專利名稱：多組分生物學轉運系統的制作方法
交叉引用相關的申請本申請是2001年7月20日提交的美國申請09/910,432的部分繼續申請案，所述美國申請09/910,432要求2000年7月21日提交的美國臨時申請系列號60/220,244的優先權，其內容在此以其全文引用作參考。
關于在聯邦資助建立的研究和開發下進行的發明的權利的聲明不適用發明背景基因遞送系統廣泛地可分為兩類病毒和非病毒遞送系統。病毒系統具有較大的毒性風險并在臨床試驗中已導致許多并發癥和死亡。非病毒系統雖然遠不如病毒途徑有效，但卻提供了使應用適合于提高特異性和潛在地減少毒性的可能性。非病毒策略廣義上可分為基于質脂體或基于非質脂體的兩類。本發明提供的策略可用于任何已存在的非病毒方法，因此此處將描述所有的非病毒方法。
最簡單的非病毒系統是直接的DNA的遞送。由于DNA的負電荷的原因，實際上只有非常少量的DNA進入細胞并且大部分被降解掉。事實上，在該策略中無核靶向性序列的DNA不進入細胞核。常規地，使用其它因素來增強基因/產物(DNA、RNA或更近年來的蛋白治療劑)遞送的效率，通過機械作用例如電穿孔、超聲、“基因槍”和直接的顯微注射，或通過電荷中和作用和使用試劑例如磷酸鈣、聚賴氨酸和脂質體制劑的化學作用來增強效率。在后面的策略中，電荷中和作用已顯示增加非特異性效率，超過單獨的脂質體制劑的化學/機械作用的效率數倍。基于這些和類似的結果，許多人已斷定，為了有效地被細胞吸收，需要對DNA和RNA進行電荷中和作用，因為DNA的負電荷基本上阻止了運輸，除了通過隨后的溶酶體融合進行胞漿溶解(通過加入其他試劑逃避降解)外。大多數轉染劑實際上使用超過DNA凈負電荷2至4倍的比例的過量正電荷。所得的帶正電荷的雜合體通過離子相互作用結合帶負電荷的細胞表面蛋白聚糖并且顯著地增強了隨后的吸收作用。一些轉染劑似乎具有細胞向性(cell tropism)，最可能的原因是更有效地靶向特定蛋白聚糖的空間和電荷模式，所述蛋白聚糖在細胞型特異性模式方面是不同的。即使使用合適的試劑(即，正確的向性)，相對于病毒策略，單獨的或和脂質體組合的電荷中和作用的效率仍然十分低下。因此，人們已鑒定了許多有助于復合物有效地進入細胞和通過任何內溶酶體(endolysosome)階段的肽和肽片段。幾種這樣的轉運因子甚至使得能夠有效地進入細胞核。在一個方法中，將轉運因子直接連接至目的治療物(小藥物、基因、蛋白等)。該方法要求產生、純化和檢測附著至轉運因子的新藥。在許多情況下，這些雜合體構成了新藥，從而需要完全的檢測。這樣的方法導致顯著增加的風險和花費?？蛇x擇地，許多策略僅僅將試劑非特異性地(或甚至在表面上特異性地)混合入作為藥物/DNA/因子的載體的脂質體制劑。盡管在效率方面改進了直接或更簡單的用藥方案(modality)，但這些方法仍然效率低下(相對于病毒)并且遠比簡單的非病毒策略更有毒性。該低效率的部分原因是由于較弱的細胞核轉運作用。因此，策略已逐漸發展成向上述復合物中加入作為治療因子雜交體的部分或脂質體混合物的部分的細胞核轉運信號。其他改進已包括試圖降低DNA/RNA/因子的降解。
上面提出的基本策略中的最重要的改進已包括和治療因子一起的特異性配體或其他靶向試劑。這些策略提供了大大降低非特異性毒性和顯著提高效率的可能性，特別是當和上述的效能試劑組合時。然而，目前的策略基于和單個載體的共價連接，從而必需特異性的合成(以確保在替代方案的量度上的空間考量不會使單個因子比其他因子占優--即，確保各效能因子和各成像部分和各靶向部分存在于主鏈上)。這事實上使得許多特異性的結構不可能發生(例如，唾液酸基-lewis X和針對表面抗原的Fab片段，因為在大多數方案中，空間限制阻止一種結構或另一種結構的有效結合，從而反過來干擾了效能因子)。盡管在概念上很有前景，但這些方法代表了花費昂貴、產量極低(通過合成的話)的方法，并且還未證實能解決該問題。
很明顯的是，對于非病毒基因和因子遞送的發展中的每一個階段，已經遇到了問題，在下一階段，通過增加復雜度來解決。每一次的改進代表了超越前面標準的增加的步驟。然而，從患者護理的角度來看所述增加的復雜性帶來了風險，從生產的角度來看帶來了低效率和高成本。這些障礙已大大地降低了對這些在另外的情況下很有前景的潛在的治療法的熱情。
需要的是可廣泛地用于各種這樣的治療劑或藥妝劑(cosmeceutical agent)的組合物的新方法和組合物，所述治療劑或藥妝劑的組合物可被靶向或成像，從而使遞送最大限度地到達特定位置。令人驚奇的是，本發明提供了這樣的組合物和方法。
本發明還涉及這樣的制劑，所述制劑用于蛋白例如胰島素的透皮遞送，還有用于更大的治療和診斷物質的透皮遞送，所述物質是例如具有50,000和更高的分子量的物質，其包括蛋白例如肉毒毒素(botulinum toxin)或其他具有生物活性的試劑例如，胰島素、肉毒毒素、不會治療性地改變血糖水平的治療性蛋白、基于核酸的試劑、非蛋白非核酸治療劑例如某些抗真菌劑或可選擇地用于免疫的試劑。當使用術語“治療劑”或“具有生物活性的蛋白”時，本發明明確地排除這樣的抗體片段，即所述抗體片段除了只結合特異性的抗原外不具有生物活性。然而，因為適合于免疫的抗原具有其他生物活性例如產生免疫應答，因此這些仍包括在本發明的合適的方面。此外，本發明也包括這樣的試劑，即該試劑通過結合特異性的抗原，從而阻斷配體的結合或改變抗原的構象而具有生物活性或治療功效。
肉毒毒素(也稱作肉毒桿菌毒素或肉毒神經毒素)是由革蘭氏陽性細菌肉毒梭菌(Clostridium botulinum)產生的神經毒素。其通過阻止synoptic傳遞或穿過神經肌肉接頭的乙酰膽堿的釋放來使肌肉產生麻痹，其也被認為以其他的方式作用。其作用基本上阻斷了通常導致肌肉痙攣或收縮的信號，導致麻痹或導致腺體的分泌或過量分泌例如多汗癥(hyperhidrosis)或痤瘡。
肉毒毒素被分為八種血清學上相關但不同的神經毒素。其中，七種可導致麻痹，即肉毒神經毒素血清型A、B、C、D、E、F和G。通過和類型特異性抗體的中和作用來區分這些類型中的每一類型。各類型可以是天然發生的，可以是生產的重組體或通過基因工程產生的變體例如蛋白融合體。但是，對于所有這七種天然發生的活性肉毒毒素血清型或其重組體形式，肉毒毒素蛋白分子的分子量大約為150kD。因為通過細菌釋放，所以肉毒毒素是包含和相關非毒素蛋白在一起的150kD肉毒毒素蛋白分子的復合物。肉毒梭菌可產生900kD、500kD和300kD形式的A型肉毒毒素復合物。B型和C型肉毒毒毒只有表觀700kD或500kD的復合物產生。D型肉毒毒素可以300kD和500kD的復合物形式產生。E型和F型肉毒毒素只以大約300kD復合物的形式產生。據認為復合物(即，分子量大于大約150kD)含有非毒素血凝素蛋白以及非毒素和非毒性非血凝素蛋白。這兩種非毒素蛋白(其和肉毒毒素分子一起組成相關的神經毒素復合物)用于為肉毒毒素分子提供對抗變性的穩定性和當毒素被攝入時提供抗消化酸的保護性。此外，更大的(大于大約150kD分子量)的肉毒毒素復合物可能導致減緩肉毒毒素從肉毒毒素復合物的肌肉注射位點的擴散速度。
肉毒毒素的不同血清型在其作用的動物種類和在其引起的麻痹嚴重度和持續時間上是不同的。例如，如以在大鼠中產生的麻痹率估量，已確定A型肉毒毒素比B型肉毒毒素強500倍。此外，已確定B型肉毒毒素在480U/kg的劑量(大約是靈長類動物對于A型的LD50的12倍)下在靈長類動物中是無毒的。由于肉毒毒素的分子大小和分子結構的原因，其不能穿過角質層和多層底層皮膚結構。
A型肉毒毒素據認為是已知的對人致死性最強的天然的生物學試劑。在土壤中可發現肉毒梭菌的孢子，其可在未恰當滅菌的和封閉的食物容器中生長。細菌的攝入可導致肉毒中毒，其可以是致命的。但同時，肉毒毒素的肌肉麻痹性作用已被用于治療作用。肉毒毒素的受控施用已用于提供肌肉麻痹來治療病癥，例如，特征在于過度興奮的骨骼肌的神經肌肉病癥。已用肉毒毒素治療的病癥包括偏側面肌痙攣、成人發生的痙攣性斜頸(adult onset spasmodic torticollis)、肛裂、眼瞼痙攣、腦癱、cervical dystonia、偏頭痛、斜視、temperomandibular joint disorder和各種類型的肌肉痙攣和抽搐。更近以來，肉毒毒素的肌肉麻痹性作用已被用于治療性應用和化妝品面部應用例如皺紋、眉間紋(frown lines)和面部肌肉痙攣或抽搐造成的其他結果的治療。
肉毒中毒，由于系統性肉毒毒素暴露產生的特征性綜合癥狀，自古以來就在歐洲存在。在1895年，Emile P.van Ermengem第一次從生腌豬肉中分離出厭氧性產孢子桿菌，該生腌豬肉獲自在比利時死于肉毒中毒的豬的死后的組織。Van Ermengem發現所述疾病是由他稱為肉毒芽孢桿菌(Bacillus botulinus)產生的細胞外毒素引起的(VanErmengem，Z Hyyg Infektionskr，261-56；Rev Infect(1897))。1922年該名稱改為肉毒梭菌。名稱梭菌用于反映微生物的厭氧特性，也反映其形態學特征(Carruthers和Carruthers，Can JOphthalmol，31389-400(1996))。在1920年代，在其他食物中毒暴發后分離了A型肉毒毒素的粗提物形式。University of California，San Francisco的Dr.Herman Sommer進行了第一次純化神經毒素的嘗試(Borodic等，Ophthalmic Plast Recostr Surg，754-60(1991))。1946年，Dr.Edward J.Schantz和其同事分離了以晶體形式存在的神經毒素(Schantz等人，InJankovi J，Hallet M(Eds)Therapy with Botulinum Toxin，New York，NYMarcel Dekker，41-49(1994))。到了1949年，Burgen和其同事能夠證明肉毒毒素阻斷通過神經肌肉接點的沖動(Burgen等人，J Physiol，10910-24(1949))。Allan B.Scott在1973第一次在猴子中使用肉毒毒素A(BTX-A)。Scott證實持續3個月的可逆的眼肌麻痹(Lamanna，Science，130763-772(1959))。此后很快地，報導了BTX-A成功地在人中治療了斜視、眼瞼痙攣、和痙攣性斜頸(Baron等人，InBaron EJ，Peterson LR，Finegold SM(Eds)，Bailey&ScottsDiagnostic Microbiology，St.Louis，MOMosby Year Book，504-523(1994)；Carruthers和Carruthers，Adv Dermatol，12325-348(1997)；Markowitz，InStrickland GT(Eds)HuntersTropical Medicine，第7版，PhiladelphiaW.B.Saunders，441-444(1991))。在1986年，Jean和Alastair Carruthers，由眼外科醫生和皮膚科醫生組成的夫妻團隊，開始發展肉毒毒素-A(BTX-A)的化妝品用途，用于眉間區域中和運動相關的皺紋的治療(Schantz和Scott，In Lewis GE(Ed)Biomedical Aspects of Botulinum，NewYorkAcademic Press，143-150(1981))。Carruthers使用BTX-A治療皺紋在1992年導致其的關于該方法的開創性出版物問世(Schantz和Scott，In Lewis GE(Ed)Biomedical Aspects ofBotulinum，New YorkAcademic Press，143-150(1981))。到了1994年，相同的組報導了關于治療臉上其他運動相關的皺紋的經驗(Scott，Ophthalmol，871044-1049(1980))。這導致化妝用的BTX-A治療法的問世。
皮膚保護身體的器官免受外界環境的威脅并充當恒溫器以維持身體的溫度。其由幾個不同的層構成，各層具有特化的功能。主要的層包括表皮、真皮和皮下組織。表皮是覆在真皮上面的上皮細胞的層化層，真皮由結締組織構成。表皮和真皮都進一步由皮下組織(脂肪組織內層)支持。
表皮，皮膚的最上層，只有0.1至1.5毫米厚(Inlander，Skin，New York，NYPeople′s Medical Society，1-7(1998))。其由角質形成細胞構成并且基于其分化的狀態分為幾層。表皮可進一步分為角質層和由粒狀melphigian以及基底細胞組成的活表皮層。角質層是吸濕的并且按重量計算需要至少10％的水分以維持其彈性和柔軟性。吸濕性部分歸因于角蛋白的保持水分的能力。角質層失去其柔軟性和彈性時，其變得粗糙易碎，導致干性膚質。
正好位于表皮下面的真皮為1.5至4毫米厚。其是皮膚的三層中最厚的一層。此外，真皮也包含大多數皮膚的結構，包括汗腺和脂腺(其通過在皮膚稱為毛孔或粉刺的開口分泌物質)、毛囊、神經末梢和血管及淋巴管(Inlander，Skin，New York，NYPeople′s MedicalSociety，1-7(1998))。然而，真皮的主要成分是膠原和彈性蛋白。
皮下組織是皮膚的最深層。其充當保持體溫的絕熱器和保護器官的減震器(Inlander，Skin，New York，NYPeople′s Medical Society，1-7(1998))。另外，皮下組織也貯存作為能源蘊藏的脂肪。皮膚的pH一般在5和6之間。該酸性是由于存在來自皮脂腺分泌物的兩性氨基酸、乳酸和脂肪酸酸造成的。術語“酸性保護膜”是指皮膚的大多數區域上存在可溶于水的物質。皮膚的緩沖能力部分歸因于貯藏在皮膚角質層中的這些分泌物。
皺紋，老化證據標志中的一個標志，可以是由生物化學、組織學和生理學變化造成的，所述變化是從環境的破壞中積累的(Benedetto，International Journal of Dermatology，38641-655(1999))。此外，存在可導致面部皺紋的特征性折痕、折皺和摺痕的其他次要因素(Stegman等人，The Skin of the Aging Face CosmeticDermatological Surgery，第2版，St.Louis，MOMosby Year Book5-15(1990))。這些次要因素包括重力的恒定拉力、對皮膚的經常性和恒定性定位壓力(即，在睡眠期間)，和由面部肌肉的收縮產生的反復的面部活動(Stegman等人，The Skin of the Aging FaceCosmetic Dermatological Surgery，第2版，St.Louis，MOMosbyYear Book5-15(1990))。為了潛在地減緩一些老化的跡象，使用了不同的技術。這些技術從含有α羥酸和維生素A的面部保濕液到手術方法和神經毒素的注射。
皮膚的一個基本功能是為潛在地對正常內穩態有害的水分和物質的轉運提供屏障。沒有堅韌的、半透性的皮膚，身體將很快脫水。皮膚幫助防止有害物質進入身體。盡管大多數物質不能滲透過屏障，但已發展了許多策略來選擇性地增加皮膚的透性并獲得不同程度的成功。
因為BTX不能有效地透過皮膚，為了提供治療有效量的BTX，目前必需將毒素注射入皮膚。美國食品和藥品管理局已批準了用于這樣的治療皺紋的方法，現在市售用于該治療的BTX產品。在這些治療中，通過受到謹慎控制或監控的注射來施用肉毒毒素，在治療部位上產生大的毒素源。然而，這樣的治療可能是不舒適的并且一般伴隨有一些疼痛。
因為肉毒毒素的局部施用的無痛性質、更大的可覆蓋的治療表面積、配制具有更高比活性的純毒素的能力、減少的對應用肉毒桿菌治療劑的培訓、更少的起作用所必需的劑量和不需要大量的毒素來達到治療性臨床結果，所以其提供了更安全和更想要的可選擇的治療法。
由于例如減少患者的不適感的潛能，治療劑至血液中的直接施用和便于監控遞送(通過使用特殊建造的設備和/或使用控釋制劑和技術進行監控)的有利因素的原因，其他治療劑的透皮施用也是極其吸引人的領域。想要舒適地施用的一種物質是胰島素，其在許多情況下仍然必需通過注射(包括自我注射)施用。施用的簡易性對更大的蛋白例如肉毒毒素也是有利的。不容易穿過皮膚但顯著小于胰島素或具有不同的物理化學性質的其他藥劑從而在具有或不具有其他材料幫助該轉移的情況下具有不同的穿過皮膚的速率和能力。各藥劑和協助轉移的材料的其他相互作用對于各藥劑來說是獨特的。
發明概述在一個方面，本發明提供了這樣的組合物，其包含下列物質的非共價復合物a)帶正電荷的主鏈；和b)至少兩個選自下列的成員i)具有數個附著的成像部分，或可選擇地數個帶負電荷的成像部分的第一帶負電荷的主鏈；ii)具有數個附著的靶向部分，或可選擇地數個帶負電荷的靶向部分的第二帶負電荷的主鏈；iii)至少一個選自RNA、DNA、核酶、經修飾的寡核苷酸和編碼選擇的轉基因的cDNA的成員；iv)編碼至少一個駐留因子(persistence factor)的DNA；和v)具有數個附著的生物學試劑或帶負電荷的生物學試劑的第三帶負電荷的主鏈。
其中復合物攜帶凈正電荷和選自i)、ii)、iii)或v)的成員中的至少一個成員。
生物學試劑，在本發明的該方面，可以是治療劑或藥妝劑。當使用術語“治療劑”或“生物活性蛋白”時，本發明明確地排除了只結合特異性的抗原但不具有其它生物活性的抗體片段。然而，因為適合于免疫的抗原具有其他生物活性例如產生免疫應答，因此這些仍屬于本發明的適當的方面。此外，本發明包含通過結合特異性的抗原，從而阻斷配體結合或改變抗原的構象而具有生物活性或治療效果的試劑?？蛇x擇地，候選試劑可用于在體內確定在這些非共價復合物中的效率。
在另一方面，本發明提供了這樣的組合物，該組合物包含帶正電荷的主鏈和至少一個選自RNA、DNA、核酶、經修飾的寡核苷酸和編碼選擇的轉基因的cDNA的核酸成員的非共價復合物，所述主鏈具有至少一個附著的效能基團。
在另一方面，本發明提供了在受試者中將生物學試劑遞送至細胞表面的方法，所述方法包括給所述受試者施用上述組合物。
在另一方面，本發明提供了用于制備藥物或藥妝組合物(cosmeceutical composition)的方法，所述方法包括將帶正電荷的主鏈成分和至少兩個選自下列的成員與藥物或藥妝可接受的載體組合形成具有凈正電荷的非共價復合物，前提是所述成員中的至少一個選自i)、ii)、iii)或v)
i)具有數個附著的成像部分，或可選擇地數個帶負電荷的成像部分的第一帶負電荷的主鏈；ii)具有數個附著的靶向部分，或可選擇地數個帶負電荷的靶向部分的第二帶負電荷的主鏈；iiii)至少一個選自RNA、DNA、核酶、經修飾的寡核苷酸和編碼選擇的轉基因的cDNA的成員；iv)編碼至少一個駐留因子的DNA；和v)具有數個附著的生物學試劑或藥妝試劑，或帶負電荷的生物學藥劑或藥妝試劑的第三帶負電荷的主鏈；在另一方面，本發明提供了用于配制藥物或藥妝遞送組合物的試劑盒，所述試劑盒包括帶正電荷的主鏈成分和至少兩種選自上述i)組至v)組的成分，以及制備所述遞送組合物的說明書。
