專利名稱：玫瑰花提取物及其應用的制作方法
技術領域：
本發明涉及天然植物地提取，特別是玫瑰花提取物，該提取物具有天然抗氧化活性，可以制成抗氧化劑，用于防治疾病，提高機體免疫力，以及作為延年益壽的保健品。
背景技術：
從目前研究結果來看，氧自由基不僅與衰老有關，而且與人類大部分常見的主要疾病均有關，從人類死亡率最高的心腦血管疾病到人類最可怕的癌癥以及艾滋病，無一不和自由基有著密切的關系。通過防止自由基產生及清除已有自由基而達到防病治病的目的。目前人工合成的抗氧化劑，具有一定的毒性和誘變性，再使用上受到很大程度的限制，所以國內外研究人員正在從植物中尋找安全，有效的天然抗氧化劑。如茶葉中茶多酚，甘草中三萜類，黃酮類；銀杏葉提取物主要為黃酮類，萜類等。但從玫瑰花中提取抗氧化活性物質至今未見報導。
玫瑰花(Rosa rugosa Thunb)，又名徘徊花、筆頭花、湖花、刺玫花等，主要產于江蘇、浙江、福建、山東、四川和河北。玫瑰花目前應用較多的方面只是用玫瑰花原料本身，常作為一種組合物的成分，用于美容護發等，如玫瑰花超級洗發寶，天然色素口紅及一種治療痤瘡和毛囊炎的藥物組合物。

發明內容
本發明的目的是提供一種玫瑰花提取物及其應用，該提取物包括多糖類，蛋白類和有機酸類，該提取物具有天然抗氧化活性，可以制成抗氧化劑，用于防治疾病，提高機體免疫力，以及作為延年益壽的保健品。并且可以用于天然保健品開發，該植物資源豐富，提取容易，安全無毒。
本發明總有效成分占提取物總量的30％，其中主要包括含多糖84.74％，蛋白8.57％，沒食子酸衍生物6.69％。
本發明具體提取方法包括如下步驟
1)干燥的玫瑰花切碎，水浸泡，回流煮沸2～4小時，提取物傾出，冷卻后離心，上清冷凍干燥，即得干粉。
2)取50mg干粉溶于適量醋酸銨緩沖液中(10mM，pH4.5)，上樣于陽離子交換纖維素層析柱(CM-32)，然后用分別為10mM pH4.5，200mM pH4.5，400mM pH8.0的醋酸銨緩沖液依次洗脫。
3)經分離得到的活性物質上樣于層析柱(Sephadex G-75)，用磷酸鹽緩沖液(50mM，pH7.0)洗脫收集，冷凍干燥。
本發明提取物(F21)包括多糖類，蛋白類，以及有機酸類，總有效成分占提取物總量的30％。其中小分子有機酸類抗氧化作用活性最強。
本發明玫瑰花提取物不僅對機體紅細胞溶血有顯著抑制作用和對組織脂質過氧化有很強的抑制作用外，而且具有高效清除超氧陰離子的活性，是一種高效抗氧化劑。通過防止機體的自由基產生和凈化產生的自由基，提高機體抗病能力，預防與自由基有關的各種疾病的發生達到延緩衰老的作用。
本發明具有抗氧化活性的特點，可以制成抗氧化劑，用于防治疾病，提高機體免疫力，以及作為延年益壽的保健品。并且可以用于天然保健品開發，該植物資源豐富，提取容易，安全無毒。


圖1是F21經CM-32陽離子交換纖維素柱層析的洗脫曲線。
圖2是F3純化產物經HPLC純度鑒定。
圖3是F21及Vc抑制SAM鼠體外紅細胞溶血曲線。
圖4是F21及BHA體外抑制SAM鼠腦勻漿脂質過氧化作用曲線。
