專利名稱：治療敗血癥的方法
技術領域：
本發明涉及一種治療敗血癥的方法、一種稠合吡唑基化合物、及該化合物在制造治療敗血癥的藥物中的應用。
若干資料顯示大量NO與敗血癥中發生的血管衰竭有關(參閱Rees(1995年)，Biochem Soc Trans.第23期，第1025至1029頁)。在活體中，大量NO通過下列途徑產生(i)在嚴重病癥(例如敗血癥)發作后內皮中NO過度的合成，參閱例如Ochoa等人(1991年)，Ann Surg.第214期，第621至626頁；Nakatsu及Diamond(1989年)，Can J Physiol Pharmacol.第67期，第251至262頁；及Guh等人(1998年)，MolPharmacol.第53期，第467至474頁；以及(ii)因細胞對于細菌產物(例如LPS)產生反應或對炎性細胞因子(例如細胞介白素1及腫瘤壞死因子)產生反應而使誘導型NO合酶(iNOS)的活性上調，參閱例如Curran等人(1989年)，J Exp Med.第170期，第1769至1774頁；及Nakayama等人(1992年)，Am J Respir Cell Mol Biol.第7期，第471至476頁。NO可與超氧化物反應產生過亞硝酸鹽(peroxynitrite)，其為氧化損害的主要原因(Szabo(1996年)，Shock第6期，第79至88頁)。過亞硝酸鹽亦曾被報告與血管細胞凋亡有關(Cuzzocrea等人(1998年)，Br J Pharmacol.第123期，第525至537頁)。
抑制血管細胞凋亡，以及因而防止血管及多種器官衰竭的化合物為治療或防止敗血癥或與敗血癥有關癥狀的候選藥物。
參閱式(I)，稠合的吡唑基化合物的一個亞類為其中A為H、Ar1為苯基、Ar2為苯基或呋喃基、以及R1與R2各為H。
稠合的吡唑基化合物的另一個亞類為其中A為(CH2)nAr3(R5)(R6)、Ar1為苯基或噻吩基、Ar2為苯基或呋喃基、Ar3為苯基、以及n為0或1。在若干具體實施例中，R1、R2、R3、R4、R5、及R6中的一個為COOH、COO-C1～C6烷基、CH2OH、CN、NO2、或鹵素。
本文所用“Ar” 的定義，指芳基及雜芳基團。芳基為至少具有一個芳環的烴環系統。芳基的一個例子為苯基。雜芳基為至少具有一個芳環的烴環系統，其中至少一個所述芳環含有至少一個雜原子(例如O、N、或S)。雜芳基的實例包括，但不限于吡啶基、噻吩基、呋喃基、或吡咯基。因此，”Ar”包括苯基、吡啶基、噻吩基、呋喃基、或吡咯基，上述基團中的每一個任意包括一、二、三、或多個取代基。除了上述指定的R1、R2、R3、R4、R5、及R6之外，所述取代基亦可為胺基、羥基、巰基、C2～C6烯基、C2～C6炔基、C1～C6烷氧基、芳基、雜芳基、環基(cyclyl)、或雜環基(heterocyclyl)，其中所述的烷基、烯基、炔基、烷氧基、芳基、雜芳基、環基、及雜環基可任意被C1～C6烷基、鹵素、胺基、羥基、巰基、氰基、或硝基取代。
本文所用“烷基”的定義，包括直鏈與支鏈，其可任意包括一或多個緊鄰的上文所述的取代基團。術語”芳基”指具有至少一個芳環的烴環系統(單環或雙環)。芳環基團的實例包括，但不限于苯基、萘基、及芘基。術語”雜芳基”一詞指具有至少一個芳環的烴環系統(單環或雙環)，其中至少一個所述芳環含有至少一雜原子(例如O、N、或S)做為環系統的一部份。雜芳基的實例包括，但不限于呋喃基、或吡咯基、噻吩基、噁唑基、咪唑基、噻唑基、吡啶基、嘧啶基、喹唑啉基、及吲哚基。術語”環基”及”雜環基”指具有4至14個環原子的部分或完全飽和的單環或雙環系統。雜環基的環含有一或多個雜原子(例如O、N、或S)做為環系統的一部份。環基與雜環基的環的例子為環己烷、哌啶、哌嗪、嗎啉、硫代嗎啉、1，4-oxazepane。
下列所示為可使用于實施本發明之方法之稠合吡唑基化合物的若干特定實例化合物1
化合物2 化合物3 化合物4 化合物5
化合物6 化合物7 化合物8 化合物9
化合物10 化合物11 化合物12 化合物13
化合物14 化合物15 化合物16 化合物17
化合物18 化合物19 化合物20 化合物21
