘭與細胞懸液1∶1(50μl加50μl)混勻，立即按白細胞計數法計數活細胞數，每毫升的活細胞數＝計數值×5000。然后用10％小牛血清RPMI1640液將細胞濃度調整到3.125×105個/毫升，備用。
加樣培養在無菌條件下，向96孔細胞培養板中每孔加入以調整好的3.125×105個/毫升K562細胞懸液80μl和已設定好的本發明化合物濃度20μl，每個化合物濃度設3～6個復孔，然后置37℃，5％CO2，飽和濕度孵溫箱中培養48小時，加0.25％MTT液20μl/孔，繼續培養4小時，然后加入10％SDS100μl/孔，置孵溫箱培養過夜。
OD值測定將上述含有培養物加入SDS在孵溫箱中培養過夜的96孔板置多孔掃描分光光度計Multiskan MCC/340 MKII中，選用單波長570nm測定OD值，計算OD值的百分率及化合物IC50。
OD值(％)＝給化合組OD/溶劑對照組OD×100％IC50值是以化合物濃度對OD百分率的對數值做線性回歸后得出的。化合物號 OD值(x±s)OVCA2780K562Kato-IIIQTP-0010.6303±0.02521.1628±0.05351.2093±0.0436QTP-0020.6705±0.01751.2180±0.07081.2403±0.1051QTP-0030.5930±0.02821.1588±0.07251.2423±0.0398QTP-0040.7128±0.01571.2448±0.03211.2573±0.0691QTP-0050.7183±0.06081.3068±0.03681.2234±0.0773QTP-0060.7070±0.03581.3495±0.02171.3458±0.0959QTP-0070.6835±0.03861.2345±0.08381.2780±0.6092QTP-0080.7165±0.02901.3155±0.03621.3095±0.0179QTP-0090.7025±0.13071.3075±0.05001.2908±0.0917QTP-0100.5800±0.04411.2688±0.01451.2093±0.0466QTP-0110.6700±0.10811.2588±0.02001.1928±0.0474QTP-0120.6860±0.04711.2233±0.06191.2178±0.024權利要求
1.式(I)三肽類似物或其立體異構體或可藥用鹽A-B-C(I)其中A為L-型或D-型芳香性天然或非天然氨基酸，芳香性部分選自有一個或多個取代基的吲哚環、苯環、萘環、蒽環、菲環、四氫喹啉環、四氫異喹啉環、苯并四氫異喹啉環，取代基包括但不限于鹵素、硝基、羥基、甲氧基、亞甲二氧基、氨基、胺甲基、N，N-二(C1-C4直鏈或支鏈烷基)胺甲基、C3-C7環胺甲基、C3-C7含氮、氧、硫雜原子的環胺甲基、磺酸甲基、磷酸酯甲基。氨基酸中的氨基部分可被取代，取代基包括但不限于C1-C4直鏈或支鏈烷基、C3-C7環烷基、各種氨基保護基，氨基保護基包括芐基、取代芐基、叔丁氧羰基、苯氧羰基、芐氧羰基、芴甲氧羰基、C1-C5羧酯基、C1-C4直鏈或支鏈烷基、C3-C7環烷基；B為選自Gly、Ala、Val、Leu、Nle、Ile、Pro、Tle、MeVal的天然或非天然親脂性氨基酸；C為C1-C4直鏈或支鏈烷基取代的γ-氨基丁酸、C1-C4直鏈或支鏈烷基取代的γ-氨基丁烯酸及其插烯同系物、一個或多個取代基的3-氨基苯甲酸、1-(C1-C4直鏈或支鏈烷基取代的3-氨基環己烯)甲酸，或為C1-C4直鏈或支鏈烷基取代的γ-氨基丁酸、C1-C4直鏈或支鏈烷基取代的γ-氨基丁烯酸及其插烯同系物、一個或多個取代基的3-氨基苯甲酸、1-(C1-C4直鏈或支鏈烷基取代的3-氨基環己烯)甲酸與天然或非天然親脂性氨基酸形成的二肽，氨基上的氫可被C1-C4直鏈或支鏈烷基取代或不被取代；苯環上的取代基包括但不限于鹵素、硝基、羥基、羧基、三氟甲基、亞甲二氧基、亞甲二硫基、C1-C6直鏈或支鏈烷基、C3-C7環烷基、C1-C5烷氧基、氨基、C1-C5酰胺基，親脂性氨基酸可為下列氨基酸Gly、Ala、Val、Leu、Nle、Ile、Pro、Tle、MeVal。
