專利名稱：關(guān)節(jié)炎的治療劑或預(yù)防劑的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及用于關(guān)節(jié)炎，特別是骨關(guān)節(jié)炎和類似類型的關(guān)節(jié)炎的治療劑或預(yù)防劑，或者涉及關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞生長促進劑，或者涉及利用鳥苷酸環(huán)化酶B(下文中稱作“GC-B”)活化劑抑制關(guān)節(jié)炎的方法或促進關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞生長的方法。本發(fā)明進一步涉及利用GC-B活性作為指標(biāo)，篩選關(guān)節(jié)炎治療劑或關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞生長促進劑的方法。
背景技術(shù)：
關(guān)節(jié)炎是關(guān)節(jié)的炎癥疾病，并且類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎和骨關(guān)節(jié)炎(或骨關(guān)節(jié)病)是普遍的關(guān)節(jié)病。
類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎被認(rèn)為是自身免疫性疾病，其伴有關(guān)節(jié)疼痛、僵硬和腫脹，并且隨著病情進展，經(jīng)?？梢詫?dǎo)致類似于骨關(guān)節(jié)炎的關(guān)節(jié)軟骨表面的變性，其導(dǎo)致關(guān)節(jié)的骨和軟骨的嚴(yán)重破壞。
骨關(guān)節(jié)炎是經(jīng)常發(fā)生于老年人中的關(guān)節(jié)軟骨的變性疾病。骨關(guān)節(jié)炎(OA)涉及由關(guān)節(jié)的構(gòu)成要素的退行變性所導(dǎo)致的軟骨的破壞和骨、軟骨的增殖性變化，其中所述變化導(dǎo)致繼發(fā)性關(guān)節(jié)炎(例如，滑膜炎)。骨關(guān)節(jié)炎主要發(fā)生在負(fù)重關(guān)節(jié)，例如膝、肘和髖關(guān)節(jié)(Virchows Arch1996；260521-663)中，并較少發(fā)生在非負(fù)重關(guān)節(jié)中，例如肩/肘和手關(guān)節(jié)。另外，具有相似病態(tài)的顳下頜關(guān)節(jié)炎已經(jīng)被確定發(fā)生于顳下頜關(guān)節(jié)中(J Orofac Pain 1999；13(4)295-306)。
已知在骨關(guān)節(jié)炎中作為軟骨的功能本體的軟骨基質(zhì)蛋白減少，并且軟骨細(xì)胞數(shù)減少(Arth Rheum 2002；46(8)1986-1996)。然而，由于在軟骨組織中缺少血管分布、高度分化的軟骨細(xì)胞數(shù)少、軟骨前體細(xì)胞數(shù)少以及軟骨基質(zhì)的更新緩慢，所述的軟骨具有太低的自我更新能力以至于不能保證在骨關(guān)節(jié)炎中從與關(guān)節(jié)軟骨基質(zhì)和軟骨細(xì)胞數(shù)減少相關(guān)的疾病中自然治愈(Novartis Found.Sypm.2003；2492-16)。另外，在骨關(guān)節(jié)炎中，關(guān)節(jié)炎與軟骨變性同時發(fā)生，這是關(guān)節(jié)疼痛的原因(JRheumatol 2001；28(6)1330-1337).
已經(jīng)報導(dǎo)的用于關(guān)節(jié)炎如類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎和骨關(guān)節(jié)炎的治療劑/預(yù)防劑的例子包括，例如蛋白酪氨酸激酶抑制劑(日本專利公開(Kohyo)11-512708A(1999))、N-?；?2-葡糖胺衍生物(日本專利公開(Kohyo)2004-507490A)和喹啉/喹唑啉衍生物(日本專利公開(Kokai)9-169646A(1997))。另外，目前已經(jīng)廣泛使用的骨關(guān)節(jié)炎標(biāo)準(zhǔn)治療劑為口服抗炎止痛劑或關(guān)節(jié)內(nèi)注射的透明質(zhì)酸和腎上腺皮質(zhì)類固醇制劑。所有這些藥物只能緩解關(guān)節(jié)疼痛，這意味著有需要對關(guān)節(jié)軟骨的變性具有抑制作用的藥物(Decision Base 7，2002)。
鳥苷酸環(huán)化酶(GC)是屬于酶家族的膜蛋白，其催化從GTP合成第二信使cGMP，它的例子包括GC-A，GC-B，……，和GC-F。GC-B主要發(fā)現(xiàn)于血管內(nèi)皮細(xì)胞中，并被認(rèn)為與平滑肌的松弛有關(guān)。已知利鈉利尿肽(NP)為活性GC。NP分為ANP(心鈉肽)、BNP(腦鈉肽)和CNP(C型利鈉利尿肽)，它們被認(rèn)為通過兩種鳥苷酸環(huán)化酶結(jié)合受體(對于ANP和BNP為NPR-A，和對于CNP為NPR-B)而升高細(xì)胞內(nèi)cGMP水平，從而表現(xiàn)出生物活性(Ann Rev Biochem 1991；60229-255)。
NPR-C不是鳥苷酸環(huán)化酶結(jié)合受體，它被認(rèn)為是不涉及信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的NP的清除受體(Science，1987；238675-678)。然而，在一個系統(tǒng)中，其中通過該系統(tǒng)當(dāng)小鼠骨髓巨噬細(xì)胞用脂多糖(LPS)刺激時，前列腺素E2(PGE2)的產(chǎn)生被環(huán)氧合酶2(COX-2)誘導(dǎo)，ANP和CNP已經(jīng)被報導(dǎo)通過經(jīng)由NPR-C降低細(xì)胞內(nèi)cAMP水平而具有對PGE2的產(chǎn)生的抑制作用，這提示在NP的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)中涉及NPR-C(Endocrinology 2002；143(3)846-852)。這篇報導(dǎo)描述了通過用LPS刺激小鼠骨髓巨噬細(xì)胞(BMM)，ANP表現(xiàn)出對PEG2生成的增強作用最大約70％的抑制作用，然而CNP只表現(xiàn)出最大約20％的抑制作用，因此CNP具有弱的作用。因為已知通過環(huán)狀核苷酸如cAMP和cGMP對COX-2生成的控制表現(xiàn)出根據(jù)細(xì)胞種類和刺激類型或者促進或者抑制的反應(yīng)，所以通過CNP在BMM細(xì)胞中由LPS誘導(dǎo)的PGE2生成的抑制是否可被應(yīng)用于其它細(xì)胞和刺激是不清楚的。另外在Endocrinology 2002；143(3)846-852中報導(dǎo)了ANP表現(xiàn)出在系統(tǒng)中的抑制作用，其中在所述的系統(tǒng)中給藥LPS增加了小鼠中血液血栓烷B2(TXB2)的水平，相反地，相同機理的cANF則被增強。另外，盡管所述報導(dǎo)描述了ANP對免疫相關(guān)疾病如關(guān)節(jié)炎和膿毒病的引用，但其中沒有提及CNP對這些相關(guān)疾病的應(yīng)用。因此，關(guān)于CNP對關(guān)節(jié)炎的作用尚沒有獲得任何發(fā)現(xiàn)。
NP已經(jīng)被報導(dǎo)在控制體液恒定性和調(diào)節(jié)血壓方面具有重要作用(JClin Invest 1987；931911-1921，J Clin Invest 1984；871402-1412)，并且已知它們在心血管系統(tǒng)以外的各種組織中的表達(dá)和表現(xiàn)生物活性(Endocrinol 1991；1291104-1106，Ann Rev Biochem 1991；60553-575)。對于軟骨，在過剩表達(dá)BNP(Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.1998；952337-2342)或CNP的轉(zhuǎn)基因小鼠中，利用CNP用于生長軟骨(auxotonic gristle)的伸長和軟骨成長不全的治療已經(jīng)被報導(dǎo)了(Nat Med2004；10(1)80-86，日本專利申請(Kokai)2003-113116A)。然而，所述生長軟骨是暫時性軟骨，其最終隨著鈣化消失并被骨替代，并且已知其具有不同于永久性軟骨的生物學(xué)性質(zhì)，其中所述的永久性軟骨，例如關(guān)節(jié)軟骨和氣管軟骨，在生命期間存在(Dev Biol 1989；136(2)500-507，J Cell Biol 2001；153(1)87-100)。另外，盡管已經(jīng)有報導(dǎo)，CNP的體外活性增強了作為永久性軟骨的關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞的過度生長，但關(guān)于對在正常動物中的關(guān)節(jié)軟骨、或者對骨關(guān)節(jié)炎中的關(guān)節(jié)軟骨變性或關(guān)節(jié)炎的體內(nèi)作用尚沒有任何發(fā)現(xiàn)。
在骨關(guān)節(jié)炎中，在疾病最初階段的關(guān)節(jié)軟骨腫脹導(dǎo)致軟骨組織容量暫時性增長(J Rheum 1991；18(3)1905-1915)，隨著疾病的進展，軟骨基質(zhì)的變性/破壞增加，導(dǎo)致所述容量降低(Arthritis Rheum 2004；50(2)476-487)。由于凋亡作用，關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞數(shù)降低(Arthritis Rheum2004；50(2)507-515)。另一方面，剩余的單獨的關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞已知為表達(dá)X型膠原蛋白，區(qū)別于具有臨時性軟骨性質(zhì)的肥大軟骨細(xì)胞(Arthritis Rheum 1992；35(7)806-811)。另外，在患病關(guān)節(jié)中，關(guān)節(jié)炎伴隨著關(guān)節(jié)軟骨的破壞并可能是臨床疼痛的因素(J Rheumatol 2001；28(6)1330-1337)。在骨關(guān)節(jié)炎中這些變化的抑制，即關(guān)節(jié)軟骨基質(zhì)和關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞數(shù)的降低或恢復(fù)，以及關(guān)節(jié)炎的抑制，被認(rèn)為在開發(fā)治療劑中是有用的。
本發(fā)明的目的是提供用于關(guān)節(jié)炎，包括骨關(guān)節(jié)炎的新型治療劑或預(yù)防劑，或用于治療所述關(guān)節(jié)炎的方法。
本發(fā)明的另一個目的是提供關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞生長促進劑或方法。
本發(fā)明的另一個目的是提供用于抑制關(guān)節(jié)炎，包括骨關(guān)節(jié)炎的方法。
本發(fā)明的另一個目的是提供用于篩選關(guān)節(jié)炎治療劑的方法。
本發(fā)明的另一個目的是提供用于篩選關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞生長促進劑的方法。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的發(fā)明人制備了過剩表達(dá)C型利鈉利尿肽(CNP)的CNP轉(zhuǎn)基因小鼠，所述C型利鈉利尿肽為一種鳥苷酸環(huán)化酶B(GC-B)活化劑，以研究對關(guān)節(jié)軟骨的作用，獲得的結(jié)果如下所示在該CNP轉(zhuǎn)基因小鼠中，關(guān)節(jié)軟骨的厚度和關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞數(shù)顯著增加；在從該CNP轉(zhuǎn)基因小鼠制備的骨關(guān)節(jié)炎模型中，對關(guān)節(jié)腫脹有耐受性，其中關(guān)節(jié)軟骨的變性減少，滑膜細(xì)胞生長、肉芽組織形成和炎性細(xì)胞浸潤有輕微變化，并且在關(guān)節(jié)軟骨中的蛋白多糖含量沒有降低，而在由正常小鼠制備的骨關(guān)節(jié)炎模型中，在滑膜細(xì)胞生長、肉芽組織形成和炎性細(xì)胞浸潤方面有顯著變化。從這些發(fā)現(xiàn)中，本發(fā)明的發(fā)明人已經(jīng)發(fā)現(xiàn)所述GC-B活化劑具有抗關(guān)節(jié)炎作用以及對關(guān)節(jié)軟骨的同化作用。
因此，本發(fā)明包含如下發(fā)明。
在第一個方面，本發(fā)明提供關(guān)節(jié)炎的治療劑或預(yù)防劑，其包含鳥苷酸環(huán)化酶B(GC-B)活化劑作為活性成分。
在本發(fā)明的一個實施方案中，所述的關(guān)節(jié)炎為骨關(guān)節(jié)炎。
在本發(fā)明的另一個實施方案中，所述的骨關(guān)節(jié)炎為負(fù)重關(guān)節(jié)或非負(fù)重關(guān)節(jié)的骨關(guān)節(jié)炎。
在本發(fā)明的另一個實施方案中，所述的骨關(guān)節(jié)炎為膝關(guān)節(jié)變性病。
在本發(fā)明的另一個實施方案中，所述的骨關(guān)節(jié)炎為變性髖關(guān)節(jié)骨關(guān)節(jié)炎。
在本發(fā)明的另一個實施方案中，所述的骨關(guān)節(jié)炎為顳下頜關(guān)節(jié)炎。
在本發(fā)明的另一個實施方案中，所述的關(guān)節(jié)炎由類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎導(dǎo)致。