在另一方面，本發明涉及這樣的組合物，該組合物包含具有生物活性的試劑例如胰島素、肉毒毒素、不會治療性地改變血糖水平的其他蛋白、基于核酸的試劑、非蛋白非核酸治療劑例如某些抗真菌劑或可選擇地用于免疫的試劑，以及這樣的載體，即所述載體包括具有此處描述的附著的帶正電荷的分支或“效能”基團的主鏈的帶正電荷的載體。當使用術語“治療劑”或“生物活性蛋白”時，本發明明確地排除了只結合特異性的抗原但不具有其它生物活性的抗體片段。然而，因為適合用于免疫的抗原具有其他生物活性例如產生免疫應答，因此這些仍屬于本發明的適當的方面。此外，本發明包含通過結合特異性的抗原，從而阻斷配體結合或改變抗原的構象而具有生物活性或治療效果的試劑。所述具有生物活性的試劑優選地是胰島素、肉毒毒素(BTX)、用于免疫的抗原或某些抗真菌劑。合適的抗真菌劑包括，例如，兩性霉素B、氟康唑、氟胞嘧啶、依曲康唑、酮康唑、克霉唑、益康唑、灰黃霉素、咪康唑、制霉菌素、環吡酮等。最優選的帶正電荷的載體是鏈較短的或鏈長度中等的帶正電荷的多肽或帶正電荷的非肽聚合物，例如，聚烯化亞胺。當具有生物活性的試劑是肉毒毒素時，本發明還涉及用于產生生物學效應的方法例如通過局部使用(優選地對需要該治療的受試者或患者的皮膚使用)含有有效量的肉毒毒素的組合物來進行肌肉麻痹、減少分泌過多或出汗、治療神經疼痛或偏頭痛、減輕肌肉痙攣、預防或減輕痤瘡、或減輕或增強免疫應答。本發明也涉及用于產生美容和/或化妝效果的方法，例如通過給臉部局部使用肉毒毒素而不是通過注射入臉部肌肉來發揮作用。當具有生物活性的試劑是胰島素時，本發明涉及通過對受試者的皮膚或上皮施用有效量的這樣的組合物來將胰島素透皮遞送入受試者的方法，所述組合物包含胰島素或胰島素和帶正電荷的主鏈的組合物。下面的蛋白具有廣泛不同的表面和物理化學性質，所述蛋白與該相同試劑和本發明的載體的復合物相比，明顯地一般不能穿過皮膚或上皮從而是使該蛋白在降低血糖上不具有治療效果，這通常使得不能確定提供胰島素的透皮遞送的技術是否對任何其他蛋白具有陽性結果。然而，本發明的載體令人相當吃驚地能夠提供這樣的其他蛋白(包括，例如肉毒毒素)的透皮遞送，如此處所描述的，所述載體具有這樣的帶正電荷的主鏈，所述主鏈具有帶正電荷的分支基團。使用檢測法例如實施例描述的檢測法可容易鑒定適合特定蛋白的透皮遞送的特定載體。這樣的蛋白可以，例如，是具有分子量超過50,000kD或低于20,000kD的大蛋白。如此處所用的，詞“治療”在血糖的意義上是指血糖水平上的降低，該降低足以在例如糖尿病患者中減輕高血糖癥的急性癥狀或體征。在本發明的所有方面，載體和具有生物活性的試劑之間的結合是通過非共價相互作用結合的，其可包括，例如，離子相互作用、氫鍵、范德瓦爾斯力或其組合。在本發明的某些方面，明確地排除能夠獲得血糖的治療性改變的治療性蛋白的透皮遞送。如此處所用的，適合用于免疫的抗原性試劑可以是不會治療性地改變血糖水平的基于蛋白的抗原、非蛋白非核酸試劑或其雜合體。然而，編碼抗原的核酸明確地不適合用于本發明的組合物。因此，所包括的試劑是適合用于免疫的抗原自身。合適的抗原包括，例如，環境試劑、病原體或生物危害物質(biohazard)的抗原。合適的試劑優選地包括，例如，和肉毒中毒、瘧疾、狂犬病、炭疽、結核病相關的抗原，或和兒童免疫例如B型肝炎、白喉、百日咳、破傷風、b型嗜血桿菌流行性感冒、滅活的脊髓灰質炎病毒、麻疹、腮腺炎、風疹、水痘、肺炎球菌屬、A型肝炎和流感的免疫相關的抗原。
帶正電荷的載體或具有其帶正電荷的分支基團的主鏈，如此處所描述的，其自身為新的化合物，并形成本發明的另一方面。
本發明也提供了制備藥物或藥妝組合物的方法，該方法包括組合載體和具有生物活性的試劑，所述載體包含帶正電荷的多肽或帶正電荷的非肽聚合物例如長鏈聚烯化亞胺、所述多肽或非肽聚合物具有此處描述的帶正電荷的分支基團或“效能”基團，所述具有生物活性的試劑是例如，胰島素、肉毒毒素、不會治療性地改變血糖水平的治療性蛋白、基于核酸的試劑、非蛋白非核酸治療劑例如某些抗真菌劑或可選擇地用于免疫的試劑。本發明也提供了用于制備或配制包含載體和治療性物質的此等組合物的試劑盒、和生產可用的制劑所需的其它產品或可用于生產這樣的制劑的預混劑。這樣的試劑盒可由施藥器(applicator)或用于使用本發明的組合物或其組分以及方法的其他設備組成。如此處所用的，“設備”可以是指例如用于遞送或混合的儀器或施藥器或形成或使用本發明的組合物和方法的其他制備技術。
本發明也包括用于透皮施用具有生物活性的試劑的設備，所述試劑是例如胰島素、肉毒毒素、不會治療性改變血糖水平的治療性蛋白、基于核酸的試劑、非蛋白非核酸治療劑例如某些抗真菌劑或可選擇地組合物中所包含的用于免疫的試劑，在一個實施方案中，所述組合物包含這樣的載體和剛剛提到的治療劑，所述載體包括優選地從短鏈至中等鏈長度的帶正電荷的多肽或更長鏈的具有此處所定義的帶正電荷的分支基團或“效能”基團的非肽聚合載體。這些設備在結構上可以如皮膚貼劑一樣簡單，或可以是更復雜的設備，包括用于分配和監控組合物分配的工具和任選地用于在一個或多個方面監控受試者的狀況的工具，包括監控受試者和正被分配的物質的反應。在本發明的所有方面，載體和具有生物活性的試劑之間的結合是通過非共價相互作用結合的，該相互作用可包括，例如，離子相互作用、氫鍵、范德瓦爾斯力或其組合。
可選擇地，所述設備可只包含治療性的具有生物活性的試劑例如，胰島素、肉毒毒素、不會治療性地改變血糖水平的治療性蛋白、基于核酸的試劑、非蛋白非核酸治療劑例如某些抗真菌劑或可選擇地用于免疫的試劑，可以分開的方式將所述載體用于皮膚。因此，本發明也包含這樣的試劑盒，其包含通過皮膚分配藥物的設備和含有帶正電荷的載體或主鏈并適合用于受試者的皮膚或上皮的材料。
一般地，本發明也包含用于給需要其的受試者或患者施用具有生物活性的試劑的方法，所述試劑是例如，胰島素、肉毒毒素、不會治療性地改變血糖水平的治療性蛋白、基于核酸的試劑、非蛋白非核酸治療劑例如某些抗真菌劑或可選擇地用于免疫的試劑，該方法一般包括施用和帶正電荷的多肽或非多肽聚合物例如聚烯化亞胺一起的有效量的所述具有生物活性的試劑，所述聚烯化亞胺具有此處描述的帶正電荷的分支基團。“和……一起”是指以組合方式將兩種成分-具有生物活性的試劑和帶正電荷的載體-一起施用，該方法可包括將其在組合物中混合，然后再將組合物給受試者施用，或將其分開施用，但以使其一起作用，從而提供有效量的具有生物活性的試劑的必需遞送的方式分開施用。例如，可首先將含有帶正電荷的載體的組合物用于受試者的皮膚，然后使用含有具有生物活性的試劑的皮膚貼劑或其他裝置。
本發明也涉及給上皮細胞施用具有生物活性的試劑的方法，所述試劑是例如，胰島素、肉毒毒素、不會治療性地改變血糖水平的治療性蛋白、基于核酸的試劑、非蛋白非核酸治療劑例如某些抗真菌劑或可選擇地如此處所定義的用于免疫的試劑，所述上皮細胞包括除了皮膚上皮細胞外的上皮細胞，例如，眼上皮細胞或腸胃系統的細胞。
附圖概述

圖1表示用于本發明的組分的示意圖。
圖2表示本發明的幾個實施方案的示意圖。
圖3-4表示含有如實施例2中所描述的大腸桿菌β半乳糖苷酶的轉基因的質粒的透皮遞送的結果。
圖5表示含有如實施例3中所描述的大腸桿菌β半乳糖苷酶的轉基因的質粒的透皮遞送的結果。
圖6表示含有如實施例4中所描述的大腸桿菌β半乳糖苷酶的轉基因的質粒的透皮遞送的結果。
圖7表示含有如實施例5中所描述的肉毒毒素的透皮遞送的結果。
圖8是實施例6中所描述的肉毒毒素的透皮遞送的結果的照片。
圖9是這樣的兩種不同視野和不同放大倍數(圖框a和b 10X對圖框c和d 40X的放大倍數)的照片描述，其描述了實施例9的成像復合物遵從具有熒光光學成像試劑(圖框b和d)的黑色素瘤色素細胞的明視野分布(圖框a和c)而分布。
發明描述總述本發明提供了成像試劑、基因或其他治療劑的選擇性、持久性的遞送的基于組分的系統。可通過在bedside制劑中設計想要的組分來選擇組合物的單個性狀。此外，在一個方面，在分開的帶負電荷的主鏈上提供成像部分和特異性靶向部分，所述主鏈可與帶正電的主鏈形成非共價離子復合物。通過將這些組分置于帶負電荷的主鏈上，本發明避免了如其他策略(所述策略增加了復雜性和成本，以及將效能降低至這樣的水平，即由于空間限制的原因還沒有報導過成功的組合)所采用的將組分附著至帶正電的主鏈上的精確位置上。
在另一方面，通過單獨地使用某些帶正電荷的載體可透皮遞送某些物質，而無需帶負電的主鏈的參與。在這些情況下，所述物質和其衍生物具有足夠的負電荷和本發明的帶正電荷的載體非共價結合。術語“足夠的”該意義上是指可通過例如顆粒尺寸或功能性分光光度學上的變化(和單獨的組分相比)來確定的結合。
圖1提供了對本發明的進一步理解。在該圖中，組分顯示為(1)具有附著的帶正電荷的基團(也稱作效能基團，如附著至加黑的條塊的加黑的環所示)的固體主鏈，例如(Gly)n1-(Arg)n2(其中下標n1是從3至大約5的整數，下標n2是從大約7至大約17的奇整數)或TAT結構域；(2)具有附著的成像部分(附著至淺色的條塊的空心三角形)的短的帶負電荷的主鏈；(3)具有附著的靶向試劑和/或治療劑(附著至淺色的條塊的空心圓)的短的帶負電荷的主鏈；(4)寡核苷酸、RNA、DNA或cDNA(淺色的交叉影線的條塊)；和(5)編碼駐留因子的DNA(暗交叉影線條塊)。圖2舉例說明多組分組合物的各種示例，其中所述基團描述于圖1中。例如，在圖2中，舉例說明第一多組分組合物，其中帶正電荷的主鏈和成像組分、靶向組分、寡核苷酸以及駐留因子結合。
舉例說明被設計用于診斷/預后成像的第二多組分組合物。在該組合物中，帶正電荷的主鏈和成像組分以及靶向組分結合在一起。最后，舉例說明用于基因遞送的第三多組分系統。在該系統中，在帶正電荷的主鏈、靶向組分、目的基因和編碼駐留因子的DNA之間形成復合物。本發明，在下面將更全面地描述，提供了許多用于治療和診斷程序的額外的組合物。
實施方案的描述組合物基于上述內容，本發明在一個方面提供了包含下列物質的非共價復合物的組合物a)帶正電荷的主鏈；和b)至少兩個選自下列的成員i)具有數個附著的成像部分或可選擇地數個帶負電荷的成像部分的第一帶負電荷的主鏈；ii)具有數個附著的靶向試劑或可選擇地數個帶負電荷的靶向部分的第二帶負電荷的主鏈；
iii)至少一個選自RNA、DNA、核酶、經修飾的寡核苷酸和編碼選擇的轉基因的cDNA的成員；iv)編碼至少一個駐留因子的DNA；和v)具有數個附著的生物學試劑或帶負電荷的生物學試劑的第三帶負電荷的主鏈；其中所述復合物攜帶凈正電荷和至少一個選自i)、ii)、iii)或v)的成員。
在一組實施方案中，所述組合物包含至少三個選自組i)至v)的成員。在另一組實施方案中，所述組合物包含來自i)、ii)、iii)和iv)組的每一個組中的至少一個成員。在另一組實施方案中，所述組合物包含來自i)和ii)組的每一個組中的至少一個成員。在另一組實施方案中，所述組合物包含來自ii)、iii)和iv)組的每一組中的至少一個成員。
優選地，帶正電荷的主鏈的長度是來自b)組的成員的組合長度的大約1至4倍?？蛇x擇地，所述帶正荷的主鏈的電荷是b)組的成員的組合電荷的大約1至4倍。在一些實施方案中，電荷密度是均勻的并且長度和電荷比率近似相等。可基于組分的分子研究或可從組分的質量來確定大小對大小(長度)的比率。
“帶正電荷的”是指載體在至少一些溶液相條件下，更優選地在一些生理可相容的條件下具有正電荷。更確切地，此處所用的“帶正電荷的”是指所述基團含有在所有pH條件都帶電荷的官能團，例如季胺，或含有可在某些溶液相條件下例如pH發生變化的條件下獲得正電荷的官能團，在該情況下是伯胺。優選地，此處所用的“帶正電荷的”是指具有在生理可相容條件下和陰離子結合的形為的基團。對于本領域技術人員而言很明顯的是具有多個帶正電荷的部分的聚合物不必是同聚物。對于本領域技術人員而言，帶正電荷的部分的其他示例在現有技術中是熟知的并且可容易地使用。本發明中描述的其自身不具有治療活性的帶正電荷的載體是已在例如此處描述的組合物和方法中使用的新的化合物。因此，在本發明的另一方面，我們詳細描述了這些新的化合物，其包括包含這樣的帶正電荷的主鏈和其自身不具治療性生物活性的任何載體，所述主鏈具有此處描述的附著的帶正電荷的分支基團。當使用術語“治療劑”或“具有生物活性的蛋白”時，本發明明確地排除了只結合特異性的抗原但不具有其它生物活性的抗體片段。然而，因為適合于免疫的抗原具有其他生物活性例如產生免疫應答，因此這些仍屬于本發明的適當的方面。此外，本發明包含通過結合特異性的抗原，從而阻斷配體結合或改變抗原的構象而具有生物活性或治療效果的試劑。
在另一個實施方案中，本發明在一個方面提供了這樣的組合物，該組合物包含具有生物活性的試劑，例如，胰島素、肉毒毒素、不會治療性地改變血糖水平的治療性蛋白、基于核酸的試劑、非蛋白非核酸治療劑例如某些抗真菌劑或可選擇地用于免疫的試劑，以及包含帶正電荷的主鏈例如帶正電荷的多肽或非肽聚合物的載體，所述聚合物可以是異聚物或同聚物，例如，聚烯化亞胺、具有此處描述的帶正電荷的分支基團或“效能”基團的多肽或非肽聚合物。各基于蛋白的治療劑和非核酸非蛋白治療劑具有獨特的改變總的復合物特性的物理化學特性。這些帶正電荷的載體是下面被描述為帶正電荷的主鏈的材料中的一些材料。本發明也提供了施用治療有效量的此處提到的具有生物活性的試劑的方法，其包括給受試者(其可以是人或其他哺乳動物)的皮膚或上皮施用具有生物活性的試劑和這樣的量的具有分支基團的帶正電荷的主鏈，所述量足以將具有生物活性的試劑透皮遞送給所述受試者。在該方法中，具有生物活性的試劑和帶正電荷的載體可用作預先混合的組合物，或可以分開的方式給皮膚或上皮施用(例如，所述試劑可存在于皮膚貼劑中或其他裝置中，所述載體可含于液體或其他類型的組合物中，所述組合物在皮膚貼劑使用之前用于皮膚)。如此處所用的，詞“治療”在血糖的情況下是指血糖水平的降低，該降低足以在例如糖尿病患者中減輕高血糖癥的急性癥狀或體征。在本發明的某些方面，明確地排除能夠獲得血糖的治療性改變的治療性蛋白的透皮遞送。當使用術語“治療劑”或“具有生物活性的蛋白”時，本發明明確地排除了只結合特異性的抗原但不具有其它生物活性的抗體片段。然而，因為適合于免疫的抗原具有其他生物活性例如產生免疫應答，因此這些仍屬于本發明的適當的方面。此外，本發明包含通過結合特異性的抗原，從而阻斷配體結合或改變抗原的構象而具有生物活性或治療效果的試劑。如此處所用的，適合用于免疫的抗原性試劑可以是不會治療性地改變血糖水平的基于蛋白的抗原、非蛋白非核酸試劑或其雜合體。然而，編碼抗原的核酸明確地不適合用于本發明的組合物。因此，所包括的試劑是適合用于免疫的抗原自身。合適的抗原包括，例如，環境試劑、病原體或生物危害物的抗原。合適的試劑優選地包括，例如，和肉毒中毒、瘧疾、狂犬病、炭疽、結核病相關的抗原，或和兒童免疫例如B型肝炎、白喉、百日咳、破傷風、b型嗜血桿菌流行性感冒、滅活的脊髓灰質炎病毒、麻疹、流行性腮腺炎、風疹、水痘、肺炎球菌屬、A型肝炎和流感的免疫相關的抗原。
帶正電荷的主鏈帶正電荷的主鏈(也稱作帶正電荷的“載體”)一般是線性的原子鏈，其在鏈上具有在生理pH下攜帶正電荷的基團，或具有附著至從主鏈延伸出來的側鏈上的攜帶正電荷的基團。優選地，帶正電荷的主鏈自身不具有明確的酶促或生物活性。線性主鏈是碳氫主鏈，在一些實施方案中，其被選自氮、氧、硫、硅和磷的雜原子間插。大多數主鏈原子通常是碳。此外，所述主鏈通常是重復單位(例如，氨基酸、聚(乙烯氧基)、聚(丙烯胺)、聚烯化亞胺等)的聚合物。在一組實施方案中，帶正電荷的主鏈是聚丙烯胺，其中許多胺的氮原子以攜帶正電荷的銨基(四取代的)形式存在。在另一實施方案中，帶正電荷的主鏈是非肽聚合物，其可以是異聚合物或同聚合物，例如聚烯化亞胺，例如聚乙烯亞胺或聚丙烯亞胺，具有從大約10,000至大約2,500,000、優選地從大約100,000至大約1,800,000，和最優選地從大約500,000至大約1,400,000的分子量。在另一組實施方案中，所述主鏈已附著多個含有帶正電荷基團(例如，銨基、吡啶基、基、锍基、胍基或amidinium基)的側鏈部分。該組實施方案中的側鏈部分可以在間隔上是一致的或可變的間距沿主鏈放置。此外，側鏈的長度可以相似或不同。例如，在一組實施方案中，側鏈可以是具有從1至20個碳原子并在遠端(遠離主鏈)以上面提到的帶正電荷的基團中的一個結束的線性的或分支的烴鏈。在本發明的所有方面，載體和具有生物活性的試劑之間的結合是通過非共價相互作用結合的，所述相互作用可包括，例如，離子相互作用、氫鍵、范德瓦爾斯力或其組合。
在一組實施方案中，帶正電荷的主鏈是具有多個帶正電荷的側鏈基團(例如，賴氨酸、精氨酸、鳥氨酸、高精氨酸等)的多肽。優選地，所述多肽具有從大約10,000至大約1,500,000，更優選地從大約25,000至大約1,200,000，最優選地從大約100,000至大約1,000,000的分子量。本領域技術人員認識到，當氨基酸用于本發明的該部分時，所述側鏈在附著的中心可具有D型或L型(R或S構型)。
可選擇地，所述主鏈可以是多肽的類似物，例如類肽(peptoid)。參見，例如，Kessler，Angew.Chem.Int.Ed.Engl.32543(1993)；Zuckermann等人Chemtracts-Macromol.Chem.480(1992)；和Simon等人Proc.Nat′l.Acad.Sci.USA 899367(1992))。簡而言之，類肽是多聚甘氨酸，其中側鏈附著至主鏈的氮原子而不是附著至α碳原子。如上所述，側鏈的部分通常以帶正電荷的基團結尾以提供帶正電荷的主鏈組分。在例如美國專利號5,877,278中描述了類肽的合成。如此處所用的術語，具有類肽主鏈結構的帶正電荷的主鏈被認為是“非肽”，因為其不是由在α碳原子位置上具有天然發生的側鏈的氨基酸構成的。
可應用例如多肽的空間或電子模擬物來使用多種其他主鏈，其中肽的酰胺鍵由替代物取代，所述替代物是例如酯鍵、硫代酰胺(-CSNH-)、反向硫代酰胺(-NHCS-)、氨基亞甲基(-NHCH2-)或反向亞甲基氨基(-CH2NH-)、酮亞甲基(-COCH2-)、次膦酸(-PO2RCH2-)、磷酸酰胺和磷酸酰胺酯(-PO2RNH-)、反向肽(-NHCO-)、反式烯烴(-CR＝CH-)、氟代烯烴(-CF＝CH-)、二亞甲基(-CH2CH2-)、硫醚(-CH2S-)、羥亞乙基(-CH(OH)CH2-)、亞甲氧基(-CH2O-)、四唑(CN4)、亞磺酰胺基(-SO2NH-)、亞甲亞磺酰胺基(-CHRSO2NH-)、反向亞磺酰胺基(-NHS2-)，以及具丙二酸和/或gem-二氨基-烷基亞單位的主鏈，例如，由Fletcher等人((1998)Chem.Rev.98763)綜述的，和由其中引用的參考資料所詳細描述的。許多前述的替代物產生近似電子等排的(和形成于α氨基酸的主鏈相比)聚合物主鏈。
在上面提供的各主鏈中，可懸掛攜帶帶正電荷的基團的側鏈基團。例如，亞磺酰胺連接的主鏈(-SO2NH-和-NHSO2-)可具有附著至氮原子上的側鏈基團。類似地，羥亞乙基(-CH(OH)CH2-)連接可攜帶附著至羥基取代基的側鏈基團。通過使用標準的合成方法，本領域技術人員可容易地改造其他鍵合化學物質以使其提供帶正電荷的側鏈基團。
在特別優選的實施方案中，帶正電荷的主鏈是這樣的多肽，所述多肽具有獨立地選自-(gly)n1-(arg)n2、HIV-TAT或其片段、或觸角足(Antennapedia)的蛋白轉導域、或其片段或組合的分支基團(也稱為效能基團)，其中下標n1是從0至20的整數，更優選地是0至8的整數，更優選地是2至5的整數，下標n2獨立地是從大約5至大約25、更優選地大約7至大約17、最優選地大約7至大約13的奇整數。其他優選的實施方案是這樣的實施方案，在所述實施方案中，HIV-TAT片段具有式(gly)p-RGRDDRRQRRR-(gly)q、(gly)p-YGRKKRRQRRR-(gly)q或(gly)p-RKKRRQRRR-(gly)q，其中下標p和q各獨立地是從0至20的整數，所述片段通過片段的C端或N端附著至主鏈。優選的HIV-TAT片段是其中下標p和q各自獨立地是0至8、更優選地2至5的整數的片段。在另一優選的實施方案中，帶正電荷的側鏈或分支基團是觸角足(Antp)蛋白轉導域(PTD)、或其保持活性的片段。優選地帶正電荷的載體以至少大約0.05％(總載體重量的百分比)、優選地從大約0.05％至大約45％、最優選地從大約0.1至大約30％重量的量的包含帶正電荷的側鏈分支基團。對于具有式-(gly)n1-(arg)n2的帶正電荷的分支基團，最優選的量是從大約0.1至大約25％。
在另一特別優選的實施方案中，所述主鏈部分是多聚賴氨酸，帶正電荷的分支基團附著至所述賴氨酸側鏈氨基。用于該特別優選的實施方案的多聚賴氨酸具有從大約10,000至大約1,500,000、優選地從大約25,000至大約1,200,000，和最優選的大約100,000至大約1,000,000的分子量。其可以是可商購獲得(Sigma Chemical Company，St.Louis，Missouri，USA)的多聚賴氨酸中的任一種，例如，具有MW＞70,000的多聚賴氨酸、具有70,000至150,000的MW的多聚賴氨酸、具有MW 150,000至300,000的多聚賴氨酸和具有MW＞300,000的多聚賴氨酸。多聚賴氨酸的恰當選擇依賴于組合物的其余組分，要足以為組合物提供總的凈正電荷和提供這樣的長度，該長度優選地是帶負電荷的組分的組合長度的1至4倍。優選的帶正電荷的分支基團或效能基團包括，例如，-gly-gly-gly-arg-arg-arg-arg-arg-arg-arg(-Gly3Arg7)或HIV-TAT。在另一優選的實施方案中，帶正電荷的主鏈是長鏈聚烯化亞胺例如聚乙烯亞胺，例如，具有大約1,000,000的分子量的聚乙烯亞胺。