2.根據權利要求1的化合物或其可藥用鹽，其中A為L-型或D-型芳香性天然或非天然氨基酸，芳香性部分選自有一個或多個取代基的吲哚環、苯環、萘環、蒽環、菲環、四氫喹啉環、四氫異喹啉環、苯并四氫異喹啉環，這些取代基包括但不限于鹵素、硝基、羥基、甲氧基、亞甲二氧基、氨基、胺甲基、N，N-二(C1-C4直鏈或支鏈烷基)胺甲基、C3-C7環胺甲基、C3-C7含氮、氧、硫雜原子的環胺甲基、磺酸甲基、磷酸酯甲基，氨基酸中的氨基部分可被取代，取代基包括但不限于C1-C4直鏈或支鏈烷基、C3-C7環烷基、各種氨基保護基，氨基保護基包括芐基、取代芐基、叔丁氧羰基、苯氧羰基、芐氧羰基、芴甲氧羰基、C1-C5羧酯基、C1-C4直鏈或支鏈烷基、C3-C7環烷基；B為選自Gly、Ala、Val、Leu、Nle、Ile、Pro、Tle、MeVal的天然或非天然親脂性氨基酸；C為C1-C4直鏈或支鏈烷基取代的γ-氨基丁酸、C1-C4直鏈或支鏈烷基取代的γ-氨基丁烯酸及其插烯同系物、一個或多個取代基的3-氨基苯甲酸、1-(C1-C4直鏈或支鏈烷基取代的3-氨基環己烯)甲酸，或為C1-C4直鏈或支鏈烷基取代的γ-氨基丁酸、C1-C4直鏈或支鏈烷基取代的γ-氨基丁烯酸及其插烯同系物、一個或多個取代基的3-氨基苯甲酸、1-(C1-C4直鏈或支鏈烷基取代的3-氨基環己烯)甲酸與天然或非天然親脂性氨基酸形成的二肽，氨基上的氫可被C1-C4直鏈或支鏈烷基取代或不被取代；苯環上的取代基包括但不限于鹵素、硝基、羥基、羧基、三氟甲基、亞甲二氧基、亞甲二硫基、C1-C6直鏈或支鏈烷基、C3-C7環烷基、C1-C5烷氧基、氨基、C1-C5酰胺基，親脂性氨基酸可為下列氨基酸Gly、Ala、Val、Leu、Nle、Ile、Pro、Tle、MeVal。
3.式(I)三肽類似物或其立體異構體的制備方法，其包括1)將化合物Boc-B-OH與C-OP在DMF-DCM，NMM，DCC-HOBt中反應，生成Boc-B-C-OP，其中B，C如權利要求1中定義，P為C1-4烷基；2)將1)中所得產物在鹽酸/二氧六環中脫去氨基保護基，生成HCl·B-C-OP；3)將2)中產物HCl·B-C-OP與Boc-A-OH在DMF-DCM，NMM，DCC-HOBt中反應，生成Boc-A-B-C-OP；4)將3)中產物Boc-A-B-C-OP在氫氧化鋰/甲醇-四氫呋喃溶液中皂化，然后用檸檬酸酸化，生成Boc-A-B-C-OH；5)將4)中產物Boc-A-B-C-OH如2)中所述進行反應，生成脫去氨基保護基的HCl·A-B-C-OH。
4.一種藥物組合物，其包括至少一種式(I)權利要求1～3任一要求所述的三肽類似物或其立體異構體及藥用載體或賦形劑。
5.式(I)三肽類似物在制備用于治療癌癥藥物中的用途。
全文摘要
本發明涉及具有抗腫瘤活性的三肽類似物，其制備方法，含它們的藥物組合物及它們在治療癌癥中的用途。
文檔編號A61K38/08GK1467220SQ0212392
公開日2004年1月14日 申請日期2002年7月10日 優先權日2002年7月10日
發明者劉克良, 郄建坤, 梁遠軍, 趙修南 申請人:中國人民解放軍軍事醫學科學院毒物藥物研究所, 中國人民解放軍軍事醫學科學院毒物藥