專利名稱：Hsd11基因增加腫瘤細胞對多種凋亡誘導因子的敏感性的制作方法
技術領域：
本發明專利為HSD11基因的新功能，HSD11基因在調節腫瘤細胞對多種凋亡誘導因子的敏感性方面具有重要作用。本發明涉及生物醫學高技術中的新方法、新基因、新蛋白的開發與應用領域。
背景技術：
據世界衛生組織報道，1996年全球58億人口中因癌癥死亡約有630萬人，約占總死亡人數的12％，其中近60％死于肺癌、胃癌、乳腺癌、結腸直腸癌、口腔癌、肝癌、宮頸癌及食管癌，是僅次于心血管疾病的第二大死因。從1996年以來全球每年新確診的腫瘤患者均在1030萬人以上，到1999年底全球腫瘤患者總數已逾4000萬人。世界衛生組織2001年報道，世界癌癥發病率和死亡率比1990年上升了22％，今后20年還將上升大約50％。據我國衛生部統計，近年來我國每年新增腫瘤患者約250萬人，每年接受治療的腫瘤患者在600萬人以上。因此腫瘤是一類嚴重危害人類健康的重大疾病。
目前常見的腫瘤治療方法有三種手術、放療和化療，其中手術治療是直接切除腫瘤組織，而放療和化療的主要原理就是采用放射性射線或化學藥物促進腫瘤細胞發生凋亡，因此深入了解細胞凋亡的調控機制對于腫瘤的治療具有重要意義。目前放療和化療的分子靶標大多為DNA，通過抑制DNA的合成、阻礙細胞分裂從而誘使腫瘤細胞發生凋亡。隨著對細胞凋亡機制的了解的深入，一些新的基因已經逐步成為腫瘤治療的新靶標。例如，p53蛋白在誘導細胞凋亡中發揮重要作用，過量表達p53基因可以直接導致細胞發生凋亡，以該基因為靶基因的基因治療發展很快，其中以腺病毒攜帶p53臨床進展最為迅速，全球至少有5個方案進入III期臨床試驗，我國科學家研究的Ad-P53已上市，成為世界上第一個上市的基因治療藥物。除了直接誘導凋亡的基因以外，很多與凋亡相關的基因都可以調節細胞對各種凋亡刺激的敏感性，這其中包括許多目前廣泛使用的化療藥物。因此這些基因也有可能成為腫瘤治療的新靶標，而深入了解這些基因的功能對于腫瘤的治療具有潛在的應用價值。
發明目的本發明發現了HSD11基因的一個新功能HSD11基因可以調節腫瘤細胞對多種凋亡刺激的敏感性，而誘導腫瘤細胞發生凋亡是放療和化療的主要原理之一，因而HSD11基因有可能成為腫瘤治療的靶標。
內容與要求采用分子克隆等技術得到HSD11基因的cDNA序列并將HSD11基因的全長編碼區克隆至真核表達載體；采用電穿孔方法將HSD11的真核表達載體轉入Hela細胞中并讓HSD11基因過量表達，采用紫外線照射以及TNFα、TRAIL和staurosporine等化學物質處理細胞時發現，過量表達HSD11基因的Hela細胞對這些凋亡刺激更敏感，轉染HSD11基因的細胞在相同的凋亡刺激時比對照細胞的凋亡比例高。另一方面，采用特異針對HSD11基因的RNA干擾質粒抑制HSD11基因的表達導致Hela細胞拮抗紫外線照射以及TNFα、TRAIL和staurosporine等化學物質誘導的凋亡，在相同的凋亡刺激條件下，抑制HSD11基因表達的Hela細胞的凋亡比例比對照細胞的凋亡比例低。深入研究HSD11基因調節細胞對凋亡刺激的敏感性的機制時發現，HSD11主要通過調節Bcl-xL的表達水平來調節細胞對凋亡刺激的敏感性。因此本發明要求HSD11基因在細胞凋亡調控方面的新功能以及HSD11基因在腫瘤治療方面的應用價值。
該發明達到的技術指標為1.克隆HSD11基因的全長序列并將HSD11基因的編碼區克隆到pcDNA-FLAG真核表達載體中。
2.構建一個針對HSD11基因的RNA干擾載體ps-HSD11，并證明該載體可以有效地抑制Hela細胞內HSD11基因的表達(圖1)。
