專利名稱：一組長效抗逆轉錄病毒的多肽及其制備方法和應用的制作方法
技術領域：
本發明涉及一種長效的抑制逆轉錄病毒融合的多肽。
背景技術：
美國發明專利，專利號為464933，公開了DP178多肽的638-673共36個氨基酸的多肽，這些多肽具有抗逆轉錄病毒的活性，特別是對HIV。盡管該發明中公開的抗病毒融合肽顯示出有效地抗逆轉錄病毒和/或抗融合活性，但是這些多肽存在體內血漿半衰期短的缺陷，這主要是由于血清清除快和肽酶和蛋白酶的作用。因而極大地降低了多肽的有效抗病毒活性。所以需要一種延長現有抗病毒和/或抗融合的多肽半衰期并能夠使多肽在體內維持更長久的抗病毒活性。

發明內容
本發明需要解決的技術問題之一是提供一組長效的抑制逆轉錄病毒融合的多肽。
本發明需要解決的技術問題之二是提供該多肽的制備方法。
本發明需要解決的技術問題之三是公開所述多肽的應用。
本發明的發明構思是這樣的人免疫缺陷病毒HIV-1對細胞的感染過程如下(1)病毒外殼糖蛋白gp120和細胞表面CD4的結合，CD4是細胞對HIV-1病毒的初級受體；(2)外殼糖蛋白(env)與輔助受體如CCR5和CXCR4的結合；(3)病毒外殼糖蛋白gp41構象的改變，形成一種發夾前體；(4)折疊形成一種能夠介導融合的中間構象，最后使得病毒與細胞膜融合并將病毒基因組導入目標細胞中。與細胞膜吸附的過程能夠被結合到病毒糖蛋白和人CD4的抑制劑所阻斷。
值得一提的是，HIV-1吸附過程能夠被抑制gp120與細胞CD4的結合的化合物以及其類似物所抑制。因為gp120和CD4相互作用是病毒感染的前提。而且，對這樣的化合物產生抗性的能力較低。
一系列研究表明，盡管N末端螺旋區的點突變會導致病毒外殼糖蛋白介導的膜融合的降低，但是并不影響gp120與gp41復合物的形成。這些突變蛋白的膜融合活性與突變位點的側鏈疏水性相關。表明gp41在膜融合過程中起決定作用。
gp41的病毒外區域是最保守的，其中包含兩個4-3疏水重復序列，可能與形成螺旋有關，N-端的4-3疏水重復序列緊接融合多肽，是膜融合所必需的；C-端的4-3疏水重復序列為穿膜區段。現階段，合成的多肽融合抑制劑大多針對這兩個重復區域。一種對應N-端重復序列的合成多肽在溶液中是高度螺旋化的，破壞螺旋結構的突變喪失了抗病毒活性。N-端重復序列中單一脯氨酸置換導致外殼糖蛋白完全喪失了膜融合的能力。上述結果表明gp41中兩個4-3疏水重復序列以及由其形成的螺旋化的螺旋結構是HIV-1外殼糖蛋白介導的膜融合的關鍵。DP178 gp41C-端的638-673序列，能夠特異性的和gp41N-端重復序列相互作用，抑制HIV-11外殼糖蛋白介導的膜融合。
gp41的病毒外區域突變研究表明gp41的C-端的638-673序列(YTSLIHSLIEESQNQQEKNEQELLELDKWASLWNWF)的保守性為沒有改變的氨基酸位點為L(8，23)，Q(16)，N(19)，W(35)高度保守的氨基酸位點為L(24，26，32)，Q(15)，E(20)，W(29，33)高度可變的氨基酸位點為S(3，7)，L(4)，E(10)其余為中度可變的氨基酸位點。
研究表明多肽的甲基化不但可以提高多肽對蛋白酶的穩定性，還可以提高多肽在體內的半衰期，提高其穿過細胞膜的能力。Fortana Haviv等發現亮丙瑞林，那發瑞林等多肽的氨基酸的甲基化可以提高多肽對胰凝乳蛋白酶的穩定性，并且Ser(4)的甲基化還可以提高多肽在體內的半衰期，Tyr(5)的甲基化可以降低多肽在體內的清除率。David J.Gordon等研究發現Amyloid的同系物Aβ16-22經過甲基化后，提高了對蛋白酶的穩定性。
本發明在設計時充分考慮了gp41的膜外區、穿膜區的特點，與DP178結合的特點，以及gp41的638-673序列中氨基酸的保守性，蛋白酶剪切位點(K，R，W，L，S，I)、在體內容易被攻擊的不穩定側鏈基團的基礎上設計了一系列甲基化修飾的多肽。經過多肽合成后，從中篩選到5條甲基化多肽能夠在體外抑制HIV和細胞膜的融合而且活性基本保持不變，這5條甲基化多肽分別在Ile(9)，Asn(14)，Lys(18，28)，Leu(4，8，26，32)，Ser(3，7，12，30)，Trp(33，35)等位點進行了N-甲基化修飾。