化合物22 本發明的另一特征為式(I)的化合物，其中A為H、C1～C6烷基、或(CH2)nAr3(R5)(R6)，其中n為0、1、2、3、或4；Ar1、Ar2、及Ar3各自獨立地為苯基、吡啶基、噻吩基、呋喃基、或吡咯基；R1、R2、R3、R4、R5、及R6各自獨立地為XYZ，其中X為鍵或C1～C6烷基，Y為鍵、O、S、OC(O)、OC(O)(CH2)1-6C(O)O、C(O)O、C(O)S、C(O)NH、C(O)NC1～C6烷基、NH、或NC1～C6烷基，以及Z為H、鹵素、CN、NO2、或C1～C6烷基；條件是R1與R2一起或R5與R6一起任意組合為O(CH2)1-6O；以及進一步的條件是X必須為R，Y必須為OC(O)(CH2)1-6C(O)O，及R3及R4之一中的Z必須為H或C1～C6烷基。(CH2)1-6可為支鏈或直鏈。
上述的本發明的稠合吡唑基化合物的一個亞類為其中A為(CH2)nAr3(R5)(R6)，Ar1為苯基，Ar2為呋喃基，Ar3為苯基，n為0或1，R1、R2、R5、及R6之一為H，以及R3與R4之一為H。本發明的范例化合物為化合物9。
上述稠合的吡唑基化合物包括化合物本身，及其可用的鹽和及前體藥物。例如，可在稠合的吡唑基化合物上的帶負電荷的取代基(例如羧酸根)與陽離子之間形成此種鹽。適合的陽離子包括，但不限于鈉離子、鉀離子、鎂離子、鈣離子、以及銨離子例如四甲銨離子。同樣地，帶正電荷的取代基(例如氨基)能夠與帶負電荷的反離子形成鹽。適合的反離子包括，但不限于氯離子、溴離子、碘離子、硫酸根、硝酸根、磷酸根、或乙酸根。前體藥物的實例包括酯及其它藥學上可接受的衍生物，當其給予個體時，能夠提供上述的稠合的吡唑基化合物(參閱Goodman及Gilman，The Pharmacologicalbasis of Therapeutics，8thed，McGraw-HillInt.Ed.1992，”藥物的生物轉化(Biotransformation of Drugs)”)。
此外，本文所描述的若干稠合吡唑基化合物具有一或多個雙鍵，或一或多個不對稱中心。該類化合物可以表現為消旋物、消旋體混合物、單一對映體、個別的非對映立體異構體、非對映立體異構體混合物，及順-或反-，和E-或Z-雙重異構體形式。
進一步地，前述的稠合吡唑基化合物亦包括其N-氧化物。術語”N-氧化物”是指當一或多個氮原子存在于稠合的吡唑基化合物中時，其為N-氧化物形式，即，N→O。
本發明預想的取代基及變量的組合僅包括可形成穩定的稠合吡唑基化合物的組合。本處所用”穩定”一詞是指具有足以允許制造的穩定性的化合物，以及可使化合物維持足夠長時間的完整性以使該化合物可用于本文中所詳述的目的(例如治療敗血癥)。
進一步地，本發明的另一特征為一種抑制血管細胞凋亡的方法。該方法包括給予所需個體(例如哺乳動物、人或動物)有效量的上述一種或多種稠合的吡唑基化合物。
上述化合物在制造治療敗血癥的藥物中的應用亦在本發明的范疇之內。
本發明的其它特征、目的、及優點可由說明書、附圖、及權利要求中得到明顯的體現。
上述合成路徑中所使用的化學品包括，例如溶劑、試劑、催化劑以及保護基和去保護基試劑。上述方法亦可在本處所明確的各步驟前或后附加其它步驟，以增加或移除適當的保護基團從而得到最終合成的稠合吡唑基化合物。此外，許多合成步驟可利用替代程序或步驟來完成，并可得到所需化合物。可用于合成所需的稠合吡唑基化合物的合成化學的轉換與保護基團的方法學(保護與去保護)為本領域中公知的技術，可參見，例如R.Larock，Comprehensive Organic Transformations，VCH Publishers(1989)；T.W.Greeneand P.G.M.Wuts，Protective Groups in Organic Synthesis，3rdEd.，John Wileyand Sons(1999)；L. Fieser and M.Fieser，Fieser and Fieser’s Reagents forOrganic Synthesis，John Wiley and Sons(1994)；以及L.Paquette，ed.，Encyclopedia of Reagents for Organic Synthesis，John Wiley and Sons(1995)，及其以后的版本。