在本發(fā)明的另一個實施方案中，所述的關(guān)節(jié)炎由骨關(guān)節(jié)炎導(dǎo)致。
在本發(fā)明的另一個實施方案中，所述的GC-B活化劑為C型利鈉肽(CNP)或其衍生物。
在本發(fā)明的另一個實施方案中，如上所描述的CNP選自包括人的哺乳動物或者鳥由來的CNP-22和CNP-53。
在本發(fā)明的另一個實施方案中，所述的CNP為SEQ ID NO1的CNP-22或SEQ ID NO2的CNP-53。
在本發(fā)明的另一個實施方案中，所述的CNP衍生物具有在SEQ IDNO1或SEQ ID NO2的氨基酸序列中的一個或幾個氨基酸的缺失、置換或附加，同時具有CNP的活性。
在本發(fā)明的另一個實施方案中，所述的關(guān)節(jié)炎的治療劑或預(yù)防劑包含至少一種非甾體類抗炎藥。
在第二個方面中，本發(fā)明提供關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞生長促進劑，其包含GC-B活化劑作為活性成分。
在本發(fā)明的一個實施方案中，所述的GC-B活化劑為CNP或其衍生物。
在本發(fā)明的另一個實施方案中，所述的CNP為包括人的哺乳動物或者鳥由來的CNP-22和CNP-53。
在本發(fā)明的另一個實施方案中，所述的CNP為SEQ ID NO1的CNP-22或SEQ ID NO2的CNP-53。
在本發(fā)明的另一個實施方案中，所述的CNP衍生物具有在SEQ IDNO1或SEQ ID NO2的氨基酸序列中的一個或幾個氨基酸的缺失、置換或附加，同時具有CNP的活性。
在本發(fā)明的另一個實施方案中，所述的關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞生長促進劑進一步包含至少一種非甾體類抗炎藥。
在第三個方面，本發(fā)明提供用于抑制關(guān)節(jié)炎的方法，其中所述的關(guān)節(jié)炎通過活化GC-B被抑制。
在本發(fā)明的一個實施方案中，所述的GC-B被CNP或其衍生物活化。
在本發(fā)明的另一個實施方案中，所述的CNP為包括人的哺乳動物或者鳥由來的CNP-22和CNP-53。
在本發(fā)明的另一個實施方案中，所述的CNP為SEQ ID NO1的CNP-22或SEQ ID NO2的CNP-53。
在本發(fā)明的另一個實施方案中，所述的CNP衍生物具有在SEQ IDNO1或SEQ ID NO2的氨基酸序列中的一個或幾個氨基酸的缺失、置換或附加，同時具有CNP的活性。
在本發(fā)明的另一個實施方案中，所述的GC-B被CNP或其衍生物與至少一種非甾體類抗炎藥的組合活化。
在第四個方面，本發(fā)明提供用于促進關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞生長的方法，其中所述的生長通過活化GC-B被促進。
在本發(fā)明的一個實施方案中，所述的GC-B被CNP或其衍生物活化。
在本發(fā)明的另一個實施方案中，所述的CNP為包括人的哺乳動物或者鳥由來的CNP-22和CNP-53。
在本發(fā)明的另一個實施方案中，如上所述的CNP為SEQ ID NO1的CNP-22或SEQ ID NO2的CNP-53。
在本發(fā)明的另一個實施方案中，如上所述的衍生物具有在SEQ IDNO1或SEQ ID NO2的氨基酸序列中的一個或幾個氨基酸的缺失、置換或附加，并且具有CNP的活性。
在本發(fā)明的另一個實施方案中，所述的GC-B被CNP或其衍生物與至少一種非甾體類抗炎藥的組合活化。
在第五個方面，本發(fā)明提供篩選關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞生長促進劑的方法，其包括利用GC-B活性作為指標(biāo)篩選能夠促進關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞生長的候選藥劑。
在本發(fā)明的一個實施方案中，所述的方法包括制備表達(dá)GC-B的培養(yǎng)細(xì)胞或得自關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞的細(xì)胞，在候選藥物存在下培養(yǎng)所述細(xì)胞，利用細(xì)胞的GC-B活性作為指標(biāo)篩選能夠促進關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞生長的候選藥劑。
在本發(fā)明的另一個實施方案中，所述的GC-B活性由細(xì)胞內(nèi)cGMP的產(chǎn)生量確定。
在本發(fā)明的另一個實施方案中，所述的方法包括制備已強制表達(dá)GC-B的培養(yǎng)細(xì)胞系，在候選藥劑存在或不存在下培養(yǎng)所述細(xì)胞系，測定細(xì)胞內(nèi)cGMP的產(chǎn)生量，利用在候選藥劑存在和不存下的細(xì)胞內(nèi)cGMP的產(chǎn)生量之間的差別作為指標(biāo)篩選能夠促進關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞生長的候選藥劑。
在第六個方面，本發(fā)明提供篩選用于骨關(guān)節(jié)炎、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎或關(guān)節(jié)炎的治療劑的方法，其包括利用GC-B活性作為指標(biāo)篩選用于骨關(guān)節(jié)炎、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎或關(guān)節(jié)炎的候選藥劑。
在本發(fā)明的一個實施方案中，所述的方法包括制備表達(dá)GC-B的培養(yǎng)細(xì)胞或得自關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞的細(xì)胞，在候選藥劑的存在下培養(yǎng)所述細(xì)胞，利用細(xì)胞的GC-B活性作為指標(biāo)篩選能夠治療骨關(guān)節(jié)炎、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎或其它關(guān)節(jié)炎的藥劑的候選藥劑。
在本發(fā)明的另一個實施方案中，所述的GC-B活性以細(xì)胞內(nèi)cGMP的產(chǎn)生量確定。
在本發(fā)明的另一個實施方案中，所述的方法包括制備已強制表達(dá)GC-B的培養(yǎng)細(xì)胞系，在候選藥劑存在或不存在下培養(yǎng)所述細(xì)胞系，測定細(xì)胞內(nèi)cGMP的產(chǎn)生量，利用在候選藥劑存在和不存下的細(xì)胞內(nèi)cGMP的產(chǎn)生量之間的差別作為指標(biāo)篩選能夠治療骨關(guān)節(jié)炎、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎或其它關(guān)節(jié)炎的藥劑的候選藥劑。
在第七個方面，本發(fā)明提供骨關(guān)節(jié)炎的治療劑或預(yù)防劑，其包含GC-B活化劑作為活性成分。
在本發(fā)明的一個實施方案中，如上所述的骨關(guān)節(jié)炎的治療劑或預(yù)防劑進一步包含至少一種非甾體類抗炎藥。
在第八個方面，本發(fā)明提供類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的治療劑或預(yù)防劑，其包含GC-B活化劑作為活性成分。
在本發(fā)明的一個實施方案中，如上所述的類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的治療劑或預(yù)防劑進一步包含至少一種非甾體類抗炎藥。
在第九個方面，本發(fā)明提供鳥苷酸環(huán)化酶B(GC-B)活化劑的活化促進劑，其包含非甾體類活化劑。
在本發(fā)明的一個實施方案中，所述的GC-B活化劑為CNP或其衍生物。
在本發(fā)明的另一個實施方案中，所述的CNP選自包括人的哺乳動物或者鳥由來的CNP-22和CNP-53。
在本發(fā)明的另一個實施方案中，所述的CNP為SEQ ID NO1的CNP-22或SEQ ID NO2的CNP-53。
在本發(fā)明的另一個實施方案中，所述的CNP衍生物具有在SEQ IDNO1或SEQ ID NO2的氨基酸序列中的一個或幾個氨基酸的缺失、置換或附加，同時具有CNP的活性。
在本發(fā)明的另一個實施方案中，所述的非甾體類活化劑為環(huán)氧合酶抑制劑。
在本發(fā)明的另一個實施方案中，所述的環(huán)氧合酶抑制劑選自吲哚美辛、布洛芬、吡羅昔康、水楊酸、雙氯芬酸、酮洛芬、萘普生和吡羅昔康。
在第十個方面，本發(fā)明進一步提供用于活化GC-B活化劑的方法，其中使用如上所述的活化促進劑。
本申請的說明書包含日本專利申請2004-107924的說明書和/或附圖所公開的內(nèi)容，本申請要求日本專利申請2004-107924的優(yōu)先權(quán)。


圖1表示用于制備CNP轉(zhuǎn)基因小鼠的載體的構(gòu)建。圖1A已經(jīng)并入到pGEM-T Easy載體中的小鼠CNP的cDNA，將其用Pst I切出并使兩端平滑化。圖1B將pSG1用EcoR I處理并使斷端平滑化。圖1C將如圖1A中制備的小鼠CNP的cDNA并入到如圖1B中獲得的pSG1中。
圖2表示注射用DNA片段。將包含所述CNP基因的片段(約2.3kb)從在圖1C中制備的pSG1-CNP上，通過用Hind III和Xho I進行消化而切出，并且將其用作注射用片段。
圖3表示CNP轉(zhuǎn)基因小鼠的基因型分析的結(jié)果。在野生型小鼠(WT)中，檢測到3個信號(指定為“野生型CNP基因”)，而在轉(zhuǎn)基因小鼠(Tgm)中，除了野生型CNP基因外，還檢測到轉(zhuǎn)基因由來的2個信號(指定為“轉(zhuǎn)基因”)。
圖4為表示在CNP轉(zhuǎn)基因小鼠中關(guān)節(jié)軟骨厚度的圖。比較了正常同腹小鼠(野生型)和CNP轉(zhuǎn)基因小鼠(CNP tgm)之間的股骨膝蓋面的關(guān)節(jié)軟骨的厚度。本圖指出CNP轉(zhuǎn)基因小鼠具有統(tǒng)計學(xué)顯著性更厚的關(guān)節(jié)軟骨。**p＜0.01，非成對Student t檢驗。
圖5為表示在CNP轉(zhuǎn)基因小鼠中關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞數(shù)的增長。比較了正常同腹小鼠(野生型)和CNP轉(zhuǎn)基因小鼠(CNP tgm)之間的股骨膝蓋面的關(guān)節(jié)軟骨中的在光學(xué)顯微鏡下每個視野的軟骨細(xì)胞數(shù)。本圖指出CNP轉(zhuǎn)基因小鼠具有統(tǒng)計學(xué)顯著性更大的每視野的軟骨細(xì)胞數(shù)。**p＜0.05，非成對Student t檢驗。
圖6為表示在CNP轉(zhuǎn)基因小鼠中的膠原酶誘導(dǎo)的OA模型中對關(guān)節(jié)腫脹的耐受性。在給藥3％膠原酶或生理鹽水到CNP轉(zhuǎn)基因小鼠(Tgm)和野生型小鼠(WT)的右膝關(guān)節(jié)中后，測量左右膝關(guān)節(jié)的寬度，并且將膝關(guān)節(jié)寬度的差異用作膝關(guān)節(jié)腫脹的指標(biāo)，以評價病情進展(圖6A)并求出曲線下的面積(AUC)(圖6B)。所述的CNP轉(zhuǎn)基因小鼠在右膝關(guān)節(jié)中傾向于具有微弱的腫脹，并具有比在野生型中顯著更小的AUC。**p＜0.01，N.S.沒有顯著性。非成對Student t檢驗。
圖7表示在膠原酶OA模型中的右膝關(guān)節(jié)滑膜的組織學(xué)變化。本圖是向CNP轉(zhuǎn)基因小鼠和野生型小鼠的右膝關(guān)節(jié)中給藥3％膠原酶生理鹽水后28天的右膝關(guān)節(jié)滑膜的組織學(xué)圖像。當(dāng)給藥3％膠原酶時，野生型小鼠顯示出滑膜上皮細(xì)胞的增生、肉芽組織形成和炎性細(xì)胞浸潤(圖7B)。另一方面，在CNP轉(zhuǎn)基因小鼠中這些輕微發(fā)生(圖7C)。圖7A為正?；そM織的圖像。
圖8表示在膠原酶OA模型中的右股骨內(nèi)骨節(jié)關(guān)節(jié)軟骨的組織學(xué)變化。本圖是向CNP轉(zhuǎn)基因小鼠和野生型小鼠的右膝關(guān)節(jié)中給藥3％膠原酶生理鹽水后28天的右股骨內(nèi)骨節(jié)(medial femoral condyle)的組織學(xué)圖像。番紅O對軟骨基質(zhì)染色能力的降低表明在野生型小鼠中蛋白多糖含量的降低(圖8B)，而在CNP轉(zhuǎn)基因小鼠中番紅O的染色能力保持不變(圖8C)。圖8A為正常關(guān)節(jié)軟骨的圖像。
圖9表示在接受輸注給藥的CNP膠原酶OA小鼠模型中抑制關(guān)節(jié)腫脹的效果。本圖表示在將包含于生理鹽水的1.5％膠原酶給藥到接受持續(xù)皮下給藥CNP-22的C57BL/6J Jcl小鼠的右膝關(guān)節(jié)中后6天測量的右膝關(guān)節(jié)腫脹。CNP-22，在60和600ng/天的情況下都比溶劑對照組(媒介物)顯著抑制了右膝關(guān)節(jié)的腫脹。非成對Student t檢驗。
圖10表示在外科OA小鼠模型中，CNP輸注對抑制關(guān)節(jié)腫脹的效果。將C57BL/6J Jcl小鼠持續(xù)皮下給藥CNP-22并將其經(jīng)過手術(shù)過程，在右膝中切除前十字韌帶、切除脛骨內(nèi)側(cè)副韌帶和整體切除內(nèi)側(cè)半月板以誘導(dǎo)骨關(guān)節(jié)炎。在手術(shù)后4、8和11天測量右膝和左膝的寬度，并且顯示了AUC的不同。CNP-22，在60和600ng/天的情況下都比溶劑對照組(媒介物)顯著抑制右膝關(guān)節(jié)的腫脹。非成對Student t檢驗。