本發明公開的序號為1-5的多肽序列如下(序列中甲基化用(Me)表示，標在被甲基化的氨基酸之前)1、CH3CO-Tyr Thr(Me)Ser(Me)Leu Ile His(Me)Ser(Me)Leu Ile Glu Glu(Me)Ser GlnAsn Gln Gln Glu(Me)Lys Asn Glu Gln Glu Leu Leu Glu(Me)Leu Asp(Me)Lys(Me)TrpAla(Me)Ser Leu(Me)Trp Asn(Me)Trp Phe-NH22、CH3CO-Tyr Thr(Me)Ser Leu Ile His(Me)Ser(Me)Leu Ile Glu Glu(Me)Ser Gln AsnGln Gln Glu(Me)Lys Asn Glu Gln Glu Leu Leu Glu(Me)Leu Asp Lys(Me)Trp Ala(Me)Ser Leu(Me)Trp Asn(Me)Trp Phe-NH23、CH3CO-Tyr Thr(Me)Ser(Me)Leu Ile His(Me)Ser Leu Ile Glu Glu(Me)Ser Gln AsnGln Gln Glu Lys Asn Glu Gln Glu Leu Leu Glu Leu Asp(Me)Lys Trp Ala(Me)SerLeu(Me)Trp Asn Trp Phe-NH24、CH3CO-Tyr Thr(Me)Ser Leu Ile His(Me)Ser Leu(Me)Ile Glu Glu(Me)Ser Gln AsnGln Gln Glu Lys Asn Glu Gln Glu Leu Leu Glu Leu Asp(Me)Lys Trp Ala(Me)SerLeu Trp Asn Trp Phe-NH25、CH3CO-Tyr Thr Ser Leu Ile His(Me)Ser(Me)Leu Ile Glu Glu(Me)Ser Gln Asn GlnGln Glu Lys Asn Glu Gln Glu Leu Leu Glu Leu Asp(Me)Lys Trp Ala(Me)Ser Leu(Me)Trp Asn Trp Phe-NH2觀察體外細胞間的融合來檢測多肽的融合抑制活性。在沒有加多肽融合抑制劑時，表達HXB2外殼蛋白，tat和rev的中國倉鼠卵巢細胞和表達CD4和長末端重復序列的HeLa細胞(Hela-CD4-LTR-Beta-gal)可以融合。加入融合抑制劑后，抑制劑會阻斷上述兩種細胞的融合，試驗結果表明，本發明的融合抑制活性與DPA178接近。
比較本發明的公開的多肽和DP178對胰凝乳蛋白酶(t1/2)和胰蛋白酶(t1/2)的穩定性。檢測甲基化修飾后的多肽對胰凝乳蛋白酶(t1/2)和胰蛋白酶(t1/2)的穩定性。發現DP178對胰凝乳蛋白酶和胰蛋白酶都非常敏感，半衰期不到1分鐘。而經過甲基化修飾的多肽其半衰期有顯著提高，最長超過60分鐘。具體結果見下表DP178及本發明的的多肽用生物素標記后，每種成分經過靜脈注射到家兔體內2mg/kg，每隔六小時抽血檢測一次，用EDTA作為抗凝劑。血液經過離心分離后，通過ELISA檢測其在血清中的含量。實驗結果表明，經過甲基化修飾的多肽其體內半衰期比未修飾的DP178延長了20多倍。
本發明提供一組多肽。可方便地采用固相化學法制備或將編碼抗菌肽的基因克隆到載體上，然后進入宿主細胞中表達后獲得。
本發明公開的多肽在制備抗逆轉錄病毒融合的抑制劑中的應用，其中尤其是逆轉錄病毒HIV。該多肽在制備抗HIV的藥物中的應用，其特征在于所述的藥物包括權利要求1的多肽中的一種或一種以上，并混合有一種或一種以上醫藥上可接受的載體和添加劑。有希望成為新的長效抗HIV藥物。


圖1為表示病毒外殼糖蛋白gp41C-端的638-673序列的保守性。
圖2為1號多肽的質譜圖。
具體實施例方式
實施例1 多肽的固相化學合成制備及分離純化制備本發明公開的多肽序列1號-5號，同時制備DP178。
本實施例采用固相化學法合成，所用儀器為美國應用生物系統公司生產的Pioneer多肽合成儀。合成的多肽經過高濃度的TFA剪切后，用反向柱純化，純化后的多肽通過質譜鑒定。具體試驗步驟如下1、多肽的制備(以制備0.1mmol量的為例)以下所有制備多肽的試劑均購于美國應用生物系統公司。