合成的稠合吡唑基化合物可進一步通過閃爍柱層析、高效液相層析或結晶法加以純化。
本發明的一方面為治療敗血癥的方法，該方法包括給予所需個體有效量的上述一種或多種稠合吡唑基化合物的及其藥學上可接受的載體。術語“治療”指的是將稠合的吡唑基化合物給予個體，從而達到治愈、減輕、緩解、補救、改善、或影響敗血癥、敗血癥癥狀或敗血癥傾向的目的。“有效量”定義為給予所需個體的稠合吡唑基化合物的量可完成對該個體的治療效果。稠合吡唑基化合物的有效量的范圍自0.1mg/Kg至100mg/Kg。如本領域技術人員所知，由于給藥路徑、賦形劑的使用以及可能與其它治療敗血癥的制劑的共同使用等因素的影響，有效劑量也將隨之改變。
為實行本發明的方法，稠合吡唑基化合物可透過口服、腸胃外給藥、吸入式噴霧器或通過植入型儲存器(implanted reservoir)的方式給藥，其中，腸胃外給藥方式包括皮下、皮內、靜脈內、肌內、關節內、動脈內、滑膜腔內、胸骨內、鞘內、病灶內、以及顱內注射或輸注技術。
可口服給藥的組合物可以口服可接受的任劑型，這些劑型包括，但不限于片劑、膠囊、乳劑，以及水性懸浮液、分散液和溶液。對于口服用的片劑，常規使用的載體包括乳糖和玉米淀粉。潤滑劑，例如硬脂酸鎂，通常也要加于片劑中。對于膠囊型式的口服劑型來說，可用的稀釋劑包括乳糖以及干玉米淀粉。當水性懸浮液或者乳液用于口服給藥時，活性成分可懸浮或溶解在與乳化劑或懸浮劑合用的油相中。如果需要，亦可加入甜味劑、調味劑或者著色劑。
可注射用的無菌組合物，(例如水質或油質的懸浮液)可采用本領域公知的技術用合適的分散劑或潤濕劑(如Tween 80)及懸浮劑制備而成。這種可注射的無菌制劑也可以是采用無毒的、腸胃外可接受的稀釋劑或溶劑制成的無菌注射溶液或懸浮液，例如，采用1，3-丁二醇制成的溶液。可供使用的可接受的賦形劑和溶劑包括甘露糖醇、水、林格氏液(Ringer’s solution)、以及等滲氯化鈉溶液。此外，無菌固定油類可作為溶劑或懸浮介質而常規使用(例如，合成的甘油一酯或甘油二酯)。脂肪酸，例如油酸及其甘油酯衍生物，在制備注射劑中很有用處，藥學上可接受的天然油類也是如此，例如橄欖油或蓖麻油，特別是其聚氧乙基化形式。這些油溶液或懸浮液亦可包含長鏈醇稀釋劑或分散劑，或者羧甲基纖維素或類似的分散劑。
可吸入用的組合物可采用本領域公知的技術制備而成，如制成溶于生理鹽水的溶液，其中可加入苯甲醇或其它合適的防腐劑、用于增加生物利用度的吸收促進劑、碳氟化合物和/或其它本領域公知的加溶劑或分散劑。
藥物組合物中的載體必須是“可接受的”，即與制劑中的活性成份是可共存的(優選能夠使活性成份穩定)并且對受治療者是無毒的。例如加溶劑，如環糊精(其可與稠合的吡唑基化合物形成溶解度更大的特定復合物)，可被用作載運稠合的吡唑基化合物的藥物賦形劑。其它載體的例子包括膠態二氧化硅、硬脂酸鎂、纖維素、十二烷基硫酸鈉、以及D&C Yellow#10。
可采用適當的體外試驗來初步評估稠合吡唑基化合物在抑制血管細胞凋亡中的效果。亦可采用下述本領域公知的過程進行體內篩選，請參照以下實例。
盡管未作進一步詳細闡述，但可以確信，上述描述已經足夠使本發明予以實現。因而，下述具體的實施例金用來對本發明作進一步說明，而不是用于將本發明囿于實施例所公開的內容。本文所引用的所有出版物均全文收納于此作為參考。
細胞毒性檢驗利用MTT檢測法進行細胞毒性檢驗。MTT(溴化-3-(4，5-二甲基噻唑-2-基)-2，5-二苯基四唑鎓鹽)，Sigma Chemical，St.Louis，MO)溶于磷酸緩沖鹽溶液(PBS)中，配制成濃度為5mg/mL的儲存液，并過濾(Millipore，Bedford，MA)。向培養板每孔中加入上述過濾后的儲存液10μL/100μL培養液，然后緩慢搖動平板并在37℃恒溫持續2小時。以MTT處理的活細胞內會產生藍紫色的結晶物質，而在死細胞中則無染色現象。MTT處理完后，傾去添加MTT的培養液，每孔加入100μL的二甲基亞砜(DMSO)。在細胞內MTT被還原的程度可通過ELISA(enzyme-linked immunosorbent assay)讀數器中采用OD550進行定量測量。