3.流式細胞分析結果表明，過量表達HSD11基因增加Hela細胞對TNFα誘導的細胞凋亡的敏感性(圖2)。
4.過量表達HSD11基因增加Hela細胞對紫外線照射以及TNFα、TRAIL和staurosporine等化學物質誘導的凋亡的敏感性(圖3)。
5.抑制HSD11基因的表達導致Hela細胞可以拮抗紫外線照射以及TNFα、TRAIL和staurosporine等化學物質誘導的凋亡(圖4)。
6.檢測細胞中的caspases和PARP的表達水平進一步證明HSD11基因增加Hela細胞對TNFα誘導的凋亡的敏感性(圖5)。
7.檢測細胞中的caspases和PARP的表達水平進一步證明HSD11基因增加Hela細胞對紫外線誘導的凋亡的敏感性(圖6)。
8.檢測細胞中的caspases和PARP的表達水平進一步證明抑制HSD11基因的表達導致Hela細胞可以拮抗紫外線照射誘導的凋亡(圖7)。
9.檢測細胞中的Bcl-2家族蛋白的表達水平表明過量表達HSD11降低Hela細胞中Bcl-xL的表達水平，而抑制Hela細胞中的HSD11基因的表達則有助于使Hela在TNFα刺激后維持Bcl-xL的表達水平(圖8)。
10.檢測細胞中的Bcl-2家族蛋白的表達水平表明過量表達HSD11降低Hela細胞中Bcl-xL的表達水平，而抑制Hela細胞中的HSD11基因的表達則有助于使Hela在紫外照射后維持Bcl-xL的表達水平(圖9，圖10)。


圖1.將我們構建的RNA干擾質粒ps-HSD11與對照質粒ps-NC分別轉染Hela細胞，轉染后24小時收獲細胞的蛋白質，Western blot檢測細胞中HSD11基因以及對照基因β-actin的表達水平，結果表明ps-HSD11可以有效地抑制Hela細胞內HSD11基因的表達。
圖2.將轉染pcDNA-HSD11或轉染pcDNA-FLAG的Hela細胞分別采用100ng/ml的TNFα處理12小時或不處理作為對照，流式細胞儀分析不同細胞的凋亡水平，結果表明過量表達HSD11基因增加Hela細胞對TNFα誘導的細胞凋亡的敏感性。
圖3.將轉染pcDNA-HSD11或轉染pcDNA-FLAG的Hela細胞分別采用150J/m2的紫外線處理或者分別采用100ng/ml的TNFα、50ng/ml的TRAIL、0.2μM的staurosporine處理12小時，采用流式細胞儀分析不同細胞的凋亡水平，三次實驗的結果統計分析后得到圖3，過量表達HSD11基因增加Hela細胞對紫外線照射以及TNFα、TRAIL和staurosporine等化學物質誘導的凋亡的敏感性。
圖4.將轉染RNA干擾質粒ps-HSD11或轉染對照質粒ps-NC的Hela細胞分別采用150J/m2的紫外線處理或者分別采用100ng/ml的TNFα、50ng/ml的TRAIL、0.2μM的staurosporine處理12小時，采用流式細胞儀分析不同細胞的凋亡水平，三次實驗的結果統計分析后得到圖4，抑制HSD11基因的表達導致Hela細胞可以拮抗紫外線照射以及TNFα、TRAIL和staurosporine等化學物質誘導的凋亡。