圖11表示在C57BL/6J Jcl膠原酶OA小鼠模型中，CNP-22(6ng/天，持續(xù)皮下給藥)、吲哚美辛(Indo.，1mg/kg，口服給藥)及其組合對膝關(guān)節(jié)腫脹的抑制作用。圖11A表示在給藥0.15％和1.5％膠原酶生理鹽水到小鼠右膝關(guān)節(jié)后7天中右膝關(guān)節(jié)的腫脹變化。圖11B表示圖11A中的圖的曲線下面積(AUC)。當(dāng)比較AUC時，與同時沒有吲哚美辛的溶劑對照組(媒介物)比較，CNP-22顯著抑制右膝關(guān)節(jié)的腫脹。另一方面，CNP-22和吲哚美辛的組合顯示出比單獨使用CNP22具有顯著性更強的顯著抑制作用。非成對Student t檢驗。*p＜0.05(對媒介物)，**p＜0.01(對媒介物)。
圖12表示在輔助關(guān)節(jié)炎鼠模型中CNP-22對四肢末端關(guān)節(jié)炎和體重變化的效果。圖12A表明四肢末端關(guān)節(jié)炎的得分變化，它指出對于CNP-22組具有較低的關(guān)節(jié)炎得分。圖12B表示體重變化，它指出在從抗原致敏的第7天和第10天，CNP-22組顯示出比溶劑對照組(媒介物)顯著重的體重。非成對Student t檢驗。*p＜0.05(對媒介物)。
圖13表示CNP-22對膠原質(zhì)關(guān)節(jié)炎鼠模型中體重的效果。它指出盡管從抗原致敏的第21、24和28天時，與正常組相比溶劑對照組(媒介物)顯示出顯著輕的體重，但是CNP-22組(CNP 6μg/天)與溶劑對照組相比顯示出顯著重的體重。非成對Student t檢驗。##p＜0.01(對正常組)，*p＜0.05(對媒介物)。
發(fā)明的詳細(xì)說明參考附圖進一步描述本發(fā)明。
本發(fā)明的發(fā)明人用DNA印記法分析了如下文中所述的實施例2中制備的CNP-轉(zhuǎn)基因小鼠(CNP Tgm)的基因型。結(jié)果，如圖3所示，本發(fā)明的發(fā)明人在野生型小鼠中檢測到3個信號(“野生型CNP基因”)，而在CNP Tgm中，除了野生型CNP基因外，還檢測到轉(zhuǎn)基因由來的2個信號(“轉(zhuǎn)基因”)。在肝臟——預(yù)計高度表達(dá)所述轉(zhuǎn)基因的器官——以及在血漿中檢測CNP水平以研究在CNP Tgm中的CNP的表達(dá)。結(jié)果，發(fā)現(xiàn)在肝臟和血漿中，CNP Tgm分別顯示出比野生型高10倍和約24倍的CNP水平，顯示出統(tǒng)計學(xué)顯著性的CNP肽的過剩表達(dá)(實施例4的表1)。
另外，從組織學(xué)上檢測關(guān)節(jié)軟骨的厚度和軟骨細(xì)胞數(shù)以進行CNPTgm的關(guān)節(jié)軟骨的組織學(xué)分析，結(jié)果顯示在CNP Tgm中關(guān)節(jié)軟骨統(tǒng)計學(xué)顯著性地厚(圖4)并且關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞數(shù)統(tǒng)計學(xué)顯著性地大(圖5)。這些結(jié)果表明GC-B活化劑例如CNP可以通過增加軟骨細(xì)胞數(shù)而增加關(guān)節(jié)軟骨的厚度。
在下文中描述的實施例6中，通過向小鼠的膝關(guān)節(jié)中注射膠原酶以使膝關(guān)節(jié)韌帶和半月板不穩(wěn)定并誘導(dǎo)骨關(guān)節(jié)炎而建立骨關(guān)節(jié)炎動物模型(Am.J.Pathol.1989；1351001-14)。所述CNP Tgm和正常小鼠由來的骨關(guān)節(jié)炎動物模型被用于評價該CNP Tgm對關(guān)節(jié)炎和關(guān)節(jié)軟骨變性的耐受性。在CNP Tgm由來的動物模型中，當(dāng)與正常小鼠由來的動物模型相比較時，其膝關(guān)節(jié)腫脹顯著更輕微，關(guān)節(jié)軟骨變性被顯著性地更大程度地抑制，在滑膜中的滑膜細(xì)胞生長、肉芽組織形成和炎性細(xì)胞滲透均非常輕微，并且在關(guān)節(jié)軟骨中的蛋白多糖含量上幾乎沒有變化(圖6-8)。這些結(jié)果說明GC-B活化劑在骨關(guān)節(jié)炎中對關(guān)節(jié)炎和關(guān)節(jié)軟骨的變性具有抑制作用。
另外，用移植有滲透泵的正常小鼠建立骨關(guān)節(jié)炎模型以檢驗CNP輸注對骨關(guān)節(jié)炎模型的治療效果。在CNP組中，發(fā)現(xiàn)本組動物對膝關(guān)節(jié)腫脹具有耐受性，他們具有顯著降低的關(guān)節(jié)軟骨變性，并表現(xiàn)出在滑膜中的滑膜細(xì)胞生長、肉芽組織形成和炎性細(xì)胞滲透方面相當(dāng)輕微的變化(圖9)。這些結(jié)果表明GC-B活化劑對骨關(guān)節(jié)炎具有治療作用。
另外，將移植有滲透泵的正常小鼠經(jīng)過手術(shù)過程，在右膝關(guān)節(jié)中切除前十字韌帶，切除脛骨內(nèi)側(cè)副韌帶和完全切除內(nèi)側(cè)半月板以誘導(dǎo)骨關(guān)節(jié)炎，并檢驗CNP輸注對骨關(guān)節(jié)炎模型的治療效果。結(jié)果表明在兩個劑量下的AUC(曲線下面積)在CNP組中比溶劑對照組顯著性更低(圖10)。這些結(jié)果說明GC-B活化劑對抑制由手術(shù)過程導(dǎo)致的身體過負(fù)荷而誘導(dǎo)的骨關(guān)節(jié)炎中的關(guān)節(jié)炎也是有效的。
另外，當(dāng)將CNP給藥到膠原酶OA小鼠模型中時，單獨使用或與非甾體類抗炎藥(NSAID)組合使用，CNP單獨使用顯著地抑制關(guān)節(jié)腫脹，而單獨使用NSAID則不會，而且CNP和NSAID的組合顯示出甚至更強的協(xié)同抗腫脹作用(實施例9，圖11)。
另外，當(dāng)利用通常在實驗室中用作類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎(RA)模型的輔助關(guān)節(jié)炎和膠原蛋白關(guān)節(jié)炎模型來進一步檢驗CNP的作用時(Arthritis& Rheumatism，27797-806，1984；British Journal of Rheumatology，33798-807，1994)，所述CNP組(大鼠)與對照組相比，顯示出顯著降低的關(guān)節(jié)炎和更大的體重增長，說明對常見病癥的顯著性改善(實施例10和11，圖12和13)。這些結(jié)果說明CNP對于在類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎中的關(guān)節(jié)炎的作用。
從這些驗證性的例子中，本發(fā)明的發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，不被任何特定的理論或?qū)嶒炈拗?，GC-B活化劑，例如CNP，具有抗關(guān)節(jié)炎的作用以及對關(guān)節(jié)軟骨的同化作用。
因此，本發(fā)明提供關(guān)節(jié)炎的治療劑或預(yù)防劑，其包含GC-B活化劑作為活性成分。
根據(jù)本發(fā)明可被治療或預(yù)防的關(guān)節(jié)炎的例子包括但不限于涉及關(guān)節(jié)軟骨的那些，特別是例如與骨關(guān)節(jié)炎、滑膜炎、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎(類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎(成人)和青少年類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎(兒童))相關(guān)的關(guān)節(jié)炎、骨關(guān)節(jié)炎、全身性紅斑狼瘡(SLE)、痛風(fēng)、硬皮病、牛皮癬(牛皮癬關(guān)節(jié)炎)、例如芽生菌病的真菌感染、強直性脊柱炎、賴特爾綜合癥、膿毒性關(guān)節(jié)炎、成人斯蒂爾病、三期萊姆病(晚期)、結(jié)核(結(jié)核性關(guān)節(jié)炎)、病毒性感染(病毒性關(guān)節(jié)炎)和由感染有淋病(淋球菌性關(guān)節(jié)炎)和細(xì)菌(非淋球菌性細(xì)菌性關(guān)節(jié)炎)導(dǎo)致的關(guān)節(jié)炎。
在本發(fā)明的一個實施方案中，優(yōu)選的關(guān)節(jié)炎為骨關(guān)節(jié)炎或與骨關(guān)節(jié)炎相關(guān)的關(guān)節(jié)炎。
骨關(guān)節(jié)炎是由關(guān)節(jié)軟骨的變性和破壞導(dǎo)致的疾病，并且可應(yīng)用的骨關(guān)節(jié)炎的例子包括例如，(1)負(fù)重關(guān)節(jié)的骨關(guān)節(jié)炎，例如在膝關(guān)節(jié)的膝關(guān)節(jié)變性病、在髖關(guān)節(jié)的髖關(guān)節(jié)病、在足部的足骨關(guān)節(jié)炎和在脊柱的脊椎骨關(guān)節(jié)炎，和(2)非負(fù)重關(guān)節(jié)的骨關(guān)節(jié)炎，例如在肩部的肩骨關(guān)節(jié)炎、在肘部的肘骨關(guān)節(jié)炎、在手部的手骨關(guān)節(jié)炎(例如，赫伯登(heberden’s)結(jié)節(jié)、布夏爾(Bouchard’s)結(jié)節(jié)、拇指CM骨關(guān)節(jié)炎)和頜骨中的顳下頜關(guān)節(jié)炎。
在本發(fā)明的一個實施方案中，所述的骨關(guān)節(jié)炎為影響負(fù)重關(guān)節(jié)的骨關(guān)節(jié)炎，優(yōu)選為膝關(guān)節(jié)變性病或髖關(guān)節(jié)變性病。
在本發(fā)明的另一個實施方案中，所述的骨關(guān)節(jié)炎為影響非負(fù)重關(guān)節(jié)的骨關(guān)節(jié)炎，優(yōu)選顳下頜關(guān)節(jié)炎。
本發(fā)明的治療劑或預(yù)防劑還可用于治療或預(yù)防類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎。類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎被認(rèn)為是自身免疫性疾病，盡管它具有與骨關(guān)節(jié)炎不同的病因?qū)W，它涉及，如伴隨著骨關(guān)節(jié)炎的，隨著病情進展，關(guān)節(jié)軟骨面的變性和軟骨的破壞。因此，給藥本發(fā)明的治療劑可以抑制或緩解關(guān)節(jié)炎。
本文中所用的術(shù)語“治療”、“治療方法”和“治療劑”，意思是消除、抑制或緩解根據(jù)本發(fā)明患有關(guān)節(jié)炎的病人的癥狀。或者為此目的的方法或藥物。另外，術(shù)語“預(yù)防”和“預(yù)防劑”意思是預(yù)防關(guān)節(jié)炎或為此目的的藥物。
如本發(fā)明中所用的，術(shù)語“鳥苷酸環(huán)化酶B(GC-B)”具有與利鈉肽受體B(NPR-B)相同的含義。
如本發(fā)明中所用的，術(shù)語“GC-B活性”具有與鳥苷酸環(huán)化酶活性相同的含義。在本發(fā)明中，鳥苷酸環(huán)化酶B(GC-B)活化劑或GC-B活化劑為肽或非肽的低分子量化合物，優(yōu)選為CNP肽或其衍生物，其可以結(jié)合并活化GC-B，所述GC-B已知為CNP受體。本文中所用的肽指由多個(L-、D-和/或修飾的)氨基酸的酰胺鍵連接組成的物質(zhì)，包括多肽和蛋白。GC-B活化劑可以通過如下方式鑒定例如在培養(yǎng)細(xì)胞系如COS-7中表達(dá)GC-B受體，向該培養(yǎng)物中加入候選藥劑，在一定時段和在一定溫度下(例如37℃，5分鐘)培養(yǎng)該細(xì)胞系，以及測量分子內(nèi)cGMP的產(chǎn)生量(Science 1991；252120-123)。利用這樣的試驗體系和利用細(xì)胞內(nèi)cGMP的產(chǎn)生量作為指標(biāo)，GC-B活化劑可以被鑒定并被用于本發(fā)明中。
根據(jù)本發(fā)明的一個實施方案，所述的GC-B活化劑為肽，并優(yōu)選為CNP或其衍生物。優(yōu)選的CNP選自包括人的哺乳動物或鳥由來的CNP-22和CNP-53，并且更優(yōu)選SEQ ID NO1的CNP-22或SEQ ID NO2的CNP-53。
根據(jù)本發(fā)明的另一個實施方案，如上所述的CNP衍生物具有在SEQ ID NO1或SEQ ID NO2的氨基酸序列中的一個或幾個氨基酸的缺失、置換或附加，同時保持CNP的活性?；蛘撸鯟NP衍生物包含具有與SEQ ID NO1或SEQ ID NO2的氨基酸序列約70％或更高、約80％或更高、約85％或更高、約90％或更高、約95％或更高、約97％或更高、約98％或更高或約99％或更高的同一性，并保留CNP的活性。
本文中所用的術(shù)語“一個或幾個”通常表示1到10，優(yōu)選1到5，更優(yōu)選1到3的任意整數(shù)。兩種氨基酸序列間的“同一性的百分比”可以利用本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的技術(shù)確定，例如BLAST蛋白質(zhì)檢測(Altschul，S.F.，Gish，W.Miller，W.，Myers，E.W.& Lipman，D.J.(1990)“Basic Local Alignment Search Tool”J.Mol.Biol.215403-410)。
可用于本發(fā)明的CNP的例子包括得自包括人的哺乳動物的CNP(CNP-22Biochem.Biophys.Res.Commun.1990；168863-870，國際公開WO 91/16342，CNP-53Biochem.Biophys.Res.Commun.1990；170973-979，日本專利公開4-74198A(1992)，日本專利公開4-139199A(1992)，日本專利公開4-121190A(1992))，得自鳥的CNP(日本專利公開4-120094A(1992))，得自兩棲動物的CNP(日本專利公開4-120095A(1992))和公開于日本專利公開6-9688A(1994)和國際公開WO02/074234中的CNP衍生物，例如CNP類似肽。