這樣的帶正電荷的主鏈或載體分子是新的化合物并形成本發明的方面，所述主鏈或載體包含具有上述分支基團的多肽或非肽聚合物例如聚烯化亞胺和上面提到的其他帶正電荷的主鏈。
在本發明的另一個實施方案中，只有具有帶正電荷的分支基團的帶正電荷的載體是活性物質的透皮遞送所必需的。在該情況的一個實施方案中，所述帶正電荷的載體是具有多個上述的帶正電荷的側鏈基團的多肽(例如，賴氨酸、精氨酸、鳥氨酸、高精氨酸等)。優選地，所述多肽具有至少大約10,000的分子量。在該情況的另一個實施方案中，帶正電荷的載體是非肽聚合物例如具有至少大約100,000分子量的具有多個帶正電荷的側鏈基團的聚烯化亞胺。這些聚烯化亞胺包括聚乙烯亞胺和聚丙烯亞胺。在任一示例中，作為單獨的透皮遞送所唯一必需的試劑，所述帶正電荷的載體分子包含帶正電荷的分支或效能基團、HIV-TAT或其片段、或觸角足PTD或其片段，所述分支或效能基團包含-(gly)n1-(arg)n2，其中下標n1是從0至20，更優選地從0至8，更優選地2至5的整數，下標n2獨立地是從大約5至大約25，更優選地從大約7至大約17和最優選地從大約7至大約13的奇整數。優選地，所述側鏈或分支基團具有上述通式-(gly)n1-(arg)n2。其他優選的實施方案是這樣的方案，在所述方案中，分支或效能基團是具有式(gly)p-RGRDDRRQRRR-(gly)、(gly)p-YGRKKRRQRRR-(gly)q或(gly)p-RKKRRQRRR-(gly)q的HIV-TAT片段，其中下標p和q各自獨立地是從0至20的整數，所述片段通過該片段的C端或N端附著至載體分子。所述側鏈分支基團可在附著的中心具有D型或L型(R或S構型)。優選的HIV-TAT片段是這樣的片段，在所述片段中，下標p和q各自獨立地是從0至8、優選地2至5的整數。其他優選的實施方案是這樣的實施方案，在所述實施方案中，分支基團是保持基團活性的觸角足PTD基團或其片段。這些在本領域中是已知的，例如根據Console等人，J.Biol.Chem.27835109(2003)。
在特別優選的實施方案中，所述載體是具有附著至賴氨酸側鏈氨基的帶正電荷的分支基團的多聚賴氨酸。用于該特別優選的實施方案的多聚賴氨酸可以是可商購(例如Sigma Chemical Company，St.Louis，Missouri，USA)獲得的多聚賴氨酸中的任一種，例如，具有MW＞70,000的多聚賴氨酸、具有70,000至150,000的MW的多聚賴氨酸、具有MW 150,000至300,000的多聚賴氨酸和具有MW＞300,000的多聚賴氨酸。然而，優選的多聚賴氨酸具有至少大約10,000的MW。優選的帶正電荷的分支基團或效能基團包括，例如，-gly-gly-gly-arg-arg-arg-arg-arg-arg-arg(-Gly3Arg7)、HIV-TAT或其片段、和觸角足PTD或其片段。
其他組分除了帶正電荷的主鏈組分外，本發明的多組分組合物還包含至少兩種選自下列的組分
i)具有數個附著的成像部分或可選擇地數個帶負電荷的成像部分的第一帶負電荷的主鏈；ii)具有數個附著的靶向試劑或可選擇地數個帶負電荷的靶向部分的第二帶負電荷的主鏈；iii)至少一個選自RNA、DNA、核酶、經修飾的寡核苷酸和編碼選擇的轉基因的cDNA的成員；iv)編碼至少一個駐留因子的DNA；和v)具有數個附著的生物學試劑或帶負電荷的生物學試劑的第三帶負電荷的主鏈。
在此處描述的相關方面，在本發明的一些實施方案或組合物中，帶正電荷的主鏈或載體可單獨地用于提供某些類型的物質的透皮遞送。此處描述的具有生物活性的試劑的組合，例如，胰島素、肉毒毒素、不會治療性地改變血糖水平的蛋白、適合用于免疫的抗原、非蛋白非核酸試劑的組合，也可用于這些組合物。
帶負電荷的主鏈，當用于攜帶成像部分、靶向部分和治療劑時，可以是具有多個在生理條件下攜帶負電荷的基團的各種主鏈(類似于上述的主鏈)。可選擇地，具有足夠表面負電荷的成像部分、靶向部分和治療劑不需要額外的主鏈的附著來和帶正電荷的主鏈通過離子相互作用結合，這對本領域技術人員來說是顯而易見的。在該上下文中，足夠包含有這樣的意思，即成像部分、靶向部分或治療劑的表面存在合適密度的帶負電荷的基團，從而提供和上述的帶正電荷的主鏈的離子鍵。在這些情況下，所述物質或其衍生物具有足夠的負電荷和本發明的帶正電荷的載體非共價地結合?？赏ㄟ^例如顆粒大小或功能分光光度學上的變化(和單獨的組分相比)來確定該上下文中的術語“足夠”。合適的帶負電荷的基團是羧酸、次膦酸、膦酸或磷酸、亞磺酸或磺酸等。在一些實施方案中，帶負電荷的主鏈是寡核苷酸。在另一實施方案中，帶負電荷的主鏈是寡糖(例如，葡聚糖)。在另一個實施方案中，帶負電荷的主鏈是多肽(例如，聚谷氨酸、聚天冬氨酸或這樣的多肽，即在所述多肽中，谷氨酸或天冬氨酸殘基被不帶電荷的氨基酸間插)。一般通過酯鍵將下面更詳細地描述的部分(成像部分、靶向部分和治療劑)附著至具有這些懸掛基團的主鏈?？蛇x擇地，打斷帶負電荷的氨基酸或懸掛在帶負電荷的主鏈的末端的氨基酸可用于附著成像部分和靶向部分，通過例如二硫鍵(通過半胱氨酸殘基)、酰胺鍵、醚鍵(通過絲氨酸或蘇氨酸羥基)等進行附著。可選擇地，在帶負電荷的聚合物不存在的情況下，所述成像部分和靶向部分自身可以是小陰離子?？蛇x擇地，所述成像部分、靶向部分和治療劑自身可通過共價修飾以提供足夠的表面帶負電荷的部分以和帶正電荷的主鏈通過離子相互作用結合，這對于本領域技術人員來說是顯而易見的。在這兩種情況下，所述物質或其衍生物具有足夠的負電荷以和本發明的帶正電荷的載體非共價結合。在該上下文中，術語“足夠”是指可通過例如顆粒大小或功能性分光光度學上的變化(和單獨的組分相比)來確定的結合。
成像部分許多診斷或成像部分可用于本發明并以有效的量存在，該有效量依賴于進行診斷或成像的病癥、施用的途徑、試劑和用于所述試劑的檢測的設備的靈敏性等。
合適的成像或診斷劑的示例包括不透射線的照影劑、順磁性照影劑、超順磁性照影劑、光學成像部分、CT造影劑和其他造影劑。例如，不透射線的照影劑(用于X射線成像)可包括無機和有機碘化合物(例如，泛影酸鹽)、不透射線的金屬和其鹽(例如，銀、金、鉑等)和其他不透射線的化合物(例如，鈣鹽、鋇鹽例如硫酸鋇、鉭和氧化鉭)。合適的順磁性照影劑(用于MR成像)包括二乙三胺五乙酸釓(Gd-DTPA)和其衍生物，和其他釓、錳、鐵、鏑、銅、銪、鉺、鉻、鎳和鈷復合物，包括和1，4，7，10-四氮雜環十二烷基-N，N′，N″，N-四乙酸(DOTA)、乙二胺四乙酸(EDTA)、1，4，7，10-四氮雜環十二烷基-N，N′，N″-三乙酸(D03A)、1，4，7-三氮雜環壬烷基-N，N′，N″-三乙酸(NOTA)、1，4，8，11-四氮雜環十四烷基-N，N′，N″，N-四乙酸(TETA)、羥基芐基乙烯基-二胺二乙酸(HBED)等的復合物。合適的超順磁照影劑(用于MR成像)包括磁鐵礦、超順磁性氧化鐵、單晶氧化鐵，特別是可被附著至帶負電荷的主鏈的這些試劑中的各試劑的復合形式。其他合適的成像試劑是CT照影劑，包括碘化和非碘化以及離子化和非離子化的CT照影劑，以及照影劑例如自旋標記物(spin-labels)或其他診斷上有效的試劑。合適的光學成像試劑包括例如選自Cy3、Cy3.5、Cy5、Cy5.5、Cy7、Cy7.5、Oregon green 488、Oregon green500、Oregon green 514、綠色熒光蛋白、6-FAM、Texas Red、Hex、TET和HAMRA的基團。
診斷劑的其他示例包括編碼這樣的蛋白的標記基因，當所述蛋白在細胞中表達時，其可被容易地檢測到，其包括，但不限于，β-半乳糖苷酶、綠色熒光蛋白、藍色熒光蛋白、熒光素酶等。可使用各種標記物，例如放射性核素、fluors、酶、酶底物、酶輔助因子、酶抑制劑、配體(特別是半抗原)等。其他有用的物質是用放射性物質或成分標記的物質，例如葡庚糖酸99mTc。
將成像部分附著至帶負電荷的主鏈的選擇依賴于許多條件。某些成像試劑在生理pH下是中性的，從而優選地附著至帶負電荷的主鏈或經共價修飾以包含足夠的上述帶負電荷的部分，從而保持和帶正電荷的載體的復合。其他成像試劑攜帶足夠的負電荷以使即使在缺少帶負電荷的主鏈的情況下仍保持和帶正電荷的載體的復合。在這些情況下，所述物質或其衍生物具有足夠的負電荷以與本發明帶正電荷的載體非共價結合。術語“足夠”在本上下文中是指這樣的結合，即該結合可通過例如顆粒尺寸或功能性分光光度學上的變化(和單獨的組分相比)來確定。這些帶負電荷的成像部分的示例包括磷酸鹽離子(用于磁共振成像)。
靶向試劑許多靶向試劑用于此處描述的組合物。一般地，如上面關于成像部分所述的，將靶向試劑附著至帶負電荷的主鏈。在某些實施方案中，靶向試劑和成像部分在結構和/或化學性質上是截然不同的。例如，成像部分和靶向試劑兩者不都是磷酸鹽。一般地，靶向試劑可以是任何這樣的成分，即該成分使得可能指導核酸、治療劑或組合物的其它組分轉移至特定位點或改變復合物的向性(和不具有靶向試劑的復合物的向性相比)。靶向試劑可以是細胞外靶向試劑，其可以使例如核酸轉移朝向某些類型的細胞或某些想要的組織(腫瘤細胞、肝細胞、造血細胞等)。這樣的試劑也可以是細胞內靶向試劑，其可使治療劑指向特定的細胞區室(例如，線粒體、細胞核等)。所述試劑最簡單地也可以是小陰離子，其可憑借凈電荷的分布或改變凈電荷的分布來改變復合物的向性，使其從帶更高負電的細胞表面和細胞外基質組分轉向更多的細胞種類或甚至特異性地離開帶有最多負電的表面。
根據本發明，優選地將靶向試劑共價地或非共價地和本發明的帶負電荷的主鏈連接。根據本發明的優選的模式，優選地通過連接基團將靶向試劑共價地附著至用作帶負電荷的主鏈成分的寡核苷酸、聚天冬氨酸、硫酸化或磷酸化的葡聚糖等。通過使用例如異雙功能連接性基團(參見Pierce Chemical Catalog)將靶向試劑(以及其他生物學試劑)附著至核酸的方法對本領域技術人員來說是熟知的。在一組實施方案中，所述靶向試劑是用于提高細胞轉染的融合肽，更確切地說用于促進組合物或其各種成分跨膜遷移，或者用于幫助從內體外出或穿過核膜。所述靶向試劑也可以是存在于細胞類型的表面上的受體的細胞受體的配體，例如糖、運鐵蛋白、胰島素或去唾液酸-血清類粘蛋白。這樣的配體也可以是細胞內類型中的一種，例如促進轉染的DNA在細胞核內的積累的核定位信號(nls)序列。
用于本發明的內容中的其他靶向試劑包括糖、肽、激素、維生素、細胞因子、寡核苷酸、小陰離子、脂質或來源于這些成分的序列或片段并且該序列或片段使得能夠和其對應的受體特異性結合。優選地，所述靶向試劑是糖和/或肽，例如抗體或抗體片段、細胞受體的配體或其片段、受體或受體片段等。更優選地，所述靶向試劑是生長因子受體、細胞因子受體或細胞凝集素受體或粘著蛋白的受體的配體。靶向試劑也可以是使得可能靶向凝集素例如去唾液酸糖蛋白受體的糖，或可選擇地是使得可能靶向免疫球蛋白的Fc片段受體的抗體Fab片段。
在其他實施方案中，在缺少帶負電荷的主鏈的情況下使用靶向試劑。在該組實施方案中，靶向試劑攜帶足夠的帶負電荷的部分以保持和上述的帶正電荷的載體通過離子相互作用結合。在這些情況下，所述物質或其衍生物具有足夠的負電荷以和本發明的帶正電荷的載體非共價結合。術語“足夠”在本上下文中是指可通過例如顆粒尺寸或功能性分光光度學上的變化(和單獨的組分相比)來確定的結合。用于該組實施方案的合適的帶負電荷的靶向試劑是在生理學pH下具有凈負電荷的基于蛋白的靶向試劑和可促進附著特定細胞表面的靶向試劑，例如小的聚陰離子，包括例如可以基于被靶向的細胞的凈表面電荷而改變靶向的磷酸、天冬氨酸和檸檬酸。
在本發明的組合物中，核酸可以是脫氧核糖核酸或核糖核酸，可包含天然的或人工來源的序列。更特別地，此處所用的核酸可包括基因組DNA、cDNA、mRNA、tRNA、rRNA、雜合序列或合成的或半合成的序列。這些核酸可以是人、動物、植物、細菌、病毒等來源的核酸。此外，所述核酸可通過本領域技術人員已知的任何技術獲得，特別是通過基因庫的篩選獲得，通過化學合成或通過混合的方法獲得，該混合方法包括對通過基因庫的篩選獲得的序列的化學或酶修飾。此外，可將核酸整合入載體，例如質粒載體。
用于本發明的脫氧核糖核酸可以是單鏈或雙鏈的。這些脫氧核糖核酸也可編碼治療性基因、用于調控轉錄或復制的序列、反義序列、結合其他細胞成分的區域等。合適的治療性基因基本上是編碼具有治療效果的蛋白產物的任何基因。如此被編碼的蛋白產物可以是蛋白、多肽、肽等。在某些情況下，所述蛋白產物可以是和靶細胞同源的(即其是當靶細胞未表現病原性時，一般在靶細胞中表達的產物)。通過該方式，使用合適的核酸可增加蛋白的表達，使得可能例如在細胞中克服不充足的表達?？蛇x擇地，本發明提供了用于表達或可選擇地過量表達蛋白的組合物和方法，所述蛋白由于修飾的原因而失活或活性很低。因此治療性基因可以編碼細胞蛋白的突變體，該突變體具有增加的穩定性、經修飾的活性等。相對于靶細胞，所述蛋白產物也可以是異源的。在該情況下，表達的蛋白可以，例如，產生或提供細胞中缺少的活性，使其能夠抵抗病原或刺激免疫應答。
更特別地，用于本發明的核酸是這樣的核酸，所述核酸編碼酶、血液衍生物、激素、淋巴因子、白細胞介素、干擾素、TNF、生長因子、神經遞質或其前體或合成的酶、或營養因子BDNF、CNTF、NGF、IGF、GMF、aFGF、bFGF、VEGF、NT3、NT5、HARP/多效蛋白(pleiotrophin)；參與脂、選自載脂蛋白A-I、A-II、A-IV、B，C-I，C-II，C-III、D、E、F、G、H、J和apo(a)的載脂蛋白類型的代謝的蛋白、代謝酶，例如脂蛋白脂酶、肝脂酶、卵磷脂膽固醇?；D移酶、7-α-膽固醇羥化酶、磷脂酸磷酸酶或脂質轉運蛋白例如膽固醇酯轉運蛋白和磷脂轉運蛋白、結合HDLs或選自例如LDL受體、乳糜微粒殘留物受體(chylomicron-remnant receptors)和清除受體(scavengerreceptors)相關的蛋白、肌營養不良蛋白或minidystrophin、GAX蛋白、和粘液粘稠病相關的CFTR蛋白、腫瘤抑制基因p53、Rb、RaplA、DCC、k-rev；參與凝血的蛋白因子因子VII、VIII、IX；或所述核酸可以是參與DNA修復的基因、自殺基因(胸苷激酶、胞苷脫氨酶)、編碼血栓調節蛋白的基因、α1-抗胰蛋白酶、組織型纖溶酶原激活物、超氧化物歧化酶、彈性蛋白酶、基質金屬蛋白酶等的基因。
用于本發明的治療性基因也可以是反義序列或這樣的基因，所述這樣的基因在靶細胞中的表達使得可能控制基因的表達或細胞mRNA的轉錄。根據專利EP140,308中描述的技術，這些序列可以例如在靶細胞中被轉錄成細胞mRNA的互補RNA，從而阻止其翻譯成蛋白。反義序列也包含編碼能夠選擇性地破壞靶RNA的核酶的序列(參見EP321,201)。
如上面所表明的，具有生物活性的試劑也可以包含一種或多種能夠在人或動物中產生免疫應答的抗原性肽。在該特定的實施方案中，本發明因此可能產生用于人或動物的疫苗或免疫治療法，特別是抗微生物、病毒或癌癥的疫苗或免疫治療法。特別地，其可以是特異性針對EB病毒、HIV病毒、B型肝炎病毒(參見EP 185,573)、假狂犬病病毒或特異性針對腫瘤(參見EP 259,212)的抗原性肽。
優選地，所述核酸也包含這樣的序列，所述序列使得治療性基因或編碼抗原性肽的基因在想要的細胞或器官中表達。這些序列可以是這樣的序列，當所述序列能夠在被感染的細胞中發揮功能時，其天然地負責被考慮的基因的表達。所述核酸序列也可以是不同來源的序列(負責其他蛋白或甚至是合成的蛋白的表達)。特別地，所述核酸可包含用于真核或病毒基因的啟動子序列。例如，所述啟動子序列可以是來源于想要被感染的細胞的基因組的啟動子序列。類似地，所述啟動子序列可以來源于病毒的基因組，例如，基因E1A、MLP、CMV、RSV等的啟動子。此外，這些表達序列可通過加入激活序列、調控序列等來進行修飾。
除此之外，所述核酸也可包含(特別是在治療性基因的上游)指導合成的治療性產物進入靶細胞的分泌途徑的信號序列。該信號序列可以是治療性產物的天然信號序列，也可以是任何其他功能性信號序列或人工信號序列。
編碼至少一種駐留因子的DNA在一些實施方案中，組合物也包含編碼至少一種駐留因子的DNA。這樣的DNA的示例是編碼腺病毒終端前蛋白1(Adenoviralpreterminal protein 1)的DNA(參見，Lieber，等人NatureBiotechnology 15(13)1383-1387(1997))。腺病毒終端前蛋白1或編碼其的核酸可以順式或反式的方式提供給編碼想要的治療性轉基因的核酸序列。當以這種方式提供時，終端前蛋白1或序列以穩定的核附加體形式保存治療性核酸，從而防止了治療性核酸的丟失，從而防止以后治療性蛋白表達的減少。
生物學試劑許多生物學試劑，包括治療劑和藥妝劑，可用于本發明并且以有效的量存在，所述有效的量依賴于正被治療的病癥、預防的病癥或施藥的途徑、試劑的功效以及患者的大小和對治療方案的易感性。
可附著至帶負電荷的主鏈的合適的治療劑基本上可在任何種類的試劑中找到，包括，例如，止痛藥、鎮喘藥、抗生素、抗抑郁藥、抗糖尿病藥、抗真菌劑、止吐藥、抗高血壓藥、抗性無能藥、抗炎藥、抗腫瘤藥、抗HIV藥、抗病毒藥、anxiolytic agents、避孕藥、致育因子、抗血栓藥、prothrombotic agents、激素、疫苗、免疫抑制劑、維生素等。可選擇地，可將足夠的帶負電荷的基團引入治療劑以提供和上述帶正電荷的主鏈通過離子相用作用的復合。存在許多合適的方法例如磷酸化法或硫酸鹽化法，這對本領域技術人員是顯而易見的。
此外，某些試劑自身擁有足夠的和上述帶正電荷的載體結合的帶負電荷的部分而不需要附著至帶負電荷的主鏈。在這些情況下，所述物質或其衍生物具有足夠的負電荷以和本發明的帶正電荷的載體非共價地結合。術語“足夠”在本上下文中是指可通過例如顆粒尺寸或功能性分光光度學上的變化(和單獨的組分相比)來確定的結合。
合適的藥妝劑包括，例如，表皮生長因子(EGF)以及人生長激素、抗氧化劑和肉毒毒素。在本發明的上下文中，術語“肉毒毒素”不僅包括肉毒桿菌血清型A、B、C、D、E、F和G，還包括其具有肉毒毒素輕鏈活性的片段。
更特別地，用于本發明的治療劑包括鎮痛藥如利多卡因、奴佛卡因、布比卡因、普魯卡因、丁卡因、苯佐卡因、可卡因、甲哌卡因、依替卡因、丙美卡因、羅哌卡因、丙胺卡因等；抗哮喘藥例如氮卓斯汀、酮替芬、曲撤諾、皮質激素、色甘酸鈉、萘多羅米、沙丁胺醇、雙甲苯喘定甲磺酸鹽、吡布特羅、沙美特羅、terbutyline、膽茶堿等；抗生素藥例如新霉素、鏈霉素、氯胺苯醇、氟哌酸、環丙沙星、甲氧芐氨嘧啶、sulfamethyloxazole、β-內酰胺類抗生素、四環素等；抗抑郁藥例如奈福泮、奧昔哌汀、米帕明、曲唑酮等；抗糖尿病藥例如雙胍、磺脲類藥等；止吐藥和抗精神病藥例如氯丙嗪、氟奮乃靜、奮乃靜、丙氯拉嗪、普魯本近、甲哌硫丙嗪、三氟丙嗪、氟派啶醇、東莨菪堿、地芬尼多曲美芐胺、曲美芐胺等；神經肌肉因子例如阿曲庫、氯化米哇庫銨、羅庫溴銨、氯化琥珀膽堿、多沙氯銨、筒箭毒堿、和肉毒毒素(BTX)；抗真菌劑例如兩性霉素B、制霉素、殺念珠菌素、依曲康唑、酮康唑、咪康唑、克霉唑、氟康唑、環吡酮、益康唑、萘替芳、特比萘芬、灰黃霉素、環吡酮等；抗高血壓藥例如萘心安、普羅帕酮、氧烯洛爾(oxyprenolol)、尼非地平、利血平等；抗性無能藥例如一氧化氮供體等；抗炎藥包括固醇類抗炎藥例如可的松、氫化可的松、地塞米松、去氫氫化可的松、潑尼松、氟扎可等，和非固醇抗炎藥例如吲哚美辛、布洛芬、雷米那酮、prioxicam等；抗腫瘤藥例如阿霉素、環磷酰胺、放線菌素、博來霉素、duanorubicin、多柔比星、表柔比星、密吐霉素、雷帕霉素、甲氨喋呤、氟尿嘧啶、卡鉑、卡莫司汀(BCNU)、順鉑、鬼臼乙叉甙、干擾素、苯芥膽甾醇、紫杉酚(包括類似物和衍生物)、喜樹堿和其衍生物、長春堿、長春新堿等；抗HIV藥(例如，antiproteolytics)；抗病毒藥例如金剛烷胺、甲吲噻蹤、碘苷、阿糖胞苷、阿昔洛維、泛西洛維、羥甲基無環鳥苷、膦甲酸、索利夫定、三氟尿苷、伐昔洛韋、西多福韋、地達諾新、司他夫定、扎西他賓、疊氮胸苷、三氮唑核苷、金剛乙胺等；抗焦慮藥(anxiolytic agents)例如硝苯呋海因、地西泮等；COX-2抑制劑；避孕藥例如孕激素等；抗血栓藥例如GPIIb/IIIa抑制劑、組織型纖溶酶原活化劑、鏈激酶、尿激酶、肝素等；prothrombotic劑例如凝血酶、因子V、VII、VIII等；激素例如胰島素、生長激素、催乳素、EGF(表皮生長因子)等；免疫抑制劑例如環孢霉素、硫唑嘌呤、咪唑立賓、FK506、潑尼松等；血管生成因子例如VEGF(血管內皮生長因子)；維生素例如A，D，E，K等；和其他治療性或藥物活性試劑。參見，例如，GOODMAN& GILMAN′S THE PHARMACOLOGICAL BASIS OFTHERAPEUTICS，第9版，Hardman，等人，eds.McGraw-Hill，(1996)。