制備從C端到N端逐個進行，由合成儀自動控制。首先稱量0.1mmol的結合了第一個氨基酸即Phe的樹脂(購于美國應用生物系統公司)，裝柱，再用20％哌啶二甲基甲酰胺溶液脫保護，二甲基甲酰胺清洗，9-笏甲氧羰基(Fmoc)保護的游離氨基酸溶解于碳二亞胺(DCC)，羥基苯并三唑(HOBt)/二異丙基乙基胺(DIPEA)，溶解后的溶液在柱上循環偶合反應30分鐘，二甲基甲酰胺清洗重復以上脫保護到偶合反應步驟直到制備結束(具體操作步驟見pioneer多肽合成儀操作指南)。
制備后的多肽經如下步驟剪切取下反應后的樹脂，加入B型剪切液(88％三氟乙酸，5％苯酚，5％水，2％三異丙基硅烷)，室溫反應2小時，過濾，濾出液中加入10倍體積的預冷無水乙醚，4000轉/分鐘離心10分鐘，收集沉淀并室溫干燥。
2、多肽純化稱量一定量干燥后的多肽，溶于0.1％三氟乙酸，樣品處理后經反向柱分離(洗脫液為含80％乙氰的0.1％三氟乙酸)，收集洗脫峰。
實施例2 多肽的鑒定如圖2所示，制備的多肽1號經過質譜分析，在質譜圖中顯示的分子量為4660。由多肽序列計算出的理論值為4660。以下為計算結果931.9×5＝4660。證明合成的修飾多肽為設計的1號多肽。鑒定合格的多肽產物備用。
實施例3本發明公開的多肽與DP178抑制融合活性的比較本方法是通過觀察體外細胞間的融合來檢測多肽的融合抑制活性。在沒有加多肽融合抑制劑時，表達HXB2外殼蛋白，tat和rev的中國倉鼠卵巢細胞和表達CD4和長末端重復序列的HeLa細胞(Hela-CD4-LTR-Beta-gal)可以融合。加入融合抑制劑后，抑制劑會阻斷上述兩種細胞的融合。
具體試驗過程如下將表達HXB2外殼蛋白，tat和rev的中國倉鼠卵巢細胞以3×104CFU的接種量和表達CD4和Hela-CD4-LTR-Beta-gal細胞5×104CFU的接種量共培養，然后加入不同濃度的多肽抑制劑。多肽溶解于DMSO中，培養基中的DMSO的終濃度為1％，多肽濃度通過6M GuHCl中280nm的吸收值來定量。加入多肽抑制劑后培養20小時后，加入X-Gal染色。IC50通過以下公式計算y＝k/(1+[peptide]/IC50)，其中y有融合的數目，k為計數值。
表1本發明公開的多肽與DP178融合抑制活性(IC50)的比較


其中1-5分別表示本發明的序號為1-5條甲基化序列實施例四 對蛋白酶的穩定性比較本方法比較了本發明的公開的多肽和DP178對胰凝乳蛋白酶(t1/2)和胰蛋白酶(t1/2)的穩定性。檢測甲基化修飾后的多肽對胰凝乳蛋白酶(t1/2)和胰蛋白酶(t1/2)的穩定性。發現DP178對胰凝乳蛋白酶和胰蛋白酶都非常敏感，半衰期不到1分鐘。而經過甲基化修飾的多肽其半衰期有顯著提高，最長超過60分鐘。
具體結果見下表表2本發明公開的多肽與DP178對蛋白酶的穩定性的比較

其中1-5分別表示本發明序號為1-5的多肽。
Ct1/2(min)為胰凝乳蛋白酶作用后的半衰期，It1/2(min)為胰蛋白酶作用后的半衰期實施例五 體內半衰期的比較DP178及本發明的的多肽用生物素標記后，每種成分經過靜脈注射到家兔體內2mg/kg，每隔六小時抽血檢測一次，用EDTA作為抗凝劑。血液經過離心分離后，通過ELISA檢測其在血清中的含量。首先將mAb 2F5以20ng/孔的量加到96孔板中包被，然后將離心后的血清經過一定比例稀釋后，室溫孵育過夜，后加入標記辣根過氧化物酶的親和素，最后經過染色檢測血清中含有的多肽的量。實驗結果表明，經過甲基化修飾的多肽其體內半衰期比未修飾的DP178延長了20多倍。檢測結果如下表3表3本發明公開的多肽和DP178家兔體內半衰期的比較

其中1-5分別表示本發明序號為1-5的多肽t1/2為藥物體內半衰期。
序列表<110>上海高科聯合生物技術研發有限公司<120>一組長效抗逆轉錄病毒的多肽及其制備方法和應用<130>SPI048590<160>5<170>Patent In Version 2.1<210>1<211>36<212>PRT<213>人工序列<220>