分別由22個和53個氨基酸殘基組成的CNP-22和CNP-53已知為天然存在的CNP。因為CNP在它們的序列方面，在鳥和包括人的哺乳動物之間具有高度同源性，即無論動物種類如何，本發(fā)明中可以使用鳥和包括人的哺乳動物由來的CNP，優(yōu)選得自包括人的哺乳動物的CNP，更優(yōu)選得自人的CNP。人的CNP-22或CNP-53的氨基酸序列分別具有示于SEQ ID NO1或SEQ ID NO2的序列，其表示為Gly Leu Ser Lys Gly Cys Phe Gly Leu Lys Leu Asp Arg Ile Gly SerMet Ser Gly Leu Gly Cys(人的CNP-22；SEQ ID NO1)；或Asp Leu Arg Val Asp Thr Lys Ser Arg Ala Ala Trp Ala Arg Leu LeuGln Glu His Pro Asn Ala Arg Lys Tyr Lys Gly Ala Asn Lys Lys Gly LeuSerLys Gly Cys Phe Gly Leu Lys Leu Asp Arg Ile Gly Ser Met Ser GlyLeu Gly Cys(人的CNP-53；SEQ ID NO2)，其中每一個都具有分子間二硫鍵，即在人的CNP-22的6-Cys和22-Cys間，或在人的CNP-53的37-Cys和53-Cys間形成環(huán)狀肽結(jié)構(gòu)。
豬的CNP-22和大鼠的CNP-22具有與人的CNP-22相同的氨基酸序列，然而在豬的CNP-53和大鼠的CNP-53中，在位置17和28處的氨基酸殘基分別為His和Gly，而在人CNP-53中，它們分別是Gln和Ala，即在人和豬或大鼠之間的CNP-53上，有兩個氨基酸是不同的(日本專利公開4-139199A(1992)、日本專利公開4-121190A(1992)和日本專利公開4-74198A(1992))。另外，雞的CNP-22具有與人的CNP-22相同的一級結(jié)構(gòu)，除了在位置9上的氨基酸殘基為Val外(日本專利公開4-120094A(1992))。
可用于本發(fā)明的CNP包括自天然來源純化的CNP，通過已知基因工程技術(shù)制備的重組CNP，以及通過已知的化學(xué)合成制備的CNP(例如，用肽合成機進行的固相合成)，優(yōu)選通過基因工程技術(shù)制備的人CNP-22和人CNP-53。通過基因工程技術(shù)制備人的CNP包括如下步驟，例如將人CNP-22或CNP-53的DNA序列(日本專利公開4-139199A(1992))并入到載體，例如質(zhì)粒或噬菌體中，將該載體轉(zhuǎn)移到原核或真核宿主細(xì)胞，例如大腸桿菌母中，以及在適合的培養(yǎng)基中表達(dá)該DNA，優(yōu)選允許所述細(xì)胞在細(xì)胞外分泌所述CNP肽，并收集和純化制備的CNP肽的步驟。聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)技術(shù)也可用于擴增目標(biāo)DNA。
本領(lǐng)域技術(shù)人員公知各種基本技術(shù)，例如基因重組、定點突變與PCR技術(shù)，其描述于例如J.Sambrook等人，Molecular Cloning，Alaboratory Manual，第二版，Cold Spring Harbor laboratory Press(1990)；Ausubel等人，Current Protocols In Molecular Biology，John Wiley & Sons(1998)中，并且公開于其中的所述技術(shù)可被用于本發(fā)明中。作為所述載體，市售的載體或公開于出版物中的載體也可以被使用。
如在人CNP-22或CNP-53中所見的，可用于本發(fā)明的CNP衍生物具有CNP活性并具有環(huán)狀肽結(jié)構(gòu)，所述環(huán)狀肽結(jié)構(gòu)具有在兩個半胱氨酸殘基之間的二硫鍵。CNP衍生物的例子包括如上所描述的CNP片段；在上述CNP或其片段中具有由一個氨基酸被至少另一個氨基酸置換的肽；在上述CNP或其部分肽中具有至少一個氨基酸缺失的肽；以及在上述CNP或其部分肽中具有至少一個氨基酸附加的肽。如本文中所用的，氨基酸的置換、缺失或附加的意思是一定數(shù)量的氨基酸通過公知方法，例如定點突變而被置換、缺失或附加，但條件是不喪失該CNP的活性。例如，所述CNP-22或CNP-53衍生物具有在SEQ ID NO1或SEQ ID NO2的氨基酸序列中的一個或幾個氨基酸的置換、缺失或附加，其具有CNP的活性。
通常，氨基酸的置換優(yōu)選為保守氨基酸間的置換。保守氨基酸可根據(jù)，例如極性(或疏水性)或電荷類型來分類。非極性的、不帶電荷的氨基酸的例子包括甘氨酸、丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、脯氨酸等；芳族氨基酸包括苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸；極性的不帶電荷的氨基酸包括絲氨酸、蘇氨酸、半胱氨酸、蛋氨酸、天冬酰胺、谷酰胺等；帶負(fù)電荷的氨基酸包括天冬氨酸和谷氨酸；以及帶正電荷的氨基酸包括賴氨酸、精氨酸和組氨酸。
在本發(fā)明中所述的CNP活性指作用于GC-B以增加鳥苷酸環(huán)化酶活性的活性，指消除、抑制或緩解關(guān)節(jié)炎(包括骨關(guān)節(jié)炎)的活性，以及指促進關(guān)節(jié)軟骨生長的活性。所述CNP活性可通過測量細(xì)胞的鳥苷酸環(huán)化酶的活性，例如細(xì)胞內(nèi)cGMP的產(chǎn)生量，和/或通過在一定時期向關(guān)節(jié)炎、骨關(guān)節(jié)炎或類類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的小鼠或大鼠模型給藥CNP或其衍生物，并如下文中實施例7-10中所述的測量關(guān)節(jié)炎或關(guān)節(jié)軟骨變性抑制效果來測量。
CNP-22類似肽的例子包括描述于下的在日本專利公開6-9688A(1994)和國際公開WO 02/074234中的環(huán)狀肽(其中下劃線表示與人CNP-22的不同)。
Gly Leu Ser Lys Gly Cys Phe Gly Leu Lys Leu Asp Arg Ile GlyAlaMet Ser Gly Leu Gly Cys(SEQ ID NO3)Gly Leu Ser Lys Gly Cys Phe Gly Leu Lys Leu Asp Arg Ile Gly SerGlnSer Gly Leu Gly Cys(SEQ ID NO4)Gly Leu Ser Lys Gly Cys Phe Gly Leu Lys Leu Asp Arg Ile Gly SerAlaSer Gly Leu Gly Cys(SEQ ID NO5)Cys Phe Gly Leu Lys Leu Asp Arg Ile Gly Ser Met Ser Gly Leu GlyCys(SEQ ID NO6)Ser Leu Arg Arg Ser SerCys Phe Gly Leu Lys Leu Asp Arg Ile GlySer Met Ser Gly Leu Gly Cys(SEQ ID NO7)Gly Leu Ser Lys Gly Cys Phe Gly Leu Lys Leu Asp Arg Ile Gly SerMet Ser Gly Leu Gly CysAsn Ser Phe Arg Tyr(SEQ ID NO8)Cys Phe Gly Leu Lys Leu Asp Arg Ile Gly SerGlnSer Gly Leu GlyCysAsn Ser Phe Arg Tyr(SEQ ID NO9)Cys Phe GlyXaaXbbXccAsp Arg Ile GlyXddXeeSerXffXggGly Cys
(其中Xaa＝Leu，Ile，Val；Xbb＝Lys，Leu，Met；Xcc＝Leu，Ile，Ala，Val；Xdd＝Ser，Ala，Gly，Thr，Asn；Xee＝Met，Ala，Trp，His，Lys，Ser，Gly；Xff＝Gly，Lys，Als，Leu；Xgg＝Leu，Met)(SEQ ID NO10)。
CNP-53類似肽的例子包括環(huán)狀肽，該環(huán)狀肽包含類似于CNP-22類似肽的氨基酸變化。
本發(fā)明還提供關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞生長促進劑，其包含GC-B活化劑作為活性組分。本發(fā)明基于GC-B活化劑的作用以增加關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞。GC-B活化劑的例子為如上所定義的CNP或其衍生物。所述的CNP優(yōu)選為包括人的哺乳動物的、或者鳥的CNP-22或CNP-53，并且更優(yōu)選為SEQ ID NO1的CNP-22或SEQ ID NO2的CNP-53。所述的CNP衍生物具有在SEQ ID NO1或SEQ ID NO2的氨基酸序列中的一個或幾個氨基酸的缺失、置換或附加，同時保持CNP的活性。其它的GC-B活化劑可以通過如下方式鑒定例如通過在培養(yǎng)細(xì)胞系如COS-7中表達(dá)GC-B受體，向該培養(yǎng)基中加入候選藥劑，在一定時段和在一定溫度下(例如37℃，5分鐘)培養(yǎng)該細(xì)胞系，以及測量分子內(nèi)cGMP的產(chǎn)生量(Science 1991，252120-123)。因此利用這樣的試驗體系和利用細(xì)胞內(nèi)cGMP的產(chǎn)生量作為指標(biāo)，GC-B活化劑可以被鑒定并用于本發(fā)明中。
本發(fā)明還提供抑制關(guān)節(jié)炎的方法，其中所述的關(guān)節(jié)炎通過活化GC-B被抑制。本發(fā)明還提供用于促進關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞生長的方法，其包含通過活化GC-B而促進所述生長。本發(fā)明基于這樣的發(fā)現(xiàn)通過利用GC-B活化劑或通過活化GC-B，可以抑制如上所定義的關(guān)節(jié)炎，優(yōu)選骨關(guān)節(jié)炎，以及可以增強關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞的生長。在本發(fā)明的一個實施方案中，所述的GC-B被如上所定義的CNP或其衍生物活化。
本發(fā)明進一步提供用于篩選關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞生長促進劑的方法，其包含利用GC-B活性作為指標(biāo)篩選能夠促進關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞生長的候選藥劑。因為已知通過鳥苷酸環(huán)化酶的活性，GC-B可催化從GTP合成第二信使cGMP，所述GC-B活性可以以細(xì)胞內(nèi)cGMP的產(chǎn)生量來確定。
根據(jù)本發(fā)明的實施方案，如上所述的篩選方法可以包括如下步驟制備表達(dá)GC-B的培養(yǎng)細(xì)胞或者得自關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞的細(xì)胞，在候選藥劑的存在下培養(yǎng)所述細(xì)胞，并利用細(xì)胞的鳥苷酸環(huán)化酶活性，例如細(xì)胞內(nèi)cGMP的產(chǎn)生量作為指標(biāo)篩選能夠促進關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞生長的候選藥劑。
根據(jù)本發(fā)明優(yōu)選的實施方案，所述的篩選方法包括制備已強制表達(dá)GC-B的培養(yǎng)細(xì)胞系，在測試物質(zhì)存在或不存在下培養(yǎng)所述細(xì)胞系，確定細(xì)胞內(nèi)cGMP的產(chǎn)生量，和利用在候選藥劑存在和不存下的細(xì)胞內(nèi)cGMP的產(chǎn)生量之間的差別作為指標(biāo)篩選能夠促進關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞生長的候選藥劑。
本發(fā)明的篩選方法可用于篩選關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞生長促進劑，例如通過在培養(yǎng)細(xì)胞如COS-7中表達(dá)GC-B，向該培養(yǎng)物中加入候選藥劑，在一定時間期限和在一定溫度下(例如37℃，5分鐘)培養(yǎng)該細(xì)胞，以及測量分子內(nèi)cGMP的產(chǎn)生量(Science 1991，252120-123)。
本發(fā)明進一步提供篩選骨關(guān)節(jié)炎、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎或其它關(guān)節(jié)炎的治療劑的方法，其包括利用GC-B活性作為指標(biāo)篩選能夠治療骨關(guān)節(jié)炎、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎或其它關(guān)節(jié)炎的藥劑的候選藥劑。如上所述，GC-B活性可以以鳥苷酸環(huán)化酶的活性確定，例如細(xì)胞內(nèi)cGMP的產(chǎn)生量。
在本發(fā)明的一個實施方案中，如上所述的篩選方法可以包括如下步驟制備表達(dá)GC-B的培養(yǎng)細(xì)胞或者得自關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞的細(xì)胞，在候選藥劑的存在下培養(yǎng)所述細(xì)胞，并利用細(xì)胞的鳥苷酸環(huán)化酶活性，例如細(xì)胞內(nèi)cGMP的產(chǎn)生量作為指標(biāo)，篩選能夠治療骨關(guān)節(jié)炎、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎或其它關(guān)節(jié)炎的藥劑的候選藥劑。