圖5是F21及BHA體外抑制SAM鼠腎勻漿脂質過氧化作用曲線。
具體實施例方式
實施例1
玫瑰花提取物(F21)制備與純化
采集于福建產的植物玫瑰花，將干燥的植物花切碎，水浸泡，回流煮沸2小時，提取物傾出，冷卻后離心，上清冷凍干燥，即得干粉(使用LGJ0.5冷凍干燥機，北京四環科學儀器廠制造)。
取50mg干粉溶于適量醋酸銨緩沖液中(10mM，pH4.5)，上樣于CM-32陽離子交換纖維素層析柱，然后用分別為10mM pH4.5，200mM pH4.5，400mM pH8.0的醋酸銨緩沖液依次洗脫，自動分步收集，測定各管抗氧化活性。
經分離得到的活性物質上樣于Sephadex G-75層析柱，用磷酸鹽緩沖液(50mM，pH7.0)洗脫收集，冷凍干燥。
提取物成分確定
F21經過上述CM-32陽離子交換纖維素柱分離出3種活性成份F1、F2、F3，經Sephdex G-75層析柱將F1純化出F1-a和F1-b兩種成份，其中F1-a為活性成份。F21中活性成份F1-a，F2和F3洗脫曲線見附圖1，三種活性成份的得率見表1。
表1F21活性成份純化結果
組分性狀 得率(％)
F1-a 乳白色，粉狀 5.0
F2 黃色，粘狀 20.0
F3 乳白色，粉狀 4.0
經多糖含量測定(蒽酮比色法)發現，F2主要成分為多糖，糖含量高達84.74％，F1-a含有少量多糖。對活性成份進行蛋白質含量測定(改良Lowry法)，使用上海分析儀器總廠生產的752紫外光柵分光光度計。測定結果表明F1-a含有少量蛋白，占8.57％，F2及F3中皆不含蛋白。結果見表2。
表2F21，F1-a，F2，F3中多糖及蛋白含量測定
組分蛋白含量(干重)(％)糖含量(干重)(％)
F2112.51 32.79
F1-a 8.57 23.12
F2 0 84.74
F3 0 0
經高效液相色譜法(HPLC)鑒定純度。使用島津LC-A4 HPLC儀，采用C18反相液-液相色譜法，測得結果F1-a為糖蛋白復合物，不是單一成份，F2以多糖為主，也含有少量其他成份。F3為單一峰，是單一成份，見附圖2，而且在三種抗氧化活性成分中，活性最高。對F3進一步用核磁共振技術(UNITY plus-400型超導NMR譜儀，美國Varian公司)，付里葉變換紅外光譜測定技術(FTIR)進行分析(Magna-560型付里葉變換紅外光譜儀，美國)，而且結合紫外吸收光譜法(儀器DU-7紫外分光光度計，美國Beckman)和元素分析技術(元素分析儀，美國)進行綜合解析，確定F3抗氧化活性成份為沒食子酸衍生物。
3.玫瑰花提取物抗氧化活性測定結果見附圖3，4，5。
4.為了更好的理解本發明，下面用動物實驗來說明玫瑰花提取物活性成份在小鼠體內的抗氧化效果及對小鼠延緩衰老的作用，來說明本發明的特點。