凋亡細胞的原位標記凋亡細胞的原位檢測可利用細胞凋亡檢測試劑盒(Promega，Madison，WI，USA)通過TUNEL(terminal deoxynucleotidyltransferase(TdT)dUTP nick-end labeling)法來進行檢測，該檢測方法如前所述(Guh et al.(1998)Mol Pharmacol.53467-474)。TUNEL法利用TdT將生物素-dUTP轉移至原位細胞中斷裂的DNA的3’-OH自由端，然后，生物素標記的斷裂位點再通過與熒光素耦連的抗生物素蛋白-(抗生物素蛋白-熒光素異硫氰酸鹽)反應而顯色。可由熒光顯微鏡(Nikon)得到顯微照片。
cGMP含量檢測取匯合的單層細胞加入待檢測制劑恒溫溫育10分鐘，然后，將細胞以冰冷的PBS洗滌2次，再加入0.5mL氫氧化鈉溶液(0.1mol/L)裂解細胞，隨后加入0.5mL鹽酸(0.1mol/L)中和檢驗溶液。3,000g離心3分鐘后，采用cGMP ELISA試劑盒檢測上清液中cGMP的含量。
Caspase-3活性檢測Caspase-3的活性可以通過Caspase-3比色檢測試劑盒(R&D System，Inc.，Minneapolis，Minnesota)進行檢測。細胞以待檢測制劑處理10小時后，以冰冷的PBS洗滌2次，隨后采用胰蛋白酶消化，然后800g離心5分鐘。將細胞沉淀重懸于預冷的Caspase-3比色檢測試劑盒中的裂解緩沖液中。冰浴10分鐘后，將裂解后的細胞勻漿在10,000g離心1分鐘，取上清液，即為用于測定Caspase-3活性的胞質提取物。
在一總體積為100μL的反應緩沖液(內含50μL上述的胞質提取物，及5μL取自試劑盒的DEVD-pNA)中完成蛋白分解反應，該反應混合物在37℃溫育1至2小時，然后利用所形成的對硝基苯胺采用ELISA讀數器在405nm進行定量測量。
細胞色素c釋放反應的檢測細胞經胰蛋白酶消化、800g離心10分鐘后，將細胞沉淀重懸于50μL的提取緩沖液(內含20mmol/L HEPES、pH7.5，10mmol/L的KCl、1.5mmol/LMgCl2、1mmol/L EDTA、1mmol/L EGTA、1mmol/L DTT、1mmol/L PMSF)中，冰浴3分鐘。細胞經30次手動勻漿，然后在4℃下15,000g離心15分鐘，取其中20μg蛋白質由15％ SDS-聚丙烯酰胺凝膠進行分離，然后使分離后的蛋白質轉移于PVDF膜上。將膜與抗細胞色素c的單克隆抗體共同溫育，然后將膜與抗小鼠的IgG共同溫育，則可檢測細胞色素c的表達情況。
Western blot分析將細胞暴露于待檢測制劑4小時(Bcl-2)或6小時(細胞色素c)后，以冰冷的PBS洗滌2次，然后加入100μL冰冷的裂解緩沖液(10mmol/L Tris-HCl、pH7.4，150mmol/LNaCl、1mmol/L EGTA、0.5mmol/LPMSF、10μg/mL aprotinin、l0μg/mL leupeptin、1％ Triton X-100)終止反應。對磷酸化的Akt的檢測來說，則溶解緩沖液還須包含1mmol/L Na3VO4、1mmol/L NaF、50mmol/L焦磷酸四鈉、10nmol/L的黑海綿酸(okadaic acid)與0.25％的去氧膽酸鈉。通過Bio-Rad蛋白質檢測法(Bio-Rad實驗室，CA，USA)測定蛋白含量。對于Western blot分析實驗來說，需將細胞裂解物(25μg/lane)在10-15％ SDS-聚丙烯酰胺凝膠上進行電泳，然后轉移至硝化纖維素膜上，然后將膜以抗Bcl-2單克隆抗體、或抗α-微管蛋白單克隆抗體、或抗磷酸化的Akt的多克隆抗體進行標記，最后將膜采用抗小鼠或抗兔的二抗進行顯影，如前所述(Guh et al.(1998)Eur J Pharmacol.359281-284)。采用增強型化學發光檢測試劑盒(ECL；Amersham International，Little Chalfont，U.K.)進行信號的檢測。