根據(jù)本發(fā)明優(yōu)選的實施方案，所述的篩選方法包括制備已強制表達(dá)GC-B的培養(yǎng)細(xì)胞系，在測試物質(zhì)存在或不存在下培養(yǎng)所述細(xì)胞系，確定細(xì)胞內(nèi)cGMP的產(chǎn)生量，和利用在候選藥劑存在和不存下的細(xì)胞內(nèi)cGMP的產(chǎn)生量的差別作為指標(biāo)，篩選能夠治療骨關(guān)節(jié)炎、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎或其它關(guān)節(jié)炎的藥物的候選藥劑。
本發(fā)明的篩選方法可用于篩選骨關(guān)節(jié)炎、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎或其它關(guān)節(jié)炎的治療劑，例如通過在培養(yǎng)細(xì)胞如COS-7中表達(dá)GC-B，向培養(yǎng)物中加入候選藥劑，在一定時間期限和在一定溫度下(例如37℃，5分鐘)培養(yǎng)所述細(xì)胞，以及測量分子內(nèi)cGMP的產(chǎn)生量(Science 1991，252120-123)。
將本發(fā)明的用于關(guān)節(jié)炎如骨關(guān)節(jié)炎的治療劑或預(yù)防劑，通過將如上所定義的作為活性成分的GC-B活化劑與藥學(xué)可接受的載體、賦形劑、添加劑等組合而配制成用于口服或非腸道給藥的制劑。
用于制劑的載體和賦形劑的例子包括乳糖、硬脂酸鎂、淀粉、滑石粉、明膠、瓊脂、果膠、阿拉伯樹膠、橄欖油、芝麻油、可可油脂、乙二醇，以及其它常用的試劑。
用于口服給藥的固體組合物的例子包括片劑、丸劑、膠囊劑、粉劑、顆粒劑等。在這些固體組合物中，將至少一種活性成分與至少一種惰性稀釋劑，例如乳糖、甘露醇、葡萄糖、羥丙基纖維素、微晶纖維素、淀粉、聚乙烯吡咯烷酮、鋁硅酸鎂等混合。根據(jù)傳統(tǒng)方法，所述組合物還可以包含不是惰性稀釋劑的添加劑，例如潤滑劑如硬脂酸鎂，崩解劑如纖維狀乙醇酸鈣，和助溶劑如谷氨酸或天冬氨酸。片劑或丸劑，如果需要，可以用糖萼，如蔗糖、明膠或鄰苯二甲酸羥丙基甲基纖維素，或者用胃溶薄膜或腸溶薄膜，或者用兩層或更多層包被。還包含可吸收材料的膠囊，例如明膠。
用于口服給藥的液體組合物可以包括藥學(xué)可接受的乳劑、溶液劑、懸浮劑、糖漿劑和酏劑，并且還可以包括傳統(tǒng)的惰性稀釋劑，例如純水和乙醇。該組合物可以包含不是惰性稀釋劑的助劑，例如保濕劑和助懸劑、甜味劑、調(diào)味劑、芳香劑和防腐劑。
非腸道注射的例子包括無菌水性溶液劑或非水性溶液劑、懸浮劑和乳劑。水性溶液劑和懸浮劑的例子包括注射用水和注射用生理鹽水。非水溶液劑和懸浮劑的例子包括丙二醇、聚乙二醇、植物油例如橄欖油、醇類例如乙醇以及聚山梨醇酯80。這些組合物可進一步包含助劑，例如防腐劑、保濕劑、乳化劑、分散劑、穩(wěn)定劑(例如乳糖)，以及助溶劑(例如谷氨酸或天冬氨酸)。上述物質(zhì)可通過常規(guī)消毒方法消毒，例如用微過濾膜過濾消毒、加熱消毒例如高壓蒸汽滅菌，或者加入消毒劑。注射劑可以是液體制劑，或者是在使用前可以重新組構(gòu)的凍干制劑。凍干用賦形劑的例子包括糖醇類和糖類，例如甘露醇和葡萄糖。
將本發(fā)明的治療劑或預(yù)防劑通過藥學(xué)常用的口服或非腸道給藥方法給藥。優(yōu)選非腸道給藥方法，例如注射(例如皮下、靜脈、肌內(nèi)和腹膜內(nèi)注射)、經(jīng)皮給藥、經(jīng)粘膜給藥(例如經(jīng)鼻和經(jīng)直腸)，以及經(jīng)肺給藥。也可以采用口服給藥。
作為包含于本發(fā)明組合物中的活性組分的GC-B活化劑，優(yōu)選如上所定義的CNP或其衍生物的劑量，可以根據(jù)待治療疾病的類型、疾病的嚴(yán)重性、患者的年齡等確定，其量通?？梢允?.005μg/kg至100mg/kg，優(yōu)選0.02μg/kg至5mg/kg，更優(yōu)選0.02μg/kg至0.25mg/kg。然而對包含本發(fā)明的CNP活化劑的藥物對于它們的劑量沒有限制。
本發(fā)明的治療劑或預(yù)防劑可以與常規(guī)的或新的治療劑，例如抗炎藥、透明質(zhì)酸和腎上腺皮質(zhì)甾體組合，以及與手術(shù)操作，例如關(guān)節(jié)鏡(arthrosopic)手術(shù)、人工關(guān)節(jié)置換和骨切開術(shù)組合。
抗炎藥物，特別是例如至少一種非甾體類抗炎藥物與GC-B活化劑(例如如上所定義的CNP或其衍生物)的組合可以提供對關(guān)節(jié)炎的協(xié)同抑制作用(實施例10)。
本文中所用的“非甾體類抗炎藥物”指不具有甾體骨架的抗炎藥，并且優(yōu)選具有抑制參與前列腺素生成的環(huán)氧合酶的作用?？捎糜诒景l(fā)明的非甾體類抗炎藥物的例子包括但不限于，吲哚美辛(例如IndacinTM)、布洛芬(例如BrufenTM)、吡羅昔康、水楊酸、雙氯芬酸(例如VoltarenTM)、酮洛芬、萘普生和吡羅昔康。
另外，如上所述的GC-B活化劑與非甾體類抗炎藥物的組合的協(xié)同作用的意思是與單獨使用GC-B活化劑相比，GC-B活性被增強了，或者換句話說，如上所述的非甾體類抗炎藥物的活性成分在用GC-B活化劑活化GC-B中用作活化促進劑。
因此，本發(fā)明進一步提供GC-B活化劑的活化促進劑，其包含非甾體類活化劑。
GC-B活化劑包括如上所定義的CNP或其衍生物。CNP的例子為包括人的哺乳動物或者鳥由來的CNP-22或CNP-53，更特定為SEQ IDNO1的CNP-22或SEQ ID NO2的CNP-53。CNP衍生物的例子包括具有在SEQ ID NO1或SEQ ID NO2的氨基酸序列中的一個或幾個氨基酸的缺失、置換或附加，并保持CNP活性的那些。
在本發(fā)明中，如上所述的非甾體類活化劑優(yōu)選環(huán)氧合酶抑制劑。該環(huán)氧合酶抑制劑的例子包括但不限于，吲哚美辛、布洛芬、吡羅昔康、水楊酸、雙氯芬酸、酮洛芬、萘普生和吡羅昔康。
如上對本發(fā)明的治療劑和預(yù)防劑所述的劑型、劑量和給藥方法可以被用于本發(fā)明的活化促進劑。
本發(fā)明進一步提供活化GC-B活化劑的方法，其中使用如上所述的活化促進劑。
如上所述的本發(fā)明的活化促進劑和方法可被用于，例如通過活化GC-B而有效地在患者中治療疾病，例如關(guān)節(jié)炎。
本發(fā)明包括但不限于如下方面。
(1)關(guān)節(jié)炎的治療劑或預(yù)防劑，其包含鳥苷酸環(huán)化酶B(GC-B)活化劑作為活性成分。
(2)上述(1)的治療劑或預(yù)防劑，其中所述的關(guān)節(jié)炎為骨關(guān)節(jié)炎。
(3)上述(2)的治療劑或預(yù)防劑，其中所述的骨關(guān)節(jié)炎為負(fù)重或非負(fù)重關(guān)節(jié)的骨關(guān)節(jié)炎。
(4)上述(3)的治療劑或預(yù)防劑，其中所述的骨關(guān)節(jié)炎為膝關(guān)節(jié)變性病。
(5)上述(3)的治療劑或預(yù)防劑，其中所述的骨關(guān)節(jié)炎為髖關(guān)節(jié)變性病。
(6)上述(3)的治療劑或預(yù)防劑，其中所述的骨關(guān)節(jié)炎為顳下頜關(guān)節(jié)炎。
(7)上述(1)的治療劑或預(yù)防劑，其中所述的關(guān)節(jié)炎由類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎導(dǎo)致。
(8)上述(1)的治療劑或預(yù)防劑，其中所述的關(guān)節(jié)炎由骨關(guān)節(jié)炎導(dǎo)致。
(9)上述(1)-(8)中任一項的治療劑或預(yù)防劑，其中所述的GC-B活化劑為C型利鈉利尿肽(CNP)或其衍生物。
(10)上述(9)的治療劑或預(yù)防劑，其中所述的CNP選自包括人的哺乳動物或者鳥由來的CNP-22和CNP-53。
(11)上述(9)的治療劑或預(yù)防劑，其中所述的CNP為SEQ ID NO1的CNP-22或SEQ ID NO2的CNP-53。
(12)上述(9)的治療劑或預(yù)防劑，其中所述的衍生物具有在SEQ IDNO1或SEQ ID NO2的氨基酸序列中的一個或幾個氨基酸的缺失、置換或附加，并具有CNP活性。
(13)上述(1)-(12)中任一項的治療劑或預(yù)防劑，其進一步包含至少一種非甾體類抗炎藥。
(14)關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞生長促進劑，其包含GC-B活化劑作為活性成分。
(15)上述(14)的促進劑，其中所述的GC-B活化劑為CNP或其衍生物。
(16)上述(15)的促進劑，其中所述的CNP為包括人的哺乳動物或者鳥由來的CNP-22或CNP-53。
(17)上述(15)的促進劑，其中所述的CNP為SEQ ID NO1的CNP-22或SEQ ID NO2的CNP-53。
(18)上述(15)的促進劑，其中所述的衍生物具有在SEQ ID NO1或SEQ ID NO2的氨基酸序列中的一個或幾個氨基酸的缺失、置換或附加，同時具有CNP活性。
(19)上述(14)-(18)的促進劑，其進一步包含至少一種非甾體類抗炎藥。
(20)用于抑制關(guān)節(jié)炎的方法，其中所述的關(guān)節(jié)炎通過活化GC-B被抑制。
(21)上述(20)的抑制方法，其中所述的GC-B被CNP或其衍生物活化。
(22)上述(21)的抑制方法，其中所述的CNP為包括人的哺乳動物或者鳥由來的CNP-22或CNP-53。
(23)上述(21)的抑制方法，其中所述的CNP為SEQ ID NO1的CNP-22或SEQ ID NO2的CNP-53。
(24)上述(21)的抑制方法，其中所述衍生物具有在SEQ ID NO1或SEQ ID NO2的氨基酸序列中的一個或幾個氨基酸的缺失、置換或附加，同時具有CNP活性。
(25)上述(20)-(24)的抑制方法，其中所述的GC-B被CNP或其衍生物與至少一種非甾體類抗炎藥的組合活化。
(26)用于促進關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞生長的方法，其中所述的關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞生長通過活化GC-B被促進。
(27)上述(26)的方法，其中所述的GC-B被CNP或其衍生物活化。
(28)上述(27)的方法，其中所述的CNP為包括人的哺乳動物或者鳥由來的CNP-22或CNP-53。
(29)上述(27)的方法，其中所述的CNP為SEQ ID NO1的CNP-22或SEQ ID NO2的CNP-53。
(30)上述(27)的方法，其中所述的衍生物具有在SEQ ID NO1或SEQ ID NO2的氨基酸序列中的一個或幾個氨基酸的缺失、置換或附加，同時具有CNP的活性。
(31)上述(26)-(30)的任一項中的方法，其中所述的GC-B被CNP或其衍生物與至少一種非甾體類抗炎藥的組合活化。
(32)用于篩選關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞生長促進劑的方法，其包括利用GC-B活性作為指標(biāo)篩選能夠促進關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞的候選藥劑。
(33)上述(32)的方法，其包括制備表達(dá)GC-B的培養(yǎng)細(xì)胞或者得自關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞的細(xì)胞，在候選藥劑的存在下培養(yǎng)所述細(xì)胞，以及利用細(xì)胞的GC-B活性作為指標(biāo)篩選能夠促進關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞生長的候選藥劑。
(34)上述(32)-(33)的方法，其中所述的GC-B活性以細(xì)胞內(nèi)cGMP的產(chǎn)生量確定。
(35)上述(32)-(34)的方法，其包括制備已強制表達(dá)GC-B的培養(yǎng)細(xì)胞系，在測試物質(zhì)存在或不存在下培養(yǎng)所述細(xì)胞系，確定細(xì)胞內(nèi)cGMP的產(chǎn)生量，以及利用在候選藥劑存在和不存下的細(xì)胞內(nèi)cGMP的產(chǎn)生量的差別作為指標(biāo)篩選能夠促進關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞生長的候選藥劑。
(36)篩選用于骨關(guān)節(jié)炎、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎或其它關(guān)節(jié)炎的治療劑的方法，其包括利用GC-B活性作為指標(biāo)篩選能夠治療骨關(guān)節(jié)炎、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎或其它關(guān)節(jié)炎的藥劑的候選藥劑。
(37)上述(36)的方法，其包括制備表達(dá)GC-B的培養(yǎng)細(xì)胞或者得自關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞的細(xì)胞，在候選藥劑的存在下培養(yǎng)所述細(xì)胞，并利用細(xì)胞的GC-B活性作為指標(biāo)篩選能夠治療骨關(guān)節(jié)炎、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎或其它關(guān)節(jié)炎的藥劑的候選藥劑。
(38)上述(36)-(37)的方法，其中所述的GC-B活性以細(xì)胞內(nèi)cGMP的產(chǎn)生量確定。
(39)上述(36)-(38)中任一項的方法，其包括制備已強制表達(dá)GC-B的培養(yǎng)細(xì)胞系，在測試物質(zhì)存在或不存在下培養(yǎng)所述細(xì)胞系，確定細(xì)胞內(nèi)cGMP的產(chǎn)生量，以及利用在候選藥劑存在和不存下的細(xì)胞內(nèi)cGMP的產(chǎn)生量的差別作為指標(biāo)篩選能夠治療骨關(guān)節(jié)炎、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎或其它關(guān)節(jié)炎的藥劑的候選藥劑。