<221>CHAIN<400>1Tyr Thr MeSer MeLeu Ile His MeSer MeLeu Ile Glu Glu MeSer Gln Asn Gln5 1015Gln Glu MeLys Asn Glu Gln Glu Leu Leu Glu MeLeu Asp MeLys MeTrp Ala20 2530MeSer Leu MeTrp Asn MeTrp Phe35<210>2<211>36<212>PRT<213>人工序列<220>
<221>CHAIN<400>2Tyr Thr MeSer Leu Ile His MeSer MeLeu Ile Glu Glu MeSer Gln Asn Gln5 1015Gln Glu MeLys Asn Glu Gln Glu Leu Leu Glu MeLeu Asp Lys MeTrp Ala20 25 30MeSer Leu MeTrp Asn MeTrp Phe35<210>3<211>36<212>PRT<213>人工序列
<220>
<221>CHAIN<400>3Tvr Thr MeSer MeLeu Ile His MeSer Leu Ile Glu Glu MeSer Gln Asn Gln51015Gln Glu Lys Asn Glu Gln Glu Leu Leu Glu Leu Asp MeLys Trp Ala20 2530MeSer Leu MeTrp Asn Trp Phe35<210>4<211>36<212>PRT<213>人工序列<220>
<221>CHAIN<400>4Tvr Thr MeSer Leu Ile His MeSer Leu MeIle Glu Glu MeSer Gln Asn Gln5 1015Gln Glu Lys Asn Glu Gln Glu Leu Leu Glu Leu Asp MeLys Trp Ala20 2530MeSer Leu Trp Asn Trp Phe35<210>5<211>36<212>PRT<213>人工序列<220>
<221>CHAIN<400>5Tvr Thr Ser Leu Ile His MeSer MeLeu Ile Glu Glu MeSer Gln Asn Gln5 1015Gln Glu Lys Asn Glu Gln Glu Leu Leu Glu Leu Asp MeLys Trp Ala20 2530MeSer Leu MeTrp Asn Trp Phe3權利要求
1.一組多肽，其特征在于所述多肽具有序列表中所列的氨基酸序列。
2.一種如權利要求1或2所述多肽的制備方法，其特征在于，所述的制備方法為固相化學法合成。
3.一種如權利要求1或2所述多肽的制備方法，其特征在于，所述的制備方法為將編碼所述多肽的基因克隆到載體上，然后進入宿主細胞中表達后獲得所述多肽。
4.根據權利要求3所述多肽的制備方法，其特征在于，所述及的載體是質粒或病毒中的一種。
5.根據權利要求3所述多肽的制備方法，其特征在于，所述及的宿主細胞是原核細胞。
6.根據權利要求5所述多肽的制備方法，其特征在于，所述及的原核細胞包括大腸桿菌、枯草芽孢桿菌。
7.根據權利要求3所述多肽的制備方法，其特征在于所述及的宿主細胞是真核細胞。
8.一種如權利要求1所述多肽在制備抗逆轉錄病毒融合的抑制劑中的應用。
9.根據權利要求8所述的多肽，其特征在于，所述及的逆轉錄病毒為HIV。
10.多肽在制備抗HIV的藥物中的應用，其特征在于所述的藥物包括權利要求1的多肽中的一種或一種以上，并混合有一種或一種以上醫藥上可接受的載體和添加劑。
全文摘要
本發明公開了一組經過修飾的多肽，是一種長效的抗逆轉錄病毒融合的抑制劑。本發明還公開了該組多肽的制備方法，可以用固相化學法合成，也可以通過基因工程方法表達獲得。本發明公開的多肽對蛋白酶的穩定性提高了近60倍，在動物體內的半衰期延長了近30倍，而其融合抑制活性沒有顯著降低，可以用于制備新的長效抗逆轉錄病毒尤其是HIV的藥物。
文檔編號A61P31/00GK1781940SQ200410084728
公開日2006年6月7日 申請日期2004年12月1日 優先權日2004年12月1日
發明者黃青山, 李國棟 申請人:上海高科聯合生物技術研發有限公司