在最優選的實施方案中，所述生物學試劑選自胰島素、肉毒毒素、VEGF、用于免疫的抗原和抗真菌劑。
如上面對于靶向試劑和成像試劑所指出的，可在缺少帶負電荷的主鏈的情況下使用某些生物學試劑或藥妝劑。這些生物學試劑或藥妝劑是這樣的試劑，該試劑在生理pH下一般攜帶凈負電荷以保持和帶正電荷的載體的結合。示例包括肉毒毒素(大MW蛋白)、胰島素(小MW蛋白)、用于免疫的抗原，其可以在從非常小至非常大的范圍內變化并且通常包括蛋白或糖蛋白和許多抗真菌劑。在這些情況下，所述物質或其衍生物具有足夠的負電荷以和本發明的帶正電荷的載體非共價地結合。術語“足夠”在本上下文中是指可通過例如顆粒尺寸或功能性分光光度學上的變化(和單獨的組分相比)來確定的結合。
具有附著的成像部分、靶向試劑或治療劑的帶負電荷的主鏈對于上面的三組組分，包括成像部分、靶向試劑和治療劑，單個的化合物可附著至帶負電荷的主鏈，通過共價修飾以引入帶負電荷的部分，或者可直接使用，如果該化合物含有足夠的帶負電荷的部分以提供和上述的帶正電荷的主鏈的通過離子作用的結合。必要時，一般地，通過用于將特定的試劑共價地附著(通過存在于所述試劑和主鏈上的官能團)至主鏈的連接性基團進行附著。許多連接性基團可用于本發明的該方面。參見，例如，Hermanson，Bioconjugate Techniques，Academic Press，San Diego，CA(1996)；Wong，S.S.，Ed.，Chemistry of Protein Conjugation and Cross-Linking，CRC Press，Inc.，Boca Raton，FL(1991)；Senter，等人，J.Org.Chem.552975-78(1990)；和Koneko，等人，Bioconjugate Chem.2133-141(1991)。
在一些實施方案中，治療劑、診斷劑或靶向試劑不具有可獲得的用于附著連接性基團的官能團，從而可首先經修飾以引入例如羥基、氨基或硫醇取代基。優選地，在試劑的非干擾部分提供所述取代基，所述取代基可用于附著連接性基團，并且不會不利地影響試劑的功能。
在另一方面，本發明提供了這樣的組合物，該組合物包含具有至少一個附著的效能基團的帶正電荷的主鏈和至少一個選自RNA、DNA、核酶、經修飾的寡核苷酸和編碼選擇的轉基因的核酸的成員的非共價復合物。在本發明的該方面，帶正電荷的主鏈基本上可以是上述帶正電荷的主鏈中的任何一種，并且也包含(和上面選擇的主鏈一樣)至少一個附著的效能基團。合適的效能基團包括，例如，(Gly)n1-(Arg)n2，或TAT結構域，其中下標n1是從3至大約5的整數，下標n2獨立地是從大約7至大約17的奇整數。此外，用于本發明的該方面的核酸和上面已描述的核酸相同。
胰島素和某些更大的分子的透皮遞送已發現上述帶正電荷的載體可用于胰島素和某些其他具有生物活性的試劑的透皮遞送，所述具有生物活性的試劑不會治療性地改變血糖水平，所述具有生物活性的試劑是例如具有大約50,000和以上的分子量的蛋白，例如，肉毒毒素(BTX)，或其他具有生物活性的試劑例如基于核酸的治療劑、非蛋白非核酸治療劑例如某些抗真菌劑或用于免疫的試劑。帶正電荷的載體的使用可使蛋白或標記基因都能運入皮膚細胞或運出皮膚細胞，和以有效量和活性形式將其遞送入深層組織。例如，可將胰島素通過皮膚遞送入深層毛細管，從而運送遍布全身而無需注射?？蓪⑷舛径舅匾援a生麻痹、產生松弛、減緩收縮、預防或減輕痙攣、減少腺體分泌或提供其他想要的效果的有效量遞送至深層肌肉或皮膚內的腺體。與可注射的或可移植的材料相比，特別是在肉毒毒素的情況下，以這種方式進行的局部遞送可減少劑量、降低毒性和使得可以為想要的效果提供更精確的劑量最優化。該實施方案可包含一些小的優選多價的陰離子，例如，磷酸鹽、天冬氨酸鹽或檸檬酸鹽，或可在基本上缺少這樣的聚陰離子的情況下進行該實施方案。在本發明的所有方面，載體和具有生物活性的試劑之間的結合是通過非共價相互作用結合的，所述非共價相互作用可包括，例如，離子相互作用、氫鍵、范德瓦爾斯力，或其組合。
如此處所用的，術語“肉毒毒素”是指任何已知的肉毒毒素的血清型，無論是通過細菌產生的還是通過重組技術產生的，以及以后可被發現的任何這樣的類型，包括基因工程產生的變體或融合蛋白。如上面所提到的，目前，已表征了七種免疫學上不同的肉毒神經毒素，即A、B、C、D、E、F和G型肉毒神經毒素血清型，其各自通過用類型特異性抗體進行中和來區別。肉毒毒素血清型可從Sigma-Aldrich和從Metabiologics，Inc.(Madison，Wisconsin)以及從其他來源商購獲得。肉毒毒素的不同血清型在其作用的動物種類和在其引起的麻痹的嚴重度和持續時間上是不同的。目前，至少兩種類型的肉毒毒素，A型和B型，可以治療某些病癥的制劑形式商購獲得。例如，在商標為BOTOXO的Allergan的制劑中和商標為DYSPORT的Ipsen的制劑中含有A型，而在商標為MYOBLOC的Elan的制劑中含有B型。
用于本發明的肉毒毒素可以是肉毒毒素的衍生物，即其是這樣的化合物，所述化合物具有肉毒毒素活性，但和天然發生的或重組的天然的肉毒毒素相比，在任何部分或任何鏈上包含一種或多種化學或功能性改變。例如，肉毒毒素可以是經修飾的神經毒素，即其和天然的神經毒素相比，至少具有一個氨基酸被刪除、被修飾或被替代，或經修飾的神經毒素可以是通過重組產生的神經毒素或其衍生物或片段。例如，所述肉毒毒素可以是以這樣的方式修飾的肉毒毒素，所述方式是例如增強其特性或減少不想要的副作用，但仍保持想要的肉毒毒素活性的方式。如上所述，肉毒毒素可以是由細菌產生的肉毒毒素復合物中的任一種?？蛇x擇地，肉毒毒素可以是使用重組或化學合成技術制備的毒素，例如，重組肽、融合蛋白或雜合的神經毒素，例如從不同的肉毒毒素血清型的亞基或結構域制備而來的(例如，參見美國專利6,444,209)。肉毒毒素也可以是完整的分子的部分，該部分經顯示具有必需的肉毒毒素活性，在該情況下其自身可被使用或用作重組分子或復合分子例如融合蛋白的部分。可選擇地，毒素的部分可直接地和此處描述的帶正電荷的主鏈在具有或不具有靶向部分的情況下一起使用，因為帶正電荷的主鏈甚至在天然的BTX結合、靶向或內化結構域不存在的情況下允許細胞內化?？蛇x擇地，肉毒毒素可以肉毒毒素前體(該前體自身可以是無毒的)的形式存在，例如無毒的鋅蛋白酶，其在蛋白水解斷裂后變得有毒。
本發明也涉及肉毒毒素的組合物和混合物的一般用途，不過由于其不同的性質和特性，目前一般不施用肉毒毒素血清型的混合物。
類似地，術語“胰島素”包括從天然來源中提取的胰島素和可通過化學或重組的方法通過合成獲得的胰島素。胰島素也可以以經修飾的形式存在，或者以例如重組肽、融合蛋白或雜合分子的形式存在，或在特定的情況下，胰島素可以是具有必需的活性的胰島素分子的部分。這對于可用于這些特定的透皮組合物和方法的其他蛋白，特別是用于免疫的在物理化學性質上可發生很大變化的抗原同樣如此。同樣，可從天然來源獲得或可合成非蛋白非核酸治療劑，包括抗真菌劑。
本發明的組合物優選地以這樣的產品形式存在，該產品被用于受試者或患者即需要特定治療的人或其他哺乳動物的皮膚或上皮。術語“需要”是指包括藥物和健康相關的需要以及想要更加美觀、更具美感或主觀的需要。肉毒毒素組合物也可用于例如改變或改善面部組織的外觀。
通過使用本發明的帶正電荷的載體，可將肉毒毒素給受試者透皮施用以治療病癥，所述病癥是例如不想要的面部肌肉或其他肌肉痙攣、多汗癥、痤瘡或身體中其他想要減輕肌肉疼痛或痙攣的部位的病癥。局部施用肉毒毒素以透皮遞送至肌肉或其他與皮膚相關的結構中?？山o例如腿、肩、背(包括下背部(lower back))、腋、掌、足、頸、腹股溝、手或足的背部、肘、上臂、膝蓋、大腿、臀部、軀干、骨盆或想要施用肉毒毒素的身體的其他部分。
也可進行肉毒毒素的施用以治療其他病癥，包括治療神經痛、預防或減輕偏頭痛或其他頭痛、預防或減輕痤瘡、預防或減輕無論是主觀性的還是臨床性的肌張力障礙(dystonia)或肌張力障礙收縮(dystonic contractions)、預防或減輕和主觀或臨床多汗癥相關的癥狀、減少分泌過多或出汗、降低或加強免疫應答、或治療其他疾病(其是建議或進行通過注射的肉毒毒素的施用來治療的病癥)。為了免疫相關的目的，也可施用肉毒毒素、對血糖水平不具治療性效果的其他治療性蛋白、此處描述的用于免疫的其他抗原或其他非核酸非蛋白治療劑，例如復合的肉毒毒素。可選擇地，可制備復合物并進行局部施用以增強免疫應答，例如提供有關各種蛋白的免疫，例如，無需注射的兒童免疫或抗各種環境危害物的免疫。令人驚奇的是，也可施用此處描述的肉毒毒素或其他治療性蛋白以降低免疫應答。本發明可使BTX和其他蛋白通過改變了的施用途徑被遞送并改變所述試劑的復合抗原呈遞，從而可以用于減少對抗該蛋白的抗原的免疫應答，從而有助于反復施用而不會產生與免疫相關的活性上的降低。
一般地，通過將待施用的胰島素、肉毒毒素或其他具有生物活性的試劑和帶正電荷的載體和通常地一種或多種額外的藥物可接受的載體或賦形劑混合來制備組合物，所述具有生物活性的試劑是例如不會治療性地改變血糖水平的治療性蛋白、基于核酸的治療劑、非蛋白非核酸治療劑或用于免疫的試劑。在其最簡單的形式中，其可包含可被緩沖的簡單的水性藥物可接受的載體或稀釋劑，例如鹽水。然而，組合物可包含一般存在于局部藥物組合物或藥妝組合物中的其他成分，即皮膚或藥物可接受的載體、賦形劑或介質，即和其施用的組織相容的載體、賦形劑或介質。此處使用的術語“皮膚或藥物可接受的”是指此處描述的組合物或其組分適合用于和這些組織接觸，或用于患者而通常無過度的毒性、不相容性、不穩定性、過敏反應等。適當地，本發明的組合物可包含常規地用于所述領域特別是藥妝和皮膚學領域中的任何組分。在本發明的所有方面，載體和具有生物活性的試劑之間的結合是通過非共價相互作用結合的，所述相互作用包括，例如，離子相互作用、氫鍵、范德瓦爾斯力或其組合。
可預先配制組合物或在施用時制備組合物，例如，通過提供在施用時或施用前進行組裝的試劑盒來進行制備?？蛇x擇地，如上面所提到的，可以分開的方式例如通過提供這樣的試劑盒來給患者施用肉毒毒素或其他治療性蛋白和帶正電荷的主鏈或載體，所述試劑盒包含含有治療性蛋白的皮膚貼劑或其他分配裝置和含有帶正電荷的載體(和任選地其他成分)的液體、凝膠、乳膏劑等。在該特定的實施方案中，通過給皮膚使用含有載體的液體或其他組合物，然后使用皮膚貼劑或其他裝置來施用組合物。
如此施用本發明的組合物，以使能夠施用有效量的胰島素、肉毒毒素或其他有益物質。對于透皮遞送，術語“有效量”是指提供更多的具有生物活性的試劑的透皮遞送(和在缺少載體的情況下的試劑的透皮遞送相比)的任何組合物或方法。對于肉毒毒素，此處使用的術語“有效量”是指如上面所定義的這樣的量的肉毒毒素，該量的肉毒毒素足以產生想要的肌肉麻痹或其他效應，但該量絕對是安全的量，即低至足以避免嚴重的副作用的量。想要的效果包括使某些肌肉松弛，其目的在于例如減少細紋和/或皺紋(特別是在臉部的)的出現、或以其他方式例如加寬眼睛、抬高嘴角、或使從上唇散開的細紋平滑來調整面貌，或總體減緩肌肉緊張。最后提到的效果，即總體減緩肌肉緊張，可在臉部或其他部位例如在背部或腿部實現。對于胰島素，術語“有效量”類似地是指足以產生想要的效果即在患者或受試者的血液中降低葡萄糖的胰島素的量。對于抗原，“有效量”是指足以使受試者能夠在使用或系列使用抗原后產生對抗原的免疫應答的量。對于抗真菌劑，“有效量”是指足以減少真菌感染引起的癥狀或體征的量。對于不會治療性地改變血糖水平的其他具有生物活性的試劑而言，“有效量”是指這樣的量，即該量足以產生表征該試劑(例如Physicians′Desk Reference等中的試劑)的經定義的生物學效果或治療效果而不引起明顯的毒性。當使用術語“治療劑”或“具有生物活性的蛋白”時，本發明明確地排除了只結合特異性的抗原但不具有其它生物活性的抗體片段。然而，因為適合用于免疫的抗原具有其他生物活性例如產生免疫應答，因此這些仍屬于本發明的適當的方面。此外，本發明包含通過結合特異性的抗原，從而阻斷配體結合或改變抗原的構象而具有生物活性或治療效果的試劑。
組合物可包含合適的有效量的胰島素、肉毒毒素或其他具有生物活性的試劑(例如，不會治療性地改變血糖水平的治療性蛋白、基于核酸的治療劑、非蛋白非核酸治療劑或用于免疫的試劑)以單劑治療的方式進行使用，或其可以是更濃縮的，以在施用的部位進行稀釋的方式或以多次施用的方式進行使用。一般地，含有肉毒毒素或其他具有生物活性的試劑(例如，不會治療性地改變血糖水平的治療性蛋白或基于核酸的治療劑)的組合物可含有按重量計算從大約1×10-20至大約25％的具有生物活性的試劑和從大約1×10-19至30％的帶正電荷的載體。一般地，含有非蛋白非核酸治療劑或用于免疫的試劑的組合物可含有按重量計算從大約1×10-1至大約49.9％的抗原和從大約1×10-9至大約50％的帶正電荷的載體。一般地，本發明的組合物以適合于給受試者施用的形式含有從大約0.001至大約10,000，優選地從大約0.01至大約1,000IU/g的組合物(其是包含此處描述的肉毒毒素和帶正電荷的載體分子的組合物)。載體肉毒毒素的比例優選地分別地在大約10∶1至大約1.01∶1范圍內和更優選地在大約6∶1至大約1.5∶1的范圍內變動。載體分子的量或其對肉毒毒素的比例依賴于所述組合物中選擇使用的載體。通過，例如進行一個或多個實驗例如下面描述的實驗可容易地確定在給定的情況下載體分子的合適的量或比例。
本發明的組合物使得可以遞送更純的具有更高比活、潛在地提高的藥物動力學的肉毒毒素。此外，帶正電荷的載體減少了對外源輔助蛋白(例如，在400-600mg范圍內變化的人血清白蛋白或在250-500mg范圍內變化的重組血清白蛋白)和多糖穩定劑的需要并且可有益地降低對BTX的免疫應答。此外，所述組合物適合用于pH在4.5至6.3范圍內變化的生理環境，因此其可具有這樣的pH。所述組合物優選地可在室溫下或在冷藏的條件下貯存。
一般地如此使用包含肉毒毒素的組合物或裝置，以使其以這樣的劑量提供肉毒毒素，即每次使用每cm2的皮膚大約1U至大約20,000U、優選地大約1U至大約10,000U的肉毒毒素。例如，優選地可將這些范圍內的較高劑量和例如控釋材料一起使用，或使得能夠在除去前在皮膚上停留更短的時間。
在胰島素的情況下，本發明的組合物含有從大約0.011U至大約5000U/克，優選地從大約0.1U至大約500U/克的胰島素。包含此處描述的胰島素和帶正電荷的載體分子的形式的組合物優選地分別具有從大約30∶1至大約1.01∶1范圍內和更優選地從大約6∶1至大約1.25∶1范圍內變化的胰島素載體。同樣，載體分子的量或其對胰島素的比例依賴于所述組合物中選擇使用的載體。
根據其形式，本發明的組合物可包括溶液、乳液(包括微乳液)、懸浮液、乳膏劑、洗劑、凝膠、粉劑或其他類型的固體或液體組合物(用于可使用所述組合物的皮膚或其他組織)。除了肉毒毒素、胰島素或其他具有生物活性的試劑、和載體分子外，這些組合物可包含一般用于該產品的其他成分，例如抗微生物劑、增濕劑和水合劑、滲透劑、防腐劑、乳化劑、天然的或合成的油、溶劑、表面活性劑、去垢劑、膠凝劑、潤滑藥劑、抗氧化劑、芳香劑、充填劑、增稠劑、石蠟、氣味吸收劑(odor absorbers)、染料、著色劑、粉劑、粘性控制劑和水，和任選地包含麻醉劑、止癢活性劑、植物萃取物、調節劑、暗化劑(darkening agent)或亮化劑(lightening agent)、吉洛特、濕潤劑、云母、礦物質、多酚、硅酮或其衍生物、防曬劑(sunblocks)、維生素和植物藥(phytomedicinals)。在本發明的所有方面，載體和具有生物活性的試劑之間的結合是通過非共價相互作用結合的，其可包括，例如，離子相互作用、氫鍵、范德瓦爾斯力或其組合。
本發明的組合物可以控釋組合物或緩釋組合物的形式存在，其中將要遞送的胰島素、肉毒毒素或其他物質和載體包囊化或裝入材料中，以使其在一段時間內以受控的方式釋放至皮膚上?？蓪⒁f送的物質和載體裝入基質、脂質體、小泡、微囊、微球體等，或裝入固體顆粒材料，所有這些材料都是被選擇和/或構建來在一段時間內釋放所述物質的?？蓪⒅委熜晕镔|和載體一起包囊化(例如，在相同的包囊中)或分開包囊化(在分開的膠囊中)。
當然，給受試者施用本發明的組合物是本發明的另一方面。在肉毒毒素的情況下，最優選地，或在醫生的指導下或在其他專業護理人員(health professional)的指導下施用或由所述人員施用所述組合物?？梢詥蝿┲委煹姆绞交蛞砸欢螘r間內系列周期治療的方式施用其。對于為了上述目的的肉毒毒素的透皮遞送，在想要得到效果的部位上的皮膚局部施用上述組合物。因為其性質，最優選地，應當非常小心地，以可產生想要的結果但不產生任何不利的或不想要的結果的施用速率和施用頻率施用所用的肉毒毒素的量。
在胰島素的情況下，對于住院治療的患者或門診患者(in-officetreatments)，按照專業護理人員(health care professional)的指導進行施用或由專業護理人員進行施用，然而在其他情況下可能由患者進行施用。通過具有受控釋放和/或監控的皮膚貼劑等方式的施用可能是普便的方法，因此本發明的含有胰島素的組合物通常以包含在皮膚貼劑或其他裝置中的形式提供。在適合用于免疫的抗原的情況下，最優選地，通過或在醫生或其他專業護理人員的指導下施用所述組合物。其可以單次治療的方式或以在一段時間內系列周期治療的方式進行施用。因此，本發明也涉及緩釋組合物。對于為了上述目的適合用于免疫的抗原的透皮遞送，將上述的組合物局部地用于皮膚或甲板(nail plate)以及鄰近的皮膚。在非蛋白、非核酸治療劑例如抗真菌劑的情況下，優選地，在醫生或其他專業護理人員的指導下施用所述組合物。其可以單次治療或以在一段時間內系列周期治療的方式進行施用。也涉及非蛋白、非核酸治療劑的緩釋組合物。可通過使用例如人造甲板、甲油(lacquer)、具有著色劑的指甲油、凝膠或這些材料中的任何一些材料或所有材料的組合來給指甲或腳趾指板或周圍的解剖學結構施用抗真菌劑。對于為了上述目的肉毒毒素的透皮遞送，將上述的組合物局部地給皮膚施用。
用于在專業護理人員指導下施用或由患者或受試者施用的本發明組合物的試劑盒也可包含適合于該目的定制的施藥器。術語“定制的施藥器”是指包括剛提到的用于施用抗真菌劑的手段。
在另一方面，一般地，本發明涉及用于上述的帶正電荷的載體和有效量的胰島素、肉毒毒素、適合用于免疫的抗原、抗真菌劑或其他具有生物活性的試劑的組合的局部施用的方法，所述其他具有生物活性的試劑是例如，不會治療性地改變血糖水平的治療性蛋白、基于核酸的治療劑或非蛋白非核酸治療劑。如上所述，可通過使用包含適當的類型和量的這兩種物質(確切地說是載體和具有生物活性的試劑)的本發明的組合物來進行施用。然而，本發明也包括以組合的方式施用這兩類物質，盡管不一定以同一組合物的形式施用。例如，可將治療劑或具有生物活性的物質以無水的形式整合入皮膚貼劑或其他分配裝置中，可在使用皮膚貼劑之前將帶正電荷的載體給皮膚表面施用，這樣可使所述兩類物質共同作用，產生想要的透皮遞送。因此，在該意義上，所述兩類物質，確切地說是載體和具有生物活性的試劑，以組合的方式或結合的方式起作用，或可能相互作用以在原位形成組合物或組合。