(40)骨關(guān)節(jié)炎的治療劑或預(yù)防劑，其包含鳥苷酸環(huán)化酶B(GC-B)活化劑作為活性成分。
(41)上述(40)的骨關(guān)節(jié)炎的治療劑或預(yù)防劑，其進一步包含至少一種非甾體類抗炎藥。
(42)類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的治療劑或預(yù)防劑，其包含鳥苷酸環(huán)化酶B(GC-B)活化劑作為活性成分。
(43)上述(42)的類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的治療劑或預(yù)防劑，其進一步包含至少一種非甾體類抗炎藥。
(44)治療關(guān)節(jié)炎的方法，其包括對需要關(guān)節(jié)炎治療的病人給藥GC-B活化劑。
(45)上述(44)的方法，其中所述的GC-B活化劑為CNP或其衍生物。
(46)上述(44)或(45)的方法，其中所述的關(guān)節(jié)炎為骨關(guān)節(jié)炎。
(47)上述(46)的方法，其中所述的骨關(guān)節(jié)炎為負(fù)重或非負(fù)重關(guān)節(jié)的骨關(guān)節(jié)炎。
(48)上述(47)的方法，其中所述的骨關(guān)節(jié)炎為膝關(guān)節(jié)變性病、髖關(guān)節(jié)變性病或顳下頜關(guān)節(jié)炎。
(49)上述(44)的方法，其中所述的關(guān)節(jié)炎由類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎導(dǎo)致。
(50)上述(44)的方法，其中所述的關(guān)節(jié)炎由骨關(guān)節(jié)炎導(dǎo)致。
(51)上述(45)-(50)中任一項的方法，其中所述的CNP選自包括人的哺乳動物或者鳥由來的CNP-22或CNP-53。
(52)上述(45)-(50)中任一項的方法，其中所述的CNP為SEQ ID NO1的CNP-22或SEQ ID NO2的CNP-53。
(53)上述(45)-(50)中任一項的方法，其中所述衍生物具有在SEQ IDNO1或SEQ ID NO2的氨基酸序列中的一個或幾個氨基酸的缺失、置換或附加，同時具有CNP活性。
(54)上述(44)-(53)中任一項的方法，其中所述的GC-B活化劑包含于與至少一種非甾體類抗炎藥的組合中。
(55)GC-B活化劑的活化促進劑，其包含非甾體類活化劑。
(56)上述(55)的活化促進劑，其中所述的GC-B活化劑為CNP或其衍生物。
(57)上述(56)的活化促進劑，其中所述的CNP選自包括人的哺乳動物或者鳥由來的CNP-22或CNP-53。
(58)上述(56)的活化促進劑，其中所述的CNP為SEQ ID NO1的CNP-22或SEQ ID NO2的CNP-53。
(59)上述(56)的活化促進劑，其中所述的衍生物具有在SEQ ID NO1或SEQ ID NO2的氨基酸序列中的一個或幾個氨基酸的缺失、置換或附加，同時具有CNP活性。
(60)上述(55)的活化促進劑，其中所述的非甾體類活化劑為環(huán)氧合酶抑制劑。
(61)上述(60)的活化促進劑，其中所述的環(huán)氧合酶抑制劑選自吲哚美辛、布洛芬、吡羅昔康、水楊酸、雙氯芬酸、酮洛芬、萘普生和吡羅昔康。
(62)活化GC-B活化劑的方法，其中使用根據(jù)上述(55)-(61)中任一項所述的活化促進劑。
通過如下實施例將更詳細(xì)地描述本發(fā)明，這些實施例進用于舉例說明的目的，并且不意于限制本發(fā)明的范圍。因此本發(fā)明不受這些實施例限制。
實施例實施例1用于制備CNP轉(zhuǎn)基因小鼠的載體的構(gòu)建如圖1A所示，將鼠CNP cDNA(526bp；FEBS Lett.276209-213，1990)亞克隆到pGEM-T easy載體(Promega)中，然后將其用Pst I切斷并對斷端進行平滑化處理以制備小鼠CNP cDNA。如圖1C所示，將所述載體PSG 1(Promega；圖1B)用EcoRI切斷，對斷端進行平滑化并用所述鼠CNP cDNA結(jié)扎(ligation)，以制備SAP-mCNP載體(pSG1-CNP)。
實施例2CNP轉(zhuǎn)基因小鼠的制備注射用DNA片段制備如下。具有插入CNP基因的SAP-mCNP載體(pSG1-CNP；圖1C)首先用Hind III和Xho I處理以切出包含所述CNP基因的片段(約2.3kb)。然后將該片段用Gel Extraction Kit(QIAGEN)收集并用PBS-稀釋到濃度為3ng/μl，因此獲得注射用DNA片段(圖2)。
將其中注射入所述DNA片段注的前核期小鼠卵子，以如下方法收集。首先向C57BL/6雌性小鼠(Clea Japan，Inc.)腹膜內(nèi)注射5i.u.的孕馬血清促性腺激素(PMSG)，并于48小時后注射5i.u.的人絨膜促性腺激素(hCG)，以誘導(dǎo)過排卵。將這種小鼠與同系統(tǒng)的雄性小鼠雜交。在雜交的第二天早晨，在雌性小鼠中確定存在栓塞，并且隨后灌流輸卵管以收集前核期小鼠卵子。
用顯微操作器將所述注射用DNA片段注射到所述前核期小鼠卵子中(Latest Technology in Gene Targeting(Yodosha，Japan)，190-207，2000)。特別地，將所述DNA片段注射到660 C57BL/6J胚胎中，在隨后的幾天中，在假妊娠的第1天將在2-細(xì)胞期的561個胚胎移殖到受體母鼠的輸卵管中，輸卵管的每一邊約10個(每只動物約20個)。
將沒有在預(yù)產(chǎn)期產(chǎn)仔的受體母鼠進行剖腹產(chǎn)，所出生的產(chǎn)自由養(yǎng)母喂養(yǎng)?？偣搏@得136個產(chǎn)仔，其中5個為具有導(dǎo)入的CNP基因的轉(zhuǎn)基因小鼠(下文中指定為“Tgm”)。下文中，將最初獲得的小鼠指定為建立者(Founder)。
所有的建立者小鼠都為雄性，隨后的產(chǎn)仔(即F1小鼠)從五個系中的四個獲得。
實施例3CNP轉(zhuǎn)基因小鼠的基因型分析根據(jù)如下所述的方法通過DNA印記法進行基因型分析。
尾巴(約15mm)取自3周大的小鼠并用蛋白酶K處理(在55℃下，在100rmp下振蕩一天一夜)以獲得溶胞液。然后將所獲得的溶胞液經(jīng)過自動化核酸分離器(KURABO NA-1000；Kurabo，日本)以制備基因組DNA。該基因組DNA(15μg)用Pvu II(200U)處理，然后用苯酚-氯仿處理以除去限制酶，并且用乙醇沉淀以收集DNA。將獲得的DNA溶解于25μl的TE中并經(jīng)過在0.7％的瓊脂糖凝膠上的電泳(在50V恒定電壓下)，然后將該凝膠用0.25M HCl溶液處理15分鐘以切斷所述DNA，用水洗滌，并將其過夜印記于在0.4M的NaOH溶液中的尼龍膜上。然后將在所述膜上的DNA用紫外交聯(lián)法固定。將所述膜用雜交溶液(50％甲酰胺，0.5x Denhard’s，0.5％SDS，5x SSPE)處理，并利用所述CNP cDNA作為模板，將已經(jīng)用BcaBEST Labeling Kit(TaKaRa，日本)制備的32P標(biāo)記探針加入到該膜上以便在42℃過夜的情況下實現(xiàn)雜交。在用洗凈溶液(2x SSC，0.1％SDS)在55℃處理20分鐘后，將所述膜暴露于Imaging Plate(Fuji Film)過夜以用BAS2000(Fuji Film，日本)檢測轉(zhuǎn)基因的信號(圖3)。在野生型小鼠(WT)中，檢測到3個信號(野生型CNP基因)，而在轉(zhuǎn)基因小鼠(Tgm)中，除了野生型CNP基因外，還檢測到轉(zhuǎn)基因由來的2個信號(轉(zhuǎn)基因)。
實施例4在CNP轉(zhuǎn)基因小鼠中的CNP表達(dá)將CNP-22EIA測量試劑盒(PHOENIX PHARMACEUTICALSINC.)用于CNP水平的測定。
7周大的雄性和雌性CNP轉(zhuǎn)基因小鼠各三只，以及雄性和雌性的同腹小鼠各三只，將它們在乙醚麻醉下通過從后腔靜脈放血實施安樂死。
將肝臟——預(yù)計表現(xiàn)出高度表達(dá)所述轉(zhuǎn)基因的器官——切除，并將上述的得自測量試劑盒的EIA試驗緩沖液以每0.1g肝臟重1mL的量加入其中，隨后在冰上冷卻。將肝臟在Waring混合器(Physcotron)中均質(zhì)化，并在離心(2,000rpm，5分鐘)后將上層清液用作用于測定CNP-22水平的樣品。
將一毫克的乙二胺四乙酸四鈉鹽(Junsei Chemical Co.，Ltd.，日本)和2個胰蛋白酶抑制單位的抑肽酶(Sigma)加入到抽取的血液中并攪動以分離血漿，將其用作用于測定CNP-22水平的樣品。
結(jié)果示于表1中。
表1在CNP轉(zhuǎn)基因小鼠中的CNP表達(dá)

**p＜0.01(非成對Student t檢驗)#p＜0.05(Wilcoxon秩和檢驗)CNP轉(zhuǎn)基因小鼠在肝臟和血漿中的CNP-22水平，當(dāng)與野生型小鼠的平均值±SD值相比時，分別比野生型小鼠高約10倍和約24倍。每種情況下的差別均具有統(tǒng)計學(xué)顯著性。從這些結(jié)果可以確定的是，在CNP轉(zhuǎn)基因小鼠中CNP肽被過剩表達(dá)。
實施例5CNP轉(zhuǎn)基因小鼠的關(guān)節(jié)軟骨的組織學(xué)分析。
為了從組織學(xué)上分析生長軟骨的厚度，將5只每只9周大的雌性CNP轉(zhuǎn)基因小鼠和雌性正常同腹小鼠，在乙醚麻醉下通過從后腔靜脈放血實施安樂死。并將大腿骨用20％福爾馬林固定一周。在浸泡于20％的EDTA-4Na(Junsei Chemical Co.，Ltd.，日本)水溶液(pH 4.4)中脫鈣后，將股骨膝蓋骨面經(jīng)歷中線矢狀斷面，并通過常規(guī)方法包埋于石蠟中以制備石蠟塊。將4μm厚的切片用切片機進一步切片以制備石蠟切片，將其用蘇木精和曙紅染色。對于生長軟骨的厚度，將用目鏡(×10)觀察的一個顯微視野結(jié)合于圖像分析軟件(IPAP，Sumika technoservice，日本)，并且休止層、增殖層和肥大層的每層厚度用相同的軟件在顯微視野中在5個點處測量，并將計算的平均值作為個體每層的厚度。三層的總厚度被認(rèn)為是個體的生長軟骨的厚度。在CNP轉(zhuǎn)基因小鼠和正常同腹小鼠之間計算這些項目的平均值和標(biāo)準(zhǔn)偏差(用Microsoft Excel2000，Microsoft)，并且用非成對Student t檢驗(SAS版本6.12；SASInstitute Japan，日本)進行統(tǒng)計分析。
CNP轉(zhuǎn)基因小鼠，雄性和雌性，都說明它們具有統(tǒng)計學(xué)顯著性更厚的關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞(圖4)。另外，在雄性和雌性CNP轉(zhuǎn)基因小鼠中都顯示出統(tǒng)計學(xué)顯著性更大的每顯微視野下的關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞數(shù)(圖5)。
這些結(jié)果說明GC-B(NPR-B)活化物質(zhì)如CNP可通過增加軟骨細(xì)胞數(shù)，以及通過通常已知的由于個體軟骨細(xì)胞過度增長導(dǎo)致的細(xì)胞數(shù)量的增加而增加關(guān)節(jié)軟骨的厚度(J Biol Chem 2003；278(21)18824-32)。
實施例6CNP轉(zhuǎn)基因小鼠對骨關(guān)節(jié)炎模型的耐受性通過向小鼠的膝關(guān)節(jié)中注射膠原酶以使膝關(guān)節(jié)韌帶和半月板不穩(wěn)定而建立骨關(guān)節(jié)炎動物模型(Am.J.Pathol.1989；1351001-14)。利用CNP轉(zhuǎn)基因小鼠在這個動物模型中評價對關(guān)節(jié)炎和關(guān)節(jié)軟骨變性耐受性以確定對骨關(guān)節(jié)炎的預(yù)防和治療作用。將6μl的3％的II型膠原酶(Sigma)的生理鹽水溶液兩次注射(初始給藥日和7天后)到CNP轉(zhuǎn)基因小鼠和同腹野生型C57BL/6系小鼠的右膝關(guān)節(jié)中。在給藥后28天中用游標(biāo)卡尺(Mitutoyo Corp.，日本)及時測量左膝和右膝二關(guān)節(jié)的寬度，計算右膝和左膝關(guān)節(jié)間的差別以表示膝關(guān)節(jié)的腫脹程度。通過梯形法計算連續(xù)變化的時間-階段曲線下面積(AUC)，并通過Student t檢驗比較CNP轉(zhuǎn)基因小鼠和野生型小鼠。結(jié)果，在轉(zhuǎn)基因小鼠中的AUC比在野生型中顯著性地更小，這說明CNP轉(zhuǎn)基因小鼠對由膠原酶導(dǎo)致的膝關(guān)節(jié)腫脹有耐受性(圖6)。為了進行關(guān)節(jié)炎和關(guān)節(jié)軟骨變性的組織學(xué)評價，在給藥膠原酶后第28天，在乙醚麻醉下通過從后腔靜脈放血而實行安樂死，而后將膝關(guān)節(jié)切除，如實施例5中所述的制備蘇木精-曙紅染色的和番紅精O染色的樣品，并進行組織學(xué)分析。結(jié)果，野生型小鼠顯示在滑膜中，膠原酶誘導(dǎo)顯著的滑膜細(xì)胞生長、肉芽組織形成和炎性細(xì)胞滲透，而這些變化在CNP轉(zhuǎn)基因小鼠中顯著降低(圖7)。對于關(guān)節(jié)軟骨的變性，野生型小鼠顯示出在關(guān)節(jié)軟骨中降低的番紅精O的染色能力和降低的蛋白多糖含量，而這些變化在CNP轉(zhuǎn)基因小鼠中是輕微的，這提供了CNP轉(zhuǎn)基因小鼠抵抗由給藥膠原酶導(dǎo)致的在關(guān)節(jié)軟骨中變性變化的組織學(xué)證據(jù)(圖8)。利用EIA藥劑盒(Phoenix Pharmaceutical)測定的血漿CNP平均水平在野生型小鼠中為0.21ng/mL，和在CNP轉(zhuǎn)基因小鼠中為0.50ng/mL。
這些結(jié)果揭示了CNP具有對在骨關(guān)節(jié)炎中的關(guān)節(jié)軟骨中的關(guān)節(jié)炎和變性變化的抑制作用。
實施例7CNP輸注對骨關(guān)節(jié)炎模型的治療作用(1)將包含如下溶液的滲透泵(2004型，Durect)在9周大的雄性C57BL/6J系小鼠背部進行皮下移植。