機體在正常的生理條件下，自由基的產生與消除處于動態平衡，這是因為存在著清除自由基的酶促反應和非酶促反應的防御系統。如果防御系統功能下降，體內產生自由基的水平會隨之增高，很容易與其他物質生成新的自由基，而且往往以連鎖方式進行下去，對組織造成嚴重損傷，破壞細胞內各種生物大分子，導致細胞死亡。本發明將F21提取物作用于小鼠體內第一，通過提高內源性抗氧化酶(SOD、CAT、GSH-Px等)的活性，消除并防止自由基的產生；第二，該提取物本身所含有的抗氧化成份直接清除體內已有自由基代謝產物(過氧化脂質LPO或丙二醛MDA)，減少自由基對各種抗氧化酶的滅活作用，維持機體生理平衡，使機體免受損害，起到防病和延緩衰老的效果。
本發明玫瑰花提取物抗氧化活性的測定方法如下
1.細胞水平測定采用紅細胞溶血測定法。
給藥小鼠摘眼球取血，制備10％紅細胞懸液，加入等體積自由基引發劑2，2-偶氮-雙-(2-脒基丙烷)氯化二氫(AAPH)，引起紅細胞膜磷脂發生過氧化反應，導致細胞膜破裂，釋放出血紅蛋白，于540nm測定上清液的吸光值，按下式計算抑制率
抑制率(％)＝(1-A/B)×100％
APBS(磷酸鹽緩沖液)反應管吸光值B完全溶血吸光值
2.組織水平測定采用硫代巴比妥酸(TBA)法。
將小鼠的肝組織勻漿后加入TBA，100℃加熱15分鐘，不飽和脂肪酸過氧化產物之一丙二醛產生，丙二醛與TBA反應產生紅色物質，在535nm處測定光吸收，抗氧化活性按下式計算
抑制率(％)＝(A-A1)/A×100％
A對照吸光值，A1試樣體系吸光值
3.組織中SOD酶(超氧化物岐化酶)活性測定采用亞硝酸鹽法
黃嘌呤氧化酶(XO)與其底物次黃嘌呤或黃嘌呤反應產生O2-·，與羥胺反應生成NO2-·，在酸性條件下繼而與對氧基苯磺酸和N-萘二氨基乙烯發生顯色反應生成紅色產物，SOD酶抑制該反應。由抑制的程度確定SOD酶活力。通過波長550nm處比色，計算酶活力。
4.全血CAT酶(過氧化氫酶)活性測定采用紫外速率直接法
CAT酶可分解H2O2生成H2O和O2，H2O2在240nm處有吸收峰，測定反應中H2O2在一定時間內吸光度降低來表示CAT活性。取小鼠新鮮血20μl與5ml蒸餾水中，制成1∶250溶血液，即為待測樣品。將溶血液與H2O2混合后在240nm處測定吸光值的變化。
計算公式
a250×15 b全血Hb濃度(g/L)
5.谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)活性測定采用DTNB直接法
GSH-Px可特異性地催化GSH與過氧化物的氧化還原反應，以單位時間內GSH減少的量來表示GSH-Px的活力。在一定條件下GSH與DTNB(5，5’-二硫代對硝基苯甲酸)反應生成淺黃色5’-硫代-2-硝基苯甲酸陰離子，在423nm處有最大吸收。
取小鼠全血10μl加入1ml雙蒸水中，制成1∶100溶血液，即為待測樣品，將樣品與GSH混合后加入H2O2，反應3分鐘，然后加入NaOH調pH6.5，再加入DTNB顯色劑，通過測定各管吸光度來測定酶活性。
計算公式全血＝[GSH]非酶管-[GSH]樣品管+[GSH]試劑空白管/3×4μl
通過以上方法對三批給藥和對照組小鼠進行抗氧化活性測定。測定結果見表3
表38月齡小鼠給藥后抗氧化活性測定結果
通過以上結果表明，玫瑰花提取物對機體具有提高各種抗氧化酶的活性，是一種有效的抗氧化劑。
實施例2.