內毒素休克的誘導作用與組織學檢驗此試驗中，給小鼠(25-30g，ICR種系)腹腔內注射60mg/kg的LPS(溶于PBS)，在注射后的2小時與6小時后，以化合物3(懸浮于羧甲基纖維素)對小鼠進行口服給藥，且于注射LPS后每3至6小時監測其存活率。在組織學檢驗試驗中，將肺組織置于4％的多聚甲醛并以石蠟包埋，然后將包埋組織進行切片，切片厚度為6μm，使用蘇木精-伊紅染色，以顯微鏡觀察分析。
統計分析各組實驗的數據以mean±SEM表示，利用ANOVA檢驗進行數據的統計分析，然后進行t-試驗，p值小于0.05視為有顯著性差異。結果體外試驗首先檢驗了在培養的RASMCs中化合物3對硝基氫氰酸鈉(SNP)誘導的細胞凋亡的作用。MTT檢測法及TUNEL反應檢測的結果顯示，SNP(1mmol/L)會誘導細胞大量凋亡。然而，化合物3(30μmol/L)則可完全抑制SNP誘導的細胞凋亡。有趣地是，ODQ，一種可溶性鳥苷酸環化酶的抑制劑，對SNP誘導的細胞凋亡沒有影響，但顯著地逆轉了化合物3介導的抗凋亡反應(請參照表1)，該結果顯示可溶性鳥苷酸環化酶的活化與化合物3介導的抗凋亡作用相關，而該酶并未參與SNP誘導的細胞凋亡反應。
本研究亦檢測了細胞內cGMP的水平。單獨的化合物3可顯著地增加cGMP的合成(4.2±0.8fmol/孔；基準值2.3±0.3fmol/孔)。而且，SNP與化合物3聯合應用可以協同增加該環核苷酸的生成，可增加超過60倍(252.8±81.8fmol/孔)。然而，ODQ可顯著地抑制單獨的化合物3的作用(～基準值)以及SNP與化合物3聯合應用的作用(～21fmol/孔)。此外，采用MTT檢測方法，可穿透細胞的cGMP類似物-二丁基-cGMP可以顯著地逆轉SNP誘導的細胞凋亡(結果未顯示)。綜合而言，上述數據顯示SNP可誘導不依賴于cGMP的細胞凋亡反應，而化合物3通過cGMP依賴性信號傳導通路而抑制SNP的反應。
為檢測PI 3-激酶以及促分裂原活化的蛋白激酶(MAPK)是否與化合物3介導的抗細胞凋亡作用有關，在功能性檢測中采用其選擇性抑制劑。PI 3-激酶抑制劑—渥曼青霉素(wortmannin)以及促分裂原活化的蛋白激酶(MEK)抑制劑—PD98059可顯著地逆轉化合物3作用，此結果顯示PI 3-激酶的活化可能在化合物3誘導的抗凋亡作用中扮演著重要角色。
一般認為PI 3-激酶的脂質產物會以高親和性和專一性的方式與Akt/PKB的PH結構域進行結合，從而觸發細胞存活信號通路。在本研究中，采用Western blot方法檢測磷酸化的Akt的表達。結果顯示不論是單獨使用化合物3還是化合物3與SNP聯合使用都使得磷酸化的Akt的表達顯著增加。上述作用可被ODQ與渥曼青霉素顯著抑制，由此可推測化合物3誘導的PI 3-激酶的活化是cGMP合成的下游反應。
該研究還測定了SNP與化合物3對Bcl-2水平和細胞色素c釋放反應的影響。細胞暴露于SNP(1mmol/L)可造成Bcl-2表達的顯著下調以及細胞色素c向細胞質中的釋放。將細胞以化合物3處理可完全地抑制SNP造成的上述反應。然而，ODQ及渥曼青霉素可完全逆轉化合物3的抑制作用。這些結果顯示化合物3對于SNP造成的Bcl-2表達的下調和細胞色素c的釋放的抑制作用與化合物3對cGMP依賴性-PI 3-激酶相關的信號傳導通路的作用相關。
將細胞暴露于SNP(1mmol/L)后檢測細胞內caspase-3的活性。結果顯示SNP顯著地增加了RASMCs中的caspase-3的活性；然而，化合物3完全抑制了SNP誘導的該酶活性的增加。而且，化合物3介導的抑制作用也部份地且顯著地分別被ODQ及渥曼青霉素所逆轉。當對細胞凋亡百分比與caspase-3活性再深入分析其相關性時，可獲得正向線性回歸與0.980的相關系數(γ2值)，由此可以推測caspase-3活性的調節在SNP誘導的作用與化合物3的抗凋亡作用中扮演著決定性的角色。