·溶劑包含5％右旋糖(Junsei Chemical Co.，Ltd.，日本)、10％甘露糖(Nacalai Tesque Inc.，日本)和5mmol/L透明質(zhì)酸(Wako PureChemical industries，日本)的蒸餾水。
·10μg/mL的CNP-22(Calbiochem Novabiochem)的溶液(60ng/天)。
·100μg/mL的CNP-22(Calbiochem Novabiochem)的溶液(600ng/天)。
移植后6天，將6μL的1.5％的II型膠原酶(Sigma)溶液注射到右膝關(guān)節(jié)中，在注射后28天用游標(biāo)卡尺(Mitutoyo Corp.，日本)及時測量右膝關(guān)節(jié)和左膝關(guān)節(jié)的寬度，計算右膝和左膝二關(guān)節(jié)間的差別。這個差別表示膝關(guān)節(jié)的腫脹程度，并且通過Student t檢驗(SAS版本6.12)比較溶劑對照組和CNP組之間的AUC。結(jié)果表明與溶劑對照組相比，在CNP-22組中在每個劑量下，AUC的值顯著更低。根據(jù)實施例5中的方法制備蘇木精-曙紅染色的和番紅精O染色的樣品，并進行組織學(xué)分析。
結(jié)果，溶劑對照組顯示出在滑膜中由膠原酶誘導(dǎo)的顯著的滑膜細(xì)胞生長、肉芽組織形成和炎性細(xì)胞滲透，而這些變化在CNP組中顯著降低(圖9)。從滑膜組織得出的這些結(jié)果顯示CNP具有對骨關(guān)節(jié)炎的治療作用。
實施例8CNP輸注對骨關(guān)節(jié)炎模型的治療作用(2)將包含如下溶液的滲透泵(2004型，Durect)在9周大的雄性C57BL/6J系小鼠(CLEA Japan，日本)背部進行皮下移植。
·溶劑包含5％右旋糖(Junsei Chemical Co.，Ltd.，日本)、10％甘露糖(Nacalai Tesque Inc.，日本)和5mmol/L透明質(zhì)酸(Wako PureChemical industries，日本)的蒸餾水。
·10mg/mL的CNP-22(Calbiochem Novabiochem)的溶液(60ng/天)。
·100mg/mL的CNP-22(Calbiochem Novabiochem)的溶液(600ng/天)。
在植入后第二天，將小鼠用乙醚麻醉并經(jīng)過外科手術(shù)過程，切除右膝關(guān)節(jié)中前十字韌帶、切除脛骨內(nèi)側(cè)副韌帶和整體切除中間半月板以誘導(dǎo)骨關(guān)節(jié)炎。在給藥后11天用游標(biāo)卡尺(Mitutoyo Corp.)及時測量右膝關(guān)節(jié)和左膝關(guān)節(jié)的寬度，計算右膝和左膝關(guān)節(jié)間的差別。這個差別表示膝關(guān)節(jié)的腫脹程度，并且通過Student t檢驗(SAS PreclinicalPackage，Institute Japan，日本)比較溶劑對照組和CNP組間的AUC。結(jié)果表明與溶劑對照組相比，在CNP-22組中，在每個劑量下，AUC的值顯著更低(圖10)。
這些結(jié)果表明CNP還對抑制骨關(guān)節(jié)炎中的關(guān)節(jié)炎有效，所述骨關(guān)節(jié)炎由外科手術(shù)過程導(dǎo)致的膝關(guān)節(jié)物理負(fù)載過重導(dǎo)致。
實施例9非甾體類抗炎藥(NSAID)和CNP在膠原酶OA模型中的組合作用將包含如下溶液的滲透泵(2004型，Durect)在9周大的雄性C57BL/6J系小鼠背部進行皮下移植。
·溶劑包含5％右旋糖(Junsei Chemical Co.，Ltd.，日本)、10％甘露糖(Nacalai Tesque Inc.，日本)和5mmol/L透明質(zhì)酸(Wako PureChemical industries，日本)的蒸餾水。
·1μg/mL的CNP-22(Calbiochem Novabiochem)的溶液(6ng/天)。
另外，為了檢測當(dāng)單獨使用和與CNP結(jié)合使用NSAID吲哚美辛(Sigma)的作用，從如上所述的泵移植的日期開始，將吲哚美辛在0.2％羧甲基纖維素(Nacalai Tesque Inc.，日本)中的懸浮液以強迫口服方式給藥1mg/kg，一天1次，連續(xù)4天。
如下設(shè)置實驗組。
溶劑對照組(輸注溶劑，口服給藥溶劑)CNP 6ng/天吲哚美辛 1mg/kg
CNP 6ng/天+吲哚美辛1mg/kg在植入泵的當(dāng)天和第二天，分別向右膝中輸注6μL的0.15％的II型膠原酶(Sigma)和6μL的1.5％的II型膠原酶溶液，在輸注后7天，用游標(biāo)卡尺(Mitutoyo Corp.)每天測量右膝關(guān)節(jié)和左膝關(guān)節(jié)的寬度，計算右膝和左膝關(guān)節(jié)間的差別。這個差別表示膝關(guān)節(jié)的腫脹程度，并且通過Student t檢驗(SAS版本6.12)比較溶劑對照組和CNP組間的AUC。
結(jié)果，當(dāng)單獨使用吲哚美辛?xí)r，不會抑制膝關(guān)節(jié)腫脹。給予6ng/天的CNP組顯著地抑制膝關(guān)節(jié)腫脹。給予CNP和吲哚美辛組合組顯示比單獨給予CNP組顯著更強的抑制膝關(guān)節(jié)腫脹作用(圖11)。這些結(jié)果顯示當(dāng)CNP單獨使用時其具有比NSAID更有效的抑制膝關(guān)節(jié)腫脹的作用，它是標(biāo)準(zhǔn)的抗關(guān)節(jié)炎藥物，并且當(dāng)與NSAID結(jié)合使用時還具有協(xié)同作用。
實施例10CNP對輔助關(guān)節(jié)炎大鼠模型的作用將包含如下溶液的滲透泵(2004型，Durect)在9周大的雄性LEW/Crj系大鼠(Charles River Laboratories Japan，Inc.，日本)背部進行皮下移植。
·溶劑包含5％右旋糖(Junsei Chemical Co.，Ltd.，日本)、10％甘露糖(Nacalai Tesque Inc.，日本)和5mmol/L透明質(zhì)酸(Wako PureChemical industries，日本)的蒸餾水。
·10μg/mL的CNP-22(Calbiochem Novabiochem)的溶液(60ng/天)。
在移植的第二天，將不再有傳染力的肺結(jié)核病菌的粉末(M.TUBERCULOSIS DES.H37 RA DIFCO LABORATORIES)懸浮于液體石蠟(Junsei Chemical Co.，Ltd.，日本)中，濃度為3mg/mL，將50μL接種于大鼠尾的根部皮膚中。接種后，利用計分體系根據(jù)如下標(biāo)準(zhǔn)每天評價四肢末端的狀況，計算四肢末端得分的總和以表示個體關(guān)節(jié)炎的得分。
0分沒有損害1分在一個或多個指關(guān)節(jié)中觀察到突發(fā)/腫脹?；蛘咴跊]有腫脹的爪子的背部發(fā)紅。
2分在前肢或后肢的背部發(fā)生輕度腫脹。
3分在前肢或后肢的背部發(fā)生嚴(yán)重腫脹，但沒有在所有的指頭中發(fā)生。
4分在前肢或后肢的背部和指部發(fā)生嚴(yán)重腫脹。
結(jié)果表明，在CNP組中比在溶劑對照組中一定程度上關(guān)節(jié)炎得分更低(圖12A)。
還測量了基于每天的體重變化。結(jié)果顯示與溶劑對照組相比，在CNP組中體重增加明顯(圖12B)。
這些結(jié)果說明CNP在輔助大鼠模型中也可抑制關(guān)節(jié)炎并改善總體癥狀。
實施例11CNP對膠原質(zhì)關(guān)節(jié)炎大鼠模型的作用將包含如下溶液的滲透泵(2004型，Durect)在10周大的雌性DA/Slc系大鼠(Japan SLC，Inc.，日本)背部進行皮下移植。
·溶劑包含5％右旋糖(Junsei Chemical Co.，Ltd.，日本)、10％甘露糖(Nacalai Tesque Inc.，日本)和5mmol/L透明質(zhì)酸(Wako PureChemical industries，日本)的蒸餾水。
·1mg/mL的CNP-22(Calbiochem Novabiochem)的溶液(6μg/天)。
在移植后，立即將牛II型膠原質(zhì)溶解于0.1mol/L乙酸水溶液中制成1.5mg/mL，并將其懸浮于等體積的不完全弗氏佐劑(DIFCOLABORATORIES)中，并將400μL的懸浮液接種到大鼠背部的皮膚中。也測量了基于每天的體重變化。另外，在既沒有泵抑制也沒有接種的正常組中也測量基于每天的體重變化。
結(jié)果，與正常組相比，在溶劑對照組中體重顯著降低，而在CNP組中體重降低比溶劑對照組顯著更小(圖13)。這些結(jié)果說明CNP改善了在膠原質(zhì)關(guān)節(jié)炎大鼠模型中的總體癥狀。
工業(yè)適用性因為本發(fā)明的包含GC-B活化劑作為活性成分的治療劑或預(yù)防劑可以增加關(guān)節(jié)軟骨的厚度和關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞數(shù)，提供對關(guān)節(jié)腫脹的耐受性，抑制關(guān)節(jié)軟骨中的變性變化，使滑膜細(xì)胞生長、肉芽組織形成和炎性細(xì)胞滲透的變化顯著降低，并避免了在關(guān)節(jié)軟骨中蛋白多糖含量的降低，因此它們可用于治療或預(yù)防包括骨關(guān)節(jié)炎的關(guān)節(jié)炎，例如膝關(guān)節(jié)變性病、髖關(guān)節(jié)變性病、肘骨關(guān)節(jié)炎、脊骨關(guān)節(jié)炎和顳下頜關(guān)節(jié)病。給藥本發(fā)明的藥物組合物可導(dǎo)致對在受感染關(guān)節(jié)部分的關(guān)節(jié)軟骨基質(zhì)和軟骨細(xì)胞的降低的抑制或使其再生，并抑制在關(guān)節(jié)軟骨中的變性變化和在關(guān)節(jié)部分中的腫脹，這導(dǎo)致對關(guān)節(jié)炎疾病的抑制或降低。具體而言，由于本發(fā)明的骨關(guān)節(jié)炎的治療劑與常規(guī)的整形外科手術(shù)，例如關(guān)節(jié)鏡手術(shù)、人工關(guān)節(jié)替代和骨切開術(shù)相比，對病人造成更少的負(fù)荷和痛苦，因此它們提供了具有使病人滿意的QQL的優(yōu)異治療劑。
GC-B活化劑具有如上所述的效力，這個新的發(fā)現(xiàn)意義是，通過活化GC-B抑制關(guān)節(jié)炎并促進關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞生長是可能的。另外，利用GC-B活性(例如細(xì)胞內(nèi)cGMP的產(chǎn)生量)作為指標(biāo)，篩選關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞生長促進劑和關(guān)節(jié)炎治療劑也是可能的。
本文中引用的所有的出版物、專利和專利申請通過引用其全部內(nèi)容而并入本發(fā)明。
序列表的自由原文SEQ ID NO1的說明二硫鍵形成于6-Cys和22-Cys之間。
SEQ ID NO2的說明二硫鍵形成于37-Cys和53-Cys之間。
SEQ ID NO3的人工序列的說明CNP-22衍生物，其中二硫鍵形成于6-Cys和22-Cys之間。
SEQ ID NO4的人工序列的說明CNP-22衍生物，其中二硫鍵形成于6-Cys和22-Cys之間。
SEQ ID NO5的人工序列的說明CNP-22衍生物，其中二硫鍵形成于6-Cys和22-Cys之間。
SEQ ID NO6的人工序列的說明CNP-22衍生物，其中二硫鍵形成于1-Cys和17-Cys之間。
SEQ ID NO7的人工序列的說明CNP-22衍生物，其中二硫鍵形成于7-Cys和23-Cys之間。
SEQ ID NO8的人工序列的說明CNP-22衍生物，其中二硫鍵形成于6-Cys和22-Cys之間。
SEQ ID NO9的人工序列的說明CNP-22衍生物，其中二硫鍵形成于1-Cys和17-Cys之間。
SEQ ID NO10的人工序列的說明CNP-22衍生物，其中4-Xaa＝Leu，Ile，Val；5-Xaa＝Lys，Leu，Met；6-Xaa＝Leu，Ile，Ala，Val；11-Xaa＝Ser，Ala，Gly，Thr，Asn；12-Xaa＝Met，Ala，Trp，His，Lys，Ser，Gly；14-Xaa＝Gly，Lys，Ala，Leu；15-Xaa＝Leu，Met，并且二硫鍵形成于1-Cys和17-Cys之間。
序列表<110>中尾一和(Nakao，Kazuwa)；中外制藥株式會社(CHUGAI SEIYAKU KABUSHIKIKAISHA)<120>關(guān)節(jié)炎的治療劑或預(yù)防劑<130>SCT064756-65<150>JP 2004-107924<151>2004-03-31<160>10<170>PatentIn Ver.2.1<210>1<211>22<212>PRT<213>Homo sapiens<220>
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<221>DISULFID<222>(6)..(22)<223>A disulfide bond is formed<400>4Gly Leu Ser Lys Gly Cys Phe Gly Leu Lys Leu Asp Arg Ile Gly Ser1 5 10 15
Gln Ser Gly Leu Gly Cys20<210>5<211>22<212>PRT<213>Artificial Sequence<220>
<221>DISULFID<222>(6)..(22)<223>A disulfide bond is formed<400>5Gly Leu Ser Lys Gly Cys Phe Gly Leu Lys Leu Asp ArgIle Gly Ser1 5 10 15Ala Ser Gly Leu Gly Cys20<210>6<211>17<212>PRT<213>Artificial Sequence<220>
<221>DISULFID<222>(1)..(17)