選擇SAM鼠(天津防病中心提供)雄性、8月齡為實驗動物進行分組，給藥組6只，對照組6只，玫瑰花提取物(F21)加水配成適當水溶液，通過灌胃的方式給藥30天，給藥劑量80mg/kg·bw，對照組給以相等劑量的生理鹽水，每日一次，第31天各組小鼠同時取肝組織制備10％肝組織勻漿液(w/v)，冷凍離心后取上層清液待用。將此上清液進行100倍體積稀釋，獲得0.1％的組織液。總SOD活力測定的方法如下
試劑測定管(ml) 對照管(ml)
PBS1.01.0
組織勻漿上清液 0.03
蒸餾水 0.50.5+0.03
次黃嘌呤(HX) 0.10.1
羥胺(HA) 0.10.1
黃嘌呤氧化酶 0.10.1
(XO)
用漩渦混勻器充分混勻，置37℃恒溫水浴40分鐘
顯色劑 2 2
混勻，10分鐘后倒入1cm光徑比色杯中，蒸餾水調零，波長550nm處比色。
定義每毫克組織蛋白在1ml反應液中SOD抑制率達50％時所對應的SOD量為一個亞硝酸鹽單位(NU/mg.prot)。經計算，給藥組6只鼠的SOD酶活力平均值為739.69NU/mg.prot。對照組6只鼠的SOD酶活力平均值為624.89 NU/mg.prot，給藥后平均提高114.80 NU/mg.prot。
實施例3
小鼠的選擇、分組、給藥及給藥時間與實施例2中相同。給藥30天之后的實驗小鼠，斷頸處死，取肝組織，制成10％肝勻漿液，離心后取上清液1ml，加入無水乙醇10μl，冰浴30分鐘，加入10％TritonX-100 110μl，冰浴5分鐘。將樣品稀釋200倍加入反應體系，測定管加入酶液2ml，10mM的PBS 1ml混勻，在240nm處測定30秒吸光值的變化，計算CAT酶活力。
給藥組6只鼠的CAT酶活力平均為491.01K/g.Hb，對照組6只鼠的CAT酶活力平均為361.20K/g.Hb，給藥組比對照組CAT平均酶活力高129.81K/g.Hb。
實施例4
小鼠壽命實驗
選擇SAM鼠10只，均為雄性，有關資料記載SAM鼠平均壽命為333天，將試驗鼠分為兩組，為給藥組5只，對照組5只，給藥濃度80mg/kg·bw，每日一次以口服形式。給藥時間從小鼠10月齡開始(270天之后)一直到小鼠自然死亡為止。見表4。
表4小鼠壽命時間(天)
組別 1號2號3號4號5號平均
對照組324326334382340341
給藥組352406405397410394
以上結果表明，選用SAM鼠作動物實驗，在小鼠9個月之后通過口服玫瑰花提取物，可使小鼠壽命由對照組平均341天延長到平均壽命為394天，給藥組比對照組平均壽命增加53天。
權利要求
1、一種玫瑰花提取物，其特征在于該提取物總有效成分占提取物總量的30％，其中主要包括含多糖84.74％，蛋白8.57％，沒食子酸衍生物6.69％。
2、權利要求1所述的玫瑰花提取物的提取方法，其特征在于包括下述步驟
1)干燥的玫瑰花切碎，水浸泡，回流煮沸2～4小時，提取物傾出，冷卻后離心，上清冷凍干燥，即得干粉；
2)取干粉溶于10mM，pH4.5的醋酸銨緩沖液中，上樣于陽離子交換纖維素層析柱，然后用分別為10mM pH4.5，200mM pH4.5，400mM pH8.0的醋酸銨緩沖液依次洗脫；
3)經分離得到的活性物質上樣于層析柱，用50mM，pH7.0的磷酸鹽緩沖液洗脫收集，冷凍干燥。
3、權利要求1所述的玫瑰花提取物用于抗氧化劑的應用。
全文摘要
本發明涉及天然植物的提取，特別是玫瑰花提取物。天然植物玫瑰花(Rosa rugosaThunb)提取物總有效成分占提取物總量的30％，其中主要包括含多糖84.74％，蛋白8.57％，沒食子酸衍生物6.69％。該提取物可以抑制紅細胞溶血100％，20μg/ml抑制組織脂質過氧化90％以上，而且還具有提高各種抗氧化酶活性作用。本發明的植物資源豐富，提取容易，安全無毒，可制成抗氧化劑，用于防治疾病，提高機體免疫力，以及作為延年益壽的保健品。
文檔編號A61P39/06GK1410111SQ0214610
公開日2003年4月16日 申請日期2002年10月31日 優先權日2002年10月31日
發明者劉方, 牛淑敏, 吳子斌 申請人:南開大學