圖5.將轉染ps-HSD11(泳道1和4)、pcDNA-FLAG(泳道2和5)或pcDNA-HSD11(泳道3和6)的Hela細胞分別采用100ng/ml的TNFα處理12小時或不處理作為對照，在沒有采用TNFα刺激時，過量表達HSD11基因、抑制內源HSD11基因表達或者對照細胞中三種caspases都沒有被活化，而PARP也保持完整狀態，三種細胞之間沒有明顯差別(泳道4-6)。采用TNFα刺激細胞后，三種caspases都出現不同程度活化，其中RNA干擾抑制HSD11基因表達的細胞三種caspases活化程度最低(泳道1)，而與之相反，過量表達HSD11基因的Hela細胞中三種caspase活化程度最高(泳道3)。與上述結果對應，抑制HSD11基因表達的細胞中PARP斷裂程度最低，表明細胞凋亡程度最低(泳道1)；而過量表達HSD11基因的細胞的PARP斷裂程度最高，表明細胞凋亡程度高(泳道3)。這一結果進一步證明了HSD11基因增加了Hela細胞對TNFα刺激的凋亡的敏感性。
圖6.將轉染pcDNA-HSD11質粒或轉染pcDNA-FLAG對照質粒的Hela細胞在采用150J/m2紫外處理，然后檢測恢復不同時間的細胞中caspases以及PARP的表達情況。結果表明，caspase-3與caspase-9在紫外照射后恢復培養4h時就開始斷裂激活，而caspase-8激活的程度比較低。在各個時間點，過量表達HSD11基因的細胞中caspases的激活程度都高于轉染對照質粒的細胞。與此相似，過量表達HSD11基因的細胞中PARP的斷裂程度也高于轉染對照質粒的細胞，這些結果證明過量表達HSD11基因導致Hela細胞對紫外刺激誘導的凋亡更敏感。
圖7.將轉染ps-HSD11質粒或轉染ps-NC對照質粒的Hela細胞在采用150J/m2紫外處理，然后檢測恢復不同時間的細胞中caspases以及PARP的表達情況。結果表明，抑制HSD11基因的表達抑制了紫外照射引起的caspase-3、caspase-8和caspase-9的激活，同時抑制HSD11基因的表達抑制了紫外照射引起的PARP的斷裂，這表明采用RNA干擾抑制HSD11基因的表達拮抗紫外照射引起的細胞凋亡。
圖8.將轉染ps-HSD11(泳道1和4)、pcDNA-FLAG(泳道2和5)或pcDNA-HSD11(泳道3和6)的Hela細胞分別采用100ng/ml的TNFα處理12小時或不處理作為對照，檢測了轉染不同質粒的Hela細胞在TNFα刺激前后Bcl-2家族的四種分子的變化。結果表明，轉染不同質粒的Hela細胞的Bcl-2、Bax與Bak沒有顯著差別，采用TNFα處理三種細胞后Bcl-2、Bax與Bak的表達也沒有明顯改變。與此不同，在TNFα處理之前，轉染pcDNA-HSD11質粒的Hela細胞中的Bcl-xL表達水平比轉染pcDNA-FLAG對照質粒低(泳道6)，而轉染RNA干擾質粒沒有顯著改變Bcl-xL的表達(泳道4，5)；采用TNFα處理后，三種細胞的Bcl-xL表達水平都有所下降，但是過量表達HSD11基因的細胞的Bcl-xL表達水平最低(泳道3)，而抑制內源HSD11基因表達的細胞Bcl-xL表達水平只有少量降低，基本維持不變(泳道1)。以上結果表明過量表達HSD11基因可以降低Bcl-xL的表達水平，而抑制HSD11基因的表達有助于細胞在接受TNFα刺激時維持Bcl-xL的表達水平。
圖9.將轉染pcDNA-HSD11質粒或轉染pcDNA-FLAG對照質粒的Hela細胞在采用150J/m2紫外處理，然后檢測恢復不同時間的細胞中Bcl-2家族蛋白質的表達水平。結果表明，過量表達HSD11基因并沒有改變Bcl-2、Bax與Bak的表達水平，而且紫外處理后這些蛋白的表達水平也沒有顯著改變。但是過量表達HSD11降低了Hela細胞中Bcl-xL的表達水平，紫外處理后，Hela細胞中Bcl-xL的表達水平隨時間的延長而不斷下降，而過量表達HSD11的細胞中的Bcl-xL的表達在同一時間點都比對照細胞低，上述結果表明過量表達HSD11基因降低了Bcl-xL的表達水平。