本研究還檢測了化合物1-22對于SNP誘導的VSMCs培養細胞的凋亡的作用。16種化合物對SNP(1mmol/L)誘導的細胞凋亡具有抑制作用。其中一些化合物甚至可以完全終止SNP誘導的細胞凋亡。體內試驗為研究化合物3對于敗血癥的治療潛力，采用LPS誘發小鼠敗血癥死亡模型。給小鼠腹腔注射LPS(60mg/kg)可造成動物在10到28小時內的累積性死亡。然而，當給予LPS2小時后再給動物口服化合物3(10mg/kg)進行治療(即采用化合物3后治療(post-treatment)方式)可顯著地增加小鼠的存活率(

圖1)。此外，這些存活的小鼠在LPS處理后一個月仍然很有活力。
本實驗同時觀察了體內動物試驗的組織學檢查結果。對照組小鼠顯示完整的肺臟組織的組織學外觀。LPS處理后28小時，動物顯現損傷的血管以及肺臟組織中有大量的血液細胞溢出循環。然而，采用化合物3后治療的健康小鼠顯示出完整的血管且沒有血液細胞浸潤的現象。
血管平滑肌細胞(VSMC)的凋亡現象具有明顯的環境依存性。在動脈粥狀硬化癥及創傷后新生血管內膜形成時的VSMC細胞凋亡的現象已被進行了深入的研究(Mallat等，(1997)Circulation 96424-428；以及Newby與George(1996) Curr Opin Cardiol.11574-582)；然而，很少人關注此現象與敗血癥的關系。NO在細胞凋亡中的作用依細胞種類、細胞濃度、自由基環境，以及細胞的氧化還原狀態等而發生變化(Yabuki等，(1997)Free radical Res.27325-335；以及Filippov等，(1997)J Clin Invest.100942-948)。化合物3通過cGMP依賴性方式抑制SNP誘導的細胞凋亡作用，該結論基于以下觀察化合物3與SNP聯合使用能協同增加cGMP的合成；二丁基-cGMP可有效地摹擬化合物3介導的作用；以及ODQ可顯著逆轉化合物3的作用。然而，在化合物3介導的作用中仍有約20％對ODQ不產生反應。
推測NO誘導的細胞毒作用的機制包括粒線體呼吸鏈的失活、DNA損傷、以及Bcl-2下調/Bax上調等(Bolanos等，(1997)J Neurochem.682227-2240；以及Tamatani等，(1998)Cell Death Differ.5911-919)。如上所述，SNP可顯著誘導Bcl-2蛋白的下調，而非影響Bax的表達(數據未顯示)；它還可刺激細胞色素c釋放到細胞質，并能活化caspase-3的活性。這些數據顯示SNP介導的RASMCs細胞的凋亡機制中對Bcl-2/細胞色素c/caspase-3信號通路的調節。然而，化合物3幾乎完全抑制了SNP介導的細胞凋亡作用。而且，ODQ可顯著逆轉化合物3介導的反應，該作用顯示出化合物3是通過cGMP依賴性抗凋亡反應來發揮作用的。
目前推測環核苷酸合成的增加以及接下來PI 3-激酶的活化在抑制某些種類細胞的凋亡反應中扮演著重要角色(Webster & Anwer(1998)，Hepatology.271324-1331)。此外，已有報導指出在某些種類的細胞，如細胞因子活化的腎小球膜細胞，cGMP可能會通過NO調控p42/44 MAPK的活化(Callsen等(1998)，J Immunol.1614852-4858)。前面已顯示渥曼青霉素，但非PD98059，可逆轉化合物3介導的作用。而且，化合物3可明顯地誘導Akt的磷酸化，但該反應會被ODQ所抑制。這些結果顯示PI 3-激酶在化合物3應用后可作為sGC活化的下游作用因子，且牽涉抗細胞凋亡機制。相反，p42/44 MAPK通路對于化合物3介導的RASMCs的存活并不相關。有趣的是，即使沒有統計學上的顯著差異，單純的化合物3適度的增加了RASMCs的細胞數目(11％，表1)。ODQ與PD98059都能完全抑制化合物3誘導的細胞增殖，顯示sGC與p42/44 MAPK的活性參與其中。
本研究顯示出PKC活化在抗細胞凋亡中的作用。然而，數據顯示Ro-318220，一種選擇性PKC抑制物，對于化合物3介導的抗凋亡作用幾乎沒有影響(化合物3+SNP組細胞存活率，107.1±3.1％vs 100.6±5.5％，p＝0.32，n＝7)，此結果提示PKC活性與化合物3的作用無關。