制備組合物的方法在另一方面，本發明提供了用于制備藥物組合物的方法，該方法包括將帶正電荷的主鏈組分和至少兩種選自下列的成員與藥物可接受的載體組合以形成帶凈正電荷的非共價復合物，條件是所述成員中的至少一個選自i)、ii)、iii)或v)i)具有數個附著的成像部分或可選擇地數個帶負電荷的成像部分的第一帶負電荷的主鏈；ii)具有數個附著的靶向部分或可選擇地數個帶負電荷的靶向部分的第二帶負電荷的主鏈；iii)至少一個選自RNA、DNA、核酶、經修飾的寡核苷酸和編碼選擇的轉基因的cDNA的成員；iv)編碼至少一個駐留因子的DNA；和v)具有數個附著的生物學試劑或帶負電荷的生物學試劑的第三帶負電荷的主鏈；在相關方面，如上所述，在本發明的一些實施方案或組合物中，可單獨地使用帶正電荷的主鏈或載體以提供某些類型的物質的透皮遞送。包含具有生物活性的試劑例如肉毒毒素或不降低血糖的其他治療性蛋白、包含按重量計算大約1×10-2至大約25％的所述具有生物活性的試劑和大約1×10-19至大約30％的帶正電荷的載體的組合物和方法在此處是優選的。包含非核酸非蛋白的治療劑例如抗真菌劑或適合用于免疫的抗原、包含按重量計算大約1×10-10至大約49.9％的所述抗原和大約1×10-9至大約50％的帶正電荷的載體的組合物和方法也是優選的。在本發明的所有方面，載體和具有生物活性的試劑之間的結合是通過非共價相互作用結合的，該相互作用可包括，例如，離子相互作用、氫鍵、范德瓦爾斯力或其組合。
可容易地配制各種藥物組合物的這一易配性說明了本發明的廣泛的可應用性。一般地，通過將帶正電荷的主鏈組分和想要的目的組分(例如，DNA、靶向組分、成像組分或治療組分)按比例和順序混合以獲得具有可變的凈正電荷的組合物來制備組合物。在許多實施方案中，可通過例如在bedside使用用于組合物施用的藥物可接受的載體和稀釋劑來配制組合物。可選擇地，可通過混合合適的組分來配制組合物，然后將其凍干和貯存(通常在室溫下或更低溫度下)直至使用或將其配制入合適的遞送載體中。
可配制組合物以提供適合于局部、皮膚、口、直腸、陰道、腸胃外、鼻內、靜脈內、肌內、皮下、眼內、透皮等途徑施用的混合物。本發明的藥物組合物優選地包含這樣的載體，所述載體對于可注射特別是用于直接注射入想要的器官或用于局部施用(至皮膚和/或粘膜)的制劑是藥物可接受的。特別地其可以是無菌的、等滲溶液或無水組合物，特別是冷凍干燥的組合物，依賴于具體情況，其通過加入無菌水或生理鹽水，可使所述冷凍干燥的組合物產生可注射的溶液。例如，可根據各種參數，特別是根據使用的施用模式、涉及的病癥、要表達的基因或想要的治療持續時間，來調整用于注射的核酸的劑數和施用的次數。
可選擇地，當局部施用組合物時，例如，當想要透皮遞送時，可將目的組分以無水的形式給皮膚施用，例如，通過使用皮膚貼劑施用，其中以分開的方式用帶正電荷的主鏈或載體處理皮膚。通過該方式，所述完全的組合物基本上在原位形成并被施用給了患者或受試者。
使用組合物的方法遞送方法可使用各種方法在體內或離體將本發明的組合物遞送至受試者、細胞或靶位點。事實上，可使用一般用于將組合物導入并使其最終和要治療的組織接觸的途徑中的任一途徑。優選地，將組合物和藥物可接受的載體一起施用?？色@得施用這些化合物的合適的方法，所述方法對本領域技術人員來說是熟知的，并且，盡管可使用超過一條的途徑來施用特定的組合物，但和其他的途徑相比，特定的途徑通?？商峁└苯踊蚋行У姆磻?。通過特定的要被施用的組合物和通過用于施用組合物的方法部分地確定藥物可接受的載體。因此，存在許多合適的本發明的藥物組合物的制劑(參見，例如，Remington′sPharmaceutical Sciences，第17版，1985)。
可通過例如靜脈內、局部、腹膜內、subdermal、皮下、透皮、肌內、經口、關節內、腸胃外、鼻內或通過吸入進行施用。因此合適的施用位點包括，但不限于皮膚、小支氣管、胃腸道、眼睛和耳朵。組合物一般包含常規的藥物載體或賦形劑，并且可額外地包含其他藥劑、載體、佐劑等。優選地，按重量計算，本發明的制劑占組合物的大約5％至75％，剩余部分由合適的藥物賦形劑組成。可通過本領域熟知的方法(參見，例如，REMINGTON′S PHARMACEUTICAL SCIENCES，第18版，Mack Publishing Co.，Easton，PA(1990))使合適的賦形劑與特定的組合物和施用途徑相適應。
制劑可采用固體、半固體、冷凍干燥的粉劑、或液體劑型的形式例如片劑、丸劑、膠囊劑、粉劑、溶液、懸浮液、乳劑、栓劑、滯留型灌腸劑、乳膏劑、軟膏、洗劑、凝膠、氣霧劑等。在藥物組合物采用丸劑、片劑或膠囊劑的形式的實施方案中，制劑可包含具有生物活性的組合物和任何一種下列物質稀釋劑例如乳糖、蔗糖、磷酸二鈣等；崩解劑例如淀粉或其衍生物；潤滑劑例如硬脂酸鎂等；和粘合劑例如淀粉、阿拉伯膠、聚乙烯吡咯烷酮、明膠、纖維素和其衍生物。組合物可存在于單位劑量或多次劑量封閉的容器例如安瓿或小瓶中。給患者施用的劑量應當足以在一段時間內在患者中達到有益的治療性反應。當使用術語“治療劑”或“生物活性蛋白”時，本發明明確地排除了只結合特異性的抗原但不具有其它生物活性的抗體片段。然而，因為適合用于免疫的抗原具有其他生物活性例如產生免疫應答，因此這些仍屬于本發明的適當的方面。此外，本發明包含通過結合特異性的抗原，從而阻斷配體結合或改變抗原的構象而具有生物活性或治療效果的試劑。
在一些實施方案中，可給器官或培養細胞施用緩釋制劑或控釋制劑，所述制劑可攜帶想要的組合物?？赏ㄟ^例如注射給生物體的組織施用緩釋組合物。“緩釋”，其是指使組合物(優選地編碼目的轉基因的核酸或生物學試劑或治療劑)能夠被周圍的組織或細胞吸收更長的時間，該時間比通過施用粘性更低的介質例如鹽溶液中的所述組合物所達到的時間更長。
可將組合物單獨地或與其他合適的組分一起制成氣霧劑制劑(即，其可被“霧化”)，從而通過吸入法進行施用?？蓪忪F劑制劑置于加壓的可接受的推進劑例如二氯二氟甲烷、丙烷、氮氣等中。為了通過吸入法進行遞送，也可將組合物作為干粉遞送(例如，NektarTherapeutics，San Carlos，CA)。
適合腸胃外施用例如通過靜脈內、肌內、皮內和皮下途徑施用的制劑包括水性和非水性的、等滲無菌注射溶液和水性或非水性的無菌懸浮液，所述溶液可包含抗氧化劑、緩沖劑、制菌劑、和使制劑和想要的患者的血液等滲的溶質，所述懸浮液可包含懸浮劑、助溶劑、增稠劑、穩定劑和防腐劑。
施藥的其他方法包括，但不限于，使用血管成形氣囊、導管、凝膠制劑的施用。用于血管成形氣囊、導管和凝膠制劑遞送的方法在本領域是熟知的。
成像方法本領域技術人員理解，可使本發明的組合物適應各種成像應用。在一個實施方案中，可通過使用基于組分的成像系統進行虛擬結腸鏡術(Virtual Colonoscopy)。目前，虛擬結腸鏡術包括將造影劑注入結腸并在CT上顯現圖象，然后重構3-D圖象。類似的技術可用于MR。然而，糞便、粘液和空氣都可充當照影劑屏障，從而可給結腸壁的重建圖產生人為的表面。細胞靶向照影劑的加入可幫助克服這些障礙，從而提供真實的壁重建圖和幫助避免假陽性以及假陰性。存在幾種可在此使用基于組分的系統的方法。最簡單地，可將陽離子功效主鏈和單一的照影劑一起使用，例如用于CT、MR或光學方法。從而可顯現出細胞表面層，任何不規則物或障礙物都詳盡地顯示于圖象重建圖中。然而，基于組分的系統提供了加入特定的第二試劑的額外選擇。該試劑由陽離子功效主鏈、不同的成像部分和靶向組分(例如靶向兩個結腸癌的特征性抗原)組成。可這樣選擇成像部分(從簡單的成像部分至診斷劑)以使一種為CT照影劑而另一種為MR照影劑，或使兩種都為MR照影劑，其中一種為T2試劑而另一種為T1試劑。以這種方式，可按照前面所述的方法重建表面，對于腫瘤抗原是特異性的任何區域可被顯現和覆蓋在原始的重建圖上。此外，也可將治療劑整合入靶向診斷系統中。可將類似的策略用于局限性腸炎和潰瘍性結腸炎(與治療組合)?？蛇x擇地，可在例如黑色素瘤診斷或治療的情況下，使用優選地和熒光成像部分組合的光學成像部分和檢測方法。所述光學成像劑可選自例如Cy3、Cy3.5、Cy5、Cy5.5、Cy7、Cy7.5、Oregon green 488、Oregon green 500、Oregon green 514、綠色熒光蛋白、6-FAM、TexasRed、Hex、TET和HAMRA。
實施例實施例1本實施例舉例說明這樣的組合物，通過使用本發明的帶正電荷的主鏈或載體，所述組合物適合用于非常大的復合物，即包含藍色熒光蛋白(BFP)轉基因的質粒，的透皮遞送。
主鏈的選擇通過將-Gly3Arg7共價地附著至多聚賴氨酸MW 150,000來裝配帶正電荷的主鏈，通過以18％的飽和度(即每100個賴氨酸殘基中有18個賴氨酸殘基共價附著至-Gly3Arg7)將末端甘氨酸的羧基連接至賴氨酸側鏈的游離胺基來進行該附著。將所述經修飾的主鏈稱為“KNR2”以表示肽基載體的第二大小。對照聚陽離子是相同大小的來自相同批次的未經修飾的多聚賴氨酸(稱為“K2”，Sigma Chemical Co.，St.Louis，MO)。選擇另外的對照聚陽離子Superfect(Qiagen)作為體外高轉染率的參照(即體外現有技術功效對毒性的同時的正對照和參照)，該聚陽離子是被活化的基于樹枝狀高分子(dendrimer)的試劑。
治療劑的選擇使用包含由巨細胞病毒(CMV)啟動子驅動的藍色熒光蛋白(BFP)的完整的轉基因和部分側翼序列的8kb的質粒(基于pSport的模板，Gibco BRL，Gaithersburg，MD)。BFP用作已轉染細胞的可鑒定標記，然后轉錄和翻譯該基因從而可在熒光顯微鏡下直接被觀察到(即無需另外的染色)。因此，只有這樣的細胞(即其中在有效載荷遞送(payloaddelivery)前所述復合物已穿過質膜和核膜的細胞)可具有轉基因表達。該特定的質粒具有大約2.64×106的分子量，從而被選擇用于估計通過這些復合物進行的非常大的治療劑的遞送。
樣品的制備在各情況下，使用過量的聚陽離子裝配具有過量正電荷的終復合物。盡管增加電荷密度增加了大小(即每個復合物上存在更多的主鏈)，但每個復合物的效能因子密度上的增加可抵消這些改變。因此，最優選擇可在低比率(即基于大小)或高比率(即基于效能因子的密度)時發生，此處對KNR2的這兩個方面進行了估計。基于廠商的推薦和以前對最大功效的報導來選擇K2的功效和Superfect的功效的最佳比率。將所有組的核酸治療劑的劑量標準化，也對在細胞培養物中待測的組合物的總體積和終pH進行標準化。
制備下列混合物1)K2對0.5mg/mL表達由CMV啟動子驅動的藍色熒光蛋白的質粒的溶液，比率為4∶1。
2)KNR2對0.5mg/mL表達由CMV啟動子驅動的藍色熒光蛋白的質粒的溶液，比率為15∶1。
3)KNR2對0.5mg/mL表達由CMV啟動子驅動的藍色熒光蛋白的質粒的溶液，比率為10∶1。
4)KNR2對0.5mg/mL表達由CMV啟動子驅動的藍色熒光蛋白的質粒的溶液，比率為4∶1。
5)KNR2對0.5mg/mL表達由CMV啟動子驅動的藍色熒光蛋白的質粒的溶液，比率為1.25∶1。
6)廠商推薦的Superfect對0.5mg/mL表達由CMV啟動子驅動的藍色熒光蛋白的質粒的溶液，比率為5∶1。
細胞培養方案由對治療組不知情的觀測者進行所有細胞培養實驗。在6孔板上，向70％匯合的HA-VSMC原代人大動脈平滑肌細胞(第21代；ATCC，Rockville，MD)中加入1.0mL的各溶液并在含有10％血清的M-199中在37℃和10％的CO2下培養48小時。也對未處理的對照小孔進行估計，以每組n＝5個小孔對各組進行估計。
效率分析由盲測者(blinded observer)在60度、180度和200度下使用帶有BFP濾鏡和平場復消色差透鏡(plan apochromat lense)的NikonE600落射熒光顯微鏡從各小孔的上部獲得完整細胞板的低放大倍數照片(總計10X)。使用Image Pro Plus 3.0成像套件(image analysissuite)(Media Cybernetics，Silver Spring，MD)確定總的呈陽性的細胞面積的百分比。將該結果標準化為各組的總的細胞面積，并記錄為基因遞送的效率(以可檢測水平表達轉基因的總細胞的百分比)。
毒性分析隨后盲測者在染料排斥試驗(可存活的細胞排斥染料，而不能存活的細胞不能排斥染料)中對小孔進行估計，然后將小孔中的樣品溶解在0.4％的磷酸緩沖鹽溶液中的SDS中。在Spectronic Genesys 5UV/VIS分光光度計中在595nm波長(藍色)處對樣品進行估計以定量估計不能存活的細胞(作為轉染劑毒性的直接估量)。通過在OD595測量之前將濃度調整至與OD280值相匹配來將樣品標準化成同樣的細胞數目。
數據處理和統計分析盲測者通過使用Image Pro Plus軟件(Media Cybernetics，Silver Spring，MD)進行分批圖象分析(batch image analysis)來確定總的陽性染色并將其標準化為總的橫切面面積以確定各組的陽性染色的百分比。隨后在單向ANOVA重復測量(one way ANOVA repeatedmeasures)中使用Statview軟件(Abacus，Berkeley，CA)在95％的置信度下進行顯著性分析來確定各組的平均值和標準差。
結果效率效率的結果如下(平均值±標準差)1)0.163±0.106％2)10.642±2.195％3)8.797±3.839％4)15.035±1.098％5)17.574±6.807％6)1.199±0.573％和單獨的多聚賴氨酸和Superfect相比，Runs #4和#5表現出統計學上顯著(P＜0.05，使用Fisher PLSD和TUKEY-A事后檢測法進行單因子ANOVA重復測量)的基因遞送效率的增加。
毒性平均毒性數據如下(在OD595下以AU記錄的；低值，例如和單獨的鹽水一起存在，與低毒性關聯，而更高的值，例如在條件1下的，表明高細胞毒性)鹽水-0.057A；1)3.460A；2)0.251A；3)0.291A；4)0.243A；5)0.297A；6)0.337A。
結論用1.25至4.0的KNR2對DNA的比例可實現比對照(甚至目前的金標準Superfect的對照)毒性更小、效率更高的基因遞送。該實驗進一步確認了使用該載體將相當大的治療性復合物遞送過膜的能力。
實施例2該實施例舉例說明在一次施用后大的核酸通過本發明的載體穿過皮膚的運輸。
主鏈選擇通過將-Gly3Arg7共價地附著至多聚賴氨酸MW 150,000來裝配帶正電荷的主鏈，通過以18％的飽和度(即每100個賴氨酸殘基中有18個賴氨酸殘基共價附著至-Gly3Arg7)將末端甘氨酸的羧基連接至賴氨酸側鏈的游離胺基來進行該附著。和前面一樣，所述經修飾的主鏈被命名為“KNR2”。對照聚陽離子是相同大小的和來自相同批次的未經修飾的多聚賴氨酸(稱為“K2”，Sigma Chemical Co.，St.Louis，MO)。選擇另外的對照聚陽離子Superfect(Qiagen)作為高轉染率的參照(即體外現有技術功效對毒性的同時的正對照和參照)，該聚陽離子是被活化的基于樹枝狀高分子的試劑。
治療劑的選擇對于本實驗，使用包含由巨細胞病毒(CMV)啟動子驅動的大腸桿菌β半乳糖苷酶(βgal)的完整轉基因和部分側翼序列的8.5kb的質粒(基于pSport的模板，Gibco BRL，Gaithersburg，MD)。此處βgal用作已轉染細胞的可鑒定標記，然后轉錄和翻譯所述基因，在對所述外源酶進行特異性染色后可直接觀察。因此，只有這樣的細胞(即其中在有效載荷遞送前所述復合物已穿過皮膚，然后到達靶細胞，并轉位通過質膜和核膜的細胞)可具有轉基因表達。該特定的質粒具有大約2,805,000的分子量。
樣品的制備在各情況下，使用過量的聚陽離子裝配具有過量正電荷的終復合物?；趶S商的推薦和以前確定最大效率的體外實驗選擇對于K2的效率、KNR2的效率和Superfect的效率的最佳比率。將所有組的核酸治療劑的劑量標準化，也對要局部施用的組合物的總體積和終pH進行標準化。如下制備樣品標記為AK1的組將每個終等分(即總共80微克)8微克的βgal質粒(p/CMV-sport-βgal)和肽基載體KNR2以4∶1的比混合均勻并用磷酸緩沖鹽溶液稀釋至200微升。為進行體內實驗，將所得的組合物和1.8ml Cetaphil增濕劑混合均勻并以200微升進行等分。
標記為AL1的組將每個終等分(即總共80微克)8微克的βgal質粒(p/CMV-sport-βgal)和K2以4∶1的比混合均勻并用磷酸緩沖鹽溶液稀釋至200微升。為進行體內實驗，將所得的組合物和1.8mlCetaphil混合均勻并以200微升進行等分。
標記為AM1的組將每個終等分(即總共80微克)8微克的βgal質粒(p/CMV-sport-βgal)和Superfect以4∶1的比混合均勻并用磷酸緩沖鹽稀釋至200微升。為進行體內實驗，將所得的組合物和1.8mlCetaphil混合均勻并以200微升進行等分。
在用肽基載體和核酸治療劑進行一次處理后確定透皮遞送效率的動物實驗在處理期間通過吸入異氟烷麻痹動物。在被麻痹后，對C57 black6小鼠(每組n＝4)的背部皮膚的顱部分(之所以選擇該部分是因為小鼠不能用嘴或四肢達到該區域)施用200微升劑量的適當處理物。動物不進行脫毛處理。動物在受控的加熱環境中恢復以預防體溫過低，在有所反應后，任意提供食物和水過夜。處理后24小時，通過吸入CO2對小鼠實行安樂死，由盲測者收獲完整厚度的經處理的皮膚部分。將經處理的部分分成三個等分，用10％的中性緩沖的福爾馬林固定顱部分12-16小時，然后貯存在70％的乙醇中直至石蠟包埋。如先前所描述的，對中心部分進行快速冷凍并將其直接用于在37℃下在切片上進行β半乳糖苷酶染色(Waugh，J.M.，M.Kattash，J.Li，E.Yuksel，M.D.Kuo，M.Lussier，A.B.Weinfeld，R.Saxena，E.D.Rabinovsky，S.Thung，S.L.C.Woo，和S.M.Shenaq.LocalOverexpression of Tissue Plasminogen Activator to PreventArterial Thrombosis in an in vivo Rabbit Model.Proc Natl AcadSci USA.199996(3)1065-1070.還有Elkins CJ，Waugh JM，Amabile PG，Minamiguchi H，Uy M，Sugimoto K，Do YS，Ganaha F，Razavi MK，Dake MD.Development of aplatform to evaluate andlimit in-stent restenosis Tissue Engineering 2002.Jun；8(3)395-407)。將經處理的尾部節段進行快速冷凍以進行溶解研究。
毒性通過在成對的切片上進行染料排斥實驗來對上述接受功效分析的組進行毒性估計。切片只進行針對效率的染色或針對毒性的染色，因為該方法對同時進行兩種染色是不可靠的。對于毒性分析，將切片浸沒在排斥染料中5分鐘，然后在37℃下在10％的CO2下溫育30分鐘。在該時間期間不排斥染料的任何細胞被認為是不能存活的細胞。
數據處理和統計分析由盲測者進行數據收集和圖象分析。在具有平場復消色差透鏡的Nikon E600顯微鏡上對整個如上染色的切片照相。使用前述的ImagePro Plus軟件對所得的圖象進行分批圖象分析處理，用手工確認法確定β半乳糖苷酶活性(藍色，使用此處使用的底物法)或細胞毒性的陽性數。通過核固紅染色法將這些結果標準化為各組的細胞的總的橫切面數目，將所述結果以呈陽性染色的橫切面的百分比列表。然后，在單向ANOVA重復測量中使用Statview軟件(Abacus，Berkeley，CA)在95％的置信度下進行顯著性分析來確定各組的平均值和標準誤。
結果結果歸納在下面的表中并在圖3中進行說明。和K2(基本上為陰性對照)以及用作功效的基準標準的Superfect相比，帶正電荷的肽基透皮遞送載體在遞送效率和轉基因表達上獲得了統計學上顯著的增加。盡管相對于K2，Superfect確實獲得了統計學上顯著的提高，但在該模型系統中，和Superfect相比，KNR2在遞送效率上獲得了超過一個數量級的提高。
實施例2處理組的以總數目的百分比表示的β半乳糖苷酶呈陽性的細胞的平均值和標準差。