圖10.將轉染ps-HSD11質粒或轉染ps-NC對照質粒的Hela細胞在采用150J/m2紫外處理，然后檢測恢復不同時間的細胞中Bcl-2家族蛋白質的表達水平。結果表明，轉染ps-HSD11沒有改變細胞中的Bcl-2、Bax與Bak的表達水平，而且紫外處理后這些蛋白的表達水平也沒有顯著改變。另外，抑制內源HSD11基因的表達也沒有改變正常細胞中Bcl-xL的表達水平，但是采用紫外線處理細胞后，對照細胞中Bcl-xL的表達水平隨恢復培養時間的延長而降低，而抑制HSD11基因表達的細胞中Bcl-xL的表達水平只有微弱降低，這表明抑制HSD11基因的表達可以使Hela細胞在紫外線處理時維持Bcl-xL的表達水平。
具體實施例1.Hela細胞的培養實驗所用Hela細胞采用RPMI 1640培養基進行培養(補加0.03％谷氨酰胺，0.2％NaHCO3，0.59％Hepes(pH7.2)，10％熱滅活(56℃，30min)的胎牛血清及雙抗(青霉素和鏈霉素各100單位/mL)，培養條件為5％的CO2，培養溫度37℃。
2.Hela細胞的處理a.電轉收集細胞，用無血清無雙抗的培養基洗滌細胞一次后，用適當體積的無血清無雙抗的培養基重懸細胞進行細胞計數，離心后以1×107個細胞/500μL體積重懸。在標記好的Eppendorf管中加入以適當比例混合的質粒，再加入500μL細胞，加樣器吹打混勻，轉入冰浴預冷的電轉杯中，冰浴10min。250V，950μF電擊(Bio-Rad)，結束后于冰上放置5min，然后補加完全培養基轉入培養瓶中繼續培養，依據實驗需要在24-48小時后處理或收集細胞。b.凋亡誘導處理將轉染不同質粒的細胞分別采用不同的凋亡誘導劑進行處理，其中紫外線的劑量為150J/m2或300J/m2，TNFα的濃度為100ng/ml、TRAIL的濃度為50ng/ml、staurosporine的濃度為0.2μM，三種藥物的處理時間均為12小時，3.Hela細胞凋亡水平的檢測收獲1×106采用不同條件處理過的Hela細胞，用PBS至少洗兩遍，加250μL PBS重懸細胞，加750μL無水乙醇，4℃放置至少16h。檢測前，離心沉淀細胞，用PBS洗兩遍，再500μL PBS重懸，然后加入25μL濃度為1mg/mL碘化丙啶(PI)和2μL初始濃度為10mg/mL的RNase A，混勻后37℃放置30min后，即可進行流式細胞儀檢測。統計圖中的結果均為三次獨立實驗結果統計后的結果。
4.Western blot檢測HSD11基因以及凋亡調控中重要基因的表達水平a.細胞總蛋白的收集室溫，1,000rpm離心收集2×106細胞，預冷的PBS洗滌二次，4℃2,000rpm離心5min。細胞沉淀重懸于100μL冰預冷的RIPA緩沖液(50mM HEPES，pH7.5，150mM NaCl，2mM EDTA，2mM EGTA，1％TritonX-100，50mM NaF，5mM Sodium Pyriphosphate，50mM Sodium β-glycerophosphate，1mM SodiumOrtho-vanadate，1mM DTT， 1mM PMSF，10μg/mL Leupeptin，10μg/mL Aprotinin)。4℃在旋轉儀上混勻1h后，12,000rpm離心10min。取上清分裝于-70℃儲存或者測定濃度之后進行下一步操作。b.樣品的電泳分離及轉移樣品在濃縮膠中以80V，分離膠中以120V電壓(Bio-Rad系統)電泳至溴酚藍距凝膠底部時停止電泳。