<223>A disulfide bond is formed<400>6Cys Phe Gly Leu Lys Leu Asp Arg Ile Gly Ser Met Ser Gly Leu Gly1 5 10 15Cys<210>7<211>23<212>PRT<213>Artificial Sequence<220>
<221>DISULFID<222>(7)..(23)<223>A disulfide bond is formed<400>7Ser Leu Arg Arg Ser Ser Cys Phe Gly Leu Lys Leu Asp Arg Ile Gly1 5 10 15Ser Met Ser Gly Leu Gly Cys20<210>8<211>27
<212>PRT<213>Artificial Sequence<220>
<221>DISULFID<222>(6)..(22)<223>A disulfide bond is formed<400>8Gly Leu Ser Lys Gly Cys Phe Gly Leu Lys Leu Asp Arg Ile Gly Ser1 5 10 15Met Ser Gly Leu Gly Cys Asn Ser Phe Arg Tyr20 25<210>9<211>22<212>PRT<213>Artificial Sequence<220>
<221>DISULFID<222>(1)..(17)<223>A disulfide bond is formed<400>9Cys Phe Gly Leu Lys Leu Asp Arg Ile Gly Ser Gln Ser Gly Leu Gly1 5 10 15
Cys Asn Ser Phe Arg Tyr20<210>10<211>17<212>PRT<213>Artificial Sequence<220>
<221>MUTAGEN<222>(4)..(4)<223>Xaa is Leu，Ile，or Val<220>
<221>MUTAGEN<222>(5)..(5)<223>Xaa is Lys，Leu，or Met<220>
<221>MUTAGEN<222>(6)..(6)<223>Xaa is Leu，Ile，Ala，or Val<220>
<221>MUTAGEN<222>(11)..(11)<223>Xaa is Ser，Ala，Gly，Thr，or Asn<220>
<221>MUTAGEN<222>(12)..(12)<223>Xaa is Met，Ala，Trp，His，Lys，Ser，or Gly<220>
<221>MUTAGEN<222>(12)..(12)<223>Xaa is Met，Ala，Trp，His，Lys，Ser，or Gly<220>
<221>MUTAGEN<222>(14)..(14)<223>Xaa is Gly，Lys，Ala，or Leu<220>
<221>MUTAGEN<222>(15)..(15)<223>Xaa is Leu or Met<220>
<221>DISULFID<222>(1)..(17)<223>A disulfide bond is formed<400>10Cys Phe Gly Xaa Xaa Xaa Asp Arg Ile Gly Xaa Xaa Ser Xaa Xaa Gly1 5 10 15Cys
權(quán)利要求
1.關(guān)節(jié)炎的治療劑或預(yù)防劑，其包含鳥苷酸環(huán)化酶B(GC-B)活化劑作為活性成分。
2.權(quán)利要求1的治療劑或預(yù)防劑，其中所述的關(guān)節(jié)炎為骨關(guān)節(jié)炎。
3.權(quán)利要求2的治療劑或預(yù)防劑，其中所述的骨關(guān)節(jié)炎為負(fù)重或非負(fù)重關(guān)節(jié)的骨關(guān)節(jié)炎。
4.權(quán)利要求3的治療劑或預(yù)防劑，其中所述的骨關(guān)節(jié)炎為膝關(guān)節(jié)變性病。
5.權(quán)利要求3的治療劑或預(yù)防劑，其中所述的骨關(guān)節(jié)炎為髖關(guān)節(jié)變性病。
6.權(quán)利要求3的治療劑或預(yù)防劑，其中所述的骨關(guān)節(jié)炎為顳下頜關(guān)節(jié)炎。
7.權(quán)利要求1的治療劑或預(yù)防劑，其中所述的關(guān)節(jié)炎由類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎導(dǎo)致。
8.權(quán)利要求1的治療劑或預(yù)防劑，其中所述的關(guān)節(jié)炎由骨關(guān)節(jié)炎導(dǎo)致。
9.權(quán)利要求1-8中任一項的治療劑或預(yù)防劑，其中所述的GC-B活化劑為C型利鈉利尿肽(CNP)或其衍生物。
10.權(quán)利要求9的治療劑或預(yù)防劑，其中所述的CNP選自包括人的哺乳動物或者鳥由來的CNP-22和CNP-53。
11.權(quán)利要求9的治療劑或預(yù)防劑，其中所述的CNP為SEQ ID NO1的CNP-22或SEQ ID NO2的CNP-53。
12.權(quán)利要求9的治療劑或預(yù)防劑，其中所述的衍生物具有在SEQID NO1或SEQ ID NO2的氨基酸序列中的一個或幾個氨基酸的缺失、置換或附加，同時具有CNP活性。
13.權(quán)利要求1的治療劑或預(yù)防劑，其進一步包含至少一種非甾體類抗炎藥。
14.關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞生長促進劑，其包含GC-B活化劑作為活性成分。
15.權(quán)利要求14的促進劑，其中所述的GC-B活化劑為CNP或其衍生物。
16.權(quán)利要求15的促進劑，其中所述的CNP為包括人的哺乳動物或者鳥由來的CNP-22或CNP-53。
17.權(quán)利要求15的促進劑，其中所述的CNP為SEQ ID NO1的CNP-22或SEQ ID NO2的CNP-53。
18.權(quán)利要求15的促進劑，其中所述的衍生物具有在SEQ ID NO1或SEQ ID NO2的氨基酸序列中的一個或幾個氨基酸的缺失、置換或附加，同時具有CNP活性。
19.權(quán)利要求14的促進劑，其進一步包含至少一種非甾體類抗炎藥。
20.抑制關(guān)節(jié)炎的方法，其中所述的關(guān)節(jié)炎通過活化GC-B被抑制。
21.權(quán)利要求20的方法，其中所述的GC-B被CNP或其衍生物活化。
22.權(quán)利要求21的方法，其中所述的CNP為包括人的哺乳動物或者鳥由來的CNP-22或CNP-53。
23.權(quán)利要求21的方法，其中所述的CNP為SEQ ID NO1的CNP-22或SEQ ID NO2的CNP-53。
24.權(quán)利要求21的方法，其中所述的衍生物具有在SEQ ID NO1或SEQ ID NO2的氨基酸序列中的一個或幾個氨基酸的缺失、置換或附加，同時具有CNP活性。
25.權(quán)利要求20的方法，其中所述的GC-B被CNP或其衍生物與至少一種非甾體類抗炎藥的組合活化。
26.促進關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞生長的方法，其中所述的生長通過活化GC-B被促進。
27.權(quán)利要求26的方法，其中所述的GC-B被CNP或其衍生物活化。
28.權(quán)利要求27的方法，其中所述的CNP為包括人的哺乳動物或者鳥由來的CNP-22或CNP-53。
29.權(quán)利要求27的方法，其中所述的CNP為SEQ ID NO1的CNP-22或SEQ ID NO2的CNP-53。
30.權(quán)利要求27的方法，其中所述的衍生物具有在SEQ ID NO1或SEQ ID NO2的氨基酸序列中的一個或幾個氨基酸的缺失、置換或附加，同時具有CNP活性。
31.權(quán)利要求26的方法，其中所述的GC-B被CNP或其衍生物與至少一種非甾體類抗炎藥的組合活化。
32.篩選關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞生長促進劑的方法，其包括利用GC-B活性作為指標(biāo)篩選能夠促進關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞生長的候選藥劑。
33.權(quán)利要求32的方法，其包括制備表達(dá)GC-B的培養(yǎng)細(xì)胞或者得自關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞的細(xì)胞，在候選藥劑的存在下培養(yǎng)所述細(xì)胞，以及利用細(xì)胞的GC-B活性作為指標(biāo)篩選能夠促進關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞生長的候選藥劑。
34.權(quán)利要求32或33的方法，其中所述的GC-B活性以細(xì)胞內(nèi)cGMP的產(chǎn)生量確定。
35.權(quán)利要求32的方法，其包括制備已強制表達(dá)GC-B的培養(yǎng)細(xì)胞系，在候選藥劑存在或不存在下培養(yǎng)所述細(xì)胞系，確定細(xì)胞內(nèi)cGMP的產(chǎn)生量，以及利用在候選藥劑存在和不存下的細(xì)胞內(nèi)cGMP的產(chǎn)生量之間的差別作為指標(biāo)篩選能夠促進關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞生長的候選藥劑。
36.篩選用于骨關(guān)節(jié)炎、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎或其它關(guān)節(jié)炎的治療劑的方法，其包括利用GC-B活性作為指標(biāo)篩選能夠治療骨關(guān)節(jié)炎、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎或其它關(guān)節(jié)炎的藥劑的候選藥劑。
37.權(quán)利要求36的方法，其包括制備表達(dá)GC-B的培養(yǎng)細(xì)胞或者得自關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞的細(xì)胞，在候選藥劑的存在下培養(yǎng)所述細(xì)胞，并利用細(xì)胞的GC-B活性作為指標(biāo)篩選能夠治療骨關(guān)節(jié)炎、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎或其它關(guān)節(jié)炎的藥劑的候選藥劑。
38.權(quán)利要求36或37的方法，其中所述的GC-B活性以細(xì)胞內(nèi)cGMP的產(chǎn)生量確定。
39.權(quán)利要求36的方法，其包括制備已強制表達(dá)GC-B的培養(yǎng)細(xì)胞系，在候選藥劑存在或不存在下培養(yǎng)所述細(xì)胞系，確定細(xì)胞內(nèi)cGMP的產(chǎn)生量，以及利用在候選藥劑存在和不存下的細(xì)胞內(nèi)cGMP的產(chǎn)生量之間的差別作為指標(biāo)篩選能夠治療骨關(guān)節(jié)炎、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎或其它關(guān)節(jié)炎的藥劑的候選藥劑。
40.骨關(guān)節(jié)炎的治療劑或預(yù)防劑，其包含鳥苷酸環(huán)化酶B(GC-B)活化劑作為活性成分。
41.權(quán)利要求40的骨關(guān)節(jié)炎的治療劑或預(yù)防劑，其進一步包含至少一種非甾體類抗炎藥。
42.類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的治療劑或預(yù)防劑，其包含鳥苷酸環(huán)化酶B(GC-B)活化劑作為活性成分。
43.權(quán)利要求42的類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的治療劑或預(yù)防劑，其進一步包含至少一種非甾體類抗炎藥。
44.GC-B活化劑的活化促進劑，其包含非甾體類活化劑。
45.權(quán)利要求44的活化促進劑，其中所述的GC-B活化劑為CNP或其衍生物。
46.權(quán)利要求45的活化促進劑，其中所述的CNP選自包括人的哺乳動物或者鳥由來的CNP-22和CNP-53。
47.權(quán)利要求45的活化促進劑，其中所述的CNP為SEQ ID NO1的CNP-22或SEQ ID NO2的CNP-53。
48.權(quán)利要求45的活化促進劑，其中所述的衍生物具有在SEQ IDNO1或SEQ ID NO2的氨基酸序列中的一個或幾個氨基酸的缺失、置換或附加，同時具有CNP活性。
49.權(quán)利要求44的活化促進劑，其中所述的非甾體類活化劑為環(huán)氧合酶抑制劑。
50.權(quán)利要求49的活化促進劑，其中所述的環(huán)氧合酶抑制劑選自吲哚美辛、布洛芬、吡羅昔康、水楊酸、雙氯芬酸、酮洛芬、萘普生和吡羅昔康。
51.GC-B活化劑的活化方法，其中使用根據(jù)權(quán)利要求44-50中任一項所述的活化促進劑。
全文摘要
本發(fā)明提供用于關(guān)節(jié)炎如骨關(guān)節(jié)炎的新型治療劑或預(yù)防劑。具體地，本發(fā)明提供用于關(guān)節(jié)炎如骨關(guān)節(jié)炎的治療劑或預(yù)防劑，或者關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞生長促進劑，所述藥劑包含鳥苷酸環(huán)化酶B(GC－B)活化劑作為活性成分；或者用于通過活化GC－B而抑制關(guān)節(jié)炎或促進關(guān)節(jié)軟骨生長的方法；或者利用所述GC－B活性作為指標(biāo)篩選關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞生長促進劑或能夠治療關(guān)節(jié)炎的藥劑的方法。
文檔編號A61P17/00GK1960758SQ200580017490
公開日2007年5月9日 申請日期2005年3月31日 優(yōu)先權(quán)日2004年3月31日
發(fā)明者中尾一和, 北村秀智 申請人:中外制藥株式會社, 中尾一和