P＝0.0001(置信度99％時是顯著的)毒性的結果示于圖4，該圖描述了處理后24小時不能存活的總面積的百分比。此處，和KNR2或Superfect相比，K2表現出統計學上顯著的細胞毒性，即使是在這樣的劑量上亦如此，在該劑量上，前人報道K2具有較低的轉運效率(Amabile，P.G.，J.M.Waugh，T.Lewis，C.J.Elkins，T.Janus，M.D.Kuo，和M.D.Dake.IntravascularUltrasound Enhances in vivo Vascular Gene Delivery.J.Am.Col.Cardiol.2001 June；37(7)1975-80)。
結論肽基透皮載體可高效地將大的復合物轉運通過皮膚，特別是在以前所述的轉基因表達和總的復合物的大小受到限制的情況下。此處使用陽性面積而非陽性數目進行分析是因為(1)所述方法被大大簡化并且在圖象分析中具有大的精確性，(2)已在II.B中結論性地提供了效率的點證明，(3)面積測量值為理解體內結果提供了更廣的范圍，因為非細胞組分占據了橫切面的相當部分，和(4)有助于和更大的非肽基載體復合物的比較。
實施例3本實施例舉例說明在連續七天的應用中使用本發明的帶正電荷的肽基載體將大的基于核酸的治療劑穿過皮膚的透皮遞送。
主鏈的選擇通過將-Gly3Arg7共價地附著至多聚賴氨酸MW 150,000來裝配帶正電荷的主鏈，通過以18％的飽和度(即每100個賴氨酸殘基中有18個賴氨酸殘基共價附著至-Gly3Arg7)將末端甘氨酸的羧基連接至賴氨酸側鏈的游離胺基來進行該附著。所述經修飾的主鏈被命名為“KNR2”。對照聚陽離子是相同大小的和來自相同批次的未經修飾的多聚賴氨酸(稱為“K2”，Sigma Chemical Co.，St.Louis，MO)。
治療劑的選擇對于本實驗，使用包含由巨細胞病毒(CMV)啟動子驅動的大腸桿菌β半乳糖苷酶(βgal)的完整轉基因和部分側翼序列的8.5kb的質粒(基于pSport的模板，Gibco BRL，Gaithersburg，MD)。該特定的質粒具有大約2,805,000的分子量，從而被選擇用來估計通過肽基載體進行的非常大的治療劑穿過皮膚的遞送。
樣品的制備在各情況下，使用過量的聚陽離子裝配具有過量正電荷的終復合物。選擇實驗比例以比較前面的實驗中提出的單劑實驗。將所有組的核酸治療劑的劑量標準化，也對要局部施用的組合物的總體積和終pH進行標準化。如下制備樣品標記為AK1的組將每個終等分(即總共240微克)8微克的βgal質粒(p/CMV-sport-βgal)和肽基載體KNR2以4∶1的比混合均勻并用磷酸緩沖鹽稀釋至600微升。為進行體內實驗，將所得的組合物和5.4ml Cetaphil混合均勻并以200微升進行等分。
標記為AL1的組將每個終等分(即總共240微克)8微克的βgal質粒(p/CMV-sport-βgal)和K2以4∶1的比混合均勻并用磷酸緩沖鹽溶液稀釋至600微升。為進行體內實驗，將所得的組合物和5.4ml Cetaphil混合均勻并以200微升進行等分。
在用肽基載體和核酸治療劑進行7次每天一次的處理后確定累積的透皮遞送效率的動物實驗在處理期間通過吸入異氟烷麻痹動物。在被麻痹后，對C57 black6小鼠(每組n＝4)的背部皮膚的顱部分(之所以選擇該部分是因為小鼠不能用嘴或四肢達到該區域)施用200微升劑量的適當處理物。動物不進行脫毛處理。將動物在受控的加熱環境中恢復以預防體溫過低，在有反應后，任意提供食物和水過夜。在每天大致相同的時刻每天一次地重復該處理7天。在7天的處理后，通過吸入CO2對小鼠實行安樂死，由盲測者收獲完整厚度的經處理的皮膚部分。將經處理的部分分成三個等分，在10％的中性緩沖的福爾馬林中固定顱部分12-16小時，然后貯存在70％的乙醇中直至石蠟包埋。如前所述，對中心部分進行快速冷凍并將其直接用于在37℃下在切片上進行β半乳糖苷酶染色。將經處理的尾部節段進行快速冷凍以進行溶解研究。
數據處理和統計分析由盲測者進行數據收集和圖象分析。在具有平場復消色差透鏡的Nikon E600顯微鏡上對整個如上染色的切片照相。和前面一樣，使用Image Pro Plus軟件對所得的圖象進行分批圖象分析處理，用手工確認法確定對于β半乳糖苷酶活性是陽性的面積。將這些結果標準化為各組的總的橫切面面積，將所述結果以呈陽性染色的橫切面的百分比列表。然后，在單向ANOVA重復測量中使用Statview軟件(Abacus，Berkeley，CA)在95％的置信度下進行顯著性分析來確定各組的平均值和標準差。
結果將結果歸納于下面的表中并在圖5中進行說明。和K2相比，肽基透皮遞送載體在遞送效率和轉基因表達上獲得了統計學上顯著的增加。
實施例3在7次每天一次的施用后各處理組的以總面積的百分比表示的累積的β半乳糖苷酶的轉基因表達的平均值和標準差。
P＝0.0012(置信度為99％時是顯著的)實施例4(非肽基載體)本實施例舉例說明在連續七天的應用中使用本發明的帶正電荷的非肽基載體將大的基于核酸的治療劑穿過皮膚的透皮遞送。
主鏈選擇通過將-Gly3Arg7共價地附著至聚乙烯亞胺(PEI)MW 1,000,000來裝配帶正電荷的主鏈，通過以30％的飽和度(即每100個賴氨酸殘基中有30個賴氨酸殘基共價附著至-Gly3Arg7)將末端甘氨酸的羧基連接至PEI側鏈的游離胺基來進行該附著。所述經修飾的主鏈被命名為“PEIR”以表示大的非肽基載體。對照聚陽離子是相同大小的和來自相同批次的未經修飾的PEI(稱為“PEI”，Sigma Chemical Co.，St.Louis，MO)。
治療劑的選擇對于本實驗，使用包含由巨細胞病毒(CMV)啟動子驅動的大腸桿菌β半乳糖苷酶(βgal)的完整轉基因和部分側翼序列的8.5kb的質粒(基于pSport的模板，Gibco BRL，Gaithersburg，MD)。該特定的質粒具有大約2,805,000的分子量。
樣品的制備在各情況下，使用過量的聚陽離子裝配具有過量正電荷的終復合物。將所有組的核酸治療劑的劑量標準化，也對要局部施用的組合物的總體積和終pH進行標準化。如下制備樣品標記為AS的組將每個終等分(即總共240微克)8微克的βgal質粒(p/CMV-sport-βgal)和對照PEI以5∶1的比混合均勻并用Tris-EDTA緩沖液稀釋至600微升。為進行體內實驗，將所得的組合物和5.4ml Cetaphil混合均勻并以200微升進行等分。
標記為AT的組將每個終等分(即總共240微克)8微克的βgal質粒(p/CMV-sport-βgal)和組合物非肽基載體PEIR(“PEIR”)以5∶1的比混合均勻并用Tris-EDTA緩沖液稀釋至600微升。為進行體內實驗，將所得的組合物和5.4ml Cetaphil混合均勻并以200微升進行等分。
標記為AU的組將每個終等分(即總共240微克)8微克的βgal質粒(p/CMV-sport-βgal)和高度純化的Essentia非肽基載體PEIR(“純的PEIR”)以5∶1的比混合均勻并用Tris-EDTA緩沖液稀釋至600微升。為進行體內實驗，將所得的組合物和5.4ml Cetaphil混合均勻并以200微升進行等分。
在用非肽基載體和核酸治療劑進行7次每天一次的處理后確定累積的透皮遞送效率的動物實驗在處理期間通過吸入異氟烷麻痹動物。在被麻痹后，對C57 black6小鼠(每組n＝3)的背部皮膚的顱部分(之所以選擇該部分是因為小鼠不能用嘴或四肢達到該區域)施用200微升劑量的適當處理物。動物不進行脫毛處理。將動物在受控的加熱環境中恢復以預防體溫過低，在有反應后，任意提供食物和水過夜。在每天大致相同的時刻每天一次地重復該處理7天。在7天的處理后，通過吸入CO2對小鼠實行安樂死，由盲測者收獲完整厚度的經處理的皮膚部分。將經處理的部分分成三個等分，在10％的中性緩沖的福爾馬林中固定顱部分12-16小時，然后貯存在70％的乙醇中直至石蠟包埋。如前所述，對中心部分進行快速冷凍并將其直接用于在37℃下在切片上進行β半乳糖苷酶染色。將經處理的尾部節段進行快速冷凍以進行溶解研究。
數據處理和統計分析由盲測者進行數據收集和圖象分析。在具有平場復消色差透鏡的Nikon E600顯微鏡上對整個如上染色的切片照相。使用Image Pro Plus軟件對所得的圖象進行分批圖象分析處理，用手工確認法確定對于β半乳糖苷酶活性是陽性的面積。將這些結果標準化為各組的總的橫切面面積，將所述結果以呈陽性染色的橫切面的百分比列表。然后，在單向ANOVA重復測量中使用Statview軟件(Abacus，Berkeley，CA)在95％的置信度下進行顯著性分析來確定各組的平均值和標準差。
結果將結果歸納于下面的表中并在圖6中進行說明。和PEI相比，以組合物形式存在的和以超純形式存在的非肽基透皮遞送載體在遞送效率和轉基因表達上獲得了統計學上顯著的增加。PEIR的超純形式表現出比標準的PEIR具有更高的效率的傾向，這與計算得出的該試劑的更高的比活性一致。
實施例4在7次每天一次的施用后各處理組的以總面積百分比表示的累積的β半乳糖苷酶的轉基因表達的平均值和標準差。
P＝0.0058(置信度為99％時是顯著的)結論非肽基透皮載體可高效地將大的復合物轉運通過皮膚，特別是在前述的轉基因表達物和總復合物大小受到限制的情況下。盡管效率不如用更小的肽基載體的復合物獲得的效率高，但也獲得了顯著的增加。值得注意的是，使用大的非肽基復合物的基因表達產物的分布幾乎只位于毛囊，而肽基載體的分布結果是在整個截面上彌散。因此，大小和主鏈的向性可用于納米機制的靶向遞送。
實施例5本實施例顯示在一次施用后，和對照相比，肽基載體將含有完整的標記蛋白肉毒毒素的大復合物運輸穿過完整皮膚的用途。
主鏈的選擇通過將-Gly3Arg7共價地附著至多聚賴氨酸MW 112,000來裝配帶正電荷的主鏈，通過以18％的飽和度(即每100個賴氨酸殘基中有18個賴氨酸殘基共價地附著至-Gly3Arg7)將末端甘氨酸的羧基連接至賴氨酸側鏈的游離胺基來進行該附著。所述經修飾的主鏈被命名為“KNR”。對照聚陽離子是相同大小的和來自相同批次的未經修飾的多聚賴氨酸(稱為“K”，Sigma Chemical Co.，St.Louis，MO)。
治療劑選擇Boxtox商標的肉毒毒素A(Allergan)進行本實驗。其具有大約150,000的分子量。
樣品的制備根據廠商說明書重構肉毒毒素。用經計算超過12倍摩爾量的硫代NHS-LC生物素(Pierce Chemical)對蛋白等分進行生物素化。被標記的產物稱作“Btox-b”。
在各情況下，與遞送高度帶負電荷的大核酸復合物一樣，使用過量的聚陽離子裝配具有過量正電荷的終復合物。凈中性或凈正電荷防止了來自高度負電的細胞表面蛋白聚糖和細胞外基質對蛋白復合物的排斥。對所有組的Btox-b劑量進行標準化，也對要局部施用的組合物的總體積和終pH進行標準化。如下制備樣品標記為“JMW-7”的組將每等分(即總共20U)2.0U的Btox-b和肽基載體KNR以經計算為4∶1的MW比率混合均勻并用磷酸緩沖鹽溶液稀釋至200微升。將所得的組合物和1.8ml Cetaphil混合均勻并以200微升進行等分。
標記為“JMW-8”的組將每等分(即總共20U)2.0U的Btox-b和K以4∶1的比混合均勻并用磷酸緩沖鹽溶液稀釋至200微升。將所得的組合物和1.8ml Cetaphil混合均勻并以200微升進行等分。
在用肽基載體和經標記的肉毒毒素進行一次處理后確定透皮遞送效率的動物實驗在處理期間通過吸入異氟烷麻痹動物。在被麻痹后，C57 black 6小鼠(每組n＝4)接受局部敷藥，將200微升劑量的適當處理物施用于背部皮膚的顱部分(之所以選擇該部分是因為小鼠不能用嘴或四肢達到該區域)。動物不進行脫毛。在最初的處理之后30分鐘，通過吸入CO2對小鼠實行安樂死，由盲測者收獲完整厚度的經處理的皮膚部分。將經處理的部分分成三等分，在10％的中性緩沖的福爾馬林中固定顱部分12-16小時，然后貯存在70％的乙醇中直至石蠟包埋。如下面所概述的，由盲測者將中心部分進行快速冷凍并將其直接用于生物素顯示。為進行溶解研究，快速冷凍經處理的尾部節段。
如下進行生物素顯示。簡而言之，將各切片浸沒在NeutrAvidin緩沖液中1小時。為觀察堿性磷酸酶的活性，在鹽水中洗滌橫切面4次，然后浸沒在NBT/BCIP(Pierce Scientific)中1小時。然后在鹽水中漂洗切片，在具有平場復消色差透鏡的Nikon E600顯微鏡上對整個切片照相。
數據處理和統計分析由盲測者使用Image Pro Plus軟件(Media Cybernetics，SilverSpring，MD)通過分批圖象分析確定總的陽性染色，并將其標準化為總的橫切面面積以確定各組的陽性染色百分比。然后，在單向ANOVA重復測量中使用Statview軟件(Abacus，Berkeley，CA)在95％的置信度下進行顯著性分析來確定各組的平均值和標準差。
結論在將Btox-b與KNR(“EB-Btox”)或K(“n1”)一起進行一次局部施用后，用總面積的百分比來表示對于生物素化的肉毒毒素呈陽性的平均橫切面面積。將所述結果列于下列的表中并在圖7中進行說明。在圖7中，在用“EB-Btox”和“n1”進行三天每天一次的處理后，將對于標記是陽性的面積測定為總面積的百分比，其中所述“EB-Btox”包含Btox-b和肽基載體KNR，而“n1”包含Btoxb和聚陽離子K作為對照。描述各組的平均值和標準差。
實施例5.在將Btox-b與KNR(JMW-7)或K(JMW-8)一起進行一次局部施用30分鐘后，以總橫切面的百分比表示被標記的肉毒毒素面積的平均值和標準差。
P＝0.0001(置信度為99％時是顯著的)實施例6實施例5表明在鼠類模型的完整皮膚中局部施用后，肽基透皮載體可使肉毒毒素有效地轉運。然而，該實驗沒有表明復合蛋白肉毒毒素在轉運穿過皮膚后是否以功能性形式釋放。因此建立下列的實驗來估計使用該肽基載體(同樣，無蛋白的共價修飾)是否可將肉毒毒素作為局部試劑遞送穿過完整的皮膚仍具治療效果。
通過將-Gly3Arg7共價地附著至多聚賴氨酸MW 112,000來裝配帶正電荷的主鏈，以18％的飽和度(即每100個賴氨酸殘基中有18個賴氨酸殘基共價附著至-Gly3Arg7)將末端甘氨酸的羧基連接至賴氨酸側鏈的游離胺基來進行該附著。所述經修飾的主鏈被命名為“KNR”。對照聚陽離子是相同大小的和來自相同批次的未經修飾的多聚賴氨酸(稱為“K”，Sigma Chemical Co.，St.Louis，MO)。和在實施例5中一樣使用相同的肉毒毒素治療劑，和以相同的方式制備其。如下制備樣品標記為“JMW-9”的組將每等分(即總共60U)2.0單位的肉毒毒素和肽基載體KNR以經計算為4∶1的MW比率混合均勻并用磷酸緩沖鹽溶液稀釋至600微升。將所得的組合物和5.4ml Cetaphil混合均勻并以200微升進行等分。
標記為“JMW-10”的組將每等分(即總共60U)2.0單位的肉毒毒素和K以4∶1的比混合均勻并用磷酸緩沖鹽溶液稀釋至600微升。將所得的組合物和5.4ml Cetaphil混合均勻并以200微升進行等分。
標記為“JMW-11”的組用磷酸緩沖鹽溶液將每等分(即總共60U)2.0單位的無聚陽離子的肉毒毒素稀釋至600微升。將所得的組合物和5.4ml Cetaphil混合均勻并以200微升進行等分。
在用肽基載體和肉毒毒素進行一次處理后確定透皮遞送效率的動物實驗在處理期間通過吸入異氟烷麻痹動物。在被麻痹后，C57 black 6小鼠(每組n＝4)接受局部敷藥，將400微升劑量的適當處理物均一地施用于腳趾至大腿中部(mid-thigh)。兩只腿都進行處理，對腿的任一側，處理都是隨機的。動物不進行脫毛。在最初的處理之后30分鐘，根據公開的足趾外展(digital abduction)分值(用于評價足的靈活性)(Aoki，KR.A comparison of the safety margins of botulinumneurotoxin serotypes A，B，and F in mice.Toxicon.2001 Dec；39(12)1815-20)就在施用肉毒毒素后足趾外展的能力對小鼠進行估計。小鼠的靈活性也通過主觀估計。
數據處理和統計分析由兩個盲測者獨立地將足趾外展分值列表。然后，在單向ANOVA重復測量中使用Statview軟件(Abacus，Berkeley，CA)在95％的置信度下進行顯著性分析來確定各組的平均值和標準差。
結果將平均足趾外展分值(在肉毒毒素與KNR(“JMW-9”)、K(“JMW-10”)或無聚陽離子的稀釋劑一起進行一次局部施用后獲得的)示于下列的表中并在圖8的代表性顯微照片中進行說明。和兩個對照(其相互之間是相當的)相比，肽基載體KNR提供了統計學上顯著的肉毒毒素穿過皮膚的功能性遞送。本發明的另外的獨立重復實驗(總共三個獨立的實驗，所有實驗具有相同的結論具有KNR的局部肉毒毒素而不是對照具有統計學上顯著的麻痹作用)進一步確認了本發現和揭示了在具有K或不具有K的局部肉毒毒素(即兩個對照)之間沒有顯著的不同。有趣的是，小鼠始終朝向被麻痹的肢體方向走動(在100％的接受處理的動物中發生該現象，在來自任一對照組的對照中發生率為0％)。如圖8所示，用肉毒毒素和對照聚陽離子多聚賴氨酸或用肉毒毒素而無聚陽離子(“單獨的Btox”)處理的肢體可活動足趾(當被提起時，作為防御機制)，但用肉毒毒素和肽基載體KNR(“Essentia Btoxlotion”)處理的肢體則不能活動。
實施例6.在一次局部施用肉毒毒素和肽基載體KNR(“JMW-9”)、肉毒毒素和對照聚陽離子K(“JMW-10”)、和單獨的肉毒毒素(“JMW-11”)后30分鐘的足趾外展分值。
P＝0.0351(置信度為95％時是顯著的)結論本實驗表明肽基透皮載體可將治療有效量的肉毒毒素治療劑轉運穿過皮膚而無需治療劑的共價修飾。本實驗也進一步確認當在對照中局部施用時肉毒毒素不起作用。
實施例7本實驗展示非肽基載體在本發明中的表現。
主鏈的選擇通過將-Gly3Arg7共價地附著至聚乙烯亞胺(PEI)MW 1,000,000來裝配帶正電荷的主鏈，通過以30％的飽和度(即每100個賴氨酸殘基中有30個賴氨酸殘基共價附著至-Gly3Arg7)將末端甘氨酸的羧基連接至PEI側鏈的游離胺基來進行該附著。經修飾的主鏈被命名為“PEIR”以表示大的非肽基載體。對照聚陽離子是相同大小的和來自相同批次的未經修飾的PEI(稱為“PEI”，Sigma Chemical Co.，St.Louis，MO)。如實施例5中那樣使用相同的肉毒毒素治療劑。
根據廠商說明書從BOTOX產品重構肉毒毒素。在各情況下，與遞送高度帶負電荷的大核酸復合物一樣，使用過量的聚陽離子裝配具有過量正電荷的終復合物。凈中性或凈正電荷防止了來自高度負電的細胞表面蛋白聚糖和細胞外基質對蛋白復合物的排斥。對所有組的肉毒毒素劑量進行標準化，也對要局部施用的組合物的總體積和終pH進行標準化。如下制備樣品標記為“AZ”的組將每等分(即總共60U)2.0單位的肉毒毒素和超純形式的非肽基載體PEIR以經計算為5∶1的MW混合均勻并用磷酸緩沖鹽溶液稀釋至600微升。將所得的組合物和5.4ml Cetaphil混合均勻并以200微升進行等分。
標記為“BA”的組將每等分(即總共60U)2.0單位的肉毒毒素和PEI以5∶1的比混合均勻并用磷酸緩沖鹽溶液稀釋至600微升。將所得的組合物和5.4ml Cetaphil混合均勻并以200微升進行等分。
在一次處理后確定透皮遞送效率的動物實驗在處理期間通過吸入異氟烷麻痹動物。在被麻痹后，C57 black 6小鼠(每組n＝3)接受局部敷藥，將400微升劑量的適當處理物均一地施用于腳趾至大腿中部。對兩只腿都進行處理，對兩側中的任一側來說，處理都是隨機的。動物不進行脫毛處理。在最初的處理之后30分鐘，根據公開的足趾外展分值(用于評價足的靈活性)(Aoki，KR.Acomparison of the safety margins of botulinum neurotoxinserotypes A，B，and F in mice.Toxicon.2001 Dec；39(12)1815-20)在施用肉毒毒素后就足趾外展的能力對小鼠進行估計。小鼠的靈活性也通過主觀估計。
數據處理和統計分析由兩個盲測者獨立地將足趾外展分值列表。然后，在單向ANOVA重復測量中使用Statview軟件(Abacus，Berkeley，CA)在95％的置信度下進行顯著性分析來確定各組的平均值和標準差。
結果將在一次局部施用肉毒毒素和超純PEIR(“AZ”)、或肉毒毒素和對照聚陽離子PEI(“BA”)、和重復實驗(本試驗的單一獨立重復實驗)后獲得的平均足趾外展分值示于下列的表中。和對照相比，非肽基載體PEIR提供了統計學上顯著的肉毒毒素穿過皮膚的功能性遞送。和前面一樣，觀察到動物朝向被麻痹的肢體作圓周走動。