戴上手套，用2張Whatman 3M濾紙剝下凝膠，用剪刀將膠和濾紙修剪成合適大小，然后將膠和其中一張濾紙泡在電轉緩沖液(39mM甘氨酸，48mMTris堿，30％甲醇)至少5min以上，將另一張濾紙作模板，剪一張同樣大小的硝酸纖維素膜，然后一同放入電轉緩沖液浸泡片刻，稍后安裝電轉裝置按負極/多孔墊片/濾紙/凝膠/硝酸纖維素膜/濾紙/多孔墊片/正極，把整個結合體浸泡于含電轉緩沖液的電泳槽中，由負極向正極方向進行電轉(注先趕盡各層之間可能存在的氣泡)，0.22A 4℃電轉1.2-1.3h。將硝酸纖維素膜取下，Fast Green(0.04％Fast Green溶于20％甲醇和5％冰醋酸)染色，雙蒸水漂洗，選取所需分子量之間的區帶進行反應。分子量依其Rf值在標準曲線上查出。c.免疫反應以及顯色反應用溶于1×TBST(20mM Tris-HCl，pH7.5，500mM NaCl，0.05％Tween20)的5％脫脂奶粉37℃搖晃封閉1h，TBST緩沖液洗5min×3次。先用一抗100μg/mL，1∶1000稀釋在1％BSA/TBS-T中，4℃在rotator上反應過夜或室溫反應1h；TBS-T緩沖液洗10min×3次(抗體加入1％BSA和0.1％NaN3-20℃保存，可以重復使用)。再用HRP標記的二抗IgG，1∶2000稀釋在封閉液中，室溫反應1h。TBS-T緩沖液洗10min×3，滴干膜。將膜放在一張保鮮膜上，用手拿住保鮮膜的兩端，預先將ECL反應液A和B按1∶1體積混勻，加入ECL反應混合液(50μL/cm2)，讓混合液鋪滿整張膜，反應1min。滴干膜，用另一張保鮮膜將膜包好，于暗室中壓上X光片，曝光時間30sec-5min不等，之后顯影，定影。
權利要求
1.本發明涉及一個一個名為HSD11的基因，該基因的特征為在GenBank中的注冊號AY652615，cDNA的長度為1055堿基對，編碼蛋白質長度為312個氨基酸。
2.根據權利要求1所述之基因，其特征在于在人宮頸癌細胞Hela細胞中過量表達HSD11基因增加了Hela細胞對紫外線照射以及腫瘤壞死因子α(TNFα)、腫瘤壞死因子相關的凋亡誘導配體(TRAIL)和staurosporine等化學物質誘導的細胞凋亡的敏感性。
3.根據權利要求1、2所述之基因，其特征在于采用RNA干擾技術抑制Hela細胞中HSD11基因的表達能夠導致Hela細胞拮抗紫外線照射以及TNFα、TRAIL和staurosporine等化學物質誘導的細胞凋亡。
4.根據權利要求1、2、3所述之基因及其功能，其特征在于HSD11基因可以增強腫瘤細胞對射線以及化學藥物誘導的凋亡的敏感性，因而可以與腫瘤的放射性療法和化學療法結合用于癌癥患者的治療。
全文摘要
本發明涉及一個名為HSD11的基因在細胞凋亡調控上的功能以及該基因在腫瘤治療上的價值。內容包括在人宮頸癌細胞Hela細胞中過量表達HSD11基因增加了Hela細胞對紫外線照射以及TNFα、TRAIL和staurosporine等化學物質誘導的細胞凋亡的敏感性；采用RNA干擾技術抑制Hela細胞中HSD11基因的表達能夠導致Hela細胞拮抗紫外線照射以及TNFα、TRAIL和staurosporine等化學物質誘導的細胞凋亡。由于HSD11基因可以增強腫瘤細胞對射線以及化學藥物誘導的凋亡的敏感性，所以HSD11基因具有與腫瘤的放射性療法和化學療法結合用于癌癥患者治療的潛力。
文檔編號A61P35/00GK1869219SQ20051007106
公開日2006年11月29日 申請日期2005年5月24日 優先權日2005年5月24日
發明者蔡從利, 繆時英, 王琳芳 申請人:中國醫學科學院基礎醫學研究所