此外，實驗結果顯示化合物3具有抑制LPS誘導的小鼠敗血癥死亡的作用，特別是當實驗采用化合物3后治療的方式進行時。數據顯示LPS處理小鼠的死亡率顯著降低。同時對肺臟組織的檢查充分顯示肺衰竭是敗血癥死亡的重要原因之一。組織學檢查結果顯示LPS處理后的動物表現出血管損傷以及肺組織中大量血細胞滲出循環。此外，以化合物3后治療的小鼠顯示完整的血管且無血細胞浸潤情形，顯示出正常的活性。
本研究也對化合物3的其它藥理學活性結果進行檢測。之前的研究指出，化合物3對于環氧酶活性沒有抑制作用(Ko等(1994)，Blood.844226-4233)；本研究亦顯示，在NR8383巨噬細胞中，化合物3對于LPS/干擾素γ誘導的TNFα釋放幾乎沒有抑制作用(18.5±1.2ng/mL；對照組15.5±1.3ng/mL，p＝0.13，n＝4)，并且對于由黃嘌呤/黃嘌呤氧化酶系統所產生的過氧化物陰離子對細胞色素c的還原反應幾乎沒有抑制作用(40±0.6％；對照組42.0±2.1％，p＝0.4，n＝4)。此外，又采用穩定自由基1，1-二苯基-2-苦味酸肼(1，1-diphenyl-2-picrylhydrazyl)對化合物3的自由基捕捉活性進行檢測。化合物3幾乎未顯示出自由基捕捉活性(數據未顯示)。在另一實驗中，對鼠源巨噬細胞RAW264.7以LPS(1μg/mL)刺激24小時后，可觀察到大量NO形成。然而，在本實驗中，化合物3并未影響LPS誘發的這種反應(53.4±12.3μmol/L 硝酸鹽；對照組68.8±13.4μmol/L亞硝酸鹽，P＝0.43，n＝4)。這些結果顯示化合物3對于抗炎、抗氧化、以及抗LPS誘導的NO生成等方面幾乎沒有作用，從而可排除這些作用對化合物3介導的動物存活率的影響。因此，基于以上討論，化合物3對于小鼠敗血癥死亡的作用中，抗細胞凋亡機制起到重要的作用。表1對硝基氫氰酸鈉(SNP)、化合物3、以及ODQ對于大鼠大動脈平滑肌細胞存活率的調控處理細胞存活率(％) n對照組100±06SNP 49.3±4.4*6化合物3 111.3±8.86SNP+化合物3 102.9±8.1+6ODQ 99.5±5.7 5ODQ+化合物3 96.1±4.2 7ODQ+SNP+化合物3 69.6±4.0#6數據以5到7個實驗的平均值±SEM表示，n代表獨立實驗的數目。*與對照組相比，P＜0.001；+與SNP組相比，P＜0.001；#與SNP+化合物3組相比，P＜0.01。其它實施例本文所披露的所有特征可以做任意組合。本文所披露之每一特征可以具有相同、等同、或相似的目的的替代性特征所取代。因此，除非特別說明，否則所披露的每一特征僅作為一般性相同或相似特征之一例示。
由上所述，任何本領域的技術人員可以很容易了解本發明的主要特征，并且在不脫離本發明之精神與范疇之內，可對本發明進行多種改變與修飾以適于各種應用或狀況。例如，構造與稠合的吡唑基化合物類似的化合物亦可以用于施行本發明。因此，其它實施例亦包含于本發明申請專利范圍之內。
權利要求
1.一種治療敗血癥的方法，該方法包括給予所需個體有效量的式(I)的稠合吡唑基化合物 其中A為H、C1～C6烷基、或 ；其中n為0、1、2、或3；Ar1、Ar2、及Ar3各自獨立地為苯基、吡啶基、噻吩基、呋喃基、或吡咯基；以及R1、R2、R3、R4、R5、及R6各自獨立地為XYZ；或R1與R2一起、或R3與R4一起、或R5與R6一起連接為O(CH2)1-6O；其中X為鍵或C1～C6烷基，Y為鍵、O、S、OC(O)、OC(O)(CH2)1-6C(O)O、C(O)O、C(O)S、C(O)NH、C(O)NC1～C6烷基、NH、或NC1-C6烷基，以及Z為H、鹵素、CN、NO2、或C1～C6烷基；條件是R3及R4中至少有一個不為H。
2.如權利要求1所述的治療敗血癥的方法，其中A為H。
3.如權利要求2所述的治療敗血癥的方法，其中Ar1為苯基。
4.如權利要求3所述的治療敗血癥的方法，其中Ar2為苯基。
5.如權利要求4所述的治療敗血癥的方法，其中R1與R2各為H。
6.如權利要求3所述的治療敗血癥的方法，其中Ar2為呋喃基。
7.如權利要求6所述的治療敗血癥的方法，其中R1與R2各為H。
8.如權利要求1所述的治療敗血癥的方法，其中A為