實施例7.重復實驗1.在一次局部施用肉毒毒素和超純PEIR(“AZ”)、或肉毒毒素和對照聚陽離子PEI(“BA”)后30分鐘的足趾外展分值。顯示平均值和標準差。
P＝0.0002(置信度為99％時是顯著的)實施例7.重復實驗2.在一次局部施用肉毒毒素和超純PEIR(“AZ1”)、或肉毒毒素和對照聚陽離子PEI(“BA1”)后30分鐘的足趾外展分值。顯示平均值和標準差。
P＝0.0001(置信度為99％時是顯著的)
結論本實驗表明非肽基透皮載體可將治療劑量的肉毒毒素轉運穿過皮膚而無需在之前共價修飾肉毒毒素。這些發現補充了用肽基轉移試劑進行的實驗。使用非肽基或肽基載體獲得治療效果的選擇可使施用適合特定的情況、環境和方法，加寬了本發明的透皮遞送平臺的范圍。
在這些實施例中，使用肽基或非肽基載體的肉毒毒素滲透對不使用所述載體的局部肉毒毒素進一步產生了透皮滲透抗原以進行免疫的用途，特別是在使用不易穿過皮膚的抗原例如肉毒桿菌進行免疫的情況下。功能性肉毒毒素的遞送確保至少4個不同的抗原表位以完整的狀態被透皮遞送；在兩個實施例中的任何一個中在缺少所述載體的情況下都不能遞送功能性肉毒毒素的事實進一步證實相對于缺少載體的試劑，所述載體提供了顯著的免疫潛能。因為免疫要求抗原以足以產生免疫應答的量穿過皮膚，該方法使得能夠遞送用于免疫的抗原。因為該方法不要求抗原的共價修飾和不需要涉及病毒的基因轉移，因此在安全穩定性和效率方面產生了許多有利方面。
實施例8本發明詳述了具有TAT效能因子的肽基和非肽基載體的產生以及這些載體和肉毒毒素的裝配。
聚乙烯亞胺(PEI)和TAT片段GGGRKKRRQRRR的偶聯將缺少所有側鏈保護基團的TAT片段GGGRKKRRQRRR(6mg，0.004mmol，Sigma Genosys，Houston，TX)溶解在1ml 0.1M MES緩沖液中。向其中加入EDC(3mg，0.016mmol)，然后加入50％(w∶v)的水中的PEI 400k(分子量)溶液(～0.02ml，～2.5×10-5mmol)。通過試紙測定pH為7.5。再加入1ml的0.1M MES，加入HCl將pH調整至大約為5。再加入一部分EDC(5mg，0.026mmol)，攪拌pH～5的反應物過夜。第二天早上，冷凍和凍干反應混合物。
用無菌1xPBS將Sephadex G-25柱子(直徑1cm×高14cm)(Amersham Biosciences Corp.，Piscataway，NJ)調成漿。通過具有19kD分子量的FITC葡聚糖(Sigma，St Louis，MO)的洗脫標準化柱子。標準物最初在5ml PBS處洗脫，在6ml處具有中間峰，在7ml處結束。將來自上面的凍干的反應混合物溶解在小體積的PBS中并加到柱上。通過連續加入1ml PBS來洗脫其。收集級分，第一級分由首先洗脫的3ml組成，包括反應物體積。隨后的級分為1ml。
在280nm處測定被洗脫的級分的UV吸光率。對應于5-7ml的級分3、4和5顯示出中等吸收峰。將所有級分凍干并獲取紅外光譜。在級分4-6中觀察到TAT片段的特征性胍三重峰(2800-3000cm-1)。這些級分也顯示在1700cm-1處的酰胺片段，從而進一步確定TAT片段和PEI的偶聯。
使用TAT片段GGGRKKRRQRRR(11.6mg，0.007mmol)進行另一重復實驗。計算該量以使30個PEI胺基中有一個預期和TAT片段反應。這非常接近上述的原始的多聚賴氨酸-寡聚精氨酸(KNR)功效因子的組成。如上所述通過IR進一步確定TAT片段與PEI胺基的成功的共價附著。
多聚賴氨酸與TAT片段的偶聯向1ml 0.1M MES，pH～4.5中的多聚賴氨酸(10mg 1.1×10-4mmol；Sigma)溶液中加入TAT片段(4mg，0.003mmol)，然后再加入EDC(3.5mg，0.0183mmol)。在室溫下攪拌所得的反應混合物(pH～4.5)。將反應物在-78℃下冷凍過夜。第二天將反應混合物融解至室溫，通過加入飽和碳酸氫鈉將pH調整至～8。將反應混合物直接用于如上所述構建和標準化的Sephadex G-25柱。其洗脫于7個始于5ml后的1ml級分中。測出UV280的吸光率，在級分2、3和4中顯示出相關的峰。凍干的級分的IR顯示級分1-7中的特征性胍峰(2800-3000cm-1)。級分1在1730cm-1處具有很強的峰而在1600cm-1處無峰，對于級分2-6，情況正好相反。因此，進一步確定了TAT片段至肽基載體多聚賴氨酸的成功的共價附著。
隨后將共價附著的TAT片段和PEI(PEIT)以及共價附著的TAT片段和多聚賴氨酸(KNT)與肉毒毒素混合以形成如下的非共價復合物標記為“JL-1”的組將每等分(即總共20U)2.0單位的Btox-b和PEIT以4∶1的比混合均勻并用磷酸緩沖鹽溶液稀釋至200微升。
標記為“JL-2”的組將每等分(即總共20U)2.0單位的Btox-b和KNT以4∶1的比混合均勻并用磷酸緩沖鹽溶液稀釋至200微升。
在非共價復合物形成后，將顆粒在12,000xg下在旋轉微量離心管中離心5分鐘，然后在20微升去離子水中重懸乳并在Germanium衰減全反射小室中進行蒸發以進行IR。從而進一步確認復合物中Btox-b的存在?？傮w而言，該實驗進一步確定合成方案可用于其他效能因子，如在前面的實施例中一樣，通過使用具有帶正電荷的分支基團的寡聚精氨酸或效能基團的載體可將所得的載體和具有生物活性的試劑(在該情況下是肉毒毒素)結合。
實例9本實驗展示用于特定抗原成像的肽基載體的性能。在本實驗中，光學成像部分、經修飾的靶向黑色素瘤的抗體和一種Essentia肽基載體KNR2的復合物適合用于黑色素瘤的局部檢測。
主鏈的選擇通過將-Gly3Arg7共價地附著至多聚賴氨酸MW 150,000來裝配帶正電荷的肽基主鏈，通過以18％的飽和度(即每100個賴氨酸殘基中有18個賴氨酸殘基共價附著至-Gly3Arg7)將末端甘氨酸的羧基連接至賴氨酸側鏈的游離胺基來進行該附著。經修飾的主鏈被命名為“KNR2”。對照聚陽離子是相同大小的來自相同批次的未經修飾的多聚賴氨酸(稱為“K2”，Sigma Chemical Co.，St.Louis，MO)。
通過上述的EDC偶聯將針對保守的人黑色素瘤結構域神經節苷脂2的鼠類單克隆抗體(IgG3，US Biologicals，Swampscott，MA)共價地附著至短的多聚天冬氨酸陰離子鏈(MW 3,000)以產生稱為“Gang2Asp”的衍生抗體。此外，通過使用寡核酸作為聚陰離子設計陰離子成像試劑，其中序列是ATGC-J(此后稱作“ATGC-J”)，“J”代表共價附著的Texas Red熒光團，(Sigma Genosys，Woodlands，TX)。為進行本實驗，將6.35微克Gang2Asp和0.1712微克ATGC-J混合，然后再和17.5微克KNR2在總體積為200微升的去離子水中復合以獲得5∶1∶1KNR2∶ATGC-J∶Gang2Asp的比例。將混合物渦旋2分鐘。將所得的復合物施加于水合CellTek Human Melanoma切片和對照CellTek Cytokeratin切片(SDL，Des Plaines，IL)上，并在對相同視野中的黑色素瘤色素的熒光分布對亮視野分布進行照相測定前溫育5分鐘。也使用不具有ATGC-J或不具有Gang2Asp的額外的對照。
結果非共價復合物提供了遵從抗體衍生物的向性的光學成像試劑的分布，而不是在缺少抗體的情況下的復合物的分布。更值得注目的是，如圖9中描述的，所述復合物的分布與黑色素瘤細胞的分布相一致。
結論本實驗展示了使用適合用于局部遞送的載體產生用于穿過皮膚的轉運和通過光學技術顯現黑色素瘤的可行復合物?？蓪⑦@樣的方法和例如手術邊界確定法(surgical margin-setting)結合使用或可將其用于常規的黑色素瘤監視。也可容易地將類似的策略用于其他和皮膚相關的病癥的局部診斷，這對本領域技術人員來說是顯而易見的。假定光學成像部分具有非常高的靈敏度，那么通過這些非共價復合物可在提高對這些疾病的檢測上提供遠大的前景。
要理解此處描述的實施例和實施方案只是用于說明目的，要理解本領域技術人員會聯想到其各種修飾或改變，所述修飾或改變在本申請的精神和范圍內和在所附的權利要求的范圍內。此處引用的所有出版物、專利和專利申請以其全文在此引用作為所有目的的參考。
權利要求
1.包含具有生物活性的蛋白和載體的組合物，所述具有生物活性的蛋白不會治療性地改變血糖水平，所述載體包含附著有帶正電荷的分支基團的帶正電荷的主鏈并且該載體以對透皮遞送有效的量存在，其中所述載體和所述具有生物活性的蛋白之間的結合是非共價結合。
2.權利要求1的組合物，其中和缺少所述載體的具有生物活性的蛋白相比，所述組合物提供更多的所述具有生物活性的蛋白的透皮遞送。
3.權利要求2的組合物，其中所述具有生物活性的蛋白具有治療活性。
4.包含非蛋白非核酸的具有生物活性的試劑和載體的組合物，所述載體包含附著有帶正電荷的分支基團的帶正電荷的主鏈并且其以對透皮遞送有效的量存在，其中所述載體和所述具有生物活性的試劑之間的結合是非共價結合。
5.權利要求4的組合物，其中和缺少所述載體的具有生物活性的試劑相比，所述組合物提供更多的所述具有生物活性的試劑的透皮遞送。
6.權利要求5的組合物，其中所述具有生物活性的試劑具有治療性活性。
7.權利要求3的組合物，其中所述治療性蛋白具有至少50,000kD的分子量。
8.權利要求1的組合物，其中所述主鏈包含帶正電荷的多肽。
9.權利要求8的組合物，其中所述主鏈包含具有從大約10,000至大約1,500,000的分子量的帶正電荷的多肽。
10.權利要求8的組合物，其中所述主鏈包含具有從大約25,000至大約1,200,000的分子量的帶正電荷的多肽。
11.權利要求8的組合物，其中所述主鏈包含具有從大約100,000至大約1,000,000的分子量的帶正電荷的多肽。
12.權利要求8的組合物，其中所述主鏈包含帶正電荷的多聚賴氨酸。
13.權利要求12的組合物，其中所述主鏈包含具有從大約10,000至大約1,500,000的分子量的帶正電荷的多聚賴氨酸。
14.權利要求12的組合物，其中所述主鏈包含具有從大約25,000至大約1,200,000的分子量的帶正電荷的多聚賴氨酸。
15.權利要求12的組合物，其中所述主鏈包含具有從大約100,000至大約1,000,000的分子量的帶正電荷的多聚賴氨酸。
16.權利要求1的組合物，其中所述主鏈包含帶正電荷的非肽基聚合物。
17.權利要求16的組合物，其中所述非肽基聚合物主鏈包含帶正電荷的聚烯化亞胺。
18.權利要求17的組合物，其中所述聚烯化亞胺是聚乙烯亞胺。
19.權利要求18的組合物，其中所述聚乙烯亞胺具有從大約10,000至大約2,500,000的分子量。
20.權利要求18的組合物，其中所述聚乙烯亞胺具有從大約100,000至大約1,800,000的分子量。
21.權利要求18的組合物，其中所述聚乙烯亞胺具有從大約500,000至大約1,400,000的分子量。
22.權利要求1的組合物，其中所述載體包含帶正電荷的聚合物，所述聚合物具有附著的獨立選自-(gly)n1-(arg)n2、HIV-TAT和其片段、以及觸角足PTD和其片段或混合物的帶正電荷的分支基團，其中下標n1是從0至大約20的整數，下標n2獨立地是從大約5至大約25的奇整數。
23.權利要求22的組合物，其中帶正電荷的分支基團獨立地選自具有式-(gly)n1-(arg)n2的基團。
24.權利要求23的組合物，其中下標n1是從大約1至大約8的整數。
25.權利要求23的組合物，其中下標n1是從大約2至大約5的整數。
26.權利要求23的組合物，其中下標n2是從大約7至大約17的奇數。
27.權利要求23的組合物，其中下標n2是從大約7至大約13的奇數。
28.權利要求22的組合物，其中所述分支基團選自HIV-TAT和其片段。
29.權利要求28的組合物，其中所述附著的帶正電荷的分支基團是具有式(gly)p-RGRDDRRQRRR-(gly)q、(gly)p-YGRKKRRQRRR-(gly)q或(gly)p-RKKRRQRRR-(gly)q的HIV-TAT片段，其中下標p和q各自獨立地是從0至20的整數。
30.權利要求22的組合物，其中所述分支基團是觸角足PTD基團或其片段。
31.權利要求22的組合物，其中所述帶正荷的聚合物包含多肽。
32.權利要求31的組合物，其中所述多肽選自多聚賴氨酸、多聚精氨酸和多聚鳥氨酸。
33.權利要求32的組合物，其中所述多肽是多聚賴氨酸。
34.權利要求22的組合物，其中所述聚合物包含帶正電荷的非肽基聚合物。
35.權利要求34的組合物，其中所述非肽基聚合物包含帶正電荷的聚烯化亞胺。
36.權利要求35的組合物，其中所述聚烯化亞胺是聚乙烯亞胺。
37.權利要求4的組合物，其中所述主鏈包含帶正電荷的多肽。
38.權利要求37的組合物，其中所述主鏈包含具有從大約10,000至大約1,500,000的分子量的帶正電荷的多肽。
39.權利要求37的組合物，其中所述主鏈包含具有從大約25,000至大約1,200,000的分子量的帶正電荷的多肽。
40.權利要求37的組合物，其中所述主鏈包含具有從大約100,000至大約1,000,000的分子量的帶正電荷的多肽。
41.權利要求37的組合物，其中所述主鏈包含帶正電荷的多聚賴氨酸。
42.權利要求41的組合物，其中所述主鏈包含具有從大約10,000至大約1,500,000的分子量的帶正電荷的多聚賴氨酸。
43.權利要求41的組合物，其中所述主鏈包含具有從大約25,000至大約1,200,000的分子量的帶正電荷的多聚賴氨酸。
44.權利要求41的組合物，其中所述主鏈包含具有從大約100,000至大約1,000,000的分子量的帶正電荷的多聚賴氨酸。
45.權利要求4的組合物，其中所述主鏈包含帶正電荷的非肽基聚合物。
46.權利要求45的組合物，其中所述非肽基聚合物主鏈包含帶正電荷的聚烯化亞胺。
47.權利要求46的組合物，其中所述聚烯化亞胺是聚乙烯亞胺。
48.權利要求47的組合物，其中所述聚乙烯亞胺具有從大約10,000至大約2,500,000的分子量。
49.權利要求47的組合物，其中所述聚乙烯亞胺具有從大約100,000至大約1,800,000的分子量。
50.權利要求47的組合物，其中所述聚乙烯亞胺具有從大約500,000至大約1,400,000的分子量。
51.權利要求4的組合物，其中所述載體包含帶正電荷的聚合物，該聚合物具有附著的獨立地選自-(gly)n1-(arg)n2、HIV-TAT和其片段、以及觸角足PTD和其片段或混合物的帶正電荷的分支基團，其中下標n1是從0至大約20的整數，下標n2獨立地是從大約5至大約25的奇整數。
52.權利要求51的組合物，其中所述帶正電荷的分支基團獨立地選自具有式-(gly)n1-(arg)n2的基團。
53.權利要求52的組合物，其中下標n1是從大約1至大約8的整數。
54.權利要求52的組合物，其中下標n1是從大約2至大約5的整數。
55.權利要求52的組合物，其中下標n2是從大約7至大約17的奇數。
56.權利要求52的組合物，其中下標n2是從大約7至大約13的奇數。
57.權利要求51的組合物，其中所述分支基團選自HIV-TAT和其片段。
58.權利要求57的組合物，其中所述附著的帶正電荷的分支基團是具有式(gly)p-RGRDDRRQRRR-(gly)q、(gly)p-YGRKKRRQRRR-(gly)q或(gly)p-RKKRRQRRR-(gly)q的HIV-TAT片段，其中下標p和q各自獨立地是從0至20的整數。
59.權利要求51的組合物，其中所述分支基團是觸角足PTD基團或其片段。
60.權利要求51的組合物，其中所述帶正電荷的聚合物包含多肽。
61.權利要求60的組合物，其中所述多肽選自多聚賴氨酸、多聚精氨酸、多聚鳥氨酸和多聚高精氨酸。
62.權利要求61的組合物，其中所述多肽是多聚賴氨酸。
63.權利要求51的組合物，其中所述聚合物包含帶正電荷的非肽基聚合物。
64.權利要求63的組合物，其中所述非肽基聚合物包含帶正電荷的聚烯化亞胺。
65.權利要求64的組合物，其中所述聚烯化亞胺是聚乙烯亞胺。
66.權利要求4的組合物，其包含按重量計算從大約1×10-20至大約25％的具有生物活性的試劑和從大約1×10-19至大約30％的帶正電荷的載體。
67.權利要求4的控釋組合物。
68.權利要求1的組合物，其中所述具有生物活性的蛋白是肉毒毒素。
69.權利要求68的組合物，其中所述肉毒毒素選自A、B、C、D、E、F和G血清型肉毒毒素。
70.權利要求68的組合物，其中所述肉毒毒素包括肉毒毒素衍生物。
71.權利要求68的組合物，其中所述肉毒毒素包括重組肉毒毒素。
72.用于將權利要求1的組合物給受試者施用的試劑盒，其包含用于遞送具有生物活性的試劑和載體的裝置，所述載體包含具有附著的帶正電荷的分支基團的帶正電荷的主鏈，該載體以對透皮遞送有效的量存在。
73.權利要求72的試劑盒，其中所述具有生物活性的試劑是肉毒毒素。
74.權利要求72的試劑盒，其中所述組合物含于用于通過皮膚或上皮將具有生物活性的蛋白施用給受試者的裝置中。
75.權利要求74的試劑盒，其中所述裝置是皮膚貼劑。
76.用于將具有生物活性的蛋白給受試者施用的試劑盒，其包含用于將具有生物活性的蛋白遞送給皮膚或上皮的裝置和組合物，所述組合物包含帶正電荷的載體，所述載體具有附著的獨立地選自-(gly)n1-(arg)n2、HIV-TAT和其片段、以及觸角足PTD和其片段或混合物的帶正電荷的分支基團，其中下標n1是從0至大約20的整數，下標n2獨立地是從大約5至大約25的奇整數，其中所述載體和具有生物活性的蛋白之間的結合是非共價結合。
77.權利要求76的試劑盒，其中所述裝置是皮膚貼劑。
78.給受試者施用具有生物活性的蛋白的方法，所述具有生物活性的蛋白不會治療性地改變血糖水平，該方法包括將所述蛋白和有效量的帶電荷的載體一起給受試者的皮膚或上皮局部地施用，所述載體包含具有附著的帶正電荷的分支基團的帶正電荷的主鏈，其中所述載體和具有生物活性的蛋白之間的結合是非共價結合。
79.權利要求78的方法，其中和缺少所述載體的具有生物活性的蛋白相比，所述組合物提供更多的具有生物活性的蛋白的透皮遞送。
80.權利要求79的方法，其中所述具有生物活性的蛋白具有治療活性。
81.給受試者施用非蛋白非核酸的具有生物活性的試劑的方法，該方法包括將所述具有生物活性的試劑和有效量的帶電荷的載體給受試者的皮膚或上皮局部地施用，所述載體包含具有附著的帶正電荷的分支基團的帶正電荷的主鏈，其中所述載體和具有生物活性的試劑之間的結合是非共價結合。
82.權利要求81的方法，其中和缺少所述載體的試劑相比，所述組合物提供更多的具有生物活性的試劑的透皮遞送。
83.權利要求82的方法，其中所述具有生物活性的試劑具有治療活性。
84.權利要求80的方法，其中將所述具有生物活性的蛋白和載體以含有兩種成分的組合物形式給受試者施用。
85.權利要求80的方法，其中將所述具有生物活性的蛋白和載體以分開的方式給受試者施用。
86.權利要求83的方法，其中將所述具有生物活性的蛋白和載體以包含兩種成分的組合物的方式給受試者施用。
87.權利要求83的方法，其中將所述具有生物活性的試劑和載體以分開的方式給受試者施用。
88.權利要求80的方法，其中所述組合物是控釋組合物或緩釋組合物。
89.權利要求83的方法，其中所述組合物是控釋組合物或緩釋組合物。
90.權利要求80的方法，其中所述治療性蛋白是肉毒毒素。
91.權利要求90的方法，其中所述肉毒毒素選自A、B、C、D、E、F和G血清型肉毒毒素。
92.權利要求90的方法，其中所述肉毒毒素包括肉毒毒素衍生物。
93.權利要求90的方法，其中所述肉毒毒素包括重組肉毒毒素。
94.權利要求90的方法，其中給受試者施用所述肉毒毒素以提供美學和/或美容益處。
95.權利要求90的方法，其中給受試者施用肉毒毒素以預防或減輕和肌肉痙攣或抽搐相關的癥狀。
96.權利要求90的方法，其中將肉毒毒素和所述帶正電荷的載體給受試者臉上位置局部施用。
97.權利要求90的方法，其中將肉毒毒素和所述帶正電荷的載體給受試者的除了臉部以外的位置局部施用。
98.包含適合用于免疫的抗原和載體的組合物，所述載體包含具有附著的帶正電荷的分支基團的帶正電荷的主鏈，并且該載體以對透皮遞送有效的量存在，其中所述載體和所述抗原之間的結合是非共價結合。
99.權利要求98的組合物，其中所述主鏈包含帶正電荷的多肽。
100.權利要求99的組合物，其中所述主鏈包含具有從大約10,000至大約1,500,000的分子量的帶正電荷的多肽。
101.權利要求99的組合物，其中所述主鏈包含具有從大約25,000至大約1,200,000的分子量的帶正電荷的多肽。
102.權利要求99的組合物，其中所述主鏈包含具有從大約100,000至大約1,000,000的分子量的帶正電荷的多肽。
103.權利要求99的組合物，其中所述主鏈包含帶正電荷的多聚賴氨酸。
104.權利要求103的組合物，其中所述主鏈包含具有從大約10,000至大約1,500,000的分子量的帶正電荷的多聚賴氨酸。
105.權利要求103的組合物，其中所述主鏈包含具有從大約25,000至大約1,200,000的分子量的帶正電荷的多聚賴氨酸。
106.權利要求103的組合物，其中所述主鏈包含具有從大約100,000至大約1,000,000的分子量的帶正電荷的多聚賴氨酸。
107.權利要求98的組合物，其中所述主鏈包含帶正電荷的非肽基聚合物。
108.權利要求107的組合物，其中所述非肽基聚合物主鏈包含帶正電荷的聚烯化亞胺。
109.權利要求108的組合物，其中所述聚烯化亞胺是聚乙烯亞胺。
110.權利要求109的組合物，其中所述聚乙烯亞胺具有從大約10,000至2,500,000的分子量。
111.權利要求109的組合物，其中所述聚乙烯亞胺具有從大約100,000至大約1,800,000的分子量。
112.權利要求109的組合物，其中所述聚乙烯亞胺具有從大約500,000至大約1,400,000的分子量。
113.權利要求98的組合物，其中所述載體包含帶正電荷的聚合物，該聚合物具有附著的獨立地選自-(gly)n1-(arg)n2、HIV-TAT和其片段、以及觸角足PTD和其片段或混合物的帶正電荷的分支基團，其中下標n1是從0至大約20的整數，下標n2獨立地是從大約5至大約25的奇整數。
114.權利要求113的組合物，其中所述帶正電荷的分支基團獨立地選自具有式-(gly)n1-(arg)n2的基團。
115.權利要求114的組合物，其中下標n1是從大約1至大約8的整數。
116.權利要求114的組合物，其中下標n1是從大約2至大約5的整數。
117.權利要求114的組合物，其中下標n2是從大約7至大約17的奇數。
118.權利要求114的組合物，其中下標n2是從大約7至大約13的奇數。
119.權利要求113的組合物，其中所述分支基團選自HIV-TAT和其片段。
120.權利要求119的組合物，其中所述附著的帶正電荷的分支基團是具有式(gly)p-RGRDDRRQRRR-(gly)q、(gly)p-YGRKKRRQRRR-(gly)q或(gly)p-RKKRRQRRR-(gly)q的HIV-TAT片段，其中下標p和q各自獨立地是從0至20的整數。
121.權利要求113的組合物，其中所述分支基團是觸角足PTD基團。
122.權利要求113的組合物，其中所述帶正電荷的聚合物包含多肽。
123.權利要求122的組合物，其中所述多肽選自多聚賴氨酸、多聚精氨酸和多聚鳥氨酸。
124.權利要求123的組合物，其中所述多肽是多聚賴氨酸。
125.權利要求113的組合物，其中所述聚合物包含帶正電荷的非肽基聚合物。
126.權利要求125的組合物，其中所述非肽基聚合物包含帶正電荷的聚烯化亞胺。
127.權利要求126的組合物，其中所述聚烯化亞胺是聚乙烯亞胺。
128.權利要求98的組合物，其包含按重量計算從大約1×10-10至大約49.9％的抗原和從大約1×10-9至大約50％的帶正電荷的載體。
129.權利要求98的控釋組合物。
130.權利要求98的組合物，其中所述抗原是肉毒毒素。
131.權利要求130的組合物，其中所述肉毒毒素選自A、B、C、D、E、F和G血清型肉毒毒素。
132.權利要求130的組合物，其中所述肉毒毒素包括肉毒毒素衍生物。
133.權利要求130的組合物，其中所述肉毒毒素包括重組肉毒毒素。
134.權利要求98的組合物，其中所述抗原適合進行兒童免疫。
135.用于將適合用于免疫的抗原給受試者施用的試劑盒，其包含將所述抗原遞送至皮膚或上皮的裝置和權利要求98的組合物。
136.權利要求135的試劑盒，其還包含定制的施藥器。
137.權利要求135的試劑盒，其中所述組合物包含于用于通過皮膚或上皮將適合用于免疫的抗原施用給受試者的裝置中。
138.權利要求137的試劑盒，其中所述裝置是皮膚貼劑。
139.用于將適合用于免疫的抗原給受試者施用的試劑盒，其包含用于將適合用于免疫的抗原遞送給皮膚或上皮的裝置和組合物，所述組合物包含帶正電荷的載體，所述載體具有附著的獨立地選自(gly)n1-(arg)n2、HIV-TAT和其片段、以及觸角足PTD和其片段或混合物的帶正電荷的分支基團，其中下標n1是從0至大約20的整數，下標n2獨立地是從大約5至大約25的奇整數，其中所述載體和所述抗原之間的結合是非共價結合。
140.權利要求139的試劑盒，其中所述裝置是皮膚貼劑。
141.給受試者施用適合用于免疫的抗原的方法，該方法包括將適合用于免疫的抗原和有效量的帶正電荷的載體一起給受試者的皮膚或上皮局部施用，所述載體包含具有附著的帶正電荷的分支基團的帶正電荷的主鏈，其中所述載體和所述抗原之間的結合是非共價結合。
142.權利要求141的方法，其中將適合用于免疫的抗原和載體以包含兩種組分的組合物的形式給受試者施用。
143.權利要求141的方法，其中將所述適合用于免疫的抗原和載體以分開的方式給受試者施用。
144.權利要求141的方法，其中所述主鏈包含帶正電荷的多肽。
145.權利要求144的組合物，其中所述主鏈包含具有從大約10,000至大約1,500,000的分子量的帶正電荷的多肽。
146.權利要求144的方法，其中所述主鏈包含具有從大約25,000至大約1,200,000的分子量的帶正電荷的多肽。
147.權利要求144的組合物，其中所述主鏈包含具有從大約100,000至大約1,000,000的分子量的帶正電荷的多肽。
148.權利要求144的組合物，其中所述主鏈包含帶正電荷的多聚賴氨酸。
149.權利要求148的方法，其中所述主鏈包含具有從大約10,000至大約1,500,000的分子量的帶正電荷的多聚賴氨酸。
150.權利要求148的方法，其中所述主鏈包含具有從大約25,000至大約1,200,000的分子量的帶正電荷的多聚賴氨酸。
151.權利要求148的方法，其中所述主鏈包含具有從大約100,000至大約1,000,000的分子量的帶正電荷的多聚賴氨酸。
152.權利要求141的方法，其中所述主鏈包含帶正電荷的非肽基聚合物。
153.權利要求152的方法，其中所述非肽基聚合物主鏈包含帶正電荷的聚烯化亞胺。
154.權利要求153的方法，其中所述聚烯化亞胺是聚乙烯亞胺。
155.權利要求154的方法，其中所述聚乙烯亞胺具有從大約10,000至大約2,500,000的分子量。
156.權利要求154的方法，其中所述聚乙烯亞胺具有從大約100,000至大約1,800,000的分子量。
157.權利要求154的方法，其中所述聚乙烯亞胺具有從大約500,000至大約1,400,000的分子量。
158.權利要求141的方法，其中所述載體包含帶正電荷的聚合物，該聚合物具有附著的獨立地選自-(gly)n1-(arg)n2、HIV-TAT和其片段、以及觸角足PTD和其片段或混合物的帶正電荷的分支基團，其中下標n1是從0至大約20的整數，下標n2獨立地是從大約5至大約25的奇整數。
159.權利要求158的方法，其中所述帶正電荷的分支基團獨立地選自具有式-(gly)n1-(arg)n2的基團。
160.權利要求159的方法，其中下標n1是從大約1至大約8的整數。
161.權利要求159的方法，其中下標n1是從大約2至大約5的整數。
162.權利要求159的方法，其中下標n2是從大約7至大約17的奇數。
163.權利要求159的方法，其中下標n2是從大約7至大約13的奇數。
164.權利要求158的方法，其中所述分支基團選自HIV-TAT和其片段。
165.權利要求164的方法，其中所述附著的帶正電荷的分支基團是具有式(gly)p-RGRDDRRQRRR-(gly)q、(gly)p-YGRKKRRQRRR-(gly)q或(gly)p-RKKRRQRRR-(gly)q的HIV-TAT片段，其中下標p和q各自獨立地是從0至20的整數。
166.權利要求158的方法，其中所述分支基團是觸角足PTD基團。
167.權利要求158的方法，其中所述帶正電荷的聚合物包含多肽。
168.權利要求167的方法，其中所述多肽選自多聚賴氨酸、多聚精氨酸和多聚鳥氨酸。
169.權利要求168的方法，其中所述多肽是多聚賴氨酸。
170.權利要求158的方法，其中所述聚合物包含帶正電荷的非肽基聚合物。
171.權利要求170的方法，其中所述非肽基聚合物包含帶正電荷的聚烯化亞胺。
172.權利要求171的方法，其中所述聚烯化亞胺是聚乙烯亞胺。
173.權利要求141的方法，其中所述組合物是控釋組合物。
174.權利要求141的方法，其中所述適合用于免疫的抗原是肉毒毒素。
175.權利要求174的方法，其中所述肉毒毒素選自A、B、C、D、E、F和G血清型肉毒毒素。
176.權利要求174的方法，其中所述肉毒毒素包括肉毒毒素衍生物。
177.權利要求174的方法，其中所述肉毒毒素包括重組肉毒毒素。
178.權利要求141的方法，其中所述抗原適合進行兒童免疫。
179.權利要求141的方法，其中施用所述適合用于免疫的抗原以提供對環境抗原的抗性。
180.權利要求141的方法，其中施用所述適合用于免疫的抗原以提供對潛在病原體的抗性。
181.權利要求141的方法，其中施用所述適合用于免疫的抗原以提供對潛在的生物危害物的抗性。
182.權利要求4的組合物，其中所述具有生物活性的試劑是抗真菌劑。
183.權利要求182的組合物，其包含按重量計算從大約1×10-10至大約49.9％的具有生物活性的試劑和從大約1×10-9至大約50％的帶正電荷的載體。
184.權利要求182的控釋組合物。
185.權利要求182的組合物，其中所述抗真菌劑選自兩性霉素B、氟康唑、氟胞嘧啶、依曲康唑、酮康唑、克霉唑、益康唑、灰黃霉素、咪康唑、制霉菌素和環吡酮。
186.用于將抗真菌劑給受試者施用的試劑盒，其包含將所述抗真菌劑遞送至受試者的皮膚或上皮的裝置和權利要求182的組合物。
187.權利要求186的試劑盒，其還包含定制的施藥器。
188.權利要求186的試劑盒，其中所述組合物包含于用于通過甲板或鄰近解剖結構將抗真菌劑施用給受試者的裝置中。
189.權利要求186的試劑盒，其中所述裝置是修復用甲板(prosthetic nail plate)或甲油。
190.權利要求81的方法，其中所述具有生物活性的試劑是抗真菌劑。
191.權利要求190的方法，其中將所述抗真菌劑和載體以包含兩種組分的組合物的形式給受試者施用。
192.權利要求190的方法，其中將所述抗真菌劑和載體以分開的方式給受試者施用。
193.權利要求190的方法，其中所述組合物是控釋組合物。
194.權利要求190的方法，其中所述抗真菌劑選自兩性霉素B、氟康唑、氟胞嘧啶、依曲康唑、酮康唑、克霉唑、益康唑、灰黃霉素、咪康唑、制霉菌素和環吡酮。
195.權利要求190的方法，其中施用所述抗真菌劑以治療真菌感染的癥狀和體征。
196.權利要求190的方法，其中施用抗真菌劑以改變甲板或甲床的真菌感染的癥狀或體征。
197.帶正電荷的多肽或非肽基聚合物，其具有附著的獨立地選自-(gly)n1-(arg)n2、HIV-TAT和其片段、以及觸角足PTD和其片段和混合物的帶正電荷的分支基團，其中下標n1是從0至大約20的整數，下標n2獨立地是從大約5至大約25的奇整數。
198.權利要求197的帶正電荷的多肽或非肽基聚合物，其中所述帶正電荷的分支基團獨立地選自具有式-(gly)n1-(arg)n2的基團。
199.權利要求198的帶正電荷的多肽或非肽基聚合物，其中下標n1是從大約1至大約8的整數。
200.權利要求198的帶正電荷的多肽或非肽基聚合物，其中下標n1是從大約2至大約5的整數。
201.權利要求198的帶正電荷的多肽或非肽基聚合物，其中下標n2是從大約7至大約17的奇數。
202.權利要求198的帶正電荷的多肽或非肽基聚合物，其中下標n2是從大約7至大約13的奇數。
203.權利要求197的帶正電荷的多肽或非肽基聚合物，其中所述分支基團選自HIV-TAT和其片段。
204.權利要求203的帶正電荷的多肽或非肽基聚合物，其中所述附著的帶正電荷的分支基團是具有式(gly)p-RGRDDRRQRRR-(gly)q、(gly)p-YGRKKRRQRRR-(gly)q或(gly)p-RKKRRQRRR-(gly)q的HIV-TAT片段，其中下標p和q各自獨立地是從0至20的整數。
205.權利要求197的帶正電荷的多肽或非肽基聚合物，其中所述分支基團是觸角足PTD基團或其片段。
206.權利要求197的帶正電荷的聚合物，其中所述帶正電荷的載體包含多肽。
207.權利要求206的帶正電荷的聚合物，其中所述多肽選自多聚賴氨酸、多聚精氨酸、多聚鳥氨酸和多聚高精氨酸。
208.權利要求207的帶正電荷的聚合物，其中所述多肽是多聚賴氨酸。
209.權利要求197的帶正電荷的聚合物，其中所述帶正電荷的載體包含帶正電荷的非肽基聚合物。
210.權利要求209的帶正電荷的聚合物，其中所述非肽基聚合物包含帶正電荷的聚烯化亞胺。
211.權利要求210的帶正電荷的聚合物，其中所述聚烯化亞胺是聚乙烯亞胺。
212.一種組合物，其包含下列物質的非共價復合物a)帶正電荷的主鏈；和b)至少兩個選自下列的成員i)具有數個附著的成像部分的帶負電荷的主鏈或數個帶負電荷的成像部分；ii)具有數個附著的靶向部分的帶負電荷的主鏈或數個帶負電荷的靶向部分；iii)至少一個選自RNA、DNA、核酶、經修飾的寡核苷酸和編碼選擇的轉基因的cDNA的成員；iv)編碼至少一個駐留因子的DNA；和v)具有數個附著的生物學試劑的帶負電荷的主鏈或帶負電荷的生物學試劑；其中所述復合物攜帶凈正電荷且至少一個所述成員選自i)、ii)、iii)或v)。
213.制備藥物或藥妝組合物的方法，所述方法包括將帶正荷的主鏈組分和至少兩個選自下列的成員與藥物或藥妝可接受的載體組合以形成具有凈正電荷的非共價復合物，并且其中至少一個所述成員選自i)、ii)、iii)或v)i)具有數個附著的成像部分的帶負電荷的主鏈；或數個帶負電荷的成像部分；ii)具有數個附著的靶向部分的帶負電荷的主鏈；或數個帶負電荷的靶向部分；iii)至少一個選自RNA、DNA、核酶、經修飾的寡核苷酸和編碼選擇的轉基因的cDNA的成員；iv)編碼至少一個駐留因子的DNA；和v)具有數個附著的生物學試劑或藥妝試劑的帶負電荷的主鏈，或帶負電荷的生物學試劑或藥妝試劑。
214.包含胰島素和對胰島素的透皮遞送有效的量的載體的組合物，所述載體包含具有附著的帶正電荷的分支基團的帶正電荷的主鏈，其中所述載體和胰島素之間的結合是非共價結合。
215.權利要求214的組合物，其包含從大約30∶1至大約1.01∶1的重量比的胰島素和帶正電荷的載體。
216.權利要求214的控釋組合物。
217.用于將胰島素給受試者施用的試劑盒，其包含胰島素和載體，所述載體包含具有附著的帶正電荷的分支基團的帶正電荷的主鏈，所述載體以對透皮遞送有效的量存在，其中所述載體和胰島素之間的結合是非共價結合。
218.權利要求217的試劑盒，其中所述組合物包含于用于將胰島素通過皮膚或上皮給受試者施用的裝置中。
219.將胰島素給受試者施用的方法，其包括將胰島素和有效量的帶正電荷的載體一起給受試者的皮膚或上皮局部施用，所述載體包含具有附著的帶正電荷的分支基團的帶正電荷的主鏈，其中所述載體和胰島素之間的結合是非共價結合。
220.權利要求219的方法，其中所述組合物是控釋組合物。
221.包含成像部分和靶向試劑以及載體的組合物，所述載體包含具有附著的帶正電荷的分支基團的帶正電荷的主鏈，所述載體以對透皮遞送有效的量存在，其中所述載體和具有生物活性的蛋白之間的結合是非共價結合。
222.權利要求221的組合物，其中所述成像部分和靶向試劑在物理或化學上是不同的。
223.權利要求221的組合物，其中所述成像部分和靶向試劑不都是磷酸鹽。
224.權利要求221的組合物，其中所述成像試劑是光學成像試劑。
225.權利要求224的組合物，其中所述成像試劑選自Cy3、Cy3.5、Cy5、Cy5.5、Cy7、Cy7.5、Oregon green 488、Oregon green 500、Oregongreen 514、綠色熒光蛋白、6-FAM、Texas Red、Hex、TET和HAMRA。
226.權利要求221的組合物，其中所述成像試劑適合用于磁共振成像。
227.權利要求221的組合物，其中所述靶向試劑識別黑色素瘤。
228.用于將權利要求221的組合物給受試者施用的試劑盒，其包含用于遞送所述成像和靶向部分以及載體的裝置，所述載體包含具有附著的帶正電荷的分支基團的帶正電荷的主鏈，并且其以對透皮遞送有效的量存在。
229.用于將成像部分和靶向試劑給受試者施用的方法，其包括將所述成像部分和靶向試劑與有效量的帶正電荷的載體一起給受試者的皮膚或上皮局部施用，所述載體包含具有附著的帶正電荷的分支基團的帶正電荷的主鏈，其中所述載體和所述具有生物活性的蛋白之間的結合是非共價結合。
230.權利要求229的方法，其中所述成像部分和靶向試劑在物理或化學上不同。
231.權利要求229的方法，其中所述成像部分和靶向試劑不都是磷酸鹽。
232.權利要求229的方法，其中所述成像試劑是光學成像試劑。
233.權利要求232的方法，其中所述成像試劑選自Cy3、Cy3.5、Cy5、Cy5.5、Cy7、Cy7.5、Oregon green 488、Oregon green 500、Oregongreen 514、綠色熒光蛋白、6-FAM、Texas Red、Hex、TET和HAMRA。
234.權利要求229的方法，其中所述成像試劑適合用于磁共振成像。
235.權利要求229的方法，其中所述靶向試劑識別黑色素瘤。
236.權利要求229的方法，其中將所述組合物用于篩查有患黑色素瘤風險的患者。
237.權利要求229的方法，其中將所述組合物用于幫助手術切除黑色素瘤。
238.權利要求229的方法，其中將所述組合物和照相技術或圖象分析技術結合使用。
239.一種組合物，其包含下列物質的非共價復合物a)帶正電荷的主鏈；和b)至少兩個選自下列的成員i)具有數個附著的成像部分的帶負電荷的主鏈；或數個帶負電荷的成像部分；ii)具有數個附著的靶向試劑的帶負電荷的主鏈；或數個帶負電荷的靶向部分；和iii)具有數個附著的生物學試劑的帶負電荷的主鏈，或帶負電荷的生物學試劑；其中所述復合物攜帶凈正電荷且所述成員中的至少一個選自i)、ii)、iii)或v)。
240.制備藥物或藥妝組合物的方法，所述方法包括將帶正電荷的主鏈組分和至少兩個選自下列的成員與藥物或藥妝可接受的載體組合以形成具有凈正電荷的非共價復合物，條件是其中至少一個所述成員選自i)、ii)、iii)或v)i)具有數個附著的成像部分的帶負電荷的主鏈或數個帶負電荷的成像部分；ii)具有數個附著的靶向試劑的帶負電荷的主鏈或數個帶負電荷的靶向部分；和iii)具有數個附著的生物學試劑或藥妝試劑的帶負電荷的主鏈，或帶負電荷的生物學試劑或藥妝試劑。
全文摘要
提供了用于遞送，包括透皮遞送具有生物活性的試劑的組合物和方法，所述具有生物活性的試劑是例如除了胰島素、肉毒毒素、抗體片段和VEGF外的非蛋白非核酸治療劑和基于蛋白的治療劑。所述組合物和方法特別地適用于抗真菌劑和適合用于免疫的抗原試劑的局部遞送?？蛇x擇地，可用用于組合物靶向遞送的組分和成像組分制備所述組合物。
文檔編號A61K49/14GK1950100SQ200580014006
公開日2007年4月18日 申請日期2005年3月3日 優先權日2004年3月3日
發明者J·M·沃, M·D·戴克 申請人:雷文斯治療公司