9.如權利要求8所述的治療敗血癥的方法，其中Ar1為苯基。
10.如權利要求9所述的治療敗血癥的方法，其中Ar2為苯基。
11.如權利要求10所述的治療敗血癥的方法，其中Ar3為苯基。
12.如權利要求11所述的治療敗血癥的方法，其中n為0或1。
13.如權利要求12所述的治療敗血癥的方法，其中R1、R2、R3、R4、R5、及R6中的一個為COOH、COO-C1～C6烷基、CH2OH、CN、NO2、或鹵素。
14.如權利要求9所述的治療敗血癥的方法，其中Ar2為呋喃基。
15.如權利要求14所述的治療敗血癥的方法，其中Ar3為苯基。
16.如權利要求15所述的治療敗血癥的方法，其中n為0或1。
17.如權利要求16所述的治療敗血癥的方法，其中R1、R2、R3、R4、R5、及R6中的一個為COOH、COO-C1～C6烷基、CH2OH、CN、NO2、或鹵素。
18.如權利要求9所述的治療敗血癥的方法，其中Ar3為苯基。
19.如權利要求9所述的治療敗血癥的方法，其中n為0或1。
20.如權利要求8所述的治療敗血癥的方法，其中Ar1為噻吩基。
21.如權利要求20所述的治療敗血癥的方法，其中Ar2為呋喃基。
22.如權利要求21所述的治療敗血癥的方法，其中Ar3為苯基。
23.如權利要求22所述的治療敗血癥的方法，其中n為0或1。
24.如權利要求23所述的治療敗血癥的方法，其中R1、R2、R3、R4、R5、及R6中的一個為COOH、COO-C1～C6烷基、CH2OH、CN、NO2、或鹵素。
25.如權利要求1所述的治療敗血癥的方法，其中該化合物為 或
26.一種如式(I)的化合物 其中A為H、C1～C6烷基、或 其中n為0、1、2或3；Ar1、Ar2、及Ar3各自獨立地為苯基、吡啶基、噻吩基、呋喃基、或吡咯基；以及R1、R2、R3、R4、R5、及R6各自獨立地為XYZ；其中X為鍵或C1～C6烷基，Y為鍵、O、S、OC(O)、OC(O)(CH2)1-6C(O)O、C(O)O、C(O)S、C(O)NH、C(O)NC1～C6烷基、NH、或NC1～C6烷基，以及Z為H、鹵素、CN、NO2、或C1～C6烷基；條件是R1與R2一起或R5與R6一起任意連接為O(CH2)1-6O；且進一步的條件是X必須為C1～C6烷基，Y必須為OC(O)(CH2)1-6C(O)O，以及在R3及R4之一中，Z必須為H或C1-C6烷基。
27.如權利要求26所述的化合物，其中A為
28.如權利要求27所述的化合物，其中Ar1為苯基。
29.如權利要求28所述的化合物，其中Ar2為呋喃基。
30.如權利要求29所述的化合物，其中Ar3為苯基。
31.如權利要求30所述的化合物，其中R1、R2、R5、及R6各為H。
32.如權利要求31所述的化合物，其中R3與R4中的一個為H。
33.如權利要求32所述的化合物，其中n為0或1。
34.如權利要求33所述的化合物，其中在R3與R4之一中，X為CH2，Y必須為OC(O)CH2CH2C(O)O，以及Z為H。
35.一種抑制血管細胞凋亡的方法，該方法包括給予所需個體有效量的式(I)的稠合吡唑基化合物 其中A為H、C1～C6烷基、或 ；其中n為0、1、2、或3；Ar1、Ar2、及Ar3各自獨立地為苯基、吡啶基、噻吩基、呋喃基、或吡咯基；以及R1、R2、R3、R4、R5、及R6各自獨立地為XYZ；或R1與R2一起、或R3與R4一起、或R5與R6一起連接為O(CH2)1-6O；其中X為鍵、或C1～C6烷基，Y為鍵、O、S、OC(O)、OC(O)(CH2)1-6C(O)O、C(O)O、C(O)S、C(O)NH、C(O)NC1～C6烷基、NH、或NC1～C6烷基、以及Z為H、鹵素、CN、NO2、或C1～C6烷基；條件是R3及R4中至少一個不為H。
全文摘要
本發明的特征為一種治療敗血癥的方法。該方法包括給予需要治療的個體一有效劑量的式(I)的稠合吡唑基化合物A為H、C
文檔編號A61K31/437GK1456154SQ0310300
公開日2003年11月19日 申請日期2003年1月27日 優先權日2002年1月25日
發明者鄧哲明, 潘秀玲, 顧記華, 郭盛助, 李芳裕 申請人:永信藥品工業